Summary
L-012、化学発光のルミノール アナログを視覚化し、マウス切除創傷モデルで生成される活性酸素種 (ROS) を定量化を利用した、非侵襲的生体内でイメージ投射は、効率的でコスト効果の高い、プロトコルについて述べる.
Abstract
活性酸素種 (ROS) の生成は炎症性プロセスの特徴が、過剰な酸化ストレスは広くがん、動脈硬化、糖尿病など様々 な疾患に関与。我々 は以前に核因子 (赤血球由来 2) の機能障害-2 (Nrf2) のような糖尿病患者の創傷処置生理: Kelch 様赤芽球細胞由来蛋白質 1 (Keap1) を信号経路は、皮膚の中にロスが極端に不均衡につながる/。ROS レベルは創傷治癒の進行の重要な指標であるので、具体的かつ正確な定量化技術、貴重です。細胞や組織の活性酸素を測定するいくつか生体外の試金が記載されています。しかし、彼らはのみサンプルあたり 1 つの累積的な測定を提供します。最近では、タンパク質ベースのインジケーターおよびイメージ投射様相の開発独自の時空間解析許可されています。L-012 (C13H8ClN4直2)、ルミノール誘導体の生体内と体外の化学発光の両方に使用できるNAPDH 酸化酵素によって生成される活性酸素の検出。L-012 他蛍光プローブより強い信号を出力し、機密とロスを検出するため信頼性の高いことが示されています。L 012 促進イメージングの時間経過の適用性は、犠牲の必要性を削減し、全体的な研究の動物の数を減らす炎症性プロセスに関する貴重な情報を提供します。ここでは、L 012 促進体内糖尿病マウスを用いたローカル機能不全 Nrf2/Keap1 の切除創傷治癒モデルにおける酸化ストレスを定量化するイメージングを利用したプロトコルについて述べる。
Introduction
炎症性プロセスによって生成された酸素代謝は細胞成分1の破壊的な変更と同様、様々 なシグナル伝達カスケードに貢献します。ROS を測定する高感度および特定の技術は、炎症性プロセスを調査し、酸化ストレスの影響を特徴付けるのため重要です。In vivoイメージングは、生体組織の動的空間的および時間的なデータを提供する能力のため貴重です。L-012 はスーパーオキシド陰イオンの高感度は、細胞、組織、および全血1,2,3,その他蛍光プローブより高い光強度を生成する合成化学発光プローブ4. 関節炎、大腸炎の5,6を含むいくつかの炎症性疾患を研究する生体内イメージング マウスモデルでの正常に採用されています。まだ確立された皮膚創傷治癒モデルで採用される必要があります。生成される活性酸素の測定はさまざまな条件下での創傷治癒の進行を評価するために均等に関連です。感度とこのメソッドの非侵襲的自然治癒マウス モデル間でを研究のための有望な技術になります。
Nrf2 は抗酸化反応といくつか抗酸化酵素8のプロモーター領域に一般的な抗酸化剤応答要素 (は) に特異的な転写因子の主要なドライバーです。酸化ストレスのない場合は、Nrf2 は Keap1 は、その後そのユビキチン化と分解を原因によって細胞質内に隔離されます。Nrf2/Keap1 経路の不均衡は、不適切なレドックスの恒常性と酸化ストレスの増加9の設定の遅延の創傷治癒過程に関与しています。我々 は以前、Keap1 の抑制が Nrf2 活性の上昇を刺激し、促進することを示されている糖尿病の病理学的皮膚創傷治癒過程の救助傷9。
ここで ROS や創傷治癒の間の関連付けを強調するため非常に重要です切除皮膚創傷治癒モデルにおける ROS レベルを測定するイメージング L 012 補助発光を利用するプロトコルについて述べる。この手法は、傷および即時の周囲の内で酸化的負担にリアルタイムの変更を示します。さらに、このメソッドは、介入およびメカニズムの迅速な評価のため、影響を与える酸化還元処理をするをできます。ここで酸化還元の恒常性の回復のための戦略の有効性を評価するのにKeap1 ノックダウンのモデルを使用します。本手法は非侵襲的傷が妨げられるため、同じ動物は組織またはセル lysates に基づいてさらに確証的解析に使用できます。
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Protocol
ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会のニューヨーク大学医学部によって承認されています。すべてのマウス、障壁の後ろに収容され、すべての要員は適切な個人用保護具を着用します。
1 日 0: 切除創傷治癒のマウスモデルの作製
- 2% イソフルレンの吸入で、8-12 週間を高齢者、糖尿病 (Leprdb/db) マウスを麻酔します。確認、適切に麻酔されてそれぞれのマウスを利用してテスト ピンチ足のパッドを使用します。乾燥からの刺激を防ぐためにそれぞれの目に滅菌眼潤滑剤を適用します。イソフルランを使用して動物を麻酔するとき、研究者は制度的獣医職員のガイドラインに従ってください。
- マウスの重量を量るし、それぞれのマウスの体重を記録します。使用して各動物の血糖値を記録することによって動物の糖尿病の状態を確認します。
- 手続き型のワークスペースと麻酔機器を消毒します。髪トリマーを使用してマウスの背毛を削除し、過剰な髪を拭くためローションのアプリケーションで続いて。2 回、露出した肌をきれいにするアルコール綿を使用し、乾燥することができます。
- 老舗切除治癒法7、8によると滅菌 10 mm 生検パンチを使用して組織層 carnosus を拡張する 2 つの 10 mm 全層傷を作成します。すべて生存外科用滅菌手袋を使用します。オートクレーブ手術および手術のフィールドでのみ開く前にバッグのすべての手術器械。
- スプリント傷 10 mm 円形開口を持つ 0.5 mm 厚のシリコン シートを使用してを開き、安全な場所を使用してのステントは 4-0 シルクの縫合。
- 術後、麻酔から動物を取り外し、適切なリカバリを容易にするパッドを加熱。注記のうち、動物の体温低下している最中、動物移動することによって加熱パッドを以前麻酔下の体熱の損失を最小限に抑える。彼らが目を覚まし、モバイルまで動物を監視します。
- 完全に回復した動物 (術後濃縮のケージの床には、いくつかの食品を確認) 食料と水を含む個々 のケージに戻ります。細断紙タオル 2 週間追加ネスト材料を提供します。有害な相互作用と創傷治癒の状態への変更を防ぐために、他の動物の手術を受けている動物をしない家します。
- 術後の痛みを軽減するため注入マウス皮下ブプレノルフィン 0.1 mg/kg 体重の 1 日 2 回、すぐに次のプロシージャは、3 日間の開始。
2. 1 日目: Keap1 siRNA の準備
注: は、バイオ セーフティ キャビネット内のすべての治療を準備します。
- 氷の上の 1.5 mL 遠心チューブに 20 μ M Keap1 siRNA (siKeap1) の 12.5 μ L (250 pmol) で減少血清中の 37.5 μ L を組み合わせることにより siRNA 希釈を準備します。
- 1.5 mL 遠心チューブにリポソーム ミックスの 25 μ L で減少血清中の 25 μ L を組み合わせることにより、リポソーム希釈を準備します。
- 50 μ L リポソーム希釈滴 (1:1 巻) に siRNA 希釈の 50 μ L を加え、軽く混ぜます。
- 室温で 20 分間インキュベートします。
- 水で 2% セルロース ゲルの 50 μ L を追加し、上下にピペットで穏やかに混合します。
- ナンセンス siNS (コントロール) とそれぞれの動物の治療や siKeap1 (実験)。ゲルを傷の上に適用されます。手足の可動性を維持するために自由を維持する場所にゲルを維持する透明フィルム ドレッシングで動物の胴体をラップします。
3. 3 日目: L-012 ソリューションの準備
注: は、バイオ セーフティ キャビネットのすべての試薬を準備します。
- 1.5 mL 遠心チューブに濃度 0.5 mg/100 mL の 1x PBS で L-012 を準備します。
- 手動で渦遠心チューブ。液体で均等に中断する必要がありますしかし、L-012 は、PBS に完全に溶解しません。注記のうち、不穏な生理学的な電解質バランス注入を避けるために水で L-012 を解散することをしないでください。
- 27 G の針を用いて 1 mL シリンジにソリューションを転送します。
注: は光から L-012 ソリューションを保護してください。
4 糖尿病性創傷の 3 日目: In Vivoイメージング
- 2% イソフルレンの吸入マウスを麻酔します。イソフルランを使用して動物を麻酔するとき、研究者は制度的獣医職員のガイドラインに従ってください。確認、適切に麻酔されてそれぞれのマウスを利用してテスト ピンチ足のパッドを使用します。乾燥からの刺激を防ぐためにそれぞれの目に滅菌眼潤滑剤を適用します。
- そっと傷を乱すことがなくマウスから透明フィルム ドレッシングを削除します。
- それぞれの注文にイメージングのチャンバーにマウスを配置します。商工会議所の O2を適切なレベルを維持するためにイメージング システムの流入および誘導室 O2レベルを 1.0 L/分に設定します。
- 生物発光と L-012 化合物の投与前に、のベースライン時の写真のマウスをイメージします。
- 腹部をアルコール綿で拭いて、乾燥することができます。L-012 ソリューションは 27 ゲージ針を使用して 200 g 体重当たり 5 mg の腹腔内投与を行います。たとえば、体重 20 g のマウス L-012 0.5 mg が表示されます。
- L-012 注射の直後イメージングの商工会議所のそれぞれの場所にマウスを配置します。4 分間隔で 1 分、60 分のコースにマウスをイメージします。ROS レベルを決定するための関心領域として 10 mm の傷を定義します。
- 術後、麻酔から動物を取り外し、適切なリカバリを容易にするパッドを加熱。彼らが目を覚まし、モバイルまで動物を監視します。
- 完全に回復した後、1.6 で説明した同じ術後の濃縮環境を維持する個々 のケージに動物を返します。有害な相互作用と創傷治癒の状態への変更を防ぐために、他の動物の手術を受けている動物をしない家します。
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Representative Results
確立された切除傷モデル (図 1 a) によると二国間の傷を作成した後 3 日間糖尿病マウスは、イメージングの商工会議所に配置されます。初期の写真と発光のメジャーがバック グラウンド信号 (図 1 b) を考慮して L-012 の注入前にされます。L-012 ソリューションと腹腔内投与は、マウスが商工会議所の再配置し、ROS が検出された傷の分野で生物発光を視覚化 (図 1).正しいイメージングと分析の設定図 2に示すよう選択したら、イメージングを続行します。発光は、1 分 60 分 (図 3) のコース上 5 分間隔で記録されます。これは、時間の経過とともに関心領域の発光の飽和を示しています。私たちの動物モデルで完全な L-012 飽和に到達する最適な撮像時間は 50 分後に、生物発光の顕著な違いは高く評価なしに決定しました。今回は、動物によって異なりますモデル活用し必要があります個別判断し、サイズ、動物型、治療等によって創傷モデルを変化させるために最適化
糖尿病性創傷部に限られた生物発光の定量化を目的として領域 (ROI)、オーバーレイ イメージ (図 4) に描画されます。これら・ ロワは、1 siRNA 投与マウス (図 4) ナンセンス siRNA で処理された (図 4 b) とKeapL-012 注入 (図 4 a)、前後 L-012 注入を含むすべての傷に対して同様に定義されます。生物発光は地域によって光強度の合計の数で除して計算されます。表 1は、図 4に示された計算を示しています。ナンセンス siRNA で処理された糖尿病傷いた 45,775 11,649 発光/cm2、19,405 5,939 発光/cm2 (平均 SD) で起因したKeap1 抑制中。スチューデントの t 検定が大幅減少生物発光を示した (p = 0.042)、 Keap1 siRNA で処理された傷の傷は、siRNA で処理されたナンセンスと比べて酸化による負担を軽減と高い Nrf2 活性 (図との相関で4 D). L-012 siNSと炎症を測定の他の確立された手段で siKeap1相関で可視化した活性酸素の相対的なレベル、我々 は、10 日間を分析確認する傷のティッシュ セクション。H & E の汚れ減少 siKeap1の細胞浸潤を示した-siNSと対照をなして傷を処理-処理されたものを示す減少炎症性形態 (図 5 a)。F4/80、タンパク質マクロファージ マーカー (赤い蛍光性) 明らかに傷組織切片の免疫減少 siNSに比べて処理 siKeap1 マクロファージ傷-傷 (図 5 b) を処理します。これはさらに、L-012 により可視化された ROS レベルが正確かつ他の確立された ROS 測定モデルと相関を示しています。批判的に、このテクニックを適用しなかった必要と必要な H & E と蛍光染色組織切片の動物を犠牲にすること。
図 1: イメージングのための実験の設定です。(A) 糖尿病マウス負傷して確立された切除傷モデルを使用しています。発光前 L 012 吹出し写真の A (B) 基準オーバーレイ。(C) ROS の視覚化 L-012 の腹腔内投与は、以下。B と C の発光スケールこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:体外イメージング システム プログラム イメージと解析の設定。(A) 選択「イメージング ウィザード」取得コントロール パネル (赤矢印)。(B)「生物発光イメージング」は画像モードを選択です。(C)「オープン フィルター」は、計測手法として選択されます。(D) 選択イメージングの件名は、「マウス」と「シリーズ研究の時間」のオプションを選択します。セグメントとセグメント間の遅延時間の合計数を入力します。(E) 選択「シーケンスの取得」イメージングを続行します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:体内ROS イメージングの縦断研究。糖尿病マウスの次の 5 分で L-012 腹腔内注入 1 分間隔 60 分赤のコース上の円が作成されます: 投資収益率。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 生物発光を定量化します。糖尿病傷 (A) (B) L-012 注入前に傷の生物発光のオーバーレイを使って写真は L-012 注射後 siKeap1 で治療の傷に L-012 注入、および (C) の後罪と扱われます。(D) 平均発光の数量で割る罪と siKeap・ ロワの表面積 1 扱われた傷。黄色の円: 投資収益率。データは mean±standard 偏差として表されます。p < 0.05、n = 4。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 免疫組織染色と ROS 相関します。糖尿病の (A) H & E の汚れ傷組織切片を 10 日に示した減らされた細胞浸潤 siKeap1の減らされた炎症性形態の証拠としてNS -si と比較して傷が傷を治療します。(B) F4/80 蛍光 (赤色) はNS -彼らの si と比較して 10 日でセクション処理対応 siKeap1扱われる傷でマクロファージ数の減少傾向を示した。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 投資収益率 | si | 総カウント | Avg のカウント | Stdev カウント | エリア [cm ²] | 総数/面積 | 平均数/面積 |
| 投資収益率 1 | NS | 9.38E + 03 | 1.14E 秒 02 | 3.85E + 01 | 2.48E-01 | 3.78E + 04 | 4.58E + 04 |
| 投資収益率 2 | NS | 4.68E + 03 | 5.37E + 01 | 3.13E + 01 | 2.63E-01 | 1.78E + 04 | |
| 投資収益率 3 | NS | 1.72E + 04 | 2.18E 秒 02 | 1.54E 秒 02 | 2.39E-01 | 7.20E + 04 | |
| 投資収益率 4 | NS | 1.24 E + 04 | 1.68E 秒 02 | 8.41E + 01 | 2.24E-01 | 5.55E + 04 | |
| 投資収益率 5 | Keap1 | 3.21E + 03 | 3.41E + 01 | 2.76E + 01 | 2.84E-01 | 1.13E + 04 | 1.94E + 04 |
| 投資収益率 6 | Keap1 | 2.56E + 03 | 2.88E + 01 | 1.06E + 01 | 2.69E-01 | 9.52E + 03 | |
| 投資収益率 7 | Keap1 | 4.92E + 03 | 6.48E + 01 | 5.03E + 01 | 2.30E-01 | 2.14E + 04 | |
| 投資収益率 8 | Keap1 | 8.34E + 03 | 1.07E 秒 02 | 5.25E + 01 | 2.36E-01 | 3.54E + 04 |
表 1: の生物発光を定量化・ ロワを定義します。生物発光は各 ROI の測定、表面領域に対する標準化します。平均、標準偏差と標準誤差の計算がそれに応じて計算されます。投資収益率 1、罪の生物の繰り返しの 2、3、および 4 を表す傷から ROI 治療糖尿病傷や投資収益率 5、6、7、および 8 を表す・ ロワ生物の繰り返しから siKeap1の治療糖尿病の傷。
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Discussion
ROS を測定するための一般的な手法は、組織抽出または同様に侵襲的な技術を必要とする複雑なプロトコルによって制限されています。近年、酸化ストレスの測定は、革新的な画像診断装置をそれによって時空間評価9,10,11に基づいて報告されています。L-012 は、ルミノール、ルシゲニン、MCLA1,4を基準にして化学発光プローブとしていくつかの利点があります。化合物は、非毒性、簡単にルミノールや同様のプローブ12に比べて多くの強力な発光で、吸収されます。批判的に、L-012 安全に管理できる複数回効果副作用なしの縦断的分析の連続でまたは動物に害を及ぼすモデル6。この戦略は、限られた特別な訓練を必要とする機器に必要なすぐに利用できるほとんどの研究所ので広くアクセス プロトコル.
最適な使用試薬を正しく日付と劣化を避けるために光から保護されていることをお勧めします。ステント留置術によって傷を人間的マウス傷を重要な収縮によってではなく、移行および再上皮化を癒すことができます。縫合糸はステント境界を通して場所で傷のエッジを確保するための方法の 3 分の 2 を配置する必要があります。透明フィルム ドレッシング ゲル アプリケーションが場所に局所治療が残っていることを確認した後でマウスをラップします。結果を混同するかもしれない、マウスで自傷行為の傷を防ぐために苦い味のスプレーはかむことを阻止するための周辺と縫合ノットに適用可能性があります。L-012 PBS の容解性を限られていますが、ソリューションの反復的なピペッティングによる懸濁液を形成します。これらの措置をトラブルシューティングは動物の快適さを維持しながらユーザ間の変動を排除するさまざまな傷、全体で一貫性を確保します。この手法は、動物モデルに液の腹腔内注入に依存しているので、コントロールできない動物に固有いくつかの干渉要因があります。たとえば、局所の血流、その後吸収と L-012 の関心の領域に局在を決定できません。ただし、この変数は独自の内部統制傷のいずれかのように扱うことができる siNSと siKeap1のように動物を使用して軽減できます。
皮膚創傷治癒モデルにおける活性酸素の生体内での研究のための戦略の有用性について報告する.本研究ではKeap1 siRNA 傷の治療しました、Nrf2 の意義の理解を確認する酸化的負荷を低減/抗酸化のKeap1経路処理します。定量分析のためにこの方法ができますが、いくつかの重要な制限があります。L-012 は非常に敏感なのですが、それは ROS 特定されていないと活性窒素種6にも反応するが示されています。さらに分析対象となるプローブと免疫測定法に基づく方法は、強化された特異性と極局在の ROS 関連13を介してこのアプローチを補完します。L ベース 012 発光機構提案 L-012 H2O212との組み合わせでペルオキシダーゼ活性を分子状酸素による酸化が含まれます。これは、ペルオキシダーゼと対話する抗酸化酵素阻害剤を研究するためのこの技術の使用を制限します。詳細な分析やのものに特にスーパーオキシドアニオン以外ロスを定量化する活性窒素種の代謝物が現在の戦略では不可能です。
L-012 の高感度を与え広くロスを検出するため、それは様々 な皮膚創傷治癒や組織の他のモデルに容易に適応できます。我々 は、RTA 408 など糖尿病傷にターゲットを絞った治療法の酸化還元の影響とKeap1 siRNA14,15lipoproteoplex 配信を評価するためのこの手法の有用性を実証しました。Ex vivoアプローチ、集中解剖, organoids 深いコンパートメント内にある ROS を勉強するための同様の戦略を適用することで巨大な将来性があるこのプロトコルの重要な強さを与え。
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Disclosures
我々 は報告書に開示があります。
Acknowledgments
医学 NYU オーランド アリスティバルとユーセフ Zaim Wadghiri のおかげで特別な前臨床イメージング コアに感謝しております。コアは、ローラとアイザック パールミュッターがんセンター サポート助成金 NIH/NCI 5P30CA016087 と NIBIB バイオメディカル技術リソース センター助成金 NIH P41 EB017183、部分的にサポート、共有リソースです。この作業は [許可番号 1-16-エース-08] d. c. と p. r. に NYU 適用研究支援基金に米国糖尿病協会「糖尿病を停止する経路」によって支えられた
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratories | 000642 | |
| 13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm) | Sigma Aldrich | 665581 | |
| 3M Tegaderm Transparent Film Dressings | 3M | 88-1626W | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668027 | |
| Keap1 Stealth siRNA | Thermofisher Scientific | 1299001 | |
| Silencer negative control | Thermofisher Scientific | AM4635 | |
| Opti-MEM Reduced Serum | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| Methyl-cellulose | Sigma Aldrich | 9004-67-5 | |
| L-012 | Wako Chemicals | 120-04891 | |
| IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System | PerkinElmer |
References
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