Summary
Целью данного метода является визуализация легочных артериальных сетей ранних послеродовых и взрослых мышей путем инфляции легких и инъекции радиопрозрачного полимерного соединения через легочную артерию. Обсуждаются также потенциальные заявки на литые ткани.
Abstract
Кровеносные сосуды образуют сложные сети в трехмерном пространстве. Следовательно, трудно визуально оценить, как сосудистые сети взаимодействуют и ведут себя, наблюдая за поверхностью ткани. Этот метод обеспечивает средство визуализации сложной трехмерной сосудистой архитектуры легких.
Для этого в легочную артерию вводится катетер, и сосуд одновременно смывается из крови и химически расширяется, чтобы ограничить сопротивление. Легкие затем надуваются через трахею при стандартном давлении и полимерное соединение вливается в сосудистое ложе со стандартной скоростью потока. После того, как вся артериальная сеть заполнена и разрешена к лечению, сосуды легких могут быть визуализированы непосредственно или изображены на микро-КТ (КТ) сканер.
При успешном исполнении, можно оценить легочной артериальной сети у мышей, начиная от раннего послеродового возраста для взрослых. Кроме того, в то время как попродемонстрировано в легочной артериальной кровати, этот метод может быть применен к любой сосудистой кровати с оптимизированным размещением катетера и конечных точек.
Introduction
Основное внимание в этой технике уделяется визуализации легочной артериальной архитектуры с использованием полимерного соединения у мышей. В то время как обширная работа была проведена на системных сосудистых кроватях, таких как мозг, сердце и почки1,,2,,3,,4,,5,меньше информации о подготовке и заполнении легочной артериальной сети. Цель этого исследования, таким образом, заключается в расширении напредыдущей работе 6,7 ,8ипредоставить подробную письменную и визуальную ссылку, что исследователи могут легко следовать производить изображения высокого разрешения легочной артерии дерева.
Хотя существуют многочисленные методы для маркировки и визуализации сосудов легких, таких как магнитно-резонансная томография, эхокардиография, или КТангиографии 9,10, многие из этих методов не в состоянии адекватно заполнить и / или захватить мелкие сосуды, ограничивая масштабы того, что может быть изучено. Такие методы, как серийная секция и реконструкция обеспечивают высокое разрешение, но время /трудоемкий 11,12,13. Окружающая целостность мягких тканей скомпрометирована в традиционномкоррозионной литье 10,,13,,14,,15,,16. Даже возраст и размер животных становятся факторами при попытке ввести катетер или, разрешение не хватает. Техника инъекций полимера, с другой стороны, заполняет артерии до уровня капилляров и в сочетании с КТ, позволяет беспрецедентноеразрешение 5. Образцы из легких мыши в возрасте послеродового дня 14 были успешноотлиты 8 и обработаны в течение нескольких часов. Они могут быть rescanned на неопределенный срок, или даже отправлены на гистологическую подготовку / электронная микроскопия (EM) без ущерба для существующихмягких тканей 17. Основными ограничениями этого метода являются первоначальная стоимость КТ-оборудования/программного обеспечения, проблемы с точным мониторингом внутрисосудистого давления и невозможность продольно приобретать данные у одного и того же животного.
Эта статья основывается на существующей работе по дальнейшей оптимизации техники инъекций легочной артерии и раздвигать возрастные/размерные границы вплоть до послеродового дня 1 (P1), чтобы дать поразительные результаты. Это наиболее полезно для команд, которые хотят изучать артериальные сосудистые сети. Соответственно, мы предоставляем новые рекомендации по размещению/стабилизации катетера, усилению контроля над скоростью заполнения/объемом и подчеркиваем заметные подводные камни для повышения успеха литья. Полученные слепки могут быть использованы для будущей характеристики и морфологического анализа. Возможно, что еще более важно, это первая визуальная демонстрация, насколько нам известно, что прогулки пользователя через эту сложную процедуру.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными (ACUC) Национального института легких и крови сердца.
1. Подготовка
- Ввишайте мышь интраперитонально с гепарином (1 единица/г массы тела мыши) и дайте ему амбулировать в течение 2 минут.
- Усытворяйте животное в камере CO2.
- Упорядочить мышь в положении на спине на хирургической доске и обеспечить все четыре конечности на доске с лентой. Используйте увеличение для тонкого вскрытия.
2. Разоблачение легких и трахеи
- Спрей брюшной стороне мыши с 70% этанола, чтобы свести к минимуму вмешательства волос.
- Возьмите брюшную кожу с типсами и сделайте небольшой разрез ножницами в пупочной области. Сдвиньте кончики ножниц в фасциальный слой между брюшной мускулатурой и кожей и начните разделять два слоя. Работая rostrally, удаление кожи из живота, грудной клетки и шеи.
- Откройте брюшную мускулатуру ножницами и вырезать боковой с обеих сторон, пока диафрагма подвергается.
- Аккуратно понять процесс xiphoid и слегка поднять грудную клетку максимизации зрения каудальных легких через тонкий, полупрозрачный диафрагмы. Тщательно сделайте небольшой разрез в диафрагме прямо под процессом xiphoid. Легкие будут разрушаться и отходить от диафрагмы. Вскрыть диафрагму от грудной клетки, заботясь, чтобы не ник легких parenchyma.
- Найдите и разъединяете нижняя кава вены (IVC) и пищевод, где они проходят через диафрагму. Используйте марлю, чтобы очистить любое объединение крови в грудной полости, избегая контакта с легкими.
- Возьмите xiphoid еще раз и осторожно поднимите. Отрежьте грудную клетку на двусторонней основе (примерно на средней линии) избегая контакта с легкими. Удалите переднюю грудную клетку полностью, что делает окончательный разрез вдоль кормового угла незадолго до манубриума.
- Используя предварительно заполненный шприц, либерально влажные легкие с фосфатно-буферным солевым раствором (PBS, pH 7.4) для предотвращения высыхания. Продолжайте эту рутину на протяжении всей процедуры.
- Используя миппы, схватите манубриум и аккуратно поднимитесь от тела. Используя ножницы, вырезать 1-2 мм боковой манубрия, разрыв ключицы, и удалить. Это будет подвергать тимуса под.
- Возьмитесь за каждую долей тимуса, разъехать и удалить. Повторите эту процедуру с подумнибулярной железой. Наконец, удалить мышечной ткани наложения трахеи.
ПРИМЕЧАНИЕ: После вскрытия, сердце, восходящая аорта (АА), легочный артериальный ствол (PAT), и трахея должны быть видны. Убедитесь, что первичные артериальные ветви от ствола не разделены или повреждены.
3. Катетеризация ПА и перфузия крови
- Для сборки блока 1, нить 15 см PE-10 трубки на концентратор 30 G иглы и прикрепить к 1 мл шприц предварительно заполнены с 10-4 M нитропрусид натрия (SNP) в PBS. Премьер трубки путем продвижения поршень, пока весь воздух очищается от этого устройства ( Рисунок 1).
ВНИМАНИЕ: SNP является токсичным, если проглотить. Избегайте контакта с кожей и глазами. Вымойте кожу тщательно после обработки. Носите соответствующее средства индивидуальной защиты.- Кроме того, соберите блок 2. Для мышей послеродовой день 7 (P7) и моложе, используйте гемостат, чтобы отделить дополнительные 30 G иглы от его концентратора и нить иглы на открытом конце трубки блока 1 (Рисунок 1).
- Вместо иглы используйте изогнутые острые типсы, чтобы схватить один конец шелка длиной 10 см. Проникнете в вершину сердца, входящая с одной стороны и передавая кончики типсов через мышцы и с другой стороны. Возьмите шелк с другим набором типсов и вытяните примерно 2 см длины до конца и связать. Возьмите оставшиеся 8 см конце шва, дергая сердце caudally, и ленты конец хирургической доске.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это создаст напряжение, дальнейшее разоблачение больших сосудов и привязывая сердце на месте, что позволяет легче размещения катетера в легочной артерии. - Крюк кончики изогнутых тибры под оба АА и PAT. Вытяните 3 см длиной 7-0 шелка обратно через отверстие и создать один бросок свободный шов.
- С помощью ножниц сделать 1-2 мм разрез к вершине сердца, проникая тонкостенный правый желудочек (RV), чтобы обеспечить вставку катетера (Unit 1). Перед вставкой подтвердите, что в системе нет воздуха. Введи загрунтовку труб в правый желудочек и осторожно заранее в полупрозрачный тонкостенный PAT.
- Визуально убедитесь, что катетер не продвинулся ни в левую, ни в правую легочные ветви и не примыкает к ветке легочной артерии. Используя ленту, закрените дисттальную часть трубки к хирургической доске.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для идентификации Р.В., использовать щипы, чтобы ущипнуть правую сторону сердца. В отличие от левого желудочка, относительно тонкая свободная стена Р.В. должна быть легко схвачена. - Для мышей моложе P7, приложите блок 2 к микроманипулятору и ввемите конец иглы блока в PAT, как описано выше, используя манипулятор.
- Визуально убедитесь, что катетер не продвинулся ни в левую, ни в правую легочные ветви и не примыкает к ветке легочной артерии. Используя ленту, закрените дисттальную часть трубки к хирургической доске.
- Аккуратно затяните свободный шов вокруг обоих больших сосудов и разрежьте 8 см длиной шва, созданного в шаге 3.2, чтобы вернуть сердце в естественное положение покоя. Катетер теперь надежно закреплен в PAT.
- Клип левой асикулы сердца, чтобы перфусировать выйти из системы.
- Безопасный шприц, содержащий SNP (Unit 1 или Unit 2, размер зависит) в шприц-насосе и пронизывает раствор со скоростью 0,05 мл/мин, чтобы промыть кровь и максимально расширить сосуды. Кровь/перфусат будет выходить через обрезанную асикулу. Продолжайте перфузию до тех пор, пока перфусировать работает ясно (200 йл во взрослой мыши, меньше для молодых животных).
ПРИМЕЧАНИЕ: При запутывании низкой вязкости PBS/SNP, относительно более высокая скорость вливания была использована в интересах экономии времени. Более вязкое полимерное соединение проливается медленнее, чтобы предотвратить переполняние, разрыв и максимальный контроль над дистальных конечных точек.
4. Трахеостомия и инфляция легких
- Построить блок инфляции легких(рисунок 2).
- Подключите гибкий пластиковый катетер 24 G intravenous (IV) (иголка удалена)/настой бабочки к стоп-стопку, прикрепленный к открытому шприцу 50 мл (без поршеня). Повесьте шприц с кольцевой подохи.
- Добавьте 10% буферного формалина в шприц. Откройте стопкок, позволяя формалину войти в трубы и очистить весь воздух от системы. Закройте стопкок и поднимите шприц до тех пор, пока мениска не будет на 20 см выше трахеи8.
ВНИМАНИЕ: Формалин легковоспламеняющийся, канцерогенный, остро токсичный при приеме внутрь, и вызывает раздражение кожи, серьезное повреждение глаз, сенсибилизацию кожи и мутагенность зародышевых клеток. Избегайте приема пищи и контакта с кожей и глазами. Избегайте вдыхания пара или тумана. Держитесь подальше от источников зажигания. Носите соответствующее средства индивидуальной защиты.
- Поместите два свободных шва уступает крикоидного хряща 2-4 мм друг от друга.
- Используя ножницы, сделайте небольшой разрез в крикотиреоидной связке, превосходящей швы.
- Вставьте IV катетер в отверстие и заранее кончик за два свободных швов.
- Затяните швы вокруг трахеи и откройте стопкок. Разрешить формалин, чтобы войти в легкие под действием силы тяжести и ждать 5 минут для легких, чтобы полностью надуть. Если легкие придерживаются грудной клетки во время инфляции, схватить внешнюю сторону грудной клетки с тупым наконечником типсов и двигаться во всех направлениях, чтобы помочь в освобождении долей. Не ввесяте напрямую с легкими.
- Через 5 минут, обратно IV катетер за первый шов и ligate. Повторите для второго шва. Легкие теперь надуваются в закрытом, под давлением состоянии.
5. Кастинг сосудов
- В трубке 1,5 мл, подготовить 1 мл 8:1:1 раствор8 полимера: разъедать: лечение агента и осторожно инвертировать несколько раз, чтобы обеспечить хорошее смешивание.
- Снимите поршень со шприца 1 см, накройте противоположный конец пальцем в перчатках и вылейте полимерный состав в шприц. Тщательно перезагрузить поршень, инвертировать и продвинуть поршень, чтобы удалить весь воздух и сформировать мениск на кончике шприца.
- Удалите шприц SNP/PBS из центра иглы и капайте дополнительный PBS в концентратор, чтобы создать мениска. Тщательно проверьте концентратор на наличие захваченного воздуха, выбить при необходимости и реформировать мениск. Присоединяйтесь к концентратору к шприцу, наполненному полимерным соединением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Создание мениска на обоих концах значительно снижает вероятность входа воздуха в систему. - Прикрепите полимерное соединение заполненного шприца к шприц-насосу и настаивайте на 0,02 мл/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для небольших легких, более медленный темп может быть полезным для предотвращения переполнения, но, не является существенным. - Мониторинг соединения, как он свободно движется вниз PE трубки и обратите внимание на объем шприца, как он входит в PAT. Продолжить заполнение до тех пор, пока все доли заполнены полностью до уровня капилляров и остановить шприц насоса. Проверьте объем шприца еще раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: После нескольких запусков предполагаемый объем может быть использован для оценки приблизительной конечной точки (35 йл для взрослой мыши и 5 йл для щенка P1). После того, как насос остановлен, остаточное давление в системе будет продолжать толкать полимерного соединения в легочных артериях. Все легочные доли должны заполняться с аналогичной скоростью. - Обложка легких с волоконно-оптической очистки протрите, либерально применять PBS, и позволить туше сидеть спокойно в течение 30-40 минут при комнатной температуре. В течение этого периода полимерный состав вылечит и затвердеет.
- Удалите катетер, разорвать руки / нижнюю половину мыши, и поместите голову / грудную клетку в 50 мл конической заполнены 10% буферных формалин ночь.
- После фиксации, схватить трахею и осторожно отделить сердце / легкий блок от оставшейся грудной клетки и грудной клетки. Поместите блок сердца/легких в формалин, заполненный сцинтилляционным флаконом. Отбросьте все остальное.
6. Альтернативные сосудистые койки для литья (таблица 1)
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая целевая сосудистая кровать может потребовать различных размещений катетера, инфузионных ставок и оптимального времени заполнения. Таким образом, несколько животных будет необходимо бросить несколько органов.
- Для системных сосудистых коек выше или ниже диафрагмы следуйте шагам 1.1-2.5, как указано выше. Смотрите дополнительные заметки на портале системы и диафрагмы (Таблица 1).
- Возьмитесь за процесс кифоида с помощью гемостата и вырежьте грудную клетку на двусторонней основе (примерно в средней линии) непосредственно перед внутренними грудными артериями.
- Сложите еще связанную грудную клетку над такой, что она опирается на шею/голову животного, полностью обнажая грудную полость.
- Следуйте шаг 3.1 выше, а затем удалить легкие. После того, как торакальная аорта (TA) видна, зацепить кончики изогнутых типсов под ним, 10 мм превосходит диафрагму. Возьмитесь за 3 см длиной 7-0 шелка, отоймите отверстие под TA и создайте одноразовый свободный шов. Повторите эту процедуру на 8 мм выше диафрагмы.
- Для структур, превосходящих диафрагму, используйте пружинные ножницы, чтобы создать небольшое отверстие (30% от общей окружности) на брюшной части TA, на 2 мм ниже свободных швов, помещенных в шаг 6.4.
- Для структур, уступаемых диафрагме, вместо этого создайте небольшое отверстие размером 2 мм, превосходяе свободные швы.
- В зависимости от размера животного, ввимите блок 1 или 2 в сосуд, выйти за пределы свободных швов и аккуратно завять сосуд.
- Следуйте шагу 3.7, установив шприц-насос со скоростью 1,0 мл/мин и засовыв минимум 5 мл. Perfusate выйдет через IVC.
- Следуйте шагам 5.1 - 5.4, регулируя скорость вливания до 0,05 мл/мин, визуально отслеживая целевую ткань в режиме реального времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем инфузии будет органом и возрастом животных специфическим. Объем может быть дополнительно ограничен лигатированием артериальных ветвей, ведущих к нецелесотевой сосудистой кровати (т.е. мозгу, печени, почкам, кишечнику). - Следуйте 5.6 затем удалить ткани-мишени и поместить в формалин.
7. Пример монтажа, сканирования и реконструкции микро-КТ
- Используя парафиновую пленку, создайте плоскую поверхность на сканирующей кровати и центр мокрого образца на этой поверхности(рисунок 3A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если артефакт движения обнаружен, образец может потребовать дальнейшей стабилизации. - Слегка палатка / крышка образца с дополнительной парафиновой пленкой для предотвращения обезвоживания. Будьте особенно заботы, чтобы не отдохнуть парафиновой пленки на образец вызывает деформацию ткани (Рисунок 3B).
- Сканирование образца с помощью параметров, изложенных в таблице 2, и стандартизация этих параметров в рамках данного эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это зависит от эксперимента/конечной точки. Стандартизируйте выбранные параметры для простоты сравнения между образцами. - Передача реконструированных сканирований для постобработки и анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешный актерский состав будет выставлен равномерной начинкой всей легочной артериальной сети. Мы демонстрируем это у мышей C57Bl/6J в возрасте: послеродовой день P90 (Рисунок 4A), P30 (Рисунок 4B), P7 (Рисунок 4C), и P1 (Рисунок 4D). Контролируя скорость потока и визуально отслеживая заполнение в режиме реального времени, были достигнуты надежные конечные точки самой дистальнойсосудоуполножения (рисунок 5A).
Общие проблемы включают повреждение легких, неполное заполнение, недозаполнение, или переполнение, засорение катетера, и размер животного.
Если есть повреждение легких / дыхательных путей, небольшие утечки будут препятствовать легких от проведения давления(рисунок 5B,C). При отсутствии полной инфляции становится трудно проводить точные количественные и пространственные сопоставления по выборке. Чтобы свести к минимуму риск для легких parenchyma, избежать резки слишком близко к легким при удалении грудной клетки и держать легкие влажными с PBS на протяжении всей процедуры, чтобы избежать обезвоживания и присоединения к окружающим структурам. Если доля прилипает к грудной клетке во время инфляции, осторожно схватить внешнюю сторону грудной клетки (вдали от легких) с типсами и переместить его в направлении, чтобы освободить доли. Кроме того, тупой инструмент, такой как шпатель, с гладким краем может быть использован для подъема или отодвинуть надутое легкое от грудной клетки. При надувании легких придерживайтесь предлагаемых параметров давления и избегайте чрезмерной инфляции, так как это может привести к разрыву дыхательных путей. Наконец, не удаляйте легкие из грудной полости до завершения постфиксации. Трахея, легкие и сердце должны быть удалены ан блок из оставшихся частей грудной полости.
Патчи(рисунок 5D)или неполная(рисунок 5E)заполнение может возникнуть из "воздушного замка", в котором воздух вводится в сосудистую систему через катетер, блокируя вниз по течению поток соединения. Чтобы свести к минимуму вероятность шлюза, бдительно очистить воздух от кончика катетера до вставки (шаг 3.4) и во время перехода шприца от SNP/PBS к полимерной соединения. Если заполнение остается неоднородным или неполным, это может быть признаком повышенной сосудистой устойчивости в результате очагового/ длинного стеноза сегмента или тортуозности. Сгустки крови могут также привести к неполной заполнения и легко избежать с помощью гепарина до процедуры.
Неправильный объем инъекций приведет к недозаполнения или переполнения. Недозаполнение происходит, когда слишком мало соединения вводится в сосуды(рисунок 5F). Кроме того, переполнирование, или введение слишком много полимерного соединения слишком быстро может привести либо артериальный разрыв (рисунок 5G) или, чаще всего, венозный транзит (Рисунок 5H). Обе проблемы могут быть решены с помощью шприц насоса. Следователям следует внимательно придерживаться предлагаемых ограничений по ставке и объему или устанавливать собственные ставки на основе их конкретной модели и оптимизации. Мониторинг перфузии полимерного соединения в режиме реального времени при увеличении имеет решающее значение, и заполнение небольших артериол/ капилляров должно использоваться в качестве конечной точки.
Продвижение катетера слишком далеко вниз по стволу легких может привести к кончик клин в одну легочную артерию ветви и создать дисбаланс в потоке. В результате, одна сторона заполняет быстрее, чем другая(рисунок 5I), что часто приводит к переполнению в одном легком и недозаполнения в другом. Хотя катетер засорения является наиболее вероятной причиной в этом сценарии, "воздушный замок" и отсутствие гепарина также может быть фактором.
Наконец, мелкие животные представляют свой собственный набор дополнительных препятствий. Молодые животные требуют устойчивых рук, а мелкие ошибки менее прощают. Высококачественные приборы, специально предназначенные для микрохирургии, становятся более важными в ранних постнатальных точках времени. Использование микроманипулятора очень помогает не только в размещении, но и в предотвращении вывиха катетера. Важно также использовать шприц насос на мелких животных, чтобы точно контролировать и управлять конечных точек.
Хотя специально показано для легочной сосудов, эта процедура может быть легко применена к системной целевой сосудистых кроватей, а также(таблица 1). В дополнение к перечисленным выше проблемам, выбор правильной точки входа имеет решающее значение. Кастинг через торакальные аорты дает отличные результаты для большинства сосудистых коек. Следует отметить, однако, что вставка катетера как проксимальная в целевой участок, насколько это возможно, и лигатирование нецелесочных сосудов помогает в контроле потока и громкости. Эти уточнения в сочетании с соответствующим прямым мониторингом дистальных сосудистых конечныхточек (рисунок 6A-F)-Fи стандартными показателями инфузии оптимизируют заполнение. Многие примеры таких методов литья существуют в литературе и слишком многочисленны для полных ссылок. Тем не менее, дополнительные детали могут быть найдены в органе конкретноготекста,таких какэти 4,5,,7,,18,,19,,20,,21.
После литья, образцы могут быть обработаны для сканирования qCT(рисунок 7A,B). Для постобработки коммерческий пакет программного обеспечения (см. таблицу материалов)произвел 3D-рендеринг объема легочного сосудистого дерева, представленный как изображения по-прежнему(рисунок 7C),или фильмы. Дальнейшие статистические анализы, исследуя сосудистые характеристики, такие как длина сегмента и число, тортуочность, порядок (поколение или ранг), объем и длина аркады также могут быть выполнены. В дополнение к сканированию, литые образцы также могут быть очищены для получения грубых изображений или обработаны и вырезаны для гистологического анализа8.
Рисунок 1: Установка катетера и иглы. Шприцы показаны с прикрепленными трубками и иглами (Unit1 и Unit2). Вставка: крупным планом иглы и трубки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Установка инфляции легких. Кольцо стенд, зажим, шприц заполнен формалин, и трубки с катетером прилагается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Micro-CT подготовки образца предварительного сканирования. () Здесь образец был сосредоточен на парафиновой пленкой базы, (B) Здесь образец был по центру и покрыты на базе парафильма. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Сосудистые легкие на различных стадиях развития от 3 месяцев до 1 дня. Дорсальный вид легких, (A) P90, (B) P30, (C) P7, и ( D )P1Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Примеры идеальной начинки и распространенных ошибок во время вливания полимерного соединения. (A) Когда была достигнута конечная точка заполнения, наблюдалась надежная и тонкая сосудистая сеть. (B) Полностью надутые формалин проникнуты легкие представлены белой пунктирнойлинии,( C ) Недоинфляции / спущенные легкие показаны. Это наблюдалось из-за скомпрометированных легочных дыхательных путей. Исходное надутое положение представлено белой пунктирной линией, а спущенное положение представлено черной пунктирнойлинией, (D)патчи заполнения: сосуды части доли остается незаполненным в то время как другие области были полностью заполнены, (E) Неполная начинка: полимерное соединение не удалось проникнуть целые участкилегких,( F ) Недозаполнение: полимерное соединение не удалось заполнить дистальной сосудов, (G) Разрыв: стрелка указывает на полимерное соединение экструдированных из сосудов, ( H )Венознойзаполнения: обратите внимание на стрелку, указывающую на артериальные сегменты полностью заполнены и расширения в венозной системы. Вены и вены были значительно большего калибра, (I) Катетер клин: Здесь катетер был шунтирован в одну артерию предотвращения сосудов правой доли от заполнения полностью в то время как левая доля была переполнена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6. Сосудистое литье и конечные точки в дополнительных органах. (A) Почки: пунктуат появление полимерного соединения в glomerulus при условии конечной точки. (B) Печень: обратите внимание на мелкие сосуды, видимые по краям органа. (C)желудок: мелкие сосуды были видны и полностью заполнены. (D)Большой кишечник: Малые сосуды легко идентифицировать и заполнить. (E) Диафрагма: мышцы здесь тонкие и полупрозрачные с небольшими заполненными сосудами очевидно. (F). Мозг: мелкие сосуды были видны в коре головного мозга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7. КТ-изображения и 3D объем рендеринга полимерного соединения заполнены легких. (A) Один серый масштаб реконструированного ломтика легких, (B) Это была максимальная проекция интенсивности КТ производится из полимерных заполненных легких, (C) 3D объем рендеринга сосудистой аркады был создан с использованием коммерчески доступного программного обеспечения (см. Таблица материалов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Целевая артериальная сосудистая кровать | Размещение катетера | Направление инфузии | Скорость инфузии | Заметки |
| Мозга | Торакальная аорта, указывающая черепно | Ретроградный в сонной артерии | 0,05 мл/мин | Cannulate грудной аорты, флип мыши в положение склонны, открытая кожа головы, и визуально контролировать прогресс полимера через череп. |
| Диафрагмы | Левый Вентрический | Антероград во внутренние грудные, френические и межреберные | 0,05 мл/мин | Откройте окно в сторону грудной клетки, оставляя большую часть грудной клетки и диафрагмы нетронутыми. Cannulate левой желудочковой, клип правого атриума, и контролировать прогресс от хвостовой стороны диафрагмы. |
| Мускулатура верхних конечностей | Торакальная аорта, указывающая черепно | Ретроградный в брахиоцефалический и левый субклавский | 0,02 мл/мин | Для оптимизации потока конечностей, связать сонных артерий и удалить кожу конечностей, чтобы визуальный мониторинг полимерного транзита в мускулатуру конечностей. |
| Почек | Торакальная аорта, указывающая caudally | Антероград в почечные артерии | 0,05 мл/мин | Внутренняя сосудосувляемая заполняется вслепую. Чтобы избежать венозного транзита, прекратите инъекции, когда полимер виден в равномерном проколе через почку. |
| Система порталов | Портал вены | Антероград в порталную систему | 0,02 мл/мин | Аккуратно сложите печень, чтобы разоблачить портал вены. |
| Печеночной | Торакальная аорта, указывающая caudally | Антероград в печеночным артериям | 0,05 мл/мин | Свяжите портал вены до инфузии, чтобы избежать венозного транзита из кишечника, впадающих в печень. |
| желудок/ кишечник | Торакальная аорта, указывающая caudally | Антероград в целиакию, превосходный мезентерический и / или нижней мезентерической | 0,05 мл/мин | Некоторые области кишечника поставляются несколькими артериями и могут заполняться в разное время. Чтобы избежать венозного транзита, свяжите артерии, не необходимые для областей, представляющих интерес, и визуально контролировать прогресс полимера. |
| Внутрибрюшные жировые прокладки | Торакальная аорта, указывающая caudally | Антероград, но сосуд зависит от жирной площадки изучается | 0,05 мл/мин | Толстые прокладки поставляются несколькими артериями и могут заполняться в разное время. Чтобы избежать венозного транзита, свяжите артерии, не необходимые для точной области интереса и визуально контролировать прогресс полимера. |
| Мускулатура нижних конечностей | Инфраренальная аорта, указывающая caudally | Антероград в бедренные артерии | 0,02 мл/мин | Удалите кожу конечностей, чтобы позволить визуальный мониторинг полимерного транзита в мускулатуру конечностей. |
Таблица 1. Кастинг альтернативных сосудистых кроватей.
| Настройки КТ | |
| Kvp | 90 |
| Целевой материал | Вольфрама |
| Мощность | 8w |
| Фильтрации | Cu 0,06 мм и Al 0,5 мм |
| Проекционные номера | 6424 |
| Размер детектора | Плоская панель CMOS - 2944 x 2352 пикселей |
| Поле зрения (FOV) | 36 мм |
| Размер Voxel | 72 мкм |
| Пространственное разрешение | voxel размер x 1.5 |
| Время приобретения | 14 мин. |
| Реконструкции | FBP и коммерческий алгоритм |
| Биннинг | 1x1 |
Таблица 2. Параметры сканирования КТТ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Выполненный должным образом, этот метод дает поразительные изображения легочных артериальных сетей, что позволяет для сравнения и экспериментов в моделях грызунов. Несколько важных шагов на этом пути обеспечивают успех. Во-первых, исследователи должны гепаринизировать животное на подготовительной стадии, чтобы предотвратить образование тромбов в легочной сосудах и камерах сердца. Это позволяет осуществлять полный артериальный транзит полимерного соединения. Во-вторых, при проколе диафрагмы и удалении грудной клетки, заботиться, чтобы защитить легкие от непреднамеренных повреждений, порезов или травм. Любая утечка в дыхательных путей предотвратит полную инфляцию и сделает сравнение проб неточным. В-третьих, привязывание сердца к вершине помогает размещению катетера. В-четвертых, использование сильного сосудорасширяемого, такого как SNP, поможет как в удалении крови, так и в полном заполнении артериол икапилляров 5,,8. В-пятых, при размещении катетера в ПАТ, позаботьтесь, чтобы не похоронить кончик в бифуркацию. Это приведет к дисбалансу в потоке, шунтирование полимерного соединения в левую или правую сторону, что дает неравный градиент давления. В-шестых, использование шприц-насоса позволит пользователю контролировать скорость и titer громкость как для мыши деформации и возраста. Наконец, оставьте сердце / легкие прилагается к оставшейся части грудной полости, исправить на ночь, и удалить на следующий день. Легкие будут хорошо исправлены и потенциал для дефляции из-за случайных ники во время разделения будет сведена к минимуму.
Хотя эта методология достигает желаемых результатов, альтернативные методы могут быть полезны для некоторых пользователей. Для оказания помощи в размещении катетера может быть использован микроманипулятор. Мы выбрали версию с небольшим профилем и магнитной базой, чтобы свести к минимуму посягательство в и без того ограниченной рабочей области, обеспечивая при этом стабильную основу (при использовании магнитной базы убедитесь, что место стальной пластины под рабочее пространство, чтобы магнит заниматься). Это позволяет пользователю точно поместить кончик катетера в PAT под углом, который следует естественной траектории артерии. Кроме того, катетер является безопасным и с меньшим риском вытеснения. Другим вариантом является использование трубят катетер отзыв8. Хотя это и не тривиально для создания, трубят катетер является гораздо более безопасным и менее склонны случайно выскользнуть из PAT. Изменение соотношения полимера: разбавляющее изменяет вязкость и легкость, с которой мелкие сосуды заполнены. В зависимости от целевой васкулатуры и экспериментальных конечных точек это может быть ценным соображением. Эвтаназия через CO2 может вызвать легочное кровоизлияние в небольшой процент животных и штамм зависит22. Рассмотрим альтернативный протокол эвтаназии, если это повлияет на экспериментальные конечные точки. При надувании легких, использование формалина помогает фиксации органа на месте при данном давлении. Физиологически нейтральный буфер может быть заменен, если периферические сосуды должны быть заполнены в нефиксированном состоянии. Если скорость инфузии и контроль имеют меньшее значение для данного эксперимента, перфузия вручную также возможна. Инъекция руки требует практики и мониторинга в режиме реального времени под увеличением, чтобы избежать переполнения или разрывасосуда 8. Наконец, ткани горе / условия, параметры сканирования, и минимальные после обработки мы использовали для этой бумаги должны служить лишь отправной точкой. Различные сканеры, ткани, экспериментальные конечные точки / потребности пользователей могут потребовать альтернативных параметров.
Хотя сосудистые изображения, полученные из этой техники, впечатляют, существуют ограничения. В первую очередь, вышеуказанный метод является неоптимальным для измерения сосудистого калибра из-за неспособности контролировать и контролировать внутрисосудистое давление во время инфузии. Другие группы сумели несколько решить эти проблемы давления в системной сосудорассудии путеммониторинга давления вождения 4,23, однако, такие опасения еще больше усиливаются на легочной стороне из-за относительно тонких стенок легочной артерии, которые легко разбавляются снебольшими изменениями давления 24 и неспособность точно измерить и статично контролировать легочное внутрисосудикулярное давление.,
Вторым ограничением этого метода является то, что он остается посмертным, одновременным экспериментом, ограничивающим его полезность в исследованиях, которые требуют действительно физиологических условий или курса времени. Другие, живые животные меры, такие как КТ легочной ангиографии (CTPA) или контрастного повышения кТ (CE-CT) предлагают возможность функциональных и морфологических мер. Повторные сканирование / продольные исследования, а также измерения в различных точках в сердечном / легочном цикле,могут быть изучены 10,,25,26,27,28. Эти методы могут быть надежно использованы, в дополнение к эхокардиографии, для измерения артериального калибра. Однако как КТПА, так и эхокардиография в настоящее время ограничиваются оценкой проксимальной сосудоубийки. Для эхокардиограммы, оценка ограничивается легочного ствола в то время как CTPA позволяет адекватного расчета калибра ветви легочной артерии потенциально 1-2 заказов дальше, но разрешение ограничено, заслоняя дистальные части сосудов7. Радиационная доза также озабоченность, которая должна быть тщательно проверена при использовании КТ особенно в многосканированных продольныхисследований 29,30. Для любого из этих приложений, оборудование, время сканирования и анализа программного обеспечения может быть дорогостоящим и требуют специальной подготовки персонала. Основные объекты визуализации животных в некоторых учреждениях могут облегчить это бремя.
В качестве альтернативы этому соединению, некоторые группы используют традиционные методы литья коррозии сопровождается удалениеммягких тканей 31,32. Эти методы дают результаты, аналогичные этому полимерного соединения, но конечный продукт является хрупким, что приводит к потенциальномуартефакту 15. Кроме того, удаление мягких тканей устраняет потенциал для будущей гистологии33. Другой вариант заключается в том, чтобы оставить мягкие ткани нетронутыми и выполнить последующий шаг, в котором мягкая ткань "очищается", что делаетобразец практически прозрачным 34,35. Очистка тканей дает пользователю некоторую способность видеть глубже в образце, но, в целом, остается ниже КТ, поскольку он не может обеспечить ту же 3D визуализацию. Серийный гистологический раздел и массивная томография являются методами, которые предлагают исключительно высокое разрешение. Хотя этот метод открывает двери для захватывающих новых возможностей, рабочая нагрузка экспоненциально выше и не особенно благоприятной длябольших когорт 11,12. 3D рентгеновская гистология является неразрушаемым подходом, который чет как к КТ, так и к традиционной гистологии или даже EM36,,37,,38. Он принимает более высокий уровень зрения патологии, используя КТ для глобального выявления и точно разведчик регионов, представляющих интерес, которые затем следуют с обычнойгистологии 39. Замена контрастных агентов более низкого разрешения (или в некоторых случаях без контраста) с полимерным соединением в сосуды может служить для повышения обоих методов, когда это возможно. Другой неразрушательный подход, который является вычислительно интенсивным еще, потенциально усиливает контраст, является фазово-поиск изображенияCT 40,41. Этот метод может быть ценным при использовании на шумных данных, где контраст слаб или не возможен42. Полимер соединения, используемые в этой технике, однако, не страдает от этого ограничения. Тем не менее, фазовое извлечение может быть полезно там, где полимерное соединение, возможно, разбавлено, например, в дистальной сосудоупысяк43. Наконец, стереология была стандартом в легких количественного структурного анализа в течение44 лет. Он использует случайные, систематические выборки на поперечных сечениях тканей, чтобы сделать 3-D выводы, предполагая, что выбранные образцы являются достаточно репрезентативными. Хотя мощный инструмент, он имеет потенциал, чтобы привести к ошибкам и предвзятости. Сочетание КТ изображения со стереологией, однако, имеет большиеперспективы 45.
Изложенный метод является относительно простым и с обучением успеха в 90% достижимо. После освоения, это позволяет для полного и надежного литья сосудов легких. В фиксатор, ткани и полимер остаются стабильными на неопределенный срок для будущих сканирований, потенциальнаягистология, или EM 46,47. Мы показали, что этот метод может быть использован у животных в возрасте до P1 через взрослую жизнь и считаем, эмбрионального литья, через легочную артерию, находится в пределах досягаемости. Следует отметить, что этот метод может быть применен практически к любой другой сосудистой кровати, просто изменив точку входа катетера и определив соответствующие конечные точки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать
Acknowledgments
Это исследование было частично поддержано интрамуральной исследовательской программой NHLBI (DIR HL-006247). Мы хотели бы поблагодарить NIH Mouse Imaging Facility за рекомендации по приобретению и анализу изображений.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1cc syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| 20ml Glass Scintillation Vials | Fisher | 03-340-25P | |
| 30G Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| 50mL conical tubes | Cornin | 352098 | For sample Storage and scanning |
| 60cc syringe | Becton Dickinson | 309653 | |
| 7-0 silk suture | Teleflex | 103-S | |
| Analyze 12.0 Software | AnalyzeDirect Inc. | N/A | Primary Software |
| Amira 6.7 Software | Thermo Scientific | N/A | Alternative Sofware |
| CeramaCut Scissors 9cm | Fine Science tools | 14958-09 | |
| Ceramic Coated Curved Forceps | Fine Science tools | 11272-50 | |
| CO2 Tank | Robert's Oxygen Co. | n/a | |
| Dual syringe pump | Cole Parmer | EW-74900-10 | |
| Dumont Mini-Forceps | Fine Science tools | 11200-14 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Formalin | Sigma - Life Sciences | HT501128 | |
| Gauze | Covidien | 441215 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13013-14 | |
| Heparin (1000USP Units/ml) | Hospira | NDC 0409-2720-01 | |
| Horos Software | Horos Project | N/A | Alternative Sofware |
| induction chamber | n/a | n/a | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | fiber optic cleaning wipe |
| Labelling Tape | Fisher | 15966 | |
| Magnetic Base | Kanetec | N/A | |
| Micro-CT system | PerkinElmer | Quantum GX | |
| Microfil (Polymer Compound) | Flowech Inc. | Kit B - MV-122 | 8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent |
| Micromanipulator | Stoelting | 56131 | |
| Monoject 1/2 ml Insulin Syringe | Covidien | 1188528012 | |
| Octagon Forceps Straight Teeth | Fine Science tools | 11042-08 | |
| Parafilm | Bemis company, Inc. | #PM999 | |
| PE-10 tubing | Instech | BTPE-10 | |
| Phospahte buffered Saline | BioRad | #161-0780 | |
| Ring Stand | Fisher | S13747 | Height 24in. |
| Sodium Nitroprusside | sigma | 71778-25G | |
| Steel Plate | N/A | N/A | 16 x 16 in. area, 1/16 in thick |
| Straight Spring Scissors | Fine Science tools | 15000-08 | |
| SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter | Santa Cruz Biotechnology | 360103 | |
| Surgical Board | Fisher | 12-587-20 | This is a converted slide holder |
| Universal 3-prong clamp | Fisher | S24280 | |
| Winged Inf. Set 25X3/4, 12" Tubing | Nipro | PR25G19 | |
| Zeiss Stemi-508 Dissection Scope | Zeiss | n/a |
References
- Vasquez, S. X., et al. Optimization of microCT imaging and blood vessel diameter quantitation of preclinical specimen vasculature with radiopaque polymer injection medium. PLoS One. 6 (4), 19099 (2011).
- Hong, S. H., et al. Development of barium-based low viscosity contrast agents for micro CT vascular casting: Application to 3D visualization of the adult mouse cerebrovasculature. Journal of Neuroscience Research. 98 (2), 312-324 (2019).
- Perrien, D. S., et al. Novel methods for microCT-based analyses of vasculature in the renal cortex reveal a loss of perfusable arterioles and glomeruli in eNOS-/- mice. BMC Nephrology. 17, 24 (2016).
- Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3740 (2012).
- Zhang, H., Faber, J. E. De-novo collateral formation following acute myocardial infarction: Dependence on CCR2(+) bone marrow cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 87, 4-16 (2015).
- Kim, B. G., et al. CXCL12-CXCR4 signalling plays an essential role in proper patterning of aortic arch and pulmonary arteries. Cardiovascular Research. 113 (13), 1677-1687 (2017).
- Counter, W. B., Wang, I. Q., Farncombe, T. H., Labiris, N. R. Airway and pulmonary vascular measurements using contrast-enhanced micro-CT in rodents. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (12), 831-843 (2013).
- Phillips, M. R., et al. A method for evaluating the murine pulmonary vasculature using micro-computed tomography. Journal of Surgical Research. 207, 115-122 (2017).
- Schuster, D. P., Kovacs, A., Garbow, J., Piwnica-Worms, D. Recent advances in imaging the lungs of intact small animals. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 30 (2), 129-138 (2004).
- Samarage, C. R., et al. Technical Note: Contrast free angiography of the pulmonary vasculature in live mice using a laboratory x-ray source. Medical Physics. 43 (11), 6017 (2016).
- Grothausmann, R., Knudsen, L., Ochs, M., Muhlfeld, C. Digital 3D reconstructions using histological serial sections of lung tissue including the alveolar capillary network. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (2), 243-257 (2017).
- Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68 (2014).
- Bussolati, G., Marchio, C., Volante, M. Tissue arrays as fiducial markers for section alignment in 3-D reconstruction technology. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 9 (2), 438-445 (2005).
- Preissner, M., et al. Application of a novel in vivo imaging approach to measure pulmonary vascular responses in mice. Physiological Reports. 6 (19), 13875 (2018).
- Junaid, T. O., Bradley, R. S., Lewis, R. M., Aplin, J. D., Johnstone, E. D. Whole organ vascular casting and microCT examination of the human placental vascular tree reveals novel alterations associated with pregnancy disease. Scientific Reports. 7 (1), 4144 (2017).
- Bolender, R. P., Hyde, D. M., Dehoff, R. T. Lung morphometry: a new generation of tools and experiments for organ, tissue, cell, and molecular biology. American Journal of Physiology. 265 (6), Pt 1 521-548 (1993).
- Savai, R., et al. Evaluation of angiogenesis using micro-computed tomography in a xenograft mouse model of lung cancer. Neoplasia. 11 (1), 48-56 (2009).
- Ehling, J., et al. Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization. American Journal of Pathology. 184 (2), 431-441 (2014).
- Sueyoshi, R., Ralls, M. W., Teitelbaum, D. H. Glucagon-like peptide 2 increases efficacy of distraction enterogenesis. Journal of Surgical Research. 184 (1), 365-373 (2013).
- Zhang, H., Jin, B., Faber, J. E. Mouse models of Alzheimer's disease cause rarefaction of pial collaterals and increased severity of ischemic stroke. Angiogenesis. 22 (2), 263-279 (2019).
- Faight, E. M., et al. MicroCT analysis of vascular morphometry: a comparison of right lung lobes in the SUGEN/hypoxic rat model of pulmonary arterial hypertension. Pulmonary Circulation. 7 (2), 522-530 (2017).
- Fisher, S., Burgess, W. L., Hines, K. D., Mason, G. L., Owiny, J. R. Interstrain Differences in CO2-Induced Pulmonary Hemorrhage in Mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (6), 811-815 (2016).
- Munce, N. R., et al. Intravascular and extravascular microvessel formation in chronic total occlusions a micro-CT imaging study. JACC Cardiovascular Imaging. 3 (8), 797-805 (2010).
- Shifren, A., Durmowicz, A. G., Knutsen, R. H., Faury, G., Mecham, R. P. Elastin insufficiency predisposes to elevated pulmonary circulatory pressures through changes in elastic artery structure. Journal of Applied Physiology. 105 (5), 1610-1619 (2008).
- Sonobe, T., et al. Imaging of the closed-chest mouse pulmonary circulation using synchrotron radiation microangiography. Journal of Applied Physiology (1985). 111 (1), 75-80 (2011).
- Ritman, E. L. Micro-computed tomography of the lungs and pulmonary-vascular system. Proceedings of the American Thoracic Society. 2 (6), 477-480 (2005).
- Dinkel, J., et al. Intrinsic gating for small-animal computed tomography: a robust ECG-less paradigm for deriving cardiac phase information and functional imaging. Circulation: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 235-243 (2008).
- Ashton, J. R., West, J. L., Badea, C. T. In vivo small animal micro-CT using nanoparticle contrast agents. Frontiers in Pharmacology. 6, 256 (2015).
- Ford, N. L., Thornton, M. M., Holdsworth, D. W. Fundamental image quality limits for microcomputed tomography in small animals. Medical Physics. 30 (11), 2869-2877 (2003).
- Boone, J. M., Velazquez, O., Cherry, S. R. Small-animal X-ray dose from micro-CT. Molecular Imaging. 3 (3), 149-158 (2004).
- Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts--standard method for studying microvessels. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 48 (3), 257-261 (2007).
- Polguj, M., et al. Quality and quantity comparison study of corrosion casts of bovine testis made using two synthetic kits: Plastogen G and Batson no 17. Folia Morphologica (Warsz). 78 (3), 487-493 (2019).
- Verli, F. D., Rossi-Schneider, T. R., Schneider, F. L., Yurgel, L. S., de Souza, M. A. Vascular corrosion casting technique steps. Scanning. 29 (3), 128-132 (2007).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Albers, J., Markus, M. A., Alves, F., Dullin, C. X-ray based virtual histology allows guided sectioning of heavy ion stained murine lungs for histological analysis. Scientific Reports. 8 (1), 7712 (2018).
- Katsamenis, O. L., et al. X-ray Micro-Computed Tomography for Nondestructive Three-Dimensional (3D) X-ray Histology. American Journal of Pathology. 189 (8), 1608-1620 (2019).
- Morales, A. G., et al. Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens. Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).
- Wen, H., et al. Correlative Detection of Isolated Single and Multi-Cellular Calcifications in the Internal Elastic Lamina of Human Coronary Artery Samples. Scientific Reports. 8 (1), 10978 (2018).
- Zamir, A., et al. Robust phase retrieval for high resolution edge illumination x-ray phase-contrast computed tomography in non-ideal environments. Scientific Reports. 6, 31197 (2016).
- Yu, B., et al. Evaluation of phase retrieval approaches in magnified X-ray phase nano computerized tomography applied to bone tissue. Optics Express. 26 (9), 11110-11124 (2018).
- Bidola, P., et al. Application of sensitive, high-resolution imaging at a commercial lab-based X-ray micro-CT system using propagation-based phase retrieval. Journal of Microscopy. 266 (2), 211-220 (2017).
- Norvik, C., et al. Synchrotron-based phase-contrast micro-CT as a tool for understanding pulmonary vascular pathobiology and the 3-D microanatomy of alveolar capillary dysplasia. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (1), 65-75 (2020).
- Weibel, E. R. Lung morphometry: the link between structure and function. Cell and Tissue Research. 367 (3), 413-426 (2017).
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Sarhaddi, D., et al. Validation of Histologic Bone Analysis Following Microfil Vessel Perfusion. Journal of Histotechnology. 35 (4), 180-183 (2012).
- Ehling, J., et al. Quantitative Micro-Computed Tomography Imaging of Vascular Dysfunction in Progressive Kidney Diseases. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (2), 520-532 (2016).
