Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Technik zur Messung der drei wichtigsten Parameter ischämischer Hirnverletzungen an demselben Satz von Nagetier-Gehirnproben. Die Verwendung von nur einer Hirnprobe ist in Bezug auf ethische und wirtschaftliche Kosten sehr vorteilhaft.
Abstract
Eine der häufigsten Ursachen für Morbidität und Mortalität weltweit ist ischämischer Schlaganfall. Historisch gesehen beinhaltet ein Tiermodell, das zur Stimulierung des ischämischen Schlaganfalls verwendet wird, die mittlere Hirnarterienverschluss (MCAO). Infarktzone, Hirnödem und Blut-Hirn-Schranke (BBB) Abbau werden als Parameter gemessen, die das Ausmaß der Hirnverletzung nach MCAO widerspiegeln. Eine wesentliche Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass diese Messungen normalerweise in verschiedenen Hirnproben von Ratten durchgeführt werden, was aufgrund der großen Anzahl von Ratten, die für eine angemessene Stichprobengröße eingeschläfert werden müssen, zu ethischen und finanziellen Belastungen führt. Hier stellen wir eine Methode zur genauen Beurteilung von Hirnverletzungen nach MCAO vor, indem wir Infarktzonen, Hirnödeme und BBB-Permeabilität in den gleichen Rattengehirnen messen. Diese neuartige Technik bietet eine effizientere Möglichkeit, die Pathophysiologie des Schlaganfalls zu bewerten.
Introduction
Eine der häufigsten Ursachen für Morbidität und Sterblichkeit weltweit ist Schlaganfall. Weltweit macht ischämischer Schlaganfall 68% aller Schlaganfallfälle aus, während in den Vereinigten Staaten ischämischer Schlaganfall 87% der Schlaganfallfälle1,2ausmacht. Es wird geschätzt, dass die wirtschaftliche Belastung durch Schlaganfall in den Vereinigten Staaten34 Milliarden Dollar 2 und 45 Milliarden Euro in der Europäischen Union3erreicht. Tiermodelle des Schlaganfalls sind notwendig, um seine Pathophysiologie zu studieren, neue Methoden für die Bewertung zu entwickeln und neue therapeutische Optionen vorzuschlagen4.
Ischämischer Schlaganfall tritt mit Okklusion einer großen Zerebralparese auf, in der Regel die mittlere Hirnarterie oder einer seiner Zweige5. So haben Modelle des ischämischen Schlaganfalls historisch gesehen mittlere Zerebrale Arterienverschluss (MCAO)6,7,8,9,10,11,12. Nach MCAO wird eine neurologische Verletzung am häufigsten durch Messung der Infarktzone (IZ) mit einer 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) Färbemethode13, Hirnödem (BE) mit Trocknung oder Berechnung hemisphärischer Volumina14,15,16, und Blut-Hirn-Schranke (BBB) Permeabilität durch eine Spektrometrie-Technik mit Evans blaue Färbung17,18,19.
Die traditionelle MCAO-Methode verwendet separate Sätze von Gehirnen für jede der drei Gehirnmessungen. Bei einem großen Stichprobenumfang führt dies zu einer erheblichen Anzahl eingeschläferter Tiere mit zusätzlichen ethischen und finanziellen Erwägungen. Eine alternative Methode zur Verringerung dieser Kosten würde Messungen aller drei Parameter in einem einzigen Satz von Post-MCAO Nagetiergehirnen beinhalten.
Frühere Versuche wurden unternommen, um Kombinationen von Parametern in derselben Gehirnprobe zu messen. Die gleichzeitigen immunfluoreszierenden Färbemethoden20 sowie andere molekulare und biochemische Analysen21 wurden nach TTC-Färbung in derselben Hirnprobe beschrieben. Wir haben zuvor Gehirnhälften berechnet, um Hirnödeme zu bewerten, und TTC-Färbung durchgeführt, um die Infarktzone im selben Gehirnsatz15zu berechnen.
Im vorliegenden Protokoll stellen wir eine modifizierte MCAO-Technik vor, die ischämische Hirnverletzungen misst, indem sie die Durchlässigkeit von IZ, BE und BBB in denselben Nagetierhirnen ermittelt. IZ wird durch TTC-Färbung gemessen, BE wird durch Berechnung des hemisphärischen Volumens bestimmt und BBB-Permeabilität wird durch Spektrometriemethoden19ermittelt. In diesem Protokoll verwendeten wir ein modifiziertes MCAO-Modell, das auf der direkten Insertion und Fixierung des Monofilamentkatheters in die innere Halsschlagader (ICA) und der weiteren Blockierung des Blutflusses zur mittleren Hirnarterie (MCA)22basiert. Diese modifizierte Methode zeigt eine verringerte Sterblichkeits- und Morbiditätsrate im Vergleich zur traditionellen MCAO-Methode16,22.
Dieser neue Ansatz bietet ein finanziell solides und ethisches Modell zur Messung neurologischer Verletzungen nach MCAO. Diese Bewertung der wichtigsten Parameter der ischämischen Hirnverletzung wird dazu beitragen, seine Pathophysiologie umfassend zu untersuchen.
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Protocol
Die folgenden Verfahren wurden gemäß den Empfehlungen der Erklärung von Helsinki und Tokio und der Leitlinien für die Verwendung von Versuchstieren der Europäischen Gemeinschaft durchgeführt. Die Experimente wurden auch vom Animal Care Committee an der Ben-Gurion Universität des Negev genehmigt.
1. Vorbereitung von Ratten auf das Experimentelle Verfahren
- Wählen Sie erwachsene männliche Sprague-Dawley Ratten ohne unbedenkte Pathologie, die jeweils zwischen 300 und 350 g wiegen.
- Halten Sie alle Ratten bei Raumtemperatur bei 22 °C, mit 12 Stunden licht- und dunkler Zyklen vor dem Experiment.
- Stellen Sie sicher, dass Nahrungsmittel und Wasser ad libitum verfügbar sind.
- Führen Sie alle Prozeduren zwischen 6:00 .m und 14:00 uhr .m durch.
2. Vorbereitung von Ratten auf die Operation
- Anästhesisieren Sie die Ratten 30 min mit Isofluran (4% für Induktion und 2% für die Wartung) und 24% Sauerstoff (1,5 l/min).
- Testen Sie das Niveau der Anästhesie bei den Ratten, indem Sie sicherstellen, dass sie keinen Pedalentzugsreflex haben.
- Setzen Sie den 24-Spur-Katheter in die Schwanzvene ein.
HINWEIS: Die Schwänewämt für vasodilatation wird nicht durchgeführt.- Legen Sie die Ratten auf den Tisch in einer supine Position. Verwenden Sie medizinisches Klebeband, um alle vier Gliedmaßen der Ratten anzubringen.
- Legen Sie die Sonde zur Temperaturmessung vor der Operation in das Rattenrektum.
- Während des Verfahrens eine Heizplatte pflegen, um eine Körpertemperatur von 37 °C zu unterstützen.
- Fügen Sie Salbe in beiden Augen der Ratte zum Schutz.
- Rasieren Sie den operationsischen Bereich und desinfizieren Sie mit drei Anwendungen von 10% Povidon-Jod gefolgt von 70% Isopropylalkohol.
3. Rechte Seite mittlere Zerebrale Arterie Okklusion
HINWEIS: MCAO wird durch eine modifizierte Technik durchgeführt, wie zuvor beschrieben16,22,23, mit der Verwendung von Instrumenten beschrieben von McGarry et al.24 und Ulua et al.25.
- Sezieren Sie die Haut und oberflächliche Faszien an der ventralen Mittellinie des Halses mit chirurgischer Pinzette und Schere mit gebogenen Klingen.
- Identifizieren Sie das Muskeldreieck, bestehend aus der ICA, der äußeren Halsschlagader (ECA) und der gemeinsamen Halsschlagader (CCA).
- Trennen Sie vorsichtig die richtige CCA und ICA vom Vagusnerv mit Mikrozangen für die Gefäßchirurgie.
- Stellen Sie die richtige CCA und die ICA zur Seite. Blockieren Sie den Blutfluss, der von der CCA zur ICA kommt, entweder mit Mikroclips oder speziellen Tourniquets für die Gefäßchirurgie. Machen Sie einen Schnitt (ca. 1 mm) auf der ICA mit Mikroschere für die Gefäßchirurgie.
- Legen Sie einen Monofilamentkatheter (4-0 Nylon) direkt durch die ICA, ca. 18,5-19 mm vom Bifurkationspunkt des rechten CCA in den Kreis von Willis, bis sie einen leichten Widerstand erreichen, um den MCA26zu verschließen.
- Ligate um die ICA über der Bifurkation von CCA.
- Führen Sie für die scheinbetriebene Steuerungsgruppe ein Einsetzen von Nylongewinde anstelle der Schritte 3.5 und 3.616,22.
- 5 ml 0,9% Natriumchlorid durch intraperitoneale Injektion verabreichen.
- Schließen Sie die Wunde durch Naht und bringen Sie die Ratte in einen Erholungsbereich.
HINWEIS: Wenige Minuten nach dem Ende der Anästhesie wacht die Ratte auf und bewegt sich selbstständig um den Käfig. - Bei 23 h nach MCAO 2% Evans blau in Salin (4 ml/kg)23,26 in die Schwanzvene für beide operierten Gruppen über eine Kanüle27injizieren.
HINWEIS: Dies wird als Blut -Hirn-Permeability-Tracer verwendet. 60 Minuten zirkulieren lassen.
4. Bestimmung der Infarktzone
- Messen Sie IZ bei 24 h nach MCAO, wie zuvor beschrieben9,15,18,19,26.
HINWEIS: Ratten, die mehr als 20% ihres Gewichts verloren haben oder Anfälle oder Hemiplegie entwickelt haben, sind vom Experiment ausgeschlossen. - Euthanisieren Sie die Ratte, indem Sie das inspirierte Gasgemisch durch 20% Sauerstoff und 80% Kohlendioxid ersetzen, bis die Ratte aufhört, spontan zu atmen.
- Öffnen Sie die Brust mit einem 5-6 cm seitlichen Schnitt durch die Bauchwand unter dem Rippenkäfig mit Schere und chirurgischen Zangen.
- Führen Sie einen Zwerchfellschnitt entlang der gesamten Länge des Rippenkäfigs mit Schere und chirurgischen Zangen durch.
- Sorgfältige Verdrängung der Lunge, durch schneiden Sie durch den Rippenkäfig bis zum Schlüsselbein auf der rechten und linken Seite28.
- Durchdieseln Sie mit 200 ml normaler Saline durch die linke Herzkammer.
- Punktieren oder Incise das rechte Vorhof des Herzens mit der Schere.
- Enthauptung mit einer Guillotine durchführen und Hirngewebe sammeln.
- Mit Irisschere, von der Foramen magnum bis zum distalen Rand der hinteren Schädeloberfläche auf beiden Seiten geschnitten.
- Trennen Sie die Riechbirnen, nervöse Verbindungen entlang der ventralen Oberfläche und dorsale Oberfläche des Schädels vom Gehirn.
- Entfernen Sie das Gehirn aus dem Kopf.
- Produzieren Sie 6 Gehirnscheiben, indem Sie 2 mm dicke horizontale Abschnitte mit einem .009" Edelstahl, unbeschichtet, einrandige Rasierklinge.
- 30 min bei 37 °C in 0,05% TTC inkubieren.
- Legen Sie das Hirngewebe auf die Mikroskopdias und führen Sie ein optisches Scannen dieser 6 Gehirnscheiben mit einer Auflösung von 1600x1600 dpi durch (siehe z. B. Beilage 1).
- Fügen Sie einen blauen Filter mit einem Fotoeditor (z. B. Adobe Photoshop CS2) mit der Kanalmixer-Funktion (Bild > Anpassungen > Kanalmixer)hinzu und speichern Sie das Bild als JPEG-Dateiformat.
HINWEIS: Nach dem Anwenden des blauen Filters wird das Bild grauskaliert angezeigt. - Öffnen Sie das gespeicherte Bild in ImageJ 1.37v29,30.
HINWEIS: Dieses Computerprogramm verwendet eine Schwellenwertfunktion, um die Pixel zu isolieren und zu berechnen, die entweder schwarz oder weiß sind (siehe Abbildung 1). - Wählen Sie für jede der 6 Gehirnscheiben des Bildes jede Hemisphäre (rechtsverletzte ipsilaterale und unverletzte Kontralaterale) als separate Bilddatei mit dem Werkzeug "Polygonauswahl" aus dem Hauptmenü aus und speichern Sie sie.
- Legen Sie den Cut-off für die Bestimmung von IZ fest, indem Sie eine automatische Schwellenwertfunktion aus dem Hauptmenü der ImageJ-Software verwenden, indem Sie Bild > Anpassen > Schwellenwertauswählen und die Anzahl der Pixel in jeder Hemisphäre eines einzelnen Gehirnsatzes messen.
HINWEIS: Makros können für diesen Schritt in der ImageJ-Software verwendet werden (siehe Ergänzung 2 für den Code). Der Cut-off ist ein kritischer Parameter, um zu bestimmen, welche Pixel in Weiß konvertiert werden sollen und welche je nach Grautoninton in Schwarz konvertiert werden sollen (siehe Ergänzung 3 und Ergänzung 4 als Beispiele). ImageJ vergleicht dann weiße und schwarze Pixel, um IZ zu bestimmen. Basierend auf den Färbeprotokollen und Scannereinstellungen haben wir einen konstanten Cut-off-Wert von 0,220 verwendet. - Führen Sie die Messung der IZ-Korrektur für Gewebeschwellungen mit den Verhältnissen der Ipsilateralen und Contralateralen Zerebralpwarten (RICH) Methode13,23 (siehe Beispiel in Supplement 5).
HINWEIS: Die Infarktgröße wird als Prozentsatz der kontralateralen Hemisphäre bewertet.
5. Bestimmung von Hirnödem31
HINWEIS: Verwenden Sie ImageJ 1.37v für die Messung von BE32,33.
- Messen Sie BE 24 h nach MCAO. Verwenden Sie für die Berechnung von BE die Daten aus dem volumen der linken und rechten Halbkugel (in Einheiten).
- Führen Sie optisches Scannen mit einer Auflösung von 1600x1600 dpi durch (siehe z. B. Beilage 1).
- Wählen Sie Gehirnhälften aus und setzen Sie den Cut-off zur Bestimmung von BE mit ImageJ 1.37v, wie oben in den Abschnitten 4.17-4.19 beschrieben.
- Geben Sie den BE-Bereich als Prozentsatz der Standardbereiche der nicht betroffenen kontralateralen Hemisphäre aus, berechnet nach der RICH-Methode unter Verwendung der folgenden Gleichung (siehe Beispiel in Beilage 5)23,34.
HINWEIS: Die Ausdehnung von BE wird als Prozentsatz der kontralateralen Hemisphäre bewertet.
6. Bestimmung der BBB-Störung
- Messen Sie BBB-Störung 24 h nach MCAO.
- Teilen Sie die rechte und linke Hemisphäre in sechs Scheiben und legen Sie jede in ein Mikrozentrifugenrohr.
- Homogenisieren Sie jede Scheibe des Hirngewebes in Trichloressigsäure, basierend auf der Berechnung von 1 g Hirngewebe in 4 ml 50% Trichloressigsäure.
- Zentrifuge bei 10.000 x g für 20 min.
- Verdünnt überstandflüssigkeit 1:3 mit 96% Ethanol.
- Durchführen von Lumineszenzspektrophotometrie durch den Einsatz von Spektrophotometrie-Software, die Installation der Platte und die Durchführung eines Probenmesswerts unter Verwendung der folgenden Parameter: Fluoreszenzintensitäts-Anregungswellenlänge von 620 nm (Bandbreite 10 nm) und eine Emissionswellenlänge von 680 nm (Bandbreite 10 nm)23,35 ; Mod-Top; Nummer Fleisch 25; Handbuch 100; Schütteln 1 Sek., 1 mm.
HINWEIS: Verwenden Sie eine Anregungswellenlänge von 620 nm (Bandbreite 10 nm) und eine Emissionswellenlänge von 680 nm (Bandbreite 10 nm). 23,35
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Representative Results
Infarktzonenmessung
Ein t-Test mit unabhängiger Stichprobe ergab, dass 19 Ratten, die dauerhaften MCAO unterzogen wurden, eine signifikante Zunahme des Hirninfarktvolumens im Vergleich zu den 16 scheinbetriebenen Ratten zeigten (MCAO=7,49% ± 3,57 vs. Schein = 0,31% ± 1,9, t(28,49) = 7,56, p < 0,01 (siehe Abbildung 2A)). Die Daten werden als mittlerer Prozentsatz der kontralateralen Hemisphäre ± SD ausgedrückt.
Messung von Hirnödemen
Ein t-Test mit unabhängiger Stichprobe ergab, dass 19 Ratten, die dauerhaften MCAO-Erkrankungen unterzogen wurden, eine signifikante Zunahme des Ausmaßes von Hirnödemen nach 24 h im Vergleich zu den 16 scheinbetriebenen Ratten zeigten (MCAO=12,31 % ± 8,6 vs. Schein = 0,64 % ± 10,2, t(29,37) = 3,61, p = 0,01, d = 1,23 (siehe Abbildung 2B).). Die Daten werden als mittlerer Prozentsatz der kontralateralen Hemisphäre ± SD ausgedrückt.
Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke
Ein t-Test mit unabhängiger Stichprobe ergab, dass 19 Ratten, die dauerhaften MCAO-Fällen unterzogen wurden, eine signifikante Zunahme des Ausmaßes der BBB-Aufschlüsselung nach 24 h im Vergleich zu den 16 scheinbetriebenen Ratten zeigten (MCAO=2235 ng/g ± 1101 vs. Sham = 94 ng/g ± 36, t(18,05) = 8,47 p < 0,01, d = 2,7 (siehe Abbildung 2C).). Die Daten werden in ng/g Hirngewebe gemessen und als Mittelwert ± SD dargestellt.
| Gruppe | Zeit | Verfahren |
| Sham operiert (16 Ratten) | 0 | Induktion von MCAO und Einsetzen von Filament enden für Scheingruppen |
| MCAO (19 Ratten) | ||
| Sham operiert (16 Ratten) | 23h | Injektion von Evans blau |
| MCAO (19 Ratten) | ||
| Sham operiert (16 Ratten) | 24h | Hirnsammlung für Messungen von IZ-, BE- und BBB-Störungen |
| MCAO (19 Ratten) |
Tabelle 1: Protokollzeitplan. Um 23 H nach MCAO wurde die blaue Lösung Evans injiziert. Eine Stunde später (24 h nach MCAO) wurde die Gehirnentnahme durchgeführt und IZ, BE und BBB Permeabilität wurden in allen Gruppen gemessen.
Abbildung 1: Repräsentative Gehirnscheiben von Schein- und MCAO-Ratten.
(A-B) Original gescanntes Bild. (C-D) Transformation in Graustufen. (E-G) Schwellenwertfunktion. (G-H) Anwendung eines blauen Filters. (I-J) Schwellenwertfunktion nach blauer Filteranwendung. (K-L) Verwendung der Schwellenfunktion zur Beurteilung von Hirnödemen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Histologische Ergebnisse von MCAO-Ratten im Vergleich zu scheinoperierten Ratten.
(A) Infarktzone. Das Infarktzonenvolumen bei 19 Ratten nach MCAO war im Vergleich zu den 16 scheinoperierten Ratten 24 h nach der Operation signifikant erhöht (*p < 0,01). (B) Hirnödem. Das Hirnödemvolumen bei 19 Ratten nach MCAO war im Vergleich zu den 16 scheinoperierten Ratten 24 h nach der Operation signifikant erhöht (*p < 0,01). (C) Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke. Die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke bei 19 Ratten nach MCAO war im Vergleich zu den 16 scheinoperierten Ratten 24 h nach der Operation signifikant erhöht (*p < 0,01). Die Werte wurden als mittlerer Prozentsatz der kontralateralen Hemisphäre ± SD ausgedrückt und bedeuten Evans blauer Extravasationsindex in ng/g des Hirngewebes ± SD nach unabhängigen Proben t-Test. Die Ergebnisse wurden als statistisch signifikant angesehen, wenn p< 0,05, und sehr signifikant, wenn p < 0.01. Diese Zahl wurde von Kuts et al.23geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Beilage 1: Beispielscan von Gehirnscheiben. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzung 2: Makros, die in der ImageJ-Software für die Automatische Schwellenfunktion und die Messung von Pixeln verwendet werden können. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Beilage 3: Beispiel Auto-Schwellenwert. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Beilage 4: Beispiel für gemessene Pixel auf jeder Hemisphäre. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Beilage 5: Stichprobenanalyse. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
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Discussion
Das Hauptziel des vorliegenden Protokolls bestand darin, konsistente Messungen von drei Hauptparametern ischämischer Verletzungen zu demonstrieren: IZ, BE und BBB-Permeabilität. Frühere Studien in diesem Bereich haben die Möglichkeit gezeigt, einen oder zwei dieser Parameter zusammen in derselben Stichprobe durchzuführen. Neben der Kostensenkung, die diese dreiteilige Methode bietet, bietet sie auch ein wünschenswerteres bioethisches Modell, das die Anzahl der Tiere begrenzt, die operiert und anschließend eingeschläfert werden müssen. Wie in allen histologischen Techniken wird die Methode durch die Unfähigkeit eingeschränkt, ischämische Verletzungen dynamisch zu beobachten.
Bei der Bildanalyse wurden vier Computerprogramme verwendet: ImageJ 1.37v, Adobe Photoshop CS2, Microsoft Excel 365 und IBM SPSS Statistics 22. ImageJ wurde verwendet, um die Ausdehnung der Infarktzone und des Hirnödems zu messen. Adobe Photoshop wurde verwendet, um die Wirkung von Evans blau auf das Gehirngewebe zu begrenzen, da eine blaue Farbe auf einen BBB-Zusammenbruch hinweist. Vor der Berechnung der Infarktzone ist es notwendig, die blaue Farbe aus dem Bild zu entfernen, da die Farbe keine genauen Messungen der Infarktzone zulässt (siehe Abbildung 1B, 1D, 1F). Excel und SPSS wurden für die Datenverarbeitung verwendet.
Die Technik zur Beurteilung einer Infarktzone mit ImageJ-Computersoftware basiert auf einem Vergleich von Schwarzen und Weißen Pixeln in einer gesunden Hemisphäre mit Pixeln in einer infarktierten Hemisphäre. In der Infarkthälfte ist die Infarktzone nicht mit TTC befleckt; daher wird es durch einen weißen Bereich in Abbildung 1B angezeigt, der gemessen wird. Damit das Programm die Infarktzone korrekt berechnet, müssen die Pixel in Schattierungen unterschiedlicher Graufarbenintensitäten konvertiert werden (siehe Abbildung 1F, 1J). Die blaue Farbe, die durch Evans blau verursacht wird (siehe Abbildung 1B), kann die Beurteilung der Infarktzone beeinflussen (siehe Abbildung 1F). Daher besteht der erste Schritt darin, die blaue Farbe mit einem blauen Filter zu entfernen und dann das Bild in ein Schwarzweißbild zu konvertieren (siehe Abbildung 1J). Wir haben Adobe Photoshop verwendet, aber auch andere Computerprogramme können für diesen Zweck verwendet werden, wie RawTherapeePortable.
Wir haben dann einheitliche Parameter für die Berechnung der Infarktzone in allen 6 Scheiben eines Gehirnsatzes mit ImageJ festgelegt, um das Messverfahren zu standardisieren. Dies ist notwendig, da alle 6 Slices aus jedem Satz unter den gleichen Bedingungen gebeizt und gescannt wurden und einen einheitlichen Cut-off-Parameter erfordern. Der Cut-off ist ein kritischer Parameter, um zu bestimmen, welche Pixel in Weiß konvertiert werden sollen und welche je nach Grauton in Schwarz konvertiert werden sollen (siehe Abbildung 1D, 1H). Dazu haben wir die Threshold-Funktion aus dem Hauptmenü verwendet. Der letzte Schritt in der Bildanalyse war die Berechnung der Infarktzone und des Hirnödems.
Die Infarktzonenmessung kann mit verschiedenen Techniken durchgeführt werden, einschließlich histologischer Färbung oder radiologischer Techniken wie einem Computertomographen36, Positronenemissionstomographie und Magnetresonanztomographie23,36. Frühere Studien im Labor haben die Beurteilung des Infarktvolumens mit Färbung mit TTC15,26gezeigt. Diese Methode basiert auf einer chemischen Reaktion zwischen TTC und mitochondrialen Dehydrogenasen von Neuronen. Die gesunden Gewebe, reich an Dehydrogenasen, sind mit dieser Färbung rot gefärbt. In nekrotischen Zellen tritt diese Farbänderung jedoch nicht aufgrund von Schäden im System auf, das an der Oxidation organischer Verbindungen37beteiligt ist. In unseren früheren Studien haben wir eine hohe Korrelation zwischen dieser histologischen Technik und den Ergebnissen des Gehirnbildscannens dieses Bereichs gezeigt23.
Messungen von Hirnödemen können sowohl in vivo als auch in vitro bewertet werden. Zerebrale Ödeme resultieren aus pathologischen Veränderungen in den Aktivitäten von Natrium- und Calciumionenkanälen und Transportern, die zu einer Zunahme des intrazellulären Wassers38,39,40,41führen. Alternativ kann eine Schwellung durch BBB-Schäden auftreten, die das extrazelluläre Wasser erhöhen. 42 In früheren Studien wurde ein Zerebralpadem auf der Grundlage nasser und trockener Techniken bestimmt, gefolgt von der Berechnung des Gewebewassergehalts43. Ein Vorteil der Methode, die wir in diesem Protokoll präsentieren, ist seine Einfachheit und Genauigkeit im Vergleich zu anderen vorhandenen Techniken23,44,45.
Die nützlichste Methode zur BBB-Abbauerkennung ist die Lumineszenzspektroskopie nach der blauen Injektion von Evans. Die Messung der BBB-Permeabilität basiert auf der Injektion von Evans blue, die an Albumin bindet. Die Molekularmasse von Albumin wiederum beträgt 66 kDa und viel signifikanter als das Molekulargewicht von Evans blue 961 Da. So wird die Messung der BBB-Permeabilität genau durch die molekulare Masse von Albumin bestimmt, die durch das beschädigte BBB eindringt und damit das Evansblau überträgt. Zusätzlich zu den oben beschriebenen Techniken gibt es andere Techniken, insbesondere solche, die auf einer Kombination verschiedener Dextrans- und radioaktiver Moleküle basieren, die zusammen genauere Ergebnisse liefern. Die Messung der BBB-Aufschlüsselung durch Lumineszenzspektrometrie ist billiger und einfacher zu verwenden, im Vergleich zu genaueren, aber teureren Techniken. Wir haben diese Methode für die Auswertung von BBB-Störungen zusammen mit Messungen der Infarktzone und des Hirnödems verwendet. Die Injektion von Evans blue zur Beurteilung der BBB-Permeabilität vor der Induktion von MCAO hat keinen Einfluss auf die Genauigkeit der Messung dieser beiden Parameter23.
Das vorliegende Protokoll stellt eine neuartige Technik zur Messung der drei wichtigsten Determinanten ischämischer Hirnverletzungen an derselben Hirnprobe dar. Diese Methode kann auch auf Modelle anderer Hirnverletzungen angewendet werden. Dieses Protokoll wird zur Untersuchung der Pathophysiologie der ischämischen Verletzung beitragen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko und Evgenia Goncharyk von der Abteilung für Physiologie, Fakultät für Biologie, Ökologie und Medizin, Oles Honchar, Dnipro Universität, Dnipro, Ukraine für ihre Unterstützung und hilfreiche Beiträge zu unseren Diskussionen. Die gewonnenen Daten sind Teil der Dissertation von Ruslan Kuts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL Syringe | Braun | 4606027V | |
| 2% chlorhexidine in 70% alcohol solution | Sigma-Aldrich | 500 cc | Provides general antisepsis of the skin in the operatory field |
| 27 G Needle with Syringe | Braun | 305620 | |
| 3-0 Silk sutures | Henry Schein | 1007842 | |
| 4-0 Nylon suture | 4-00 | ||
| Brain & Tissue Matrices | Sigma-Aldrich | 15013 | |
| Cannula Venflon 22 G | KD-FIX | 183603985447 | |
| Centrifuge Sigma 2-16P | Sigma-Aldrich | Sigma 2-16P | |
| Compact Analytical Balances | Sigma-Aldrich | HR-AZ/HR-A | |
| Digital weighing scale | Sigma-Aldrich | Rs 4,000 | |
| Dissecting scissors | Sigma-Aldrich | Z265969 | |
| Eppendorf pipette | Sigma-Aldrich | Z683884 | |
| Eppendorf tube | Sigma-Aldrich | EP0030119460 | |
| Fluorescence detector | Tecan, Männedorf Switzerland | Model: Infinite 200 PRO multimode reader | Optional. |
| Fluorescence detector | Molecular Devices LLC | VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument | Optional. |
| Gauze sponges | Fisher | 22-362-178 | |
| Heater with thermometer | Heatingpad-1 | Model: HEATINGPAD-1/2 | |
| Hemostatic microclips | Sigma-Aldrich | ||
| Horizon-XL | Mennen Medical Ltd | ||
| Infusion cuff | ABN | IC-500 | |
| Micro forceps | Sigma-Aldrich | ||
| Micro scissors | Sigma-Aldrich | ||
| Multiset | Teva Medical | 998702 | |
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| Operating forceps | Sigma-Aldrich | ||
| Operating scissors | Sigma-Aldrich | ||
| Optical scanner | Canon | Cano Scan 4200F | Resolution 3200 x 6400 dpi |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5606 | |
| Purina Chow | Purina | 5001 | Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment. |
| Rat cages | Techniplast | 2000P | Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment |
| Scalpel blades #11 | Sigma-Aldrich | S2771 | |
| Software | |||
| Adobe Photoshop CS2 for Windows | Adobe | ||
| ImageJ 1.37v | NIH | The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA | |
| SPSS Statistics 22 | IBM | ||
| Office 365 ProPlus | Microsoft | - | Microsoft Office Excel |
| Windows 10 | Microsoft | ||
| Reagents | |||
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma-Aldrich | 298-96-4 | |
| 50% trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 76-03-9 | |
| Ethanol 96 % | Romical | Flammable liquid | |
| Evans blue 2% | Sigma-Aldrich | 314-13-6 | |
| Isoflurane, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | NDC 66794-017 |
References
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