Denne protokollen beskriver en ny teknikk for å måle de tre viktigste parametrene for iskemisk hjerneskade på samme sett med gnagerhjerneprøver. Bruk av bare én hjerneprøve er svært fordelaktig når det gjelder etiske og økonomiske kostnader.
En av de vanligste årsakene til sykelighet og dødelighet over hele verden er iskemisk slag. Historisk, en dyremodell som brukes til å stimulere iskemisk slag innebærer midten cerebral arterie okklusjon (MCAO). Infarct sone, hjerneødem og blod-hjernebarriere (BBB) sammenbrudd måles som parametere som gjenspeiler omfanget av hjerneskade etter MCAO. En betydelig begrensning til denne metoden er at disse målingene normalt oppnås i forskjellige rottehjerneprøver, noe som fører til etiske og økonomiske byrder på grunn av det store antallet rotter som må eutaniseres for en passende prøvestørrelse. Her presenterer vi en metode for å nøyaktig vurdere hjerneskade etter MCAO ved å måle infarct sone, hjerneødem og BBB permeabilitet i samme sett av rottehjerner. Denne nye teknikken gir en mer effektiv måte å evaluere patofysiologien til hjerneslag.
En av de vanligste årsakene til sykelighet og dødelighet over hele verden er hjerneslag. Globalt representerer iskemisk slag 68% av alle slagtilfeller, mens i USA står iskemisk slag for 87% av hjerneslagtilfeller1,2. Det er anslått at den økonomiske byrden av hjerneslag når $ 34 milliarder i USA2 og € 45 milliarder i EU3. Dyremodeller av hjerneslag er nødvendig for å studere sin patofysiologi, utvikle nye metoder for evaluering, og foreslå nye terapeutiske alternativer4.
Iskemisk slag oppstår med okklusjon av en stor cerebral arterie, vanligvis den midterste hjernearterien eller en av dens grener5. Dermed har modeller av iskemisk slag historisk involvert midten cerebral arterie okklusjon (MCAO)6,7,8,9,10,11,12. Etter MCAO, nevrologisk skade vurderes oftest ved å måle infarktsone (IZ) ved hjelp av en 2,3,5-triphenyltetrazoliumklorid (TTC) fargingsmetode13, hjerneødem (BE) ved hjelp av tørking eller beregning av hemisfæriske volumer14,15,16,og blod hjernebarriere (BBB) permeabilitet av en spektrometri teknikk ved hjelp av Evans blå flekker17,18,19.
Den tradisjonelle MCAO-metoden bruker separate sett med hjerner for hver av de tre hjernemålingene. For en stor utvalgsstørrelse resulterer dette i et betydelig antall eutaniserte dyr, med ekstra etiske og økonomiske hensyn. En alternativ metode for å lindre disse kostnadene ville innebære målinger av alle tre parametrene i et enkelt sett med post-MCAO gnagerhjerner.
Tidligere forsøk er gjort for å måle kombinasjoner av parametere i samme hjerneprøve. Samtidige immunofluorescerende fargingsmetoder20 samt andre molekylære og biokjemiske analyser21 har blitt beskrevet etter TTC-farging i samme hjerneprøve. Vi har tidligere beregnet hjernehalvkulevolumer for å vurdere hjerneødem og utført TTC-farging for å beregne infarktsone i samme hjernesett15.
I den nåværende protokollen presenterer vi en modifisert MCAO-teknikk som måler iskemisk hjerneskade ved å bestemme IZ, BE og BBB permeabilitet i samme sett med gnagerhjerner. IZ måles ved TTC-farging, BE bestemmes ved å beregne hemisfært volum, og BBB permeabilitet oppnås ved spektrometrimetoder19. I denne protokollen brukte vi en modifisert MCAO-modell, basert på direkte innsetting og fiksering av monofilamentkateteret i den indre halspulsåren (ICA) og ytterligere blokkering av blodstrømmen til den midterste hjernearterien (MCA)22. Denne modifiserte metoden viser en redusert dødelighet og sykelighet sammenlignet med den tradisjonelle MCAO-metoden16,22.
Denne nye tilnærmingen gir en økonomisk forsvarlig og etisk modell for måling av nevrologisk skade etter MCAO. Denne vurderingen av de viktigste parametrene for iskemisk hjerneskade vil bidra til å undersøke sin patofysiologi grundig.
Hovedmålet med den nåværende protokollen var å demonstrere konsistente målinger av tre hovedparametere for iskemisk skade: IZ, BE og BBB permeabilitet. Tidligere studier på dette feltet har vist muligheten for å utføre en eller to av disse parametrene sammen i samme utvalg. Foruten kostnadsreduksjonen som denne tredelte metoden tilbyr, gir den også en mer ønskelig bioetisk modell som begrenser antall dyr som må opereres på og deretter eutaniseres. Som i alle histologiske teknikker er metoden begrenset av mang…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko og Evgenia Goncharyk ved Institutt for fysiologi, Fakultet for biologi, økologi og medisin, Oles Honchar, Dnipro University, Dnipro, Ukraina for deres støtte og nyttige bidrag til våre diskusjoner. Dataene som er innhentet er en del av Ruslan Kuts ph.d.-avhandling.
2 mL Syringe | Braun | 4606027V | |
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution | Sigma-Aldrich | 500 cc | Provides general antisepsis of the skin in the operatory field |
27 G Needle with Syringe | Braun | 305620 | |
3-0 Silk sutures | Henry Schein | 1007842 | |
4-0 Nylon suture | 4-00 | ||
Brain & Tissue Matrices | Sigma-Aldrich | 15013 | |
Cannula Venflon 22 G | KD-FIX | 183603985447 | |
Centrifuge Sigma 2-16P | Sigma-Aldrich | Sigma 2-16P | |
Compact Analytical Balances | Sigma-Aldrich | HR-AZ/HR-A | |
Digital weighing scale | Sigma-Aldrich | Rs 4,000 | |
Dissecting scissors | Sigma-Aldrich | Z265969 | |
Eppendorf pipette | Sigma-Aldrich | Z683884 | |
Eppendorf tube | Sigma-Aldrich | EP0030119460 | |
Fluorescence detector | Tecan, Männedorf Switzerland | Model: Infinite 200 PRO multimode reader | Optional. |
Fluorescence detector | Molecular Devices LLC | VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument | Optional. |
Gauze sponges | Fisher | 22-362-178 | |
Heater with thermometer | Heatingpad-1 | Model: HEATINGPAD-1/2 | |
Hemostatic microclips | Sigma-Aldrich | ||
Horizon-XL | Mennen Medical Ltd | ||
Infusion cuff | ABN | IC-500 | |
Micro forceps | Sigma-Aldrich | ||
Micro scissors | Sigma-Aldrich | ||
Multiset | Teva Medical | 998702 | |
Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
Operating forceps | Sigma-Aldrich | ||
Operating scissors | Sigma-Aldrich | ||
Optical scanner | Canon | Cano Scan 4200F | Resolution 3200 x 6400 dpi |
Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5606 | |
Purina Chow | Purina | 5001 | Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment. |
Rat cages | Techniplast | 2000P | Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment |
Scalpel blades #11 | Sigma-Aldrich | S2771 | |
Software | |||
Adobe Photoshop CS2 for Windows | Adobe | ||
ImageJ 1.37v | NIH | The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA | |
Office 365 ProPlus | Microsoft | – | Microsoft Office Excel |
Windows 10 | Microsoft | ||
Reagents | |||
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma-Aldrich | 298-96-4 | |
50% trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 76-03-9 | |
Ethanol 96 % | Romical | Flammable liquid | |
Evans blue 2% | Sigma-Aldrich | 314-13-6 | |
Isoflurane, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | NDC 66794-017 |