Summary

Mätning efter stroke cerebral ödem, infarkt zon och blod -hjärnbarriär nedbrytning i en enda uppsättning gnagare hjärnprover

Published: October 23, 2020
doi:

Summary

Detta protokoll beskriver en ny teknik för att mäta de tre viktigaste parametrarna för skandinavisk hjärnskada på samma uppsättning gnagare hjärnprover. Att bara använda ett hjärnprov är mycket fördelaktigt när det gäller etiska och ekonomiska kostnader.

Abstract

En av de vanligaste orsakerna till sjuklighet och dödlighet över hela världen är ischemisk stroke. Historiskt sett innebär en djurmodell som används för att stimulera ischemisk stroke mellersta cerebral arteriell ocklusion (MCAO). Infarktzon, hjärnödem och blod- hjärnbarriärnedbrytning (BBB) mäts som parametrar som återspeglar omfattningen av hjärnskada efter MCAO. En betydande begränsning av denna metod är att dessa mätningar normalt erhålls i olika råtthjärnprover, vilket leder till etiska och ekonomiska bördor på grund av det stora antalet råttor som behöver avlivas för en lämplig provstorlek. Här presenterar vi en metod för att noggrant bedöma hjärnskada efter MCAO genom att mäta infarkt zon, hjärnan ödem och BBB permeabilitet i samma uppsättning råtta hjärnor. Denna nya teknik ger ett effektivare sätt att utvärdera strokens patofysiologi.

Introduction

En av de vanligaste orsakerna till sjuklighet och dödlighet över hela världen är stroke. Globalt representerar ischemisk stroke 68% av alla strokefall, medan ischemisk stroke i USA står för 87% avstrokefallen 1,2. Det uppskattas att den ekonomiska bördan av stroke uppgår till 34 miljarder dollar i Förenta staterna2 och 45 miljarder euro i Europeiska unionen3. Djurmodeller av stroke är nödvändiga för att studera dess patofysiologi, utveckla nya metoder för utvärdering och föreslå nya terapeutiska alternativ4.

Ischemisk stroke uppstår med ocklusion av en större cerebral artär, vanligtvis den mellersta cerebrala artären eller en av dess grenar5. Således har modeller av ischemisk stroke historiskt involverat mellersta cerebrala gatan ocklusion (MCAO)6,7,8,9,10,11,12. Efter MCAO, neurologisk skada bedöms oftast genom mätning av infarktzon (IZ) med hjälp av en 2,3,5-triphenyltetrazoliumklorid (TTC) färgningsmetod13, hjärnödem (BE) med torr eller beräkna halvklotformade volymer14,15,16, och blod hjärnbarriär (BBB) permeabilitet genom en spektroskopi teknik med Evans blå färgning17,18,19.

Den traditionella MCAO-metoden använder separata uppsättningar hjärnor för var och en av de tre hjärnmätningarna. För en stor urvalsstorlek resulterar detta i ett betydande antal avlivade djur, med ytterligare etiska och ekonomiska överväganden. En alternativ metod för att lindra dessa kostnader skulle innebära mätningar av alla tre parametrarna i en enda uppsättning efter MCAO gnagare hjärnor.

Tidigare försök har gjorts att mäta kombinationer av parametrar i samma hjärnprov. Samtidiga immunofluorescerandefärgningsmetoder 20 samt andra molekylära och biokemiska analyser21 har beskrivits efter TTC färgning i samma hjärnan prov. Vi har tidigare beräknat hjärnhalvvolymer för att bedöma hjärnan ödem och utfört TTC färgning för att beräkna infarkt zon i samma hjärna set15.

I det nuvarande protokollet presenterar vi en modifierad MCAO-teknik som mäter ischemisk hjärnskada genom att bestämma IZ, BE och BBB permeabilitet i samma uppsättning gnagare hjärnor. IZ mäts med TTC-färgning, BE bestäms genom beräkning av halvklotferisk volym och BBB permeabilitet erhålls med spektrometrimetoder19. I detta protokoll använde vi en modifierad MCAO-modell, baserad på direkt insättning och fixering av monofilamentkatetern i den inre halspulsådern (ICA) och ytterligare blockering av blodflödet till den mellersta cerebrala artären (MCA)22. Denna modifierade metod visar en minskad dödlighet och sjuklighet jämfört med den traditionella MCAO-metoden16,22.

Detta nya tillvägagångssätt ger en ekonomiskt sund och etisk modell för att mäta neurologiska skador efter MCAO. Denna bedömning av de viktigaste parametrarna för skandinaviska hjärnan skada kommer att bidra till att grundligt undersöka dess patofysiologi.

Protocol

Följande förfaranden genomfördes i enlighet med rekommendationerna i Helsingfors och Tokyoförklaringen och riktlinjerna för användning av försöksdjur från Europeiska gemenskapen. Experimenten godkändes också av djurvårdskommittén vid Ben-Gurion University of the Negev. 1. Förbereda råttor för försöksförfarandet Välj vuxna manliga Sprague-Dawley råttor utan overt patologi, var och en väger mellan 300 och 350 g. Håll alla råttor i rumstemperatur vid 22…

Representative Results

Mätning av infarktzoner Ett oberoende t-test visade att 19 råttor som genomgick permanent MCAO visade en signifikant ökning av hjärnans infarktvolym jämfört med de 16 sham-operated råttorna (MCAO= 7,49% ± 3,57 jämfört med Sham = 0,31 % ± 1,9, t(28,49) = 7,56, p < 0,01 (se figur 2A)). Uppgifterna uttrycks som en genomsnittlig procentandel av den kontralaterala ± SD. Mätning av hjär…

Discussion

Huvudsyftet med detta protokoll var att påvisa konsekventa mätningar av tre huvudparametrar för ischemisk skada: IZ, BE och BBB permeabilitet. Tidigare studier på detta område har visat möjligheten att utföra en eller två av dessa parametrar tillsammans i samma urval. Förutom den kostnadsminskning som denna tredelad metod erbjuder ger den också en mer önskvärd bioetisk modell som begränsar antalet djur som måste opereras och därefter avlivas. Som i alla histologiska tekniker begränsas metoden av oförmåg…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko och Evgenia Goncharyk vid institutionen för fysiologi, fakulteten för biologi, ekologi och medicin, Oles Honchar, Dnipro University, Dnipro, Ukraina för deras stöd och hjälpsamma bidrag till våra diskussioner. De erhållna uppgifterna ingår i Ruslan Kuts doktorsavhandling.

Materials

2 mL Syringe Braun 4606027V
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution Sigma-Aldrich 500 cc Provides general antisepsis of the skin in the operatory field
27 G Needle with Syringe Braun 305620
3-0 Silk sutures Henry Schein 1007842
4-0 Nylon suture 4-00
Brain & Tissue Matrices Sigma-Aldrich 15013
Cannula Venflon 22 G KD-FIX 183603985447
Centrifuge Sigma 2-16P Sigma-Aldrich Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances Sigma-Aldrich HR-AZ/HR-A
Digital weighing scale Sigma-Aldrich Rs 4,000
Dissecting scissors Sigma-Aldrich Z265969
Eppendorf pipette Sigma-Aldrich Z683884
Eppendorf tube Sigma-Aldrich EP0030119460
Fluorescence detector Tecan, Männedorf Switzerland Model: Infinite 200 PRO multimode reader Optional.
Fluorescence detector Molecular Devices LLC VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument Optional.
Gauze sponges Fisher 22-362-178
Heater with thermometer Heatingpad-1 Model: HEATINGPAD-1/2
Hemostatic microclips Sigma-Aldrich
Horizon-XL Mennen Medical Ltd
Infusion cuff ABN IC-500
Micro forceps Sigma-Aldrich
Micro scissors Sigma-Aldrich
Multiset Teva Medical 998702
Olympus BX 40 microscope Olympus
Operating forceps Sigma-Aldrich
Operating scissors Sigma-Aldrich
Optical scanner Canon Cano Scan 4200F Resolution 3200 x 6400 dpi
Petri dishes Sigma-Aldrich P5606
Purina Chow Purina 5001 Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment.
Rat cages Techniplast 2000P Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment
Scalpel blades #11 Sigma-Aldrich S2771
Software
Adobe Photoshop CS2 for Windows Adobe
ImageJ 1.37v NIH The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA
Office 365 ProPlus Microsoft Microsoft Office Excel
Windows 10 Microsoft
Reagents
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Sigma-Aldrich 298-96-4
50% trichloroacetic acid Sigma-Aldrich 76-03-9
Ethanol 96 % Romical Flammable liquid
Evans blue 2% Sigma-Aldrich 314-13-6
Isoflurane, USP 100% Piramamal Critical Care, Inc NDC 66794-017

References

  1. Krishnamurthi, R. V., et al. Global and regional burden of first-ever ischaemic and haemorrhagic stroke during 1990-2010: findings from the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet Global Health. 1, 259-281 (2013).
  2. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, 146 (2017).
  3. Wilkins, E., et al. . European cardiovascular disease statistics 2017. , (2017).
  4. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
  5. Lloyd-Jones, D., et al. Heart disease and stroke statistics–2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 119, 480-486 (2009).
  6. Shigeno, T., McCulloch, J., Graham, D. I., Mendelow, A. D., Teasdale, G. M. Pure cortical ischemia versus striatal ischemia. Circulatory, metabolic, and neuropathologic consequences. Surgical Neurology. 24, 47-51 (1985).
  7. Albanese, V., Tommasino, C., Spadaro, A., Tomasello, F. A transbasisphenoidal approach for selective occlusion of the middle cerebral artery in rats. Experientia. 36, 1302-1304 (1980).
  8. Hudgins, W. R., Garcia, J. H. Transorbital approach to the middle cerebral artery of the squirrel monkey: a technique for experimental cerebral infarction applicable to ultrastructural studies. Stroke. 1, 107-111 (1970).
  9. Waltz, A. G., Sundt, T. M., Owen, C. A. Effect of middle cerebral artery occlusion on cortical blood flow in animals. Neurology. 16, 1185-1190 (1966).
  10. Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1, 53-60 (1981).
  11. Aspey, B. S., Cohen, S., Patel, Y., Terruli, M., Harrison, M. J. Middle cerebral artery occlusion in the rat: consistent protocol for a model of stroke. Neuropathology and Applied Neurobiology. 24, 487-497 (1998).
  12. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
  13. O’Brien, M. D., Jordan, M. M., Waltz, A. G. Ischemic cerebral edema and the blood-brain barrier. Distributions of pertechnetate, albumin, sodium, and antipyrine in brains of cats after occlusion of the middle cerebral artery. Archives of Neurology. 30, 461-465 (1974).
  14. Chen, C. H., Toung, T. J., Sapirstein, A., Bhardwaj, A. Effect of duration of osmotherapy on blood-brain barrier disruption and regional cerebral edema after experimental stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 26, 951-958 (2006).
  15. Boyko, M., et al. Establishment of Novel Technical Methods for Evaluating Brain Edema and Lesion Volume in Stroked Rats: a Standardization of Measurement Procedures. Brain Research. , (2019).
  16. Boyko, M., et al. An experimental model of focal ischemia using an internal carotid artery approach. Journal of Neuroscience Methods. 193, 246-253 (2010).
  17. Sifat, A. E., Vaidya, B., Abbruscato, T. J. Blood-Brain Barrier Protection as a Therapeutic Strategy for Acute Ischemic Stroke. AAPS Journal. 19, 957-972 (2017).
  18. Jiang, X., et al. Blood-brain barrier dysfunction and recovery after ischemic stroke. Progress in Neurobiology. 163-164, 144-171 (2018).
  19. Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Research. 739, 88-96 (1996).
  20. Li, L., Yu, Q., Liang, W. Use of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride-stained brain tissues for immunofluorescence analyses after focal cerebral ischemia in rats. Pathology – Research and Practice. 214, 174-179 (2018).
  21. Kramer, M., et al. TTC staining of damaged brain areas after MCA occlusion in the rat does not constrict quantitative gene and protein analyses. Journal of Neuroscience Methods. 187, 84-89 (2010).
  22. Kuts, R., et al. A middle cerebral artery occlusion technique for inducing post-stroke depression in rats. Journal of Visualized Experiments. , e58875 (2019).
  23. Kuts, R., et al. A Novel Method for Assessing Cerebral Edema, Infarcted Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Post-stroke Rodent Brain. Frontiers in Neuroscience. 13, 1105 (2019).
  24. McGarry, B. L., Jokivarsi, K. T., Knight, M. J., Grohn, O. H. J., Kauppinen, R. A. A Magnetic Resonance Imaging Protocol for Stroke Onset Time Estimation in Permanent Cerebral Ischemia. Journal of Visualized Experiments. , e55277 (2017).
  25. Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. Journal of Visualized Experiments. , e1978 (2011).
  26. Boyko, M., et al. The effect of blood glutamate scavengers oxaloacetate and pyruvate on neurological outcome in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Neurotherapeutics. 9, 649-657 (2012).
  27. Kuts, R., et al. A Middle Cerebral Artery Occlusion Technique for Inducing Post-stroke Depression in Rats. Journal of Visualized Experiments. , e58875 (2019).
  28. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. , e3564 (2012).
  29. Poinsatte, K., et al. Quantification of neurovascular protection following repetitive hypoxic preconditioning and transient middle cerebral artery occlusion in mice. Journal of Visualized Experiments. , e52675 (2015).
  30. . ImageJ, U. S. National Institutes of Health Available from: https://imagej.nih.gov/ij (2018)
  31. Boyko, M., et al. Pyruvate’s blood glutamate scavenging activity contributes to the spectrum of its neuroprotective mechanisms in a rat model of stroke. European Journal of Neuroscience. 34, 1432-1441 (2011).
  32. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
  33. . ImageJ, U. S. National Institutes of Health Available from: https://imagej.nih.gov/ij (1997)
  34. Kaplan, B., et al. Temporal thresholds for neocortical infarction in rats subjected to reversible focal cerebral ischemia. Stroke. 22, 1032-1039 (1991).
  35. Kumai, Y., et al. Postischemic gene transfer of soluble Flt-1 protects against brain ischemia with marked attenuation of blood-brain barrier permeability. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 27, 1152-1160 (2007).
  36. Schuleri, K. H., et al. Characterization of peri-infarct zone heterogeneity by contrast-enhanced multidetector computed tomography: a comparison with magnetic resonance imaging. Journal of the American College of Cardiology. 53, 1699-1707 (2009).
  37. Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative Stress: A Key Modulator in Neurodegenerative Diseases. Molecules. 24, (2019).
  38. Di Napoli, M. Caplan’s Stroke: A Clinical Approach. Journal of the American Medical Association. 302, 2600-2601 (2009).
  39. Deb, P., Sharma, S., Hassan, K. M. Pathophysiologic mechanisms of acute ischemic stroke: An overview with emphasis on therapeutic significance beyond thrombolysis. Pathophysiology. 17, 197-218 (2010).
  40. Simard, J. M., Kent, T. A., Chen, M., Tarasov, K. V., Gerzanich, V. Brain oedema in focal ischaemia: molecular pathophysiology and theoretical implications. Lancet Neurology. 6, 258-268 (2007).
  41. Klatzo, I. Pathophysiological aspects of brain edema. Acta Neuropathology. 72, 236-239 (1987).
  42. Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42, 3323-3328 (2011).
  43. Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. Effect of brain edema on infarct volume in a focal cerebral ischemia model in rats. Stroke. 24, 117-121 (1993).
  44. Liu, C., et al. Increased blood-brain barrier permeability in contralateral hemisphere predicts worse outcome in acute ischemic stroke after reperfusion therapy. Journal of NeuroInterventional Surgery. 10, 937-941 (2018).
  45. Boyko, M., et al. Establishment of novel technical methods for evaluating brain edema and lesion volume in stroked rats: A standardization of measurement procedures. Brain Research. 1718, 12-21 (2019).

Play Video

Cite This Article
Frank, D., Gruenbaum, B. F., Grinshpun, J., Melamed, I., Severynovska, O., Kuts, R., Semyonov, M., Brotfain, E., Zlotnik, A., Boyko, M. Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples. J. Vis. Exp. (164), e61309, doi:10.3791/61309 (2020).

View Video