Detta protokoll beskriver en ny teknik för att mäta de tre viktigaste parametrarna för skandinavisk hjärnskada på samma uppsättning gnagare hjärnprover. Att bara använda ett hjärnprov är mycket fördelaktigt när det gäller etiska och ekonomiska kostnader.
En av de vanligaste orsakerna till sjuklighet och dödlighet över hela världen är ischemisk stroke. Historiskt sett innebär en djurmodell som används för att stimulera ischemisk stroke mellersta cerebral arteriell ocklusion (MCAO). Infarktzon, hjärnödem och blod- hjärnbarriärnedbrytning (BBB) mäts som parametrar som återspeglar omfattningen av hjärnskada efter MCAO. En betydande begränsning av denna metod är att dessa mätningar normalt erhålls i olika råtthjärnprover, vilket leder till etiska och ekonomiska bördor på grund av det stora antalet råttor som behöver avlivas för en lämplig provstorlek. Här presenterar vi en metod för att noggrant bedöma hjärnskada efter MCAO genom att mäta infarkt zon, hjärnan ödem och BBB permeabilitet i samma uppsättning råtta hjärnor. Denna nya teknik ger ett effektivare sätt att utvärdera strokens patofysiologi.
En av de vanligaste orsakerna till sjuklighet och dödlighet över hela världen är stroke. Globalt representerar ischemisk stroke 68% av alla strokefall, medan ischemisk stroke i USA står för 87% avstrokefallen 1,2. Det uppskattas att den ekonomiska bördan av stroke uppgår till 34 miljarder dollar i Förenta staterna2 och 45 miljarder euro i Europeiska unionen3. Djurmodeller av stroke är nödvändiga för att studera dess patofysiologi, utveckla nya metoder för utvärdering och föreslå nya terapeutiska alternativ4.
Ischemisk stroke uppstår med ocklusion av en större cerebral artär, vanligtvis den mellersta cerebrala artären eller en av dess grenar5. Således har modeller av ischemisk stroke historiskt involverat mellersta cerebrala gatan ocklusion (MCAO)6,7,8,9,10,11,12. Efter MCAO, neurologisk skada bedöms oftast genom mätning av infarktzon (IZ) med hjälp av en 2,3,5-triphenyltetrazoliumklorid (TTC) färgningsmetod13, hjärnödem (BE) med torr eller beräkna halvklotformade volymer14,15,16, och blod hjärnbarriär (BBB) permeabilitet genom en spektroskopi teknik med Evans blå färgning17,18,19.
Den traditionella MCAO-metoden använder separata uppsättningar hjärnor för var och en av de tre hjärnmätningarna. För en stor urvalsstorlek resulterar detta i ett betydande antal avlivade djur, med ytterligare etiska och ekonomiska överväganden. En alternativ metod för att lindra dessa kostnader skulle innebära mätningar av alla tre parametrarna i en enda uppsättning efter MCAO gnagare hjärnor.
Tidigare försök har gjorts att mäta kombinationer av parametrar i samma hjärnprov. Samtidiga immunofluorescerandefärgningsmetoder 20 samt andra molekylära och biokemiska analyser21 har beskrivits efter TTC färgning i samma hjärnan prov. Vi har tidigare beräknat hjärnhalvvolymer för att bedöma hjärnan ödem och utfört TTC färgning för att beräkna infarkt zon i samma hjärna set15.
I det nuvarande protokollet presenterar vi en modifierad MCAO-teknik som mäter ischemisk hjärnskada genom att bestämma IZ, BE och BBB permeabilitet i samma uppsättning gnagare hjärnor. IZ mäts med TTC-färgning, BE bestäms genom beräkning av halvklotferisk volym och BBB permeabilitet erhålls med spektrometrimetoder19. I detta protokoll använde vi en modifierad MCAO-modell, baserad på direkt insättning och fixering av monofilamentkatetern i den inre halspulsådern (ICA) och ytterligare blockering av blodflödet till den mellersta cerebrala artären (MCA)22. Denna modifierade metod visar en minskad dödlighet och sjuklighet jämfört med den traditionella MCAO-metoden16,22.
Detta nya tillvägagångssätt ger en ekonomiskt sund och etisk modell för att mäta neurologiska skador efter MCAO. Denna bedömning av de viktigaste parametrarna för skandinaviska hjärnan skada kommer att bidra till att grundligt undersöka dess patofysiologi.
Huvudsyftet med detta protokoll var att påvisa konsekventa mätningar av tre huvudparametrar för ischemisk skada: IZ, BE och BBB permeabilitet. Tidigare studier på detta område har visat möjligheten att utföra en eller två av dessa parametrar tillsammans i samma urval. Förutom den kostnadsminskning som denna tredelad metod erbjuder ger den också en mer önskvärd bioetisk modell som begränsar antalet djur som måste opereras och därefter avlivas. Som i alla histologiska tekniker begränsas metoden av oförmåg…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko och Evgenia Goncharyk vid institutionen för fysiologi, fakulteten för biologi, ekologi och medicin, Oles Honchar, Dnipro University, Dnipro, Ukraina för deras stöd och hjälpsamma bidrag till våra diskussioner. De erhållna uppgifterna ingår i Ruslan Kuts doktorsavhandling.
2 mL Syringe | Braun | 4606027V | |
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution | Sigma-Aldrich | 500 cc | Provides general antisepsis of the skin in the operatory field |
27 G Needle with Syringe | Braun | 305620 | |
3-0 Silk sutures | Henry Schein | 1007842 | |
4-0 Nylon suture | 4-00 | ||
Brain & Tissue Matrices | Sigma-Aldrich | 15013 | |
Cannula Venflon 22 G | KD-FIX | 183603985447 | |
Centrifuge Sigma 2-16P | Sigma-Aldrich | Sigma 2-16P | |
Compact Analytical Balances | Sigma-Aldrich | HR-AZ/HR-A | |
Digital weighing scale | Sigma-Aldrich | Rs 4,000 | |
Dissecting scissors | Sigma-Aldrich | Z265969 | |
Eppendorf pipette | Sigma-Aldrich | Z683884 | |
Eppendorf tube | Sigma-Aldrich | EP0030119460 | |
Fluorescence detector | Tecan, Männedorf Switzerland | Model: Infinite 200 PRO multimode reader | Optional. |
Fluorescence detector | Molecular Devices LLC | VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument | Optional. |
Gauze sponges | Fisher | 22-362-178 | |
Heater with thermometer | Heatingpad-1 | Model: HEATINGPAD-1/2 | |
Hemostatic microclips | Sigma-Aldrich | ||
Horizon-XL | Mennen Medical Ltd | ||
Infusion cuff | ABN | IC-500 | |
Micro forceps | Sigma-Aldrich | ||
Micro scissors | Sigma-Aldrich | ||
Multiset | Teva Medical | 998702 | |
Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
Operating forceps | Sigma-Aldrich | ||
Operating scissors | Sigma-Aldrich | ||
Optical scanner | Canon | Cano Scan 4200F | Resolution 3200 x 6400 dpi |
Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5606 | |
Purina Chow | Purina | 5001 | Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment. |
Rat cages | Techniplast | 2000P | Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment |
Scalpel blades #11 | Sigma-Aldrich | S2771 | |
Software | |||
Adobe Photoshop CS2 for Windows | Adobe | ||
ImageJ 1.37v | NIH | The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA | |
Office 365 ProPlus | Microsoft | – | Microsoft Office Excel |
Windows 10 | Microsoft | ||
Reagents | |||
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma-Aldrich | 298-96-4 | |
50% trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 76-03-9 | |
Ethanol 96 % | Romical | Flammable liquid | |
Evans blue 2% | Sigma-Aldrich | 314-13-6 | |
Isoflurane, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | NDC 66794-017 |