Summary

Измерение посттактного церебрального отека, зоны инфаркта и пробок гемо-мозгового барьера в одном наборе образцов мозга грызунов

Published: October 23, 2020
doi:

Summary

Этот протокол описывает новый метод измерения трех наиболее важных параметров ишемической черепно-мозговой травмы на том же наборе образцов мозга грызунов. Использование только одного образца мозга является весьма выгодным с точки зрения этических и экономических издержек.

Abstract

Одной из наиболее распространенных причин заболеваемости и смертности во всем мире является ишемический инсульт. Исторически сложилось так, что животное модель, используемая для стимулирования ишемического инсульта включает в себя окклюзию средней мозговой артерии (MCAO). Зона инфаркта, отек мозга и распад гемо-мозгового барьера (BBB) измеряются как параметры, отражающие степень черепно-мозговой травмы после MCAO. Существенным ограничением этого метода является то, что эти измерения, как правило, получены в различных образцах мозга крыс, что приводит к этическим и финансовым бременем из-за большого количества крыс, которые должны быть усыпляются для соответствующего размера выборки. Здесь мы представляем метод точной оценки черепно-мозговой травмы после MCAO путем измерения зоны инфаркта, отек мозга и BBB проницаемости в том же наборе крыс мозга. Этот новый метод обеспечивает более эффективный способ оценки патофизиологии инсульта.

Introduction

Одной из наиболее распространенных причин заболеваемости и смертности во всем мире является инсульт. Во всем мире ишемический инсульт составляет 68% всех случаев инсульта, в то время как в Соединенных Штатах ишемический инсульт составляет 87% случаевинсульта 1,2. Подсчитано, что экономическое бремя инсульта достигает $ 34 млрд вСоединенных Штатах 2 и 45 млрд евро в Европейском союзе3. Модели инсульта животных необходимы для изучения его патофизиологии, разработки новых методов оценки и предложить новые терапевтическиеварианты 4.

Ишемический инсульт происходит при окклюзии основной мозговой артерии, обычно средней мозговой артерии или одной из ее ветвей5. Так, в моделях ишемического инсульта исторически задействованы окклюзия средней мозговой артерии(MCAO) 6,7,8,9,10,11,12. Вслед за MCAO, неврологические травмы чаще всего оценивается путем измерения зоны инфаркта (ИЗ) с использованием 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида (TTC)окрашивания метод 13, отек мозга (BE) с помощью сушки или расчета объемов полушария14 , 15,16,игемовогомозга барьер (BBB) проницаемость по технике спектрометрии с использованием Эванс синийокрашивания 17,18,19.

Традиционный метод MCAO использует отдельные наборы мозгов для каждого из трех измерений мозга. Для большого размера выборки, это приводит к значительному числу усыпляемых животных, с дополнительными этическими и финансовыми соображениями. Альтернативный метод для облегчения этих расходов будет включать измерения всех трех параметров в одном наборе мозгов грызунов после MCAO.

Предыдущие попытки были сделаны для измерения комбинаций параметров в том же образце мозга. Одновременно иммунофторесцентныеметоды окрашивания 20, а также другиемолекулярно-биохимические анализы 21 были описаны после окрашивания ТТК в том же образце мозга. Ранее мы вычислили объемы полушария мозга для оценки отеков мозга и выполнили Окрашивание ТТК для расчета зоны инфаркта в том же наборемозга 15.

В настоящем протоколе мы представляем модифицированный метод MCAO, который измеряет ишемическую черепно-мозговую травму путем определения проницаемости ИК, BE и BBB в том же наборе мозгов грызунов. Я измеряется TTC окрашивания, BE определяется путем расчета объема полушария, и BBB проницаемость получена методами спектрометрии19. В этом протоколе мы использовали модифицированную модель MCAO, основанную на прямой вставке и фиксации монофильтрного катетера во внутреннюю соонную артерию (ICA) и дальнейшем блокировании притока крови к средней мозговой артерии (MCA)22. Этот модифицированный метод показывает снижение уровня смертности и заболеваемости по сравнению с традиционным методомMCAO 16,22.

Этот новый подход обеспечивает финансово-звуковую и этическую модель для измерения неврологических травм после MCAO. Такая оценка основных параметров ишемической черепно-мозговой травмы поможет всесторонне исследовать ее патофизиологию.

Protocol

Следующие процедуры были проведены в соответствии с рекомендациями Хельсинкской и Токийской деклараций и Руководящих принципов использования экспериментальных животных Европейского сообщества. Эксперименты были также одобрены Комитетом по уходу за животными в Университете Бен-Гу?…

Representative Results

Измерение инфарктной зоны Независимый образец t-test показал, что 19 крыс, которые прошли постоянный MCAO продемонстрировали значительное увеличение объема инфаркта мозга по сравнению с 16 фиктивных крыс (MCAO 7,49% ± 3,57 против. Шам – 0,31% ± 1,9, т(28,49) – 7,56, р-н; 0,01 (см. <st…

Discussion

Основная цель настоящего протокола состояла в том, чтобы продемонстрировать последовательные измерения трех основных параметров ишемической травмы: проницаемости ИЭЗ, BE и BBB. Предыдущие исследования в этой области продемонстрировали возможность совместного выполнения одного или дв?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Благодарим Марину Кушерову, Максима Кривоносова, Дарину Якуменко и Евгению Гончару из кафедры физиологии, биологии, экологии и медицины, Олеся Гончара, Днепровского университета, Днепра, Украины за поддержку и полезный вклад в наши дискуссии. Полученные данные являются частью докторской диссертации Руслана Куца.

Materials

2 mL Syringe Braun 4606027V
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution Sigma-Aldrich 500 cc Provides general antisepsis of the skin in the operatory field
27 G Needle with Syringe Braun 305620
3-0 Silk sutures Henry Schein 1007842
4-0 Nylon suture 4-00
Brain & Tissue Matrices Sigma-Aldrich 15013
Cannula Venflon 22 G KD-FIX 183603985447
Centrifuge Sigma 2-16P Sigma-Aldrich Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances Sigma-Aldrich HR-AZ/HR-A
Digital weighing scale Sigma-Aldrich Rs 4,000
Dissecting scissors Sigma-Aldrich Z265969
Eppendorf pipette Sigma-Aldrich Z683884
Eppendorf tube Sigma-Aldrich EP0030119460
Fluorescence detector Tecan, Männedorf Switzerland Model: Infinite 200 PRO multimode reader Optional.
Fluorescence detector Molecular Devices LLC VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument Optional.
Gauze sponges Fisher 22-362-178
Heater with thermometer Heatingpad-1 Model: HEATINGPAD-1/2
Hemostatic microclips Sigma-Aldrich
Horizon-XL Mennen Medical Ltd
Infusion cuff ABN IC-500
Micro forceps Sigma-Aldrich
Micro scissors Sigma-Aldrich
Multiset Teva Medical 998702
Olympus BX 40 microscope Olympus
Operating forceps Sigma-Aldrich
Operating scissors Sigma-Aldrich
Optical scanner Canon Cano Scan 4200F Resolution 3200 x 6400 dpi
Petri dishes Sigma-Aldrich P5606
Purina Chow Purina 5001 Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment.
Rat cages Techniplast 2000P Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment
Scalpel blades #11 Sigma-Aldrich S2771
Software
Adobe Photoshop CS2 for Windows Adobe
ImageJ 1.37v NIH The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA
Office 365 ProPlus Microsoft Microsoft Office Excel
Windows 10 Microsoft
Reagents
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Sigma-Aldrich 298-96-4
50% trichloroacetic acid Sigma-Aldrich 76-03-9
Ethanol 96 % Romical Flammable liquid
Evans blue 2% Sigma-Aldrich 314-13-6
Isoflurane, USP 100% Piramamal Critical Care, Inc NDC 66794-017

References

  1. Krishnamurthi, R. V., et al. Global and regional burden of first-ever ischaemic and haemorrhagic stroke during 1990-2010: findings from the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet Global Health. 1, 259-281 (2013).
  2. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, 146 (2017).
  3. Wilkins, E., et al. . European cardiovascular disease statistics 2017. , (2017).
  4. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
  5. Lloyd-Jones, D., et al. Heart disease and stroke statistics–2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 119, 480-486 (2009).
  6. Shigeno, T., McCulloch, J., Graham, D. I., Mendelow, A. D., Teasdale, G. M. Pure cortical ischemia versus striatal ischemia. Circulatory, metabolic, and neuropathologic consequences. Surgical Neurology. 24, 47-51 (1985).
  7. Albanese, V., Tommasino, C., Spadaro, A., Tomasello, F. A transbasisphenoidal approach for selective occlusion of the middle cerebral artery in rats. Experientia. 36, 1302-1304 (1980).
  8. Hudgins, W. R., Garcia, J. H. Transorbital approach to the middle cerebral artery of the squirrel monkey: a technique for experimental cerebral infarction applicable to ultrastructural studies. Stroke. 1, 107-111 (1970).
  9. Waltz, A. G., Sundt, T. M., Owen, C. A. Effect of middle cerebral artery occlusion on cortical blood flow in animals. Neurology. 16, 1185-1190 (1966).
  10. Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1, 53-60 (1981).
  11. Aspey, B. S., Cohen, S., Patel, Y., Terruli, M., Harrison, M. J. Middle cerebral artery occlusion in the rat: consistent protocol for a model of stroke. Neuropathology and Applied Neurobiology. 24, 487-497 (1998).
  12. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
  13. O’Brien, M. D., Jordan, M. M., Waltz, A. G. Ischemic cerebral edema and the blood-brain barrier. Distributions of pertechnetate, albumin, sodium, and antipyrine in brains of cats after occlusion of the middle cerebral artery. Archives of Neurology. 30, 461-465 (1974).
  14. Chen, C. H., Toung, T. J., Sapirstein, A., Bhardwaj, A. Effect of duration of osmotherapy on blood-brain barrier disruption and regional cerebral edema after experimental stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 26, 951-958 (2006).
  15. Boyko, M., et al. Establishment of Novel Technical Methods for Evaluating Brain Edema and Lesion Volume in Stroked Rats: a Standardization of Measurement Procedures. Brain Research. , (2019).
  16. Boyko, M., et al. An experimental model of focal ischemia using an internal carotid artery approach. Journal of Neuroscience Methods. 193, 246-253 (2010).
  17. Sifat, A. E., Vaidya, B., Abbruscato, T. J. Blood-Brain Barrier Protection as a Therapeutic Strategy for Acute Ischemic Stroke. AAPS Journal. 19, 957-972 (2017).
  18. Jiang, X., et al. Blood-brain barrier dysfunction and recovery after ischemic stroke. Progress in Neurobiology. 163-164, 144-171 (2018).
  19. Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Research. 739, 88-96 (1996).
  20. Li, L., Yu, Q., Liang, W. Use of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride-stained brain tissues for immunofluorescence analyses after focal cerebral ischemia in rats. Pathology – Research and Practice. 214, 174-179 (2018).
  21. Kramer, M., et al. TTC staining of damaged brain areas after MCA occlusion in the rat does not constrict quantitative gene and protein analyses. Journal of Neuroscience Methods. 187, 84-89 (2010).
  22. Kuts, R., et al. A middle cerebral artery occlusion technique for inducing post-stroke depression in rats. Journal of Visualized Experiments. , e58875 (2019).
  23. Kuts, R., et al. A Novel Method for Assessing Cerebral Edema, Infarcted Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Post-stroke Rodent Brain. Frontiers in Neuroscience. 13, 1105 (2019).
  24. McGarry, B. L., Jokivarsi, K. T., Knight, M. J., Grohn, O. H. J., Kauppinen, R. A. A Magnetic Resonance Imaging Protocol for Stroke Onset Time Estimation in Permanent Cerebral Ischemia. Journal of Visualized Experiments. , e55277 (2017).
  25. Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. Journal of Visualized Experiments. , e1978 (2011).
  26. Boyko, M., et al. The effect of blood glutamate scavengers oxaloacetate and pyruvate on neurological outcome in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Neurotherapeutics. 9, 649-657 (2012).
  27. Kuts, R., et al. A Middle Cerebral Artery Occlusion Technique for Inducing Post-stroke Depression in Rats. Journal of Visualized Experiments. , e58875 (2019).
  28. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. , e3564 (2012).
  29. Poinsatte, K., et al. Quantification of neurovascular protection following repetitive hypoxic preconditioning and transient middle cerebral artery occlusion in mice. Journal of Visualized Experiments. , e52675 (2015).
  30. . ImageJ, U. S. National Institutes of Health Available from: https://imagej.nih.gov/ij (2018)
  31. Boyko, M., et al. Pyruvate’s blood glutamate scavenging activity contributes to the spectrum of its neuroprotective mechanisms in a rat model of stroke. European Journal of Neuroscience. 34, 1432-1441 (2011).
  32. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
  33. . ImageJ, U. S. National Institutes of Health Available from: https://imagej.nih.gov/ij (1997)
  34. Kaplan, B., et al. Temporal thresholds for neocortical infarction in rats subjected to reversible focal cerebral ischemia. Stroke. 22, 1032-1039 (1991).
  35. Kumai, Y., et al. Postischemic gene transfer of soluble Flt-1 protects against brain ischemia with marked attenuation of blood-brain barrier permeability. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 27, 1152-1160 (2007).
  36. Schuleri, K. H., et al. Characterization of peri-infarct zone heterogeneity by contrast-enhanced multidetector computed tomography: a comparison with magnetic resonance imaging. Journal of the American College of Cardiology. 53, 1699-1707 (2009).
  37. Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative Stress: A Key Modulator in Neurodegenerative Diseases. Molecules. 24, (2019).
  38. Di Napoli, M. Caplan’s Stroke: A Clinical Approach. Journal of the American Medical Association. 302, 2600-2601 (2009).
  39. Deb, P., Sharma, S., Hassan, K. M. Pathophysiologic mechanisms of acute ischemic stroke: An overview with emphasis on therapeutic significance beyond thrombolysis. Pathophysiology. 17, 197-218 (2010).
  40. Simard, J. M., Kent, T. A., Chen, M., Tarasov, K. V., Gerzanich, V. Brain oedema in focal ischaemia: molecular pathophysiology and theoretical implications. Lancet Neurology. 6, 258-268 (2007).
  41. Klatzo, I. Pathophysiological aspects of brain edema. Acta Neuropathology. 72, 236-239 (1987).
  42. Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42, 3323-3328 (2011).
  43. Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. Effect of brain edema on infarct volume in a focal cerebral ischemia model in rats. Stroke. 24, 117-121 (1993).
  44. Liu, C., et al. Increased blood-brain barrier permeability in contralateral hemisphere predicts worse outcome in acute ischemic stroke after reperfusion therapy. Journal of NeuroInterventional Surgery. 10, 937-941 (2018).
  45. Boyko, M., et al. Establishment of novel technical methods for evaluating brain edema and lesion volume in stroked rats: A standardization of measurement procedures. Brain Research. 1718, 12-21 (2019).

Play Video

Cite This Article
Frank, D., Gruenbaum, B. F., Grinshpun, J., Melamed, I., Severynovska, O., Kuts, R., Semyonov, M., Brotfain, E., Zlotnik, A., Boyko, M. Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples. J. Vis. Exp. (164), e61309, doi:10.3791/61309 (2020).

View Video