Измерение посттактного церебрального отека, зоны инфаркта и пробок гемо-мозгового барьера в одном наборе образцов мозга грызунов

Summary

Этот протокол описывает новый метод измерения трех наиболее важных параметров ишемической черепно-мозговой травмы на том же наборе образцов мозга грызунов. Использование только одного образца мозга является весьма выгодным с точки зрения этических и экономических издержек.

Abstract

Одной из наиболее распространенных причин заболеваемости и смертности во всем мире является ишемический инсульт. Исторически сложилось так, что животное модель, используемая для стимулирования ишемического инсульта включает в себя окклюзию средней мозговой артерии (MCAO). Зона инфаркта, отек мозга и распад гемо-мозгового барьера (BBB) измеряются как параметры, отражающие степень черепно-мозговой травмы после MCAO. Существенным ограничением этого метода является то, что эти измерения, как правило, получены в различных образцах мозга крыс, что приводит к этическим и финансовым бременем из-за большого количества крыс, которые должны быть усыпляются для соответствующего размера выборки. Здесь мы представляем метод точной оценки черепно-мозговой травмы после MCAO путем измерения зоны инфаркта, отек мозга и BBB проницаемости в том же наборе крыс мозга. Этот новый метод обеспечивает более эффективный способ оценки патофизиологии инсульта.

Introduction

Одной из наиболее распространенных причин заболеваемости и смертности во всем мире является инсульт. Во всем мире ишемический инсульт составляет 68% всех случаев инсульта, в то время как в Соединенных Штатах ишемический инсульт составляет 87% случаев^{инсульта 1,2}. Подсчитано, что экономическое бремя инсульта достигает $ 34 млрд в^{Соединенных Штатах 2} и 45 млрд евро в Европейском союзе³. Модели инсульта животных необходимы для изучения его патофизиологии, разработки новых методов оценки и предложить новые терапевтические^{варианты 4.}

Ишемический инсульт происходит при окклюзии основной мозговой артерии, обычно средней мозговой артерии или одной из ее ветвей^5. Так, в моделях ишемического инсульта исторически задействованы окклюзия средней мозговой артерии^{(MCAO) 6,7,8,9,10,11,12.} Вслед за MCAO, неврологические травмы чаще всего оценивается путем измерения зоны инфаркта (ИЗ) с использованием 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида (TTC)^{окрашивания метод 13}, отек мозга (BE) с помощью сушки или расчета объемов полушария^{14 , 15,16,}и^{гемового}мозга барьер (BBB) проницаемость по технике спектрометрии с использованием Эванс синий^{окрашивания 17,18,19}.

Традиционный метод MCAO использует отдельные наборы мозгов для каждого из трех измерений мозга. Для большого размера выборки, это приводит к значительному числу усыпляемых животных, с дополнительными этическими и финансовыми соображениями. Альтернативный метод для облегчения этих расходов будет включать измерения всех трех параметров в одном наборе мозгов грызунов после MCAO.

Предыдущие попытки были сделаны для измерения комбинаций параметров в том же образце мозга. Одновременно иммунофторесцентные^{методы окрашивания 20,} а также другие^{молекулярно-биохимические анализы 21 были описаны} после окрашивания ТТК в том же образце мозга. Ранее мы вычислили объемы полушария мозга для оценки отеков мозга и выполнили Окрашивание ТТК для расчета зоны инфаркта в том же наборе^{мозга 15.}

В настоящем протоколе мы представляем модифицированный метод MCAO, который измеряет ишемическую черепно-мозговую травму путем определения проницаемости ИК, BE и BBB в том же наборе мозгов грызунов. Я измеряется TTC окрашивания, BE определяется путем расчета объема полушария, и BBB проницаемость получена методами спектрометрии¹⁹. В этом протоколе мы использовали модифицированную модель MCAO, основанную на прямой вставке и фиксации монофильтрного катетера во внутреннюю соонную артерию (ICA) и дальнейшем блокировании притока крови к средней мозговой артерии (MCA)²². Этот модифицированный метод показывает снижение уровня смертности и заболеваемости по сравнению с традиционным методом^{MCAO 16,22}.

Этот новый подход обеспечивает финансово-звуковую и этическую модель для измерения неврологических травм после MCAO. Такая оценка основных параметров ишемической черепно-мозговой травмы поможет всесторонне исследовать ее патофизиологию.

Protocol

Следующие процедуры были проведены в соответствии с рекомендациями Хельсинкской и Токийской деклараций и Руководящих принципов использования экспериментальных животных Европейского сообщества. Эксперименты были также одобрены Комитетом по уходу за животными в Университете Бен-Гу?…

Representative Results

Измерение инфарктной зоны Независимый образец t-test показал, что 19 крыс, которые прошли постоянный MCAO продемонстрировали значительное увеличение объема инфаркта мозга по сравнению с 16 фиктивных крыс (MCAO 7,49% ± 3,57 против. Шам – 0,31% ± 1,9, т(28,49) – 7,56, р-н; 0,01 (см. <st…

Discussion

Основная цель настоящего протокола состояла в том, чтобы продемонстрировать последовательные измерения трех основных параметров ишемической травмы: проницаемости ИЭЗ, BE и BBB. Предыдущие исследования в этой области продемонстрировали возможность совместного выполнения одного или дв?…

Materials

2 mL Syringe	Braun	4606027V
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution	Sigma-Aldrich	500 cc	Provides general antisepsis of the skin in the operatory field
27 G Needle with Syringe	Braun	305620
3-0 Silk sutures	Henry Schein	1007842
4-0 Nylon suture	4-00
Brain & Tissue Matrices	Sigma-Aldrich	15013
Cannula Venflon 22 G	KD-FIX	183603985447
Centrifuge Sigma 2-16P	Sigma-Aldrich	Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances	Sigma-Aldrich	HR-AZ/HR-A
Digital weighing scale	Sigma-Aldrich	Rs 4,000
Dissecting scissors	Sigma-Aldrich	Z265969
Eppendorf pipette	Sigma-Aldrich	Z683884
Eppendorf tube	Sigma-Aldrich	EP0030119460
Fluorescence detector	Tecan, Männedorf Switzerland	Model: Infinite 200 PRO multimode reader	Optional.
Fluorescence detector	Molecular Devices LLC	VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument	Optional.
Gauze sponges	Fisher	22-362-178
Heater with thermometer	Heatingpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2
Hemostatic microclips	Sigma-Aldrich
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
Infusion cuff	ABN	IC-500
Micro forceps	Sigma-Aldrich
Micro scissors	Sigma-Aldrich
Multiset	Teva Medical	998702
Olympus BX 40 microscope	Olympus
Operating forceps	Sigma-Aldrich
Operating scissors	Sigma-Aldrich
Optical scanner	Canon	Cano Scan 4200F	Resolution 3200 x 6400 dpi
Petri dishes	Sigma-Aldrich	P5606
Purina Chow	Purina	5001	Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment.
Rat cages	Techniplast	2000P	Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment
Scalpel blades #11	Sigma-Aldrich	S2771
Software
Adobe Photoshop CS2 for Windows	Adobe
ImageJ 1.37v	NIH		The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA
Office 365 ProPlus	Microsoft	–	Microsoft Office Excel
Windows 10	Microsoft
Reagents
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Sigma-Aldrich	298-96-4
50% trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	76-03-9
Ethanol 96 %	Romical		Flammable liquid
Evans blue 2%	Sigma-Aldrich	314-13-6
Isoflurane, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017