Messung des Abbaus von Hirnödem nach dem Schlaganfall, Infarktzone und Blut-Hirn-Barrierenabbau in einem einzigen Satz von Nagetier-Gehirnproben

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Technik zur Messung der drei wichtigsten Parameter ischämischer Hirnverletzungen an demselben Satz von Nagetier-Gehirnproben. Die Verwendung von nur einer Hirnprobe ist in Bezug auf ethische und wirtschaftliche Kosten sehr vorteilhaft.

Abstract

Eine der häufigsten Ursachen für Morbidität und Mortalität weltweit ist ischämischer Schlaganfall. Historisch gesehen beinhaltet ein Tiermodell, das zur Stimulierung des ischämischen Schlaganfalls verwendet wird, die mittlere Hirnarterienverschluss (MCAO). Infarktzone, Hirnödem und Blut-Hirn-Schranke (BBB) Abbau werden als Parameter gemessen, die das Ausmaß der Hirnverletzung nach MCAO widerspiegeln. Eine wesentliche Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass diese Messungen normalerweise in verschiedenen Hirnproben von Ratten durchgeführt werden, was aufgrund der großen Anzahl von Ratten, die für eine angemessene Stichprobengröße eingeschläfert werden müssen, zu ethischen und finanziellen Belastungen führt. Hier stellen wir eine Methode zur genauen Beurteilung von Hirnverletzungen nach MCAO vor, indem wir Infarktzonen, Hirnödeme und BBB-Permeabilität in den gleichen Rattengehirnen messen. Diese neuartige Technik bietet eine effizientere Möglichkeit, die Pathophysiologie des Schlaganfalls zu bewerten.

Introduction

Eine der häufigsten Ursachen für Morbidität und Sterblichkeit weltweit ist Schlaganfall. Weltweit macht ischämischer Schlaganfall 68% aller Schlaganfallfälle aus, während in den Vereinigten Staaten ischämischer Schlaganfall 87% der Schlaganfallfälle^1,2ausmacht. Es wird geschätzt, dass die wirtschaftliche Belastung durch Schlaganfall in den Vereinigten Staaten³⁴ Milliarden Dollar 2 und 45 Milliarden Euro in der Europäischen Union³erreicht. Tiermodelle des Schlaganfalls sind notwendig, um seine Pathophysiologie zu studieren, neue Methoden für die Bewertung zu entwickeln und neue therapeutische Optionen vorzuschlagen⁴.

Ischämischer Schlaganfall tritt mit Okklusion einer großen Zerebralparese auf, in der Regel die mittlere Hirnarterie oder einer seiner Zweige⁵. So haben Modelle des ischämischen Schlaganfalls historisch gesehen mittlere Zerebrale Arterienverschluss (MCAO)^{6,7,8,9,10,11,12}. Nach MCAO wird eine neurologische Verletzung am häufigsten durch Messung der Infarktzone (IZ) mit einer 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) Färbemethode¹³, Hirnödem (BE) mit Trocknung oder Berechnung hemisphärischer Volumina^14,15,16, und Blut-Hirn-Schranke (BBB) Permeabilität durch eine Spektrometrie-Technik mit Evans blaue Färbung^17,18,19.

Die traditionelle MCAO-Methode verwendet separate Sätze von Gehirnen für jede der drei Gehirnmessungen. Bei einem großen Stichprobenumfang führt dies zu einer erheblichen Anzahl eingeschläferter Tiere mit zusätzlichen ethischen und finanziellen Erwägungen. Eine alternative Methode zur Verringerung dieser Kosten würde Messungen aller drei Parameter in einem einzigen Satz von Post-MCAO Nagetiergehirnen beinhalten.

Frühere Versuche wurden unternommen, um Kombinationen von Parametern in derselben Gehirnprobe zu messen. Die gleichzeitigen immunfluoreszierenden Färbemethoden²⁰ sowie andere molekulare und biochemische Analysen²¹ wurden nach TTC-Färbung in derselben Hirnprobe beschrieben. Wir haben zuvor Gehirnhälften berechnet, um Hirnödeme zu bewerten, und TTC-Färbung durchgeführt, um die Infarktzone im selben Gehirnsatz¹⁵zu berechnen.

Im vorliegenden Protokoll stellen wir eine modifizierte MCAO-Technik vor, die ischämische Hirnverletzungen misst, indem sie die Durchlässigkeit von IZ, BE und BBB in denselben Nagetierhirnen ermittelt. IZ wird durch TTC-Färbung gemessen, BE wird durch Berechnung des hemisphärischen Volumens bestimmt und BBB-Permeabilität wird durch Spektrometriemethoden¹⁹ermittelt. In diesem Protokoll verwendeten wir ein modifiziertes MCAO-Modell, das auf der direkten Insertion und Fixierung des Monofilamentkatheters in die innere Halsschlagader (ICA) und der weiteren Blockierung des Blutflusses zur mittleren Hirnarterie (MCA)²²basiert. Diese modifizierte Methode zeigt eine verringerte Sterblichkeits- und Morbiditätsrate im Vergleich zur traditionellen MCAO-Methode^16,22.

Dieser neue Ansatz bietet ein finanziell solides und ethisches Modell zur Messung neurologischer Verletzungen nach MCAO. Diese Bewertung der wichtigsten Parameter der ischämischen Hirnverletzung wird dazu beitragen, seine Pathophysiologie umfassend zu untersuchen.

Protocol

Die folgenden Verfahren wurden gemäß den Empfehlungen der Erklärung von Helsinki und Tokio und der Leitlinien für die Verwendung von Versuchstieren der Europäischen Gemeinschaft durchgeführt. Die Experimente wurden auch vom Animal Care Committee an der Ben-Gurion Universität des Negev genehmigt. 1. Vorbereitung von Ratten auf das Experimentelle Verfahren Wählen Sie erwachsene männliche Sprague-Dawley Ratten ohne unbedenkte Pathologie, die jeweils zwischen 300 und 350 g wiege…

Representative Results

Infarktzonenmessung Ein t-Test mit unabhängiger Stichprobe ergab, dass 19 Ratten, die dauerhaften MCAO unterzogen wurden, eine signifikante Zunahme des Hirninfarktvolumens im Vergleich zu den 16 scheinbetriebenen Ratten zeigten (MCAO=7,49% ± 3,57 vs. Schein = 0,31% ± 1,9, t(28,49) = 7,56, p < 0,01 (siehe Abbildung 2A)). Die Daten werden als mittlerer Prozentsatz der kontralateralen Hemisphäre ± SD ausgedrückt. <p class=…

Discussion

Das Hauptziel des vorliegenden Protokolls bestand darin, konsistente Messungen von drei Hauptparametern ischämischer Verletzungen zu demonstrieren: IZ, BE und BBB-Permeabilität. Frühere Studien in diesem Bereich haben die Möglichkeit gezeigt, einen oder zwei dieser Parameter zusammen in derselben Stichprobe durchzuführen. Neben der Kostensenkung, die diese dreiteilige Methode bietet, bietet sie auch ein wünschenswerteres bioethisches Modell, das die Anzahl der Tiere begrenzt, die operiert und anschließend eingesch…

Materials

2 mL Syringe	Braun	4606027V
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution	Sigma-Aldrich	500 cc	Provides general antisepsis of the skin in the operatory field
27 G Needle with Syringe	Braun	305620
3-0 Silk sutures	Henry Schein	1007842
4-0 Nylon suture	4-00
Brain & Tissue Matrices	Sigma-Aldrich	15013
Cannula Venflon 22 G	KD-FIX	183603985447
Centrifuge Sigma 2-16P	Sigma-Aldrich	Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances	Sigma-Aldrich	HR-AZ/HR-A
Digital weighing scale	Sigma-Aldrich	Rs 4,000
Dissecting scissors	Sigma-Aldrich	Z265969
Eppendorf pipette	Sigma-Aldrich	Z683884
Eppendorf tube	Sigma-Aldrich	EP0030119460
Fluorescence detector	Tecan, Männedorf Switzerland	Model: Infinite 200 PRO multimode reader	Optional.
Fluorescence detector	Molecular Devices LLC	VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument	Optional.
Gauze sponges	Fisher	22-362-178
Heater with thermometer	Heatingpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2
Hemostatic microclips	Sigma-Aldrich
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
Infusion cuff	ABN	IC-500
Micro forceps	Sigma-Aldrich
Micro scissors	Sigma-Aldrich
Multiset	Teva Medical	998702
Olympus BX 40 microscope	Olympus
Operating forceps	Sigma-Aldrich
Operating scissors	Sigma-Aldrich
Optical scanner	Canon	Cano Scan 4200F	Resolution 3200 x 6400 dpi
Petri dishes	Sigma-Aldrich	P5606
Purina Chow	Purina	5001	Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment.
Rat cages	Techniplast	2000P	Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment
Scalpel blades #11	Sigma-Aldrich	S2771
Software
Adobe Photoshop CS2 for Windows	Adobe
ImageJ 1.37v	NIH		The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA
Office 365 ProPlus	Microsoft	–	Microsoft Office Excel
Windows 10	Microsoft
Reagents
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Sigma-Aldrich	298-96-4
50% trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	76-03-9
Ethanol 96 %	Romical		Flammable liquid
Evans blue 2%	Sigma-Aldrich	314-13-6
Isoflurane, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017