Summary
フェノール酸は、全粒穀物に存在する重要な植物化学物質です。それらは抗酸化保護機能のような生理活性特性を有する。この研究は、HPLC同定、総フェノール含有量推定、および穀物および豆類中のフェノール酸の抗酸化能の測定のための一般化された方法に関する報告を目的としていた。
Abstract
フェノール酸は、フェノール基とカルボキシル基の両方を持つ有機化合物の一種です。それらは穀物に見られ、穀物のふすままたは豆類の種皮に集中します。彼らは、近年、それらの潜在的な抗酸化保護健康機能について、多くの研究の関心を集めている抗酸化特性を持っています。この研究は、全粒穀物から遊離可溶性フェノール酸を抽出し、それらの抗酸化能力を分析するための一般化された方法を提示する。2つの穀物(小麦および黄色トウモロコシ)および3つの豆類(ササゲ豆、インゲン豆、および大豆)を含む5つの全粒穀物サンプルを使用した。穀物を小麦粉に粉砕し、それらの遊離可溶性フェノール酸をメタノール水溶液を用いて抽出した。次いで、化合物を高圧液体クロマトグラフ(HPLC)を用いて同定した。Folin-Ciocalteu法を使用してそれらの総フェノール含有量を決定し、それらの抗酸化能力はDPPHラジカル消去能、トロロックス等価抗酸化能(TEAC)および酸素ラジカル吸光能(ORAC)アッセイを使用して決定した。同定されたフェノール酸には、バニリック酸、カフェ酸、 p-クマル酸およびフェルラ酸が含まれていた。バニリン酸はササゲでのみ同定され、カフェ酸はインゲン豆でのみ同定された。 p-クマル酸はイエローコーン、ササゲ、大豆で同定され、フェルラ酸はすべてのサンプルで同定された。フェルラ酸は、同定された優勢なフェノール酸であった。サンプル中のフェノール酸の総濃度は、以下の順序で減少した:大豆>ササゲ豆>黄色トウモロコシ=インゲン豆>小麦。総抗酸化能力(DPPH、TEACおよびORACアッセイの値の合計)は、以下のように減少した:大豆>インゲン豆>黄色トウモロコシ=ササゲ豆>小麦。この研究は、HPLC分析ならびにDPPH、TEAC、およびORACアッセイが、全粒穀物のフェノール酸組成および抗酸化特性に関する有用な情報を提供すると結論付けた。
Introduction
フェノール酸は、草食動物や真菌の感染に対する植物の防御に重要な役割を果たし、植物組織における構造的支持と完全性の維持に重要な役割を果たしているため、植物で研究されている最も重要な植物化学物質の1つです1,2。彼らは穀物のふすまと豆類の種皮に豊富にあります3.構造的には、それらは2つのグループに分けられる:ヒドロキシ安息香酸(図1)およびヒドロキシ桂皮酸(図2)。穀物および豆類における一般的なヒドロキシ安息香酸には、没食子酸、p-ヒドロキシ安息香酸、2,4-ジヒドロキシ安息香酸、プロトカテクイ酸、バニリック酸、およびシリンギン酸が含まれ、一般的なヒドロキシ桂皮酸にはカフェ酸、p-クマル酸、鉄原酸、シナピン酸3が含まれる。フェノール酸はまた、脂肪中の酸化的酸敗を引き起こすフリーラジカルを捕捉し、生理学的系においてラジカル誘発酸化ストレスを開始および伝播することができるので、抗酸化特性を有する4,5。抗酸化物質としてのこの重要な生理学的役割のために、それらは最近の研究の対象である。これは、植物性食品の成分として消費されると、抗酸化保護を発揮することができるからです。
穀物とシリアル製品は、世界中の人間と動物にとって主要な炭水化物食料源です6。穀物には、小麦、米、トウモロコシ(トウモロコシ)、大麦、トリチケール、キビ、ソルガムなどがあります。その中で、トウモロコシが最も利用されており、2019/2020年の推定世界利用量は11億3,570万トンで、続いて同じ期間に小麦が7億5,750万トンと推定されています7。シリアル食品は炭水化物の豊富な供給源であるため、消費者にとって大きなエネルギー源です。彼らはまた、いくつかのタンパク質、脂肪、繊維、ビタミンやミネラルを提供します6.それらの栄養価に加えて、穀物は植物化学的抗酸化物質、特にフェノール酸の良い供給源であり、ラジカル誘発酸化損傷から生理学的系を保護する可能性を秘めている3。マメ科植物はまた、栄養素の良い供給源であり、一般的に穀物よりもタンパク質が高いです。それらはまたビタミンとミネラルを含み、そして様々な食物の調製に使われます8。さらに、豆類は、フェノール酸、フラボノイド、アントシアニン、およびプロアントシアニジンを含む様々な植物化学的抗酸化物質の良好な供給源である9,10。穀物および豆類の異なる品種は、異なるフェノール酸組成を有し得る。したがって、フェノール系抗酸化物質に関してそれらの潜在的な健康上の利点を知るために、穀物および豆類およびそれらの品種のフェノール酸組成を研究する必要がある。
穀物およびマメ科植物の穀物中のフェノール酸の量を測定し、それらの抗酸化活性を決定するための多くのアッセイが報告されている。全粒フェノール酸の最も一般的な分析方法は、分光光度法および液体クロマトグラフィー11である。この研究の目的は、遊離可溶性フェノール酸組成を決定するための一般化された高圧液体クロマトグラフィー法、およびいくつかの全粒穀物および豆類の総フェノール含有量および抗酸化能を決定するための分光光度法を実証することであった。
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Protocol
1. サンプルの種類
- この研究には、2つの穀物(例えば、デュラム小麦およびイエローコーン)および3つの豆類(例えば、ブラックアイサゲ豆、大豆、および赤インゲン豆)を含む5つの全粒穀物サンプルを使用する。
- 各穀物の50gを3連で粉砕し、コーヒーグラインダーを使用して小麦粉にし、それらを500μmのふるいに通す。
- -20°Cで保管してください。
2. サンプル調製
-
乾物含有量の測定と乾燥重量基準の表現
注:AOAC(2000)12の方法に従って、各粉末サンプルの乾燥物含有量を決定する。- 強制対流式オーブンの電源を入れ、温度を 130 °C に設定します。
- 乾燥剤(シリカゲル)をオーブン中で30分~1時間乾燥させ、乾燥したシリカゲルをデシケーターに移した。
- 各サンプルの2gを正確に計量し、清潔で予備乾燥し、計量したアルミニウム缶に入れます。
- 秤量した試料を強制対流式オーブン中で130°Cで1時間乾燥させる。
- 乾燥したサンプルをデシケーターに移し、周囲温度まで冷却します。
- 乾燥し、冷却されたサンプルを計量し、その重量を記録します。
- 各サンプルの乾物含有量を次のように計算します。
- 乾燥重量基準で測定された各パラメータを次の式で表します。
-
フェノール酸抽出
注:ミリグラム量の全粒穀物からのフェノール抽出を可能にするY. Qiu et al.5 の方法の改変を用いて、穀物サンプル中の可溶性遊離フェノール化合物を抽出する。- 全粒粉サンプル100mgを琥珀色の2mL容量の微量遠心管に直接正確に秤量する。チューブの暗い色は、混合物が光にさらされるのを防ぐのに役立ちます。
- サンプルを含む各チューブに1mLの80%水性HPLCグレードメタノールを加える。
- ボルテックスはメタノール溶液と試料とを短時間混合する。
- サンプルを60分間超音波処理して、遊離の可溶性フェノール化合物を抽出します。光からの追加の保護のための超音波処理の期間中、サンプルの上にカバーを置きます。
- 超音波処理後、混合物を20,000 × g で5分間遠心分離し、上清を上に残した固体残渣を沈降させる。遊離フェノール化合物は、遠心分離後の上清中に存在するであろう。
- 上清を清浄な微量遠心管に移す。
注:HPLC装置に注入する前に、上清をろ過する必要があります。上清をろ過するには、3mLシリンジのプランジャーを取り外し、シリンジフィルターを取り付けます。フィルターの孔径は 0.22 μm 以下でなければなりません。 - 約0.4 mLの上清をシリンジの上部にピペットで留める。プランジャーを再挿入し、フィルターを通して液体をバイアルインサートを含むHPLCバイアルに押し込みます。
- HPLC分析用の原稿に概説されている方法を実行するように機器がセットアップされたら、サンプルリストに対応するようにバイアルをカルーセルにロードします。
- 異なるフェノール化合物を表す明確なピークを示す320nmおよび280nmにおけるHPLCクロマトグラムを得る。
- 適切な標準曲線を使用して、ヒドロキシ桂皮酸は、この波長で最大の吸光度を有するので、320nmで定量する。同様の原理により、280nmにおけるヒドロキシ安息香酸類を定量する。
- 残りの抽出物を他の分析のために-20°Cで保存する。
フェノール組成物
- 高圧液体クロマトグラフ(材料表)を使用して、J. Xiang、F..B. Apea-Bah、V. U. Ndolo、M..C. Katundu、およびT. Beta 4の方法に基づいて、サンプル中の抽出されたフェノール化合物を同定および定量します。
- フェノール酸標準物質(バニリン酸、カフェ酸、パラクマル酸、フェルラ酸、シナピン酸)を調製して、抽出物中の構成フェノール化合物を同定および定量する。
- これを行うには、各標準物質1mgを秤量し、1mLの50%メタノール水溶液に溶解して、各標準物質の1,000μg/mLを生成する。
- 2 mL のアンバー遠沈管で 5 つの標準物質すべてを等量混合し、それぞれが 200 μg/mL の濃度の標準品のカクテルを生成します。
- 新しいチューブに容量を取り、等量のメタノール水溶液溶媒で希釈することによって、標準カクテルの段階希釈物を調製する。
- 3.125 μg/mL の濃度まで段階希釈を繰り返します。
- また、各標準物質を溶媒で40倍に別途希釈し、各標準物質の濃度を25μg/mLとした。
- カラム温度を35°C、サンプルオーブン温度を15°Cに設定します。
- 移動相A(0.1%ギ酸水溶液)を調製するために、1mLのギ酸を1L容量のメスフラスコに移し、HPLCグレードの水を1Lマークに加える。よく振って混ぜる。
- 移動相B(メタノール中の0.1%ギ酸)を調製するために、1mLのギ酸を1L容量メスフラスコに移し、HPLCグレードのメタノールを1Lマークに加える。よく振って混ぜる。
- 必要に応じて、音量を 1 L マークに調整します。
- 両方の移動相を0.45μmの親水性ろ紙でろ過します。
- 分析のために、各抽出物または標準物質(25 μg/mL 標準および標準カクテル)を逆相カラムに 10 μL 注入します。
- 次のように25分間の実行のための線形勾配プログラムに従って移動相で溶出する:0-3.81分、9%-14%B;3.81-4.85分、14%-15%B;4.85-5.89分、15%-15%B、5.89-8.32分、15%-17%B;8.32-9.71分、17%-19%B;9.71-10.40分、19%-19%B;10.40-12.48分、19%-26%B;12.48-13.17分、16%-28%B;13.17-14.21分、28%-35%B;14.21-15.95分、35%-40%B;15.95-16.64分、40%-48%B;16.64-18.37分、48%-53%B;18.37-22.53分、53%-70%B;22.53-22.88分、70%-90%B;22.88-25.00分、90%B。
- サンプル中の構成フェノール化合物を特定するために、280 nmおよび320 nmにおける濃度25 μg/mLの真正な標準について得られたクロマトグラフィーピークの保持時間を抽出物の保持時間と比較します。
- フェノール酸標準カクテルの検量線をプロットし、横軸に標準物質の濃度、縦軸にピーク面積
- 検量線を使用して、プロット上のピーク面積を、前のセクションで述べたように280nmおよび320nmにおける同定された化合物のピーク面積と比較することによって、同定されたフェノール化合物の濃度を推定する。
4.総フェノール含有量
注:F.B. Apea-Bahら13によって記載されたFolin-Cioculteu法を用いて抽出物の総フェノール含有量を決定する。
- 0.025~0.150mg/mLの濃度範囲内でフェルラ酸および没食子酸標準物質を調製し、比較して検量線をプロットし、総フェノール含有量を推定する。
- これを行うには、フェルラ酸および没食子酸標準物質のそれぞれ1mgを2mL容量の遠沈管に正確に秤量する。
- 各標準物質に50%メタノール水溶液1mLを加え、ボルテックスで溶解させ、各標準物質の1mg/mLストックを作製した。
- 各ストック溶液から一連の希釈液を合計500μLで調製する。
- 各抽出物または標準品の18.2 μLをピペットで96ウェルマイクロプレート上の別々のウェルに入れた。
- 36.4 μL の 10% (v/v) 水性フォリン・シオカルテウ試薬を各抽出物または標準液に加える。
- 次いで、各反応混合物に145.4 μLの700 mM炭酸ナトリウムを加える。
- 反応混合物を暗所、室温(20〜25°C)で2時間インキュベートする。
- 750nmのマイクロプレートリーダーで吸光度を読み取る。
- フェノール酸標準物質の濃度に対する吸光度の変化の検量線をプロットし、それらを使用して総フェノール含有量を推定する。
- 結果を、粉砕サンプル1グラムあたりのフェルラ酸当量ミリグラム(mg FAE/g)および粉砕サンプル1グラムあたりの没食子酸当量(mg GAE/g)として、乾燥重量ベースで表します。
5. 抗酸化アッセイ
注:以下の3つのアッセイを用いて穀物抽出物の抗酸化能を決定する:2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル(DPPH)ラジカル消去能;2,2'-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸(ABTS)ラジカル消去能、トロロックス等価抗酸化能(TEAC)とも呼ばれる)、酸素ラジカル吸光度能(ORAC)とも呼ばれる。
- 標準曲線のトロロックス標準の作成
- ビタミンEの水溶性類似体であるトロロックスを標準として使用し、全粒穀物抽出物の インビトロ 抗酸化能を推定する。
- 15mLチューブに1mgのトロロックスを正確に計量する。4mLの50%メタノール水溶液に溶解する。ボルテックスを溶解させ、1mM(1000μM)の原液を調製した。
- 6つの濃度のトロロックス、すなわち50、100、200、400、600、および800μMを準備して、DPPHラジカル消去能およびトロロックス等価抗酸化能(TEAC)の推定のための標準曲線をプロットする。同様に、酸素ラジカル吸光度容量(ORAC)を推定するために、6.25、12.5、25、および50μM濃度のトロロックスを準備します。 表1に示すように各濃度の全容量を500 μLに構成する。
- サンプル抽出物の希釈
- 分析前にサンプル抽出物をメタノールで希釈する。ここで、イエローコーン及びササゲ抽出物を2倍に希釈し、小麦及びインゲン豆を5倍希釈し、大豆抽出物をメタノールで10倍希釈した。
- トロロックス等価抗酸化能(TEAC)アッセイ
- F.B. Apea-Bahら14により先に記載した方法を用いて試料のトロロックス等価抗酸化能(TEAC)を測定する。
- 8.23 mgのABTSを清潔な2 mL容量の琥珀色の遠沈管に入れます。
- 次に、1.62mgの過硫酸カリウムを別のきれいな2mL容量の琥珀色の遠沈管に秤量する。
- それぞれに1mLの蒸留水を加え、渦を巻いて溶かします。
注:これにより、6 mM 過硫酸カリウム水溶液を含む16 mM ABTSストック溶液が得られます。 - ABTSと過硫酸カリウム溶液とを等量混合してABTS原液を調製する。解決策はすぐに暗い色に変わります。
- 試薬混合物を暗所で12〜16時間インキュベートする。
- ABTSストック溶液を200mMリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で30倍に希釈し、ABTS作業溶液を形成した。これを行うには、2 mLのABTSストック溶液に58 mLの200 mM PBSを加えます。作業溶液には、0.27 mM ABTSおよび0.1 mM 過硫酸カリウムが含まれます。
- 分析のために、各希釈抽出物またはトロロックスを10μLを96ウェルマイクロプレートに入れる。
- 各ウェルに190 μLのABTS作動溶液を加え、反応混合物を60分間インキュベートする。
- マイクロプレートリーダーで750nmにおける反応混合物の吸光度を測定する。
- 100~800μmol/Lの範囲の濃度のTrolox標準を使用して検量線をプロットします。
- 検量線からABTSラジカル消去能力を推定する。
- 結果を乾燥重量ベースでグラムあたりのマイクロモルトロロックス当量(μmol TE/g)として表します。
- DPPHアッセイ
注:F.B. Apea-Bah et al.13によって以前に説明した方法を用いて、サンプルのDPPHラジカル消去能力を決定する。DPPH抗酸化アッセイには、ラジカル発生化合物であるDPPH(2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル)が必要です。- 空の50 mL容量の遠沈管に1.2 mgのDPPHを正確に計量します。DPPHを30mLのメタノールに溶解し、60μmol/Lのメタノール溶液を調製する。
注:DPPHアッセイは、DPPHによって生成されたフリーラジカルを捕捉するサンプル抽出物の能力をテストします。 - 分析のために、5 μLのサンプル抽出物またはトロロックス溶液をマイクロプレートウェルに加える。
- 次に、195 μL の 60 μmol/L DPPH メタノール溶液を加え、60 分間インキュベートします。
- 515nmにおける反応混合物の吸光度を測定する。
- トロロックス標準(50-800 μmol/L)を使用して検量線をプロットし、吸光度の変化を縦軸に、トロロックス濃度を横軸にしました。
- 検量線からDPPH消去能力を推定します。
- 結果を乾燥重量ベースでグラムあたりのマイクロモルトロロックス当量(μmol TE/g)として表します。
- 空の50 mL容量の遠沈管に1.2 mgのDPPHを正確に計量します。DPPHを30mLのメタノールに溶解し、60μmol/Lのメタノール溶液を調製する。
- 酸素ラジカル吸光能
- F.B. Apea-Bahら13の方法に基づいてサンプルの酸素ラジカル吸光能(ORAC)を決定する。
- まず、75 mM リン酸カリウム (K 2 HPO 4/KH 2 PO4) バッファー中の 1,000 μM トロロックス標準原液から、濃度6.25、12.5、25、および 50 μM のトロロックス標準物質を調製します。
- これを行うには、1mgのトロロックス粉末を秤量し、超音波処理下で4mLの緩衝液に溶解して、1,000μMストック溶液を調製する。
- その後、50 μLの原液を2 mL容量の遠沈管に取り、950 μLの緩衝液で希釈して、1,000 μLの50 μM Trolox溶液を得た。
- 50 μM 溶液 500 μL を新しいチューブにピペットし、等量のバッファーで希釈して、25 μM トロロックス溶液を得た。
- 25 μM の段階希釈を繰り返して 12.5 μM を得、次に同様に 12.5 μM の希釈を繰り返して 6.25 μM を得た。
- サンプル抽出物の適切な希釈液を調製する。
- 黄トウモロコシ及びササゲ抽出物を20倍、小麦及びインゲン豆抽出物を50倍、及び大豆抽出物を緩衝液で100倍希釈する。
- 各サンプルまたはトロロックス標準物質200 μLを黒色96ウェルマイクロプレートのウェルに移し、自動ピペッティングを行います。
- 次いで、ORAC装置を備えた3つの試薬タンクを、以下のもので満たします:(1)緩衝液;(2)緩衝液中の0.816 nMフルオレセイン;(3)緩衝液中の153mMの2,2'-アゾビス(2-アミジノプロパン)二塩酸塩(AAPH)。
- それらをコンセントに入れて、自動ピペッティングします。
- 標準操作手順に基づいて、分析用のORACマシンと自動ピペッティングシステムを設定します。
- 分析のために、各希釈抽出物または標準液の25 μLを透明な底の黒い96ウェルマイクロプレートのウェルに移すように自動ピペッティングシステムをセットアップしました。
- 次いで、150 μLの0.816 nMフルオレセインを緩衝液に自動的に添加する。
- 反応混合物をORACマシン中で37°Cで15分間インキュベートする。
- その後、各反応混合物に25 μLのAAPHを自動的に添加する。
- それらをORACマシンで37°Cで50分間インキュベートする。
- ORACマシンをセットアップして、インキュベーション期間にわたって、それぞれ485nmおよび520nmの励起波長および発光波長で蛍光減衰を測定する。
- 測定後、横軸にトロロックス(6.25-50 μM)、縦軸に蛍光減衰のトロロックス標準曲線をプロットします。
- トロロックス標準曲線から抽出物の酸素ラジカル吸光能を推定する。
- 結果を乾燥重量ベースでμmol TE/gサンプルとして表します。
- 統計解析
- すべての結果を、少なくとも3連の標準偏差±手段として提示します。
- 分散分析(ANOVA)を実行して、応答変数に対する粒子型の影響を判断します。
- p<0.05に有意差が存在する場合、最小有意差(LSD)を使用して平均を比較します。
- ピアソン相関分析を実行して、フェノール含有量と抗酸化能力の関係を推定します。
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Representative Results
表2 に、穀物及びマメ科植物粒において同定されたフェノール酸類を示す。入手可能な本物の標準に基づいて、サンプル中に4つのフェノール酸が同定され、それらはバニリック酸、カフェ酸、 p-クマル酸、およびフェルラ酸である。バニリン酸はヒドロキシ安息香酸であり、他の3つはヒドロキシ桂皮酸である。バニリン酸はブラックアイササゲ豆でのみ同定され、カフェ酸はインゲン豆でのみ同定された。 p-クマル酸は、イエローコーン、ササゲ豆、および大豆で同定された。その濃度は乾燥重量ベースで7.57〜12.48μg/gの小麦粉の範囲であり、黄色いトウモロコシが最も低い値を持ち、大豆が最も高い値を持っていた。フェルラ酸は、すべてのサンプルで同定された唯一のフェノール酸であった。その濃度は、乾燥重量ベースで5.69〜41.76μg/gの小麦粉の範囲であった。サンプルの中では、フェルラ酸濃度は大豆で最も高く、小麦、イエローコーン、インゲン豆は同等の値であった(表2)。各サンプルについてすべてのフェノール酸濃度を合計すると、それらの値は次の順序で減少した:大豆>ササゲ豆>黄色トウモロコシ=インゲン豆>小麦。
表3 に、穀物及び豆類粒の総フェノール含量(TPC)及び抗酸化能を示した。抗酸化能はDPPHラジカル消去能、TEAC、およびOLACから構成されていた。したがって、これら3つの値の合計は、サンプルの総抗酸化能力を与えた。TPCは比較を目的としてフェルラ酸当量及び没食子酸当量の両方で測定した。TPCは、乾燥重量ベースで1.16〜2.78mgのFAE / g小麦粉および0.63〜1.48mgのGAE / g小麦粉の範囲であった。等価単位にかかわらず、試料のTPCは、以下の順序で減少した:大豆>小麦=黄色トウモロコシ=インゲン豆>ササゲ豆。
サンプルのDPPHラジカル消去能力は、乾燥重量ベースで4.48〜14.87μmol TE / g小麦粉の範囲であった。大豆はDPPH消去能力が最も高く、続いてインゲン豆が続き、イエローコーンとササゲ豆は同等の値であった。小麦はDPPHラジカルを捕捉する能力が最も低かった。サンプルのトロロックス等価抗酸化能(TEAC)は、乾燥重量ベースで12.82〜57.24μmol TE / g小麦粉の範囲であった。ここでも、大豆はTEAC値が最も高く、次にインゲン豆、小麦が続き、イエローコーンとササゲ豆はTEAC値が比較的低かった。サンプルの酸素ラジカル吸光能は、乾燥重量ベースで0.35〜1.67μmol TE / g小麦粉の間であり、穀物は最も低い値を有し、大豆は最も高い値を有した。すべての抗酸化能力を合計すると、サンプル中のそれらの値は、大豆>インゲン豆>黄色いトウモロコシ=ササゲ豆>小麦の順に減少した。
2つのTPC値と、TEAC、ORAC、および総抗酸化能(TAC)の値との間には強い正の相関があった(表4)。しかし、TPC値とDPPHとの間には弱い相関関係があった。
図 1: 穀物および豆類で確認されたヒドロキシ安息香酸類。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: 穀物と豆類で確認されたヒドロキシ桂皮酸。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:DPPHおよびABTS標準曲線に対するトロロックス濃度の調製。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:一部の全粒穀物および豆類のフェノール酸含有量。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表3:いくつかの全粒穀物および豆類の総フェノール含有量(TPC)および抗酸化能。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表4:いくつかの穀物およびマメ科植物粒の総フェノール含有量および抗酸化能力についてのピアソン相関マトリックス。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
全粒穀物は、世界中で幅広い食品用途を見つける代表的な穀物および豆類として選択されました。各穀物の品種間にはばらつきが存在するかもしれないが、この研究の焦点は、全粒穀物の遊離フェノール酸抽出および分析のための一般化された方法を実証することであった。抽出方法は、そのような実験が行われたときに環境に放出される化学物質の量を減らすために、サンプルおよび溶媒の量を大幅に減らすことによって修正された。この修飾はまた、全粒穀物のミリグラム量からのフェノール抽出を可能にする。
HPLC分析は、試料中の構成フェノール酸のクロマトグラムを生成する。フェノール酸を表す各クロマトグラフィーピークは、予め定義された波長におけるその保持時間を、本物のフェノール酸標準の保持時間と比較することによって同定することができる。紫外線(UV)検出器は、通常、UV波長範囲内のフェノール酸を識別するために使用されます。ヒドロキシ安息香酸類は通常254〜280nmの間で同定され、ヒドロキシ桂皮酸類は通常300〜330nm15の間で同定される。フォトダイオードアレイ検出器は、紫外可視波長範囲全体をスキャンするために使用でき、研究されたことのないサンプル中に存在する化合物の紫外可視スペクトルを決定するのに特に有用である。R. J. RobbinsおよびS. R. Bean15は、バニリン酸、カフェ酸、p-クマル酸、およびフェルラ酸について、それぞれ最大吸収について以下の波長を報告した:260nm;325nm;310 nm;325 nm。HPLCの同定方法は、保持時間とUVスペクトルデータが以前に確立されている既知のフェノール酸組成のサンプルに対して通常許容されます。これは、カラムで良好な分離が達成されない場合に一部の化合物が共溶出する可能性があるため重要です。未知のフェノール酸組成のサンプルの場合、同定のための真正な標準に加えて質量分析計が使用される。公開された文献は、研究中のサンプルまたは類似のサンプル3、9、14において以前に同定されたフェノール化合物に関する有用な情報を提供する。HPLC分析中、クロマトグラムのフェノール酸ピークは、本物の標準物質が比較に利用できる場合にのみ識別可能であることは注目に値します。したがって、対応する基準なしでは識別できない他のピークが存在する可能性があります。これは、HPLCが質量分析計に結合されている場合に克服できるHPLC分析の制限である。したがって、定量化されたフェノール酸の総濃度は、同定されたフェノール酸の数に依存するであろう。
V. L. Singleton and J. A. Rossi (1965)16によって最初に発表されたFolin-Ciocalteu法は、分析物17のTPCを推定するために使用される電子伝達ベースのアッセイである。これは、アルカリ性媒体中でリンモリブデン酸 - リンタングステン酸を還元し、それによってそれを黄色から濃い青色の溶液18に変換する分析物の能力に基づいている。得られた溶液の吸光度は、次いで、765nm19で測定することができる。この試薬は、フェノール化合物のみに特異的ではないが、チオール、還元糖およびいくつかのアミノ酸(例えば、チロシン)などの還元特性を有するいくつかの他の化合物と反応することができる。したがって、TPCは、試料または分析物17の還元特性を推定するために使用され得ることが示唆される。フェノール抽出の間、ほとんどの干渉化合物は除外され、フェノール化合物は最も遍在する植物化学物質であるため、Folin-CioculteuアッセイはサンプルのTPCを推定するのに有用な方法のままです。フェノール組成が知られていないほとんどのサンプルでは、没食子酸がTPCを推定するための検量線を描くための標準物質として使用されます。しかし、すべてのサンプルが没食子酸を含むわけではありません。今回の研究では、フェルラ酸を用いて没食子酸と比較しました。2サンプルT検定では、フェルラ酸当量として決定されたTPCは、没食子酸当量として表されたTPCよりも有意に高い値を有することが示された。HPLC分析やその他の報告結果に基づいて、すべてのサンプルにフェルラ酸が存在することを確認したので、TPC結果をフェルラ酸当量として表現することにもっと傾いています。試料中の優勢な構成フェノール化合物に対してTPCを発現することは有用である。
3つの異なる抗酸化アッセイを用いて、異なる粒子がフリーラジカルを捕捉する能力において異なる応答を示すことが観察された。DPPHラジカル消去能力およびTEACアッセイは電子移動(ET)機構に基づいており、一方、ORACアッセイは水素原子移動(HAT)機構20に基づいている。したがって、3つのアッセイを組み合わせることで、サンプルの抗酸化能力をよりよく示すことができます。ORACアッセイは、生理学的に関連するペルオキシルラジカルを捕捉するサンプルの能力を測定するが、これは生理学的系において、泡沫細胞形成およびアテローム発生に関連する脂質過酸化を引き起こす可能性がある21,22。一方、DPPHおよびTEACアッセイは、生理学的関連性のないラジカルを使用する。しかし、その使いやすさは、サンプルのラジカル消去能力を推定するための迅速な方法として有用です。ORACアッセイはまた、細胞およびDNAをバイオマーカーとして使用する他のインビトロまたはエキソビボ抗酸化アッセイとよく比較する23。
遊離フェノール酸の抽出および同定、総フェノール含量の推定、および抗酸化特性の決定のための上記のすべての方法は、標準化されていない。液体クロマトグラフィーカラムのメーカーによって異なる場合、同定のためにフェノール酸を分離するために、溶媒の異なるグラジエント溶出システムを推奨しています。Folin-Ciocalteu法は、サンプルの総フェノール含有量を推定するために最も一般的ですが、異なる研究室は、異なる方法でこのアッセイを実行します。抗酸化法についても同じことが言えます。したがって、結果の実験室間比較を促進するために、これらの方法の調和が必要である。また、フェノール酸組成をこれらの重要な分析方法によって測定された抗酸化特性に関連付けることができる堅牢な予測モデルの開発も必要である。
この研究から、使用される溶媒抽出法は、全粒穀物および豆類の小麦粉から遊離可溶性フェノール酸を抽出するのに有効であり、それによってそれらの同定および定量が容易であると結論付けられる。HPLC法は、比較のための本物の標準がある限り、全粒穀物抽出物中の遊離可溶性フェノール酸の同定および定量を可能にする。DPPH、TEAC、およびOLACの3つの異なる抗酸化方法を使用して、全粒穀物からの遊離可溶性フェノール抽出物の抗酸化能力は、水素原子移動および電子移動機構に基づいて効果的に決定することができる。この研究はさらに、全粒穀物がフェノール酸組成と抗酸化能力において異なることを確認している。相関分析は、測定された抗酸化能力が全粒穀物非含有可溶性抽出物中の構成フェノール酸に関連していることを実証する。TEACとDPPHの両方が電子移動機構によってフリーラジカルを捕捉するが、TPCとの相関は異なっていた。異なる抗酸化アッセイの挙動の違いにより、さまざまなアッセイを使用してサンプルの抗酸化能力を決定する必要があります。調査された5つの全粒穀物の中で、大豆はフェノール酸濃度が最も高く、それに対応して最も高い抗酸化能を有する。この研究はまた、全粒穀物を含まない可溶性フェノール酸を抽出することができ、その抗酸化能力がわずか1mLのメタノール水溶液で研究され、それによって環境に放出される実験用化学物質の量を減少させることを実証している。
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Disclosures
著者らは利益相反がないと宣言しています。
Acknowledgments
著者らは、アリソン・セル氏とハンナ・オドゥロ・オーベン氏の技術支援、ジャニス・ファハルド氏とミゲル・デル・ロザリオ氏によるビデオ編集のサポートに感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Falcon conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| 2 mL Amber glass ID Surestop vial | Thermo Scientific | C5000-2W | |
| 2 mL Amber microcentrifuge tubes | VWR | 20170-084 | |
| 2,2′-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) | Sigma-Aldrich | 440914-100G | |
| 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) (C18H18N4O6S4) ≥98%, | Sigma Aldrich | A1888-2G | |
| 2,2-Diphenyl-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6) | Sigma Aldrich | D913-2 | |
| 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) (C14H18O4), ≥98% | Fluka Chemika | 56510 | |
| 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | Thermo Scientific | 60180-670 | |
| 96 well flat bottom plates | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Agilent BioTek ELx800 microplate reader | Fisher Scientific | BT-ELX800NB | |
| Agilent BioTek Precision 2000 96/384 Automated Microplate Pipetting System | Fisher Scientific | N/A | |
| Agilent BioTek FLx800 Microplate Fluorescence Reader | Fisher Scientific | N/A | |
| Analytical balance SI-114 | Denver Instrument | SI-114.1 | |
| Autosampler, Waters 717 Plus | Waters | WAT078900 | |
| BD 3 mL syringe Luer-Lok Tip | BD | 309657 | |
| Bransonic ultrasonic cleaner, Branson 5510 | Millipore Sigma | Z245143 | |
| Corning LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Durapore Filter (0.45 µm PVDF Membrane) | Merck Millipore Ltd | HVLP04700 | |
| Durapore Membrane Filters (0.45 µm HV) | Merck Millipore Ltd | HVHP04700 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-5 mL | Eppendorf | 3123000071 | |
| Eppendorf Research plus, 100-1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research plus, 10-100 µL | Eppendorf | 3123000047 | |
| Ethyl acetate, HPLC grade | Fisher Chemical | E195-4 | |
| Ferulic acid standard | Sigma Aldrich | 128708-5G | |
| Fluorescein | Fisher Scientific | AC119245000 | |
| Folin & Ciocalteu phenol reagent | Sigma Aldrich | F9252 | |
| Formic acid, 99% | Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3a | 27048-0010 | |
| Gallic acid standard | Sigma | G7384 | |
| High performance liquid chromatograph (HPLC), Waters 2695 | Waters | 960402 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Chemical | A452-4 | |
| Micro pipet tips, 0.5-10 µL | Fisherbrand | 21-197-2F | |
| Microcentrifuge Sorvall Legend Micro 21 centrifuge | Thermo Scientific | 75002435 | |
| Multichannel micropipette, Proline Plus, 30-300 µL | Sartorius | 728240 | |
| Photodiode array detector, Waters 2996 | Waters | 720000350EN | |
| Pipet tips, 1000 µL | VWR | 83007-382 | |
| Pipet tips, 1-5 mL | VWR | 82018-840 | |
| Potassium persulfate (K2S2O8), ≥99.0% | Sigma Aldrich | 216224-100G | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous (K2HPO4) | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| PYREX 250 mL Short Neck Boiling Flask, Round Bottom | Corning | 4321-250 | |
| Reversed phase C18 Analytical Column (100 x 3 mm) Accucore aQ | Thermo Scientific | 17326-103030 | |
| Roto evaporator, IKA RV 10 | IKA | 0010005185 | |
| Sodium carbonate (NaCO3) anhydrous | Fisher Chemical | S263-1 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Mallinckrodt AR® | 7581 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous (NaH2PO4) | Fisher bioreagents | BP329-500 | |
| Standardization pipet tips 0-200µL | Fisherbrand | 02-681-134 | |
| Syringe Driven Filter unit (0.22 µm) | Millex®-GV | SLGVR04NL | |
| Target micro-serts vial insert (400 µL) | Thermo Scientific | C4011-631 | |
| Ultrapure water (Direct Q-3 UV system with pump) | Millipore | ZRQSVP030 |
References
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