Summary
Aquí, presentamos un protocolo para analizar la ultraestructura de los megacariocitos in situ utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM). Las médulas óseas murinas se recogen, se fijan, se incrustan en resina epoxi y se cortan en secciones ultrafinas. Después de la tinción por contraste, la médula ósea se observa bajo un microscopio TEM a 120 kV.
Abstract
La diferenciación y maduración de los megacariocitos se producen en estrecha asociación con los componentes celulares y extracelulares de la médula ósea. Estos procesos se caracterizan por la aparición gradual de estructuras esenciales en el citoplasma de megacariocitos, como un núcleo poliploide y polilobulado, una red de membrana interna llamada sistema de membrana de demarcación (DMS) y los gránulos densos y alfa que se encontrarán en las plaquetas circulantes. En este artículo, describimos un protocolo estandarizado para el estudio ultraestructural in situ de megacariocitos murinos utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM), que permite la identificación de características clave que definen su etapa de maduración y densidad celular en la médula ósea. Las médulas óseas se enjuagan, se fijan, se deshidratan en etanol, se incrustan en resina plástica y se montan para generar secciones transversales. Las secciones semidelgado y delgado se preparan para observaciones histológicas y TEM, respectivamente. Este método se puede utilizar para cualquier célula de la médula ósea, en cualquier instalación de EM y tiene la ventaja de utilizar tamaños de muestra pequeños que permiten la combinación de varios enfoques de imagen en el mismo ratón.
Introduction
Los megacariocitos son células poliploides grandes especializadas, localizadas en la médula ósea, responsables de la producciónplaquetaria 1. Se originan a partir de células madre hematopoyéticas a través de un intrincado proceso de maduración, durante el cual los precursores de megacariocitos aumentan progresivamente de tamaño, mientras sufren extensos cambios morfológicos concomitantes en el citoplasma y el núcleo2. Durante la maduración, los megacariocitos desarrollan una serie de elementos estructurales distinguibles que incluyen: un núcleo polilobulado, invaginaciones de la membrana superficial que forman el sistema de membrana de demarcación (DMS), una zona periférica desprovista de orgánulos rodeada por la red citoesquelética basada en actina y numerosos orgánulos que incluyen gránulos α, gránulos densos, lisosomas y múltiples complejos de Golgi. A nivel ultraestructural, una modificación importante observada es la compartimentación citoplasmática en regiones discretas delimitadas por el DMS3. Este extenso suministro de membranas alimentará la extensión de largos procesos citoplasmáticos en la fase inicial de la producción de plaquetas, que luego se remodelarán en plaquetas dentro de la circulación. Cualquier defecto durante la diferenciación y maduración de megacariocitos puede afectar la producción de plaquetas en términos de recuento de plaquetas y / o función plaquetaria.
La microscopía electrónica de transmisión de capa delgada (TEM) ha sido el enfoque de imagen de elección durante décadas proporcionando una ultraestructura de alta calidad de megacariocitos que han dado forma a nuestra comprensión de la fisiología de la trombopoyesis4,5. Este artículo se centra en un método TEM estandarizado que permite capturar el proceso de biogénesis plaquetaria que ocurre in situ dentro del microambiente de la médula ósea nativa, que también podría servir como base para analizar cualquier tipo de célula de la médula ósea. Proporcionamos ejemplos ultraestructurales del desarrollo de megacariocitos desde inmaduros hasta completamente maduros, que extienden los procesos citoplasmáticos en la microcirculación de sinusoides6. También describimos un procedimiento fácil para cuantificar las diferentes etapas de maduración de los megacariocitos, instruyendo sobre la regeneración y la capacidad de producción de plaquetas de la médula ósea.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las normas europeas 2010/63/EU y el Comité CREMEAS sobre la Ética de los Experimentos con Animales de la Universidad de Estrasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). El protocolo se muestra esquemáticamente en la Figura 1.
1. Recolección y fijación de médula ósea ( Figura 1A)
PRECAUCIÓN: Este procedimiento incluye sustancias cancerígenas, mutagénicas y / o tóxicas y se realiza bajo una campana de extracción química. Use el equipo de protección adecuado, como guantes y gafas de protección.
- Preparar la solución fijadora que consiste en glutaraldehído al 2,5% en tampón de cacodilato (ver Archivo Complementario).
- Recolección de médula ósea
- Use ratones adultos C57BL / 6 de cualquier sexo de 12 a 18 semanas de edad. Sacrificar a los ratones por asfixia de CO2 y luxación cervical.
- Con un par de tijeras delgadas, corte la piel alrededor del muslo y use pinzas para pelar la piel. Retire la extremidad de la pata y luego corte entre la cadera y el muslo. Separe la tibia del fémur cortando la articulación de la rodilla y elimine el tejido adherente en las tibias y los fémures mediante el uso de un bisturí.
- Retire las epífisis con una cuchilla de afeitar afilada. Mientras sostiene el fémur con pinzas, use una jeringa de 5 ml llena de tampón de cacodilato con una aguja de 21 G para enjuagar la médula ósea en un tubo de 15 ml lleno de tampón de cacodilato de 2 ml. Para hacerlo, inserte el bisel de la aguja en la abertura de la médula ósea y presione lentamente el émbolo hasta que se expulse la médula.
- Fijación de la médula ósea por inmersión rápida en fijador.
- Inmediatamente después del lavado, use una pipeta de plástico para transferir el cilindro de médula ósea a 1 ml de solución fijadora de glutaraldehído fresco (previamente preparada en 1.1) durante 60 min a temperatura ambiente.
NOTA: Para preservar el tejido, asegúrese de que todo el proceso, desde la disección ósea hasta la etapa de fijación, se complete en menos de 10 minutos. Para la fijación, asegúrese de que la solución fijadora esté a temperatura ambiente para evitar el choque térmico.
- Inmediatamente después del lavado, use una pipeta de plástico para transferir el cilindro de médula ósea a 1 ml de solución fijadora de glutaraldehído fresco (previamente preparada en 1.1) durante 60 min a temperatura ambiente.
2. Incrustación de médula ósea en agarosa
NOTA: El tejido de la médula no está lo suficientemente cohesionado para mantener su integridad durante los diferentes pasos de lavado y el material se puede perder fácilmente. Para superar este problema, la médula se cubre con un gel de agar antes de la deshidratación.
- Prepare la solución de agarosa como se describe en el Archivo Complementario.
- Lave la médula fija de la sección 1.3 en tampón de cacodilato y transfiérala cuidadosamente a un portaobjetos de vidrio con una pipeta de plástico. Usando una pipeta tibia, aplique rápidamente una gota de agar líquido al 2% en el cilindro de médula ósea.
NOTA: El agar se solidifica rápidamente mientras se enfría. Para asegurar una cubierta homogénea de la médula ósea, la solución de agar debe mantenerse caliente hasta que se deposite en el portaobjetos. - Coloque rápidamente el tobogán rápidamente sobre hielo hasta que el agar se solidifique (1-2 min).
- Bajo un microscopio, use una cuchilla de afeitar afilada para cortar y desechar las extremidades del cilindro de la médula ósea debido a la posible compresión del tejido en estas áreas. Transfiera los bloques de médula en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml que contengan 1 ml de tampón de cacodilato.
3. Incrustación de médula ósea en resina
PRECAUCIÓN: Los componentes de resina son tóxicos; algunos son cancerígenos y deben manipularse con cuidado bajo una campana de extracción química. Use el equipo de protección adecuado, como guantes y gafas de protección. El tetróxido de osmio es altamente volátil a temperatura ambiente y sus vapores son muy dañinos para los ojos, la nariz y la garganta. Antes de ser desechado, el tetróxido de osmio al 2% debe neutralizarse agregando el doble de su volumen de aceite vegetal.
- Preparar la resina epoxi como se describe en el Archivo Complementario.
- Incrustación de resina
NOTA: Mantenga las muestras en los mismos tubos de microcentrífuga durante las incubaciones en baños sucesivos de osmio, acetato de uranilo y etanol. Aspirar los sobrenadantes con una pipeta Pasteur. El volumen de solución utilizado para cada baño debe ser igual al menos 10 veces el volumen de la muestra.- Después de fijar los bloques con 1% de osmio en tampón de cacodilato durante 1 h a 4 °C, lavar una vez en tampón de cacodilato y luego una vez en agua destilada.
- Manche con acetato de uranilo al 4% en agua destilada durante 1 h, lave dos veces en agua destilada.
- Deshidratar a través de una serie graduada de etanol en agua destilada: 4 veces en etanol al 75% durante 5 min, seguido de 3 veces en etanol al 95% durante 20 min y luego 3 veces en etanol al 100% durante 20 min. En este paso, saque una jeringa de resina epoxi del congelador.
NOTA: El protocolo se puede pausar en etanol al 100% durante 1 h. - Para obtener una infiltración y polimerización uniformes de resina epoxi dentro de la médula, incube primero los bloques en 2 baños sucesivos de óxido de propileno durante 15 min.
- Añadir una mezcla 1:1 de óxido de propileno 100% y resina epoxi e incubar durante 1 h. Coloque las muestras en un agitador rotativo lento a temperatura ambiente.
- Añadir resina epoxi 100% dejar la muestra para incubación durante la noche bajo agitación.
- Añadir resina epoxi 100% durante 2 h de incubación, aún bajo agitación.
- Bajo un microscopio, coloque los bloques de médula en moldes planos de silicona. Orientar las muestras para permitir la posterior seccionamiento transversal de toda la médula ósea. Llenar los moldes con resina epoxi y colocarlos a 60 °C durante 48 h.
NOTA: Todas las soluciones (excepto el etanol y el óxido de propileno) se filtran a través de un filtro de 0,22 μm para evitar la contaminación de las muestras. Para garantizar una polimerización adecuada de la resina, evite las burbujas mientras llena los moldes.
4. Seccionamiento ultrafino (Figura 1B)
NOTA: La EM de transmisión requiere secciones de tejido delgadas a través de las cuales los electrones pueden pasar generando una imagen de proyección del interior de las células, la estructura y la organización de los orgánulos internos (gránulos, retículo endoplásmico, Golgi) y la disposición de las membranas celulares intracelulares.
- Monte el bloque de muestra en un soporte de ultra-microtomo. Póngalo en el soporte de la muestra. Recorte las muestras a 45° para eliminar el exceso de resina alrededor del tejido con un cortador de fresado giratorio de diamante o tungsteno.
- Monte las muestras en el ultramicrotomo con una hoja de cuchillo de diamante equipada con un tanque de agua. Corte de secciones transversales de espesor de 500 nm y 100 nm para análisis histológicos y TEM, respectivamente. Recoge secciones flotantes en la superficie del agua con un bucle.
- Deposite la sección de 500 nm de espesor en un portaobjetos de vidrio y las secciones de 100 nm de espesor en rejillas de cobre de barra delgada de malla 200 con un filtro de papel debajo. Prepare cinco cuadrículas para una condición: manche dos rejillas primero y mantenga las tres cuadrículas restantes como respaldo si es necesario.
5. Tinción azul de toluidina para histología
NOTA: Las secciones de tinción para histología son importantes por tres razones: 1) para asegurarse de que el tejido esté realmente cortado y no la resina, 2) para verificar la calidad de la inclusión, y 3) para evaluar rápidamente la muestra de médula. Si esto no es correcto, corte más profundamente en el bloque.
- Seque las secciones semifinas sobre una placa de calor (60 °C).
- Añadir 1% de azul de toluidina filtrado/borato de sodio al 1% en agua destilada en los portaobjetos y calentar en una placa caliente (60 °C) durante 1-2 min. Lave los portaobjetos con agua destilada y déjelo secar en la placa de calor.
- Monte secciones en la cubiertas con una gota de medio de montaje de poli(metacrilato de butilo-cometilo metacrilato) y examine bajo un microscopio de luz.
6. Tinción de metales pesados para la observación tem (Figura 1C)
NOTA: Para el contraste, la parte superior de las rejillas se invierte en gotas de 100 μL de cada baño sucesivo con un bucle. Antes de su uso, cada solución se filtra a 0,22 μm. Retire el exceso de líquido entre cada baño contactando suavemente el lado de la rejilla en un papel de filtro.
- Tinción con acetato de uranilo al 4% en agua destilada durante 5 min.
- Lavar 3 veces en agua destilada durante 5 min.
- Manchar con citrato de plomo durante 3 min.
- Lavar 3 veces en agua destilada durante 5 min.
- Deposite las rejillas por el lado inferior en contacto con el papel de filtro para dejarlas secar.
NOTA: Los metales pesados reaccionan en presencia de dióxido de carbono. Para minimizar los precipitados, evite el desplazamiento del aire durante el contraste, no hable, mantenga el ambiente tranquilo y apague el aire acondicionado.
7. TEM (Figura 1E)
NOTA: Las secciones se introducen en un microscopio TEM y se examinan a 120 kV.
- Primero examine las secciones a bajo aumento (< 500x) para apreciar el aspecto general de la preparación (ausencia de agujero en la resina, pliegues / compresión en las secciones, precipitados debido a la tinción).
- Luego examine las secciones con un aumento más alto (~ 2000x que permite distinguir la etapa de maduración). Contar manualmente los megacariocitos de cada etapa de maduración en secciones transversales enteras (ver Resultados representativos sobre cómo identificar visualmente cada etapa).
NOTA: Cada cuadrado de las rejillas se define como un área para el examen (que equivale a 16000 μm2 para 200 rejillas de cobre de malla). - Para evaluar el número de megacariocitos, cuantifique solo los cuadrados que están completamente cubiertos con una sección. Para ello, utilice un modelo basado en el cribado de rangos. Observe un primer rango de cuadrados de una extremidad de la sección a otra, luego otro rango de la misma manera, etc. Utilizando este procedimiento, evalúe completa y sistemáticamente toda la sección transversal de la médula cuadrado por cuadrado.
- Para cada cuadrado, puntúe el número de megacariocitos en estadio I, II o III.
NOTA: Se requieren aumentos más altos para analizar los gránulos, la organización del DMS, el tamaño de los territorios citoplasmáticos y el núcleo polilobulado.
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Representative Results
Histología de la médula ósea
La observación de la histología azul de toluidina de la médula ósea bajo un microscopio de luz es clave para analizar rápidamente la arquitectura general del tejido en términos de, por ejemplo, la compacidad del tejido, la continuidad del microvaso y el tamaño y la forma de los megacariocitos (Figura 1D). Se realiza antes de secciones ultrafinas para determinar la necesidad de cortar más profundamente en el bloqueo de la médula ósea. Debido a su tamaño gigante y lobulación nuclear, los megacariocitos más maduros pueden visualizarse fácilmente con un objetivo 40x. Esto da una visión general excelente y rápida de la densidad de megacariocitos maduros en el tejido y su localización relativa a los microvasos. Ya se pudieron detectar anomalías en la proliferación y maduración de megacariocitos en tales secciones semidelgadas.
Ultraestructura de la médula ósea
Sobre la base de distintas características ultraestructurales, los megacariocitos murinos se dividen en 4 etapas que representan etapas secuenciales en su maduración (Figura 2A). Los megacariocitos en estadio I tienen un diámetro de 10-15 μm con un núcleo grande que ocupa la mayor parte de la célula y que contiene abundantes ribosomas y retículo endoplásmico rugoso. La presencia de la etapa detectable más temprana del DMS, llamada pre-DMS, es también un criterio clave para distinguir los DIPUTADOs de la etapa I en el análisis TEM3. En la etapa II de maduración, comienza la formación de gránulos y se inicia el desarrollo del DMS. Los megacariocitos aumentan de tamaño, midiendo 15-25 μm de diámetro y desarrollan lobulación nuclear. Los megacariocitos maduros en estadio III son células gigantes de 25-50 μm de diámetro. Su citoplasma contiene un SGD bien desarrollado con territorios citoplasmáticos claramente definidos y una zona periférica desprovista de orgánulos. En esta etapa, el núcleo generalmente se encuentra excéntricamente y aparece muy irregular con cromatina condensada ubicada en la membrana nuclear. El último paso se caracteriza por un núcleo desnudo, también llamado pirenocyte, que consiste en un gran núcleo rodeado por una membrana plasmática después de que se ha eliminado la mayor parte del citoplasma. En ratones salvajes tipo C57BL/6, la médula ósea comprende aproximadamente el 8% de la etapa I, el 20% de la etapa II, el 71% de los megacariocitos de la etapa III y < el 1% de los pirenocitos. El número promedio de megacariocitos está entre 1,7 y 2,2 células por cuadrado. Esta clasificación arbitraria permite monitorizar convenientemente un proceso continuo de diferenciación celular y detectar sus posibles anomalías.
Además de estas etapas clásicas de maduración, la observación de megacariocitos fijos en la médula ósea permite analizar la serie de eventos que ocurren cuando los megacariocitos interactúan con la pared sinusoidal (Figura 2B). Los megacariocitos en contacto con las células endoteliales se observan con frecuencia en secciones delgadas. En ocasiones se observan megacariocitos formando protuberancias invasivas cortas penetrando en el endotelio o extendiendo gran proyección de su citoplasma hacia la luz sinusoidal7,8. Sorprendentemente, estos procesos citoplasmáticos intravasculares muestran tamaños, longitudes y diámetros variables, lo que ilustra la remodelación progresiva de las plaquetas en la circulación. Las plaquetas ya presentes en la circulación general, que tienen una forma discoide mantenida por bobinas de microtúbulos circunferenciales, también son visibles en la luz de los sinusoides. Esta morfología típica de las plaquetas es indicativa de la correcta fijación de la muestra.
La microscopía electrónica de transmisión tiene el nivel de resolución requerido para visualizar detalles ultraestructurales, como la lobulación nuclear, la organización espacial del DMS y los gránulos en términos de tamaño, forma y distribución. La Figura 2C es un ejemplo de la región perinuclear en un megacariocito en estadio III que muestra la presencia de gránulos α, cisternas de Golgi, mitocondrias y retículo endoplásmico. También cabe destacar en la Figura 2C un cuerpo multivesicular, que representa una etapa intermedia en la formación de gránulos alfa y densos, que contiene exosomas múltiples que miden menos de 200 Å de diámetro9,10. Finalmente, la microscopía electrónica de transmisión permite visualizar neutrófilos y otras células hematopoyéticas presentes en el interior de los megacariocitos, (Figura 2D) siguiendo un proceso poco común llamado emperipolesis por el cual una célula penetra en otra célula viva11. Este proceso, que afecta al 4% de los megacariocitos en condiciones fisiológicas normales, puede incrementarse significativamente en ciertas condiciones patológicas12.
Figura 1: Ilustración esquemática de la configuración experimental. (A) Procedimiento de incrustación de médula ósea. La médula ósea se enjuaga y se fija por inmersión rápida en solución de glutaraldehído. La fotografía ilustra la apariencia típica del cilindro de médula ósea después del lavado. Después de 1 h de fijación a temperatura ambiente, la médula se rodea de agarosa, se fija en tetróxido de osmio y se incuba en acetato de uranilo. Los tejidos se enjuagan en tampón, se deshidratan en una serie de etanol graduado, se incuban en óxido de propileno y se infiltran con resina epoxi. (B) La médula ósea bloquea la seccionamiento. La médula ósea incrustada se monta en un soporte ultramicrotome, se recorta a 45 ° y se corta en secciones semidelgados (500 nm) o delgadas (100 nm). Para los estudios ultraestructurales, las secciones flotantes se recogen con un bucle y se depositan en rejillas con un filtro de papel debajo. (C) Tinción de contraste para observaciones TEM. Las rejillas se invierten en gotas de acetato de uranilo, se lavan en gotas de agua destilada y se incuban en citrato de plomo antes de otra serie de lavados. Después del secado (parte superior con las secciones), las muestras están listas para ser examinadas bajo el TEM. (D) Histología de una sección de médula femoral de ratón teñida con azul de toluidina. Las células gigantes corresponden a megacariocitos maduros (1), algunos en contacto con sinusoides (2). Los sinusoides convergen en una vena sinusal central grande (3). Barra: 20 μm. Recuadro: Aspecto normal de un megacariocito maduro a un aumento de 40x. (E) Imagen TEM representativa de una sección de médula ósea a bajo aumento. Las células están apretadas con poco espacio extracelular. Cada cuadrado de cuadrícula de la sección se observa de una extremidad a otra siguiendo el camino esquemático de flechas (flechas rojas). Barra: 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes representativas in situ de la ultraestructura de los megacariocitos. (A) Etapas de maduración características de los megacariocitos de tipo salvaje. Los megacariocitos se clasifican en cuatro etapas de maduración: Etapa I, una célula de 10-15 μm de diámetro con un núcleo grande; estadio II, una célula de 15-30 μm de diámetro que contiene el SGD en desarrollo; estadio III, una célula de 30-50 μm que contiene un sistema de membrana de demarcación (DMS) bien desarrollado que define los territorios citoplasmáticos y tiene una zona periférica libre de orgánulos. Un pirenoccito corresponde al núcleo polilobulado desnudo que queda en la médula ósea después de la extensión citoplasmática completa. Barras: 10 μm (B) Interacciones megacariótico-célula endotelial y procesos citoplasmáticos intravasculares. (i) La zona periférica (PZ) de un megacariocitos se aplica estrechamente a la superficie abluminal del endotelio sinusoidal. (ii) Un megacariocitos que forman protuberancias invasivas cortas que penetran profundamente en la capa endotelial (puntas de flecha). (iii-v) Las flechas indican procesos citoplasmáticos de megacariocitos con diámetros variables, algunos de los cuales son muy grandes y tienen una zona periférica que puede representar fragmentos que acaban de entrar en el torrente sanguíneo. (vi) Una plaqueta discoide típica (P) observada en la luz sinusal. En cada micrografía, la línea roja indica el lado luminal de la barrera endotelial y la estrella indica la luz sinusoide. Barras: 2 μm. (C) Aumentos más altos de la región perinuclear de un megacariocito maduro. α, gránulo alfa; rer, retículo endoplásmico rugoso; G, golgi; MVB: cuerpo multivesicular; m, mitocondrias. Bar: 0,5 μm. (D) Ejemplo de un megacariocito que muestra emperipolesis. El neutrófilo envuelto aparece morfológicamente inalterado por la interacción con los megacariocitos. Barra: 2 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Expediente Complementario: Elaboración de los reactivos. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El examen directo de los megacariocitos en su entorno nativo es esencial para comprender la megacaripoyesis y la formación de plaquetas. En este manuscrito, proporcionamos un método de microscopía electrónica de transmisión que combina el lavado de la médula ósea y la fijación por inmersión, lo que permite diseccionar in situ las características morfológicas de todo el proceso de morfogénesis de megacariocitos que tiene lugar en la médula ósea.
El lavado de la médula ósea es un paso crítico de este método, ya que el éxito de un lavado de alta calidad depende de la práctica y la capacitación del operador. Aunque es delicado, el lavado de la médula ósea es la mejor manera de evitar la eliminación del hueso mineralizado, que generalmente requiere un tratamiento de EDTA de 2 semanas para la descalcificación completa asociada con artefactos significativos en la morfología de los megacariocitos. Además, una ventaja importante de recolectar médula ósea entera no fija de tibia y fémures es la capacidad de combinar varios enfoques de imágenes para el mismo ratón. En la práctica, solo se requiere una sola médula ósea para el estudio ultraestructural, estando los otros tres especímenes disponibles para análisis complementarios. La segunda médula ósea se puede utilizar para la preparación de explantes de médula ósea fresca, para estudiar en tiempo real la dinámica de la formación proplalet de megacariocitos nativos6. La tercera muestra generalmente está diseñada para estudios de inmunotinción en secciones gruesas, proporcionando imágenes 3D y distribución de megacariocitos dentro de su entorno natural. La última muestra puede ser congelada y almacenada para estudios posteriores mediante microscopía electrónica de inmunooro, donde se investiga la localización subcelular de proteínas a alta resolución4. Estos métodos de imagen combinados, junto con la disponibilidad de la deleción/mutación dirigida de genes en un ratón, proporcionan un medio importante para delinear in situ el papel biológico de una proteína dada en la trombopoyesis. Sin embargo, debe señalarse aquí que una limitación de este método es la retirada de las epífisis necesarias para enjuagar la médula. Se sabe que las epífisis son áreas importantes para la hematopoyesis y, por lo tanto, su eliminación dificulta cualquier posibilidad de analizar las células madre hematopoyéticas y las fases iniciales de compromiso13. Otra limitación es que los progenitores de megacariocitos antes de la etapa inmadura I no pueden ser identificados porque estas células no tienen características ultraestructurales específicas. Para superar esta limitación, se podría utilizar un enfoque de inmunooro EM.
El segundo paso importante del método es la fijación de la médula ósea por inmersión. Cuando se realiza en las condiciones descritas aquí, es decir, la fijación inmediatamente después de enjuagar el cilindro compacto de médula ósea, tiene las siguientes ventajas: (i) es rápido y fácil de realizar, (ii) conserva una ultraestructura cercana a la observada después de la fijación por perfusión6, y (iii) mantiene procesos de megacariocitos libres y plaquetas en el torrente sanguíneo sinusoide que de otro modo se eliminan / pierden después de la perfusión. Con esta técnica es posible investigar la entrada de megacariocitos en la circulación sinusoidal y caracterizar todas las formas intermedias de procesos citoplasmáticos de las que surgen plaquetas8. En línea con esto, recientemente se ha reportado que las grandes protuberancias intravasantes de los megacariocitos in vivo son estructuralmente distintas de las extensiones delgadas formadas por los megacariocitos in vitro,con una disposición notablemente diferente de los microtúbulos7. Del mismo modo, hemos demostrado recientemente que el mecanismo que gobierna la formación de plaquetas in vivo difiere del identificado in vitro14.
Se reconocen cada vez más importantes diferencias ultraestructurales entre los megacariocitos nativos cultivados in vitro y los generados in vivo, lo que subraya la necesidad del microambiente de la médula ósea para una diferenciación/ maduración completa de los megacariocitos. Después de la combinación de enrojecimiento de la médula ósea y fijación por inmersión descrita en este artículo, la microscopía electrónica de transmisión convencional sigue siendo una herramienta invaluable para estudiar la biología de los megacariocitos y la formación de plaquetas, en condiciones fisiológicas y patológicas.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), la Unión Europea a través del Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) y por la Subvención ANR-17-CE14-0001-01 a H.d.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar | Electron Microscopy Sciences, USA | 1670-B | |
| CaCl2 Calcium chloride hexahydrate | Merck, Germany | 2083 | |
| Copper grids 200 mesh thin-bar | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
| Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate | Merck, Germany | 8.20670.0250 | |
| Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
| Double Edge Stainless Razor blade | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
| Ethanol absolut | VWR International, France | 20821296 | |
| Filter paper, 90 mm diameter | Whatman, England | 512-0326 | |
| Flat embedding silicone mould | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
| Glutaraldehyde 25% | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 16210 | |
| Heat plate Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
| Histo Diamond Knife 45° | Diatome, Switzerland | 1044797 | |
| JEOL 2100 Plus TEM microscope | JEOL, Japan | EM-21001BU | |
| Lead citrate - Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
| LX-112 resin | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate | Sigma, France | M2393-100g | |
| Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 15320 | |
| Nadic Methyl Anhydride (NMA) | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
| Osmium tetroxide 2% | Merck, Germany | 19172 | |
| Propylene oxide (1.2-epoxypropane) | Sigma, France | 82320-250ML | |
| Saline injectable solution 0.9% NaCl | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
| Scalpel Surgical steel blade | Swann-Morton, England | .0508 | |
| Sodium tetraborate - Borax | Sigma, France | B-9876 | |
| Sucrose | Merck, Germany | 84100-1KG | |
| Syringe filter 0.2µm | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
| Toluidine blue | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
| Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
| Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
| Uranyl acetate | Ladd Research Industries, USA | 23620 |
References
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