Vajinal Lavaj Kullanarak Kemirgen Östrus Döngüsünün İzlenmesi: Normal Bir Döngü Olarak Böyle Bir Şey Yok

Summary

Bu çalışma, dişi sıçanları içeren deneysel tasarımlarda göz önünde bulundurulması gereken önemli faktörleri detaylandırmaktadır. Daha geniş anlamda, bu veriler damgalamayı azaltmaya ve daha kapsayıcı teşhis ve müdahale araçlarının geliştirilmesine yardımcı olmaya hizmet eder.

Abstract

Mevcut metodoloji, dişi Sprague Dawley (SD) ergen sıçanlarının östrus döngüsünü izlemek için tekrarlanabilir, standartlaştırılmış ve uygun maliyetli bir yaklaşım ortaya koymaktadır. Bu çalışma, hormonal siklusların karmaşıklığını ve güvenilir ve geçerli bir izleme tekniği oluşturmak için gereken geniş anlayış spektrumunu göstermektedir. Temel deneysel tasarım ve prosedürel unsurların derinlemesine incelenmesi yoluyla, döngünün bu tanımı ve temel ilkeleri, gelecekteki çoğaltma için yanlış anlamaları daha iyi anlamak ve yapıbozuma uğratmak için bir çerçeve sağlar.

Vajinal lavaj kullanan numune toplama sürecinin bir taslağı ile birlikte, prosedür, dört aşamalı proöstrus, östrus, metestrus ve diestrus modeline veri kategorizasyon mekanizmasını açıklar. Bu aşamalar, vajinal sıvı durumunun, mevcut hücre tiplerinin, hücre düzenlemesinin ve toplama sırasındaki hücre miktarının 4 kategorize edici belirleyicisini kullanan yeni bir önerilen yaklaşımla karakterize edilir. Her aşamanın varyasyonları, olumlu ve olumsuz örnekler, döngüsellik ve asiklik arasındaki ayrım ve toplanan kategorizasyon bileşenlerinin grafik tasvirleri, verilerin etkili yorumlayıcı ve örgütsel uygulamalarının yanında sunulmaktadır. Genel olarak, bu araçlar ölçülebilir veri aralıklarının ilk kez yayınlanmasına izin vererek çoğaltma üzerine kategorizasyon faktörlerinin standartlaştırılmasına yol açar.

Introduction

Yeni katkılar
Kemirgen östrus döngüsü, sağlığın temel bir göstergesi olarak tanımlanmıştır. Bununla birlikte, araştırmacıların bilinçsiz önyargıları ve kadın bedeni ile ilgili yanlış yorumlar, bilim camiasını engellemektedir. "Estrous" kelimesinin etimolojisi, aşağılık ve olumsuzluk duygusunu ima eder. Euripides bu terimi "çılgınlık" ya da deliliği, Homeros paniği ve Platon da irrasyonel bir dürtüyü tanımlamak için kullanmıştır. Bu çalışma, bu ilkel perspektiflerin mevcut bilimsel topluluğu nasıl etkilediğini vurgulamakta ve bu endişeleri, daha kapsamlı bir yaklaşım için kapsamı genişletilmiş, daha önce çalışılan yöntemlerin güncellenmiş bir kombinasyonu olan yeni bir mozaik paradigması aracılığıyla ele almaktadır.

Bu tekniğin incelenmesi ve kullanılması, öncelikle, standartlaştırılmış ve kapsamlı bir izleme tekniği olmadığı ve veri yorumlama uygulamalarının belirsiz olabileceği için gereklidir. İkincisi, östrus döngüsü özellikleri, çalışılan bireysel sıçanlara bağlı olmasına rağmen, genellikle evrenselleştirilmiştir. Üçüncüsü, hormonal döngüler rutin ve faydalı süreçler olsa da, 'İnsanlara Çeviri' bölümünde araştırılan tehlikeli damgalama ile çevrilidir. Bu çalışma, bu üç konuyu üç şekilde ele almayı amaçlamaktadır: (A) derinlemesine bir östrus döngüsü izleme tekniğini tanımlayarak ve sonuçların nasıl yorumlanabileceğini açıklığa kavuşturarak, (B) her döngünün bütünlüğünü ve bireyselliğini koruyan yöntemleri ana hatlarıyla belirterek ve (C) kanıtlanmamış uygulamaları sürdüren yanlış anlamalara dikkat çekerek.

Bu çalışma aynı zamanda, yetişkinlikte çeşitli davranışsal, anatomik ve fizyolojik belirtilere ışık tutan önemli gelişimsel değişikliklerle işaretlenmiş bir dönem olan ergen sıçanlara odaklanması bakımından da benzersizdir¹. Ortak önyargıları yapıbozuma uğratırken, az araştırılmış bir popülasyonda hormonal döngüleri izlemek için standartlaştırılmış bir deneysel tasarım oluşturmak, güvenilir ve geçerli hormonal korelasyonların geliştirilmesine izin verecektir ^2,3,4 ve duruma bağlı döngü bozulmalarının belirlenmesi 5,6,7,8,9,10 . Nihayetinde, bu yenilikler çeşitli sağlık endişelerinin tanı kriterlerini, tedavilerini ve müdahalelerini genişletmeye hizmet eder.

Temel tanımlar ve kullanımlar
Östrus döngüsü, üç salınımlı kadın cinsiyet steroid hormonuna yanıt olarak ortaya çıkan dinamik fizyolojik süreçlerin bir koleksiyonudur: östradiol, lötenize edici hormon (LH) ve progesteron (Şekil 1A, B). Endokrin ve merkezi sinir sistemi arasındaki etkileşimler, çoğunlukla 4-5 gün boyunca devam eden ve cinsel olgunlaşmanın başlangıcından üreme yaşlanmasına ve / veya kesilmesine kadar tekrarlayan döngüyü düzenler. Hormon seviyelerine göre ayrı kategorilere ayrılır - en yaygın olarak dairesel bir şekilde ilerleyen diestrus (DIE), proöstrus (PRO), östrus (EST) ve metestusun (MET) 4 aşamasına ayrılır. Bölüm sayısı, çalışmanın niteliğine bağlı olarak 3 aşama^{11 ila 13} aşama¹² arasında değişebilir¹³. Daha düşük sayıda bölüm genellikle MET'i bir aşama olarak hariç tutar ve kısa süreli bir geçiş dönemi olarak sınıflandırır. Daha yüksek sayı tipik olarak, tümör gelişimi veya spontan psödogebelik, embriyonik implantasyon olmadan gebeliğin fizyolojik durumu^12,14,15 gibi fenomenlerin daha yakından incelenmesine izin veren alt bölümleri içerir.

Bu çalışmada, evreler, mevcut 3 kategorize edici determinant-hücre tipi (ler), hücre düzenlemesi ve hücre miktarı olarak adlandırılan vajinal kanalın bileşenleri aracılığıyla tanımlanmıştır (Şekil 2A-D). Bu çalışmada vajinal sıvının durumu izlenmemiş olsa da, dördüncü kategorize edici bileşen olarak dahil edilmesi önerilmektedir. Vajinal sıvının incelenmesi hakkında daha fazla bilgi referans listesi^16'da bulunabilir. Kategorize edici bileşenler, günümüzde östrus döngüsü izlemede önerilen birincil teknik olan vajinal lavaj yoluyla hücrelerin çıkarılmasıyla incelenebilir. Her evredeki derinlemesine fizyolojik süreçler bu çalışmanın kapsamı dışında kalırken, literatürde daha fazla bilgi bulunabilir¹⁷.

Bu östrus döngüsü izleme tekniğinin kullanımı ve sürekli gelişimi, seks steroid hormonları ile kardiyovasküler sistem 18, endokrin sistem 8 ve merkezi sinir sistemi^19,20,21 gibi vücut sistemlerinin işlevi arasındaki bağlantılara dayanmaktadır. Aynı zamanda, dişi kemirgenler^22,23,24,25 dahil olduğunda östrus döngüsü izleme her zaman gerekli olmayabilir. Daha ziyade, öncelikle belirli bir çalışma alanında cinsiyet farklılıklarının rapor edilip edilmediğini düşünmek önemlidir, bu da yayınlanmış incelemelerde daha fazla araştırılabilir^22,23. Efroz döngü izleme, geniş bir araştırma araştırması yelpazesinde hayati öneme sahip olsa da, dişi kemirgenlerin deneylere dahil edilmesinin önünde bir engel olarak görülmemelidir. Bu teknik karmaşık ve zaman alıcı görünse de, araştırmacıya bağlı olarak prosedürün tamamlanması 15 dakikadan az sürebilir ve uygun maliyetlidir. Genel olarak, dişi kemirgenlerin bilimsel çalışmalara dahil edilmesi, vücut sistemlerinin, çeşitli koşulların ve patolojilerin ve genel sağlığın anlaşılması için avantajlıdır, çünkü bu gelişmeler esas olarak erkek vücudu şablonuna dayanmaktadır.

Kemirgenlerde evrensel parametreler ve doğal değişkenlikler
Standart döngü modellerini tanımlamak, karşılaştırmalı ve analitik amaçlar için parametreleri ayarlamak ve anormallikleri ve aykırı değerleri tespit etmek için "tipik" olarak görülen yönler için aralıklar oluşturmak gereklidir. Aynı zamanda, her sıçanın döngüsünün benzersiz olduğunu ve hayvan suşuna, fizyolojik süreçlere ve çevresel koşullara dayalı sapmaların beklendiğini bilmek de önemlidir. Aslında, östrus döngüsünün en "normal" yönlerinden biri değişkenliktir. Bu, 3-38 gün aralığında^26,27 olan toplam döngü uzunluğunda görülür; 32-34 gün ile birden fazla hafta arasında değişebilen cinsel olgunlaşma yaşı^28,29,30; döngüsel olmayan¹¹ ve kategorize edici belirleyici kalıplar^11,13 olarak kabul edilir. Genel olarak, östrus döngüsü için evrensel bir şablon yoktur ve bunu hem bilimsel topluluğa hem de genel halka çevirmek deneysel sürecin önemli bir parçasıdır.

Deneysel zaman noktaları ve gelişim yaşı
Bu değişkenlik ilkesini tanımak, güvenilir ve geçerli bir deneysel tasarım oluşturmaya yardımcı olur. Örneğin, östrus bisiklet izlemenin başlangıcı, sıçanların çevresel ve fizyolojik faktörlere bağlı olarak değişen anatomik ve fizyolojik gelişimine dayanır. İzleme, vajinal kanalın iç kısmına giden vulva ile çevrili dış vajinal delik olan vajinal açıklığın (VO) gelişmesine kadar başlayamaz (Şekil 3A-D). VO genellikle 32 ila 34 günlük yaşlar arasında tamamen gelişirken, her bir konu için bireyselleştirilmiş kalır ve süreç hakkında çok şey bilinmemektedir. Bu açıklık, östradiol 31'in artışı, hipotalamik-hipofiz-yumurtalık ekseninin olgunlaşması 32 ve sıçanlarda ilk yumurtlama 17,33,34,35 ile bağlantılı olan cinsel olgunlaşmanın başlangıcını tanımlamak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, son yayınlar, olumsuz ortamlarda hormonal ve gelişimsel olaylardan ayrılabileceği için üreme gelişiminin yalnızca dolaylı bir belirteci olduğunu bulmuştur³¹ ve cinsel olgunlaşmadan ziyade östradiol seviyelerindeki değişiklikleri temsil edebilir³³. Bu nedenle, gelişimsel yaşı belirlemek için sadece VO'ya güvenilmemesi ve östrus döngüsü izleme³⁶ için bir niteleyici olarak değil, aynı zamanda cinsel olgunlaşmanın başlangıcını işaretlemek için ilk EST aşamasının görünümünü ve epitel hücrelerinin^{kornifikasyonunu 30} olarak kullanmanız önerilir.

Vücut ağırlığı,^{kemirgenlerde 30,37} ergenlik döneminde gelişim yaşı ile özellikle ilişkilidir ve bu nedenle bu dönemde gelişim yaşının belirlenmesinde de yardımcı olabilir. Bu fenomenle ilgili önerilen mekanizmalar, büyüme hormonu gibi üreme gelişimi için gerekli hormonların uyarılmasını ve iştah düzenleyicisi leptin³⁰ tarafından hipotalamik-hipofiz adrenal (HPA) ekseninin inhibisyonunu içerir. Bununla birlikte, türler arasında sıçanlar ve satıcı sağlayıcılar arasında görülen büyük varyans nedeniyle bu önlemin gelişim yaşının tek göstergesi olarak kullanılması önerilmez³⁸. VO ve vücut ağırlığının gelişiminde görülen değişkenlik, kavramın genel deneysel süreçteki önemini örneklemektedir.

İnsanlara çeviri: kültürel ve bilimsel bağlamlar
Hayvan-insan üreme çalışmalarının translasyonel ilişkisi çift yönlüdür. Hayvan temelli çalışmalardan elde edilen sonuçlar, insan süreçlerinin nasıl değerlendirildiğini, yaklaşıldığını ve analiz edildiğini etkiler³⁹. İnsan üreme sisteminin algılanması ve bununla ilgili süreçler, hayvanların nasıl çalışıldığını etkiler. Aslında, bu alanda daha fazla araştırma için en yüksek sesli göstergelerden biri, bilimsel süreci etkileyen hormonal döngülerle ilgili önyargılı sosyokültürel inançlardan kaynaklanmaktadır. Bu sözleşmelerin çoğu, menstrüasyonu tartışmaya yönelik genel bir kültürel isteksizlikten türetilmiştir ve bu da iyi kanıtlanmış bilgilerde bir veri boşluğuna yol açmıştır^40,41. Bunun, raf yüksekliğinden ve akıllı telefon boyutundan polis vücut zırhı takılmasına ve kaçırılan kanser teşhislerine kadar küçükten ölümcüllüğe kadar uzanan bir dizi sonucu vardır⁴².

Menstrüasyonun sağlıksız, yıkıcı ve toksik olarak tanımlanması - saygın metinlerde, medyada, sözlüklerde ve tıbbi öğretilerde görülür - bilimsel yayınlar tarafından korunmaktadır. Bu, hormonal döngülerin yanlış ve önyargılı tanımları, üreme sisteminin nöroendokrin muadillerinden ve çevresel etkilerden izole edilmesi ve bir döngünün tamamlanmasının "gebe kalmama" olarak indirgemeci bakış açısıyla ortaya ^çıkar43,44. Bu, hormonal döngüleri etkileyen dış değişkenlerin ihmal edilmesi, yalnızca anatomik gelişmelere dayanarak başlangıç ve bitiş noktalarının belirlenmesi ve döngü ilerlemesinin dairesel değil doğrusal bir şekilde ölçülmesi gibi sağlam olmayan deneysel uygulamaların yaratılmasına yol açmaktadır. Sosyokültürel faktörler ve biyolojik sonuçlar arasındaki doğrudan korelasyona rağmen, bilimsel literatürde sıklıkla dikkate alınmamaktadır. Daha bütünsel yayınların incelenmesi yoluyla^43,44,45, araştırmacılar bu damgaları yapıbozuma uğratabilir ve daha güvenilir ve geçerli deneysel tasarımlar oluşturabilirler.

Protocol

Bu protokolde özetlenen tüm kullanım ve prosedür yöntemleri, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) hayvan bakımı ve kullanımı kılavuzlarıyla uyumludur ve Pepperdine Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) ve UCLA Şansölyesi Hayvan Araştırma Komitesi (ARC) tarafından onaylanmıştır.

1. Hayvan bakımı ve kullanımı

1. Güç analizine göre sayılarla dişi sıçanlar ve Whitten etkisini veya daha tutarlı döngüyü teşvik etmek için erkek sıçanlar elde edin⁴⁶. Bilinen veri tabanlarında çalışmanın amacına göre suşu belirleme⁴⁷.
   NOT: Mevcut veriler, işbirlikçi bir çalışmanın parçası olarak hem Pepperdine Üniversitesi hem de UCLA laboratuvarlarında bulunan erkek SD sıçanlarının varlığında kadın ergen SD Uluslararası Genetik Standardizasyon Programı'nın (IGS) verilerini yansıtmaktadır. Bu sıçanlar 28 günlükken ayrı gruplar halinde geldiler ve 34 günlükken (7 günlük bir alışma periyodunu takiben) akut ve kronik seviyelerdeki farklılıkları göstermek için östrus döngüsü ilerlemesi 10 veya 20 gün boyunca izlendi.
2. İşlemden önce, taşıma ve yeni ortama uyum sağladıktan sonra fizyolojik stabilizasyon için bir karantina ve / veya alışma süresi bekleyin.
   NOT: 3 günlük minimum süre belirtilmiş, 7 günlük süre 48,49,50,51,52 önerilmiştir. Genel olarak, bu ulaşım koşullarına, hayvan suşuna ve çalışma hedeflerine bağlıdır.
3. Bir alışma periyodu kullanılarak stresin azaltılmasını sağlayın, çünkü stres uygun üreme sisteminin işleyişini bozabilir⁵³. Bununla birlikte, onu ortadan kaldırmaya çalışarak aşırı telafi etmeyin, çünkü ılımlı miktarda stres hayvanların refahı için faydalıdır⁵¹.
4. Sıcaklığa (68-79 °F, yani 20-26 °C) ve nem kontrollü (%30-70) bir ortamda konakçı sıçanlar, vivaryum veya laboratuvar yöneticilerine başvurarak bu özellikleri sağlarlar. Şirket web sitesinde listelenen besin bileşenleri ve haftada bir kez kafes temizliği ile su ve chow ad libitum dağıtın.
   NOT: Bu çalışmada, sıçanlar 19 "x 10" x 8" şeffaf yeniden kullanılabilir plastik kafeslerde cinsiyete göre ayrılmış 2'li gruplar halinde barındırıldı ve haftada bir kez değiştirilen mısır koçanı yataklarına erişebildi. Sıcaklık 70 ° F'de ve nem% 35-79'da, ortalama% 62 oranında tutuldu.
5. Biyolojik tepkilerin değişmesine neden olabilecek düşük bağıl nem seviyelerinin ve aşırı sıcaklıkların kanıtı için kuyruk ve ayak parmaklarının ringtail veya iskemik nekrozunun gelişimini kontrol edin.
   NOT: Sıcaklık ve nem, üreme sistemi, cinsel olgunlaşma ve östrus döngüsellik^{54,55,56,57,58} için önemlidir.
6. Laboratuvar alanı boyunca zaman kontrollü bir ışık: karanlık sistemi üzerinde hareket eden eşit miktarda ışık kaynağı biriktirerek konut alanı boyunca doğru ve dengeli aydınlatma sağlayın.
   NOT: Burada, 06:00-18:00 saatleri arasında ışıklar açık olan 12:12 saatlik bir ışık:karanlık döngüsü, 2.550 lümenlik Lineer LED ampuller tarafından kontrol edildi.
7. Hayvanların pigmentasyonu, yaşı, suşu, cinsiyeti ve hormonal durumunun varyasyonlarına bağlı olarak^{sağlanan lüks gereksinimleri 52'ye} uyun.
   NOT: Araştırmacılar toplanan hücre örneklerini kategorize ettiklerinde, tutarlı aydınlatma uygun görsel algılama ve güvenilir evreleme^59'a izin verecektir. Işığın süresi ve yoğunluğu doğrudan üreme sistemi, cinsel olgunlaşma ve östrus döngüsü^{54,55,56,57,60,61} ile ilgilidir.

2. Ekipman ve deney hazırlığı

1. Kategorize edici belirleyicileri gözden geçirin ( Şekil 2A'da görülür): östrus döngüsünün her aşamasının nasıl tanımlanacağı ve mikroskop ve kamera ekipmanının nasıl çalıştırılacağı.
2. İzlenecek her deneğin cinsel olgunlaşmaya ulaştığından ve uygun gelişim göstergelerini (VO, vücut ağırlığı ve yaş) gösterdiğinden emin olun. Sıçanları tartın ve doğru karşılaştırmalar için her gün aynı saat arasında VO için inceleyin ve onaylanmış bir taşıma yöntemiyle aktarın. Bir hayvan önceki vücut ağırlığının% 20'sinden fazlasını kaybederse, üniversiteye bağlı veterinere danışın.
   NOT: VO, Şekil 3'te gösterildiği gibi, üretral açıklığa kaudal ve ikisi arasında bulunan anüse kraniyal kalır.
3. Bu faktörler gerinime bağlı olduğundan, spesifikasyonlar için tedarikçiye danışın ve laboratuvara özgü çevresel faktörleri göz önünde bulundurun⁶².
   NOT: Genel olarak, bu 32-34 günlük yaş arasında ve SD sıçanlar için 75-150 gram⁶³ arasında değişen ortalama vücut ağırlığı arasında gerçekleşir ve daha önce membranöz bir kılıfla kaplı dairesel şekilli bir açıklıkla gösterilir.
4. Geçiş örneklerinin toplanmasını önlemek için izlenen sıçan grubuna uygun bir numune toplama süresi seçin. İlk olarak, çoğu döngü aşamasının bulunduğu zamanı belirlemek için gün boyunca 2 veya 3 farklı zaman noktasında birkaç hayvanı örnekleyin (örneğin; farklı hayvanlar için 12: 00 saat, 13: 00 saat ve 14: 00 saatinde örnekleme). Tutarlı ve güvenilir evreleme için vajinal lavajı her gün aynı saatte tamamlayın.
   NOT: Saat 12:00 ile 14:00 arasındaki saatlerin tüm aşamaları yakalamak için en iyisi olduğu bildirilmiştir. Bu çalışmada, östrus döngüsü izleme, sıkıştırma tarzı tutma ile ele alınan 12:00 ile 14:00 saatleri arasında gerçekleşmiştir (bkz. adım 3.4). Östrus döngüsü izleme zamanlamasının diğer deneysel müdahalelere (örneğin, davranışsal koşullandırma, ilaç) göre önemi, gelişmekte olan bir araştırma alanıdır ve daha fazla araştırılabilir¹¹. Östrus döngüsü izlemenin süresinin belirlenmesi çalışmaya bağlıdır ve yayınlanmış çalışmalarda daha fazla araştırılabilir^11,33.
5. Koruyucu kapağı mikroskoptan çıkarın ve koruyucu kamera lensi kapağını çıkarıp objektifi mikroskobun göz merceğinin üzerine yerleştirerek kamerayı bilgisayara takın.
6. Ardından, bilgisayarda önceden seçilmiş yazılımı açın. Bu çalışmada seçilen yazılımı kullanmak için, ekranın sol tarafında, Kamera Listesi etiketli sekmenin altında bulunan USB'ye bağlı kamerayı seçin. USB fotoğraf makinesinin bilgisayara düzgün bir şekilde bağlandığından emin olun, aksi takdirde Kamera Listesi etiketli sekmenin altında Aygıt Yok yazacaktır.
7. USB kamera sekmenin altında seçildikten sonra, tabanda bulunan mikroskop ışık anahtarını açın.
8. Bilgisayarda hücre örnek fotoğrafları için ayrılmış bir klasör oluşturun. Verilerin toplandığı her ayrı gün için, görüntüler çekilmeden önce önceden hazırlanmış bir dosya klasörü oluşturun.
9. Hazırlanan ekipman ile deneğin kafesini tutma yerinden alın ve numune toplama istasyonuna getirin.

3. Vajinal hücrelerin toplanması

1. Tek kullanımlık bir şırınga alın ve şırıngaların her birini 0,2 mL steril% 0,9 NaCl ile doldurun. Hava kabarcıkları varsa, tüm hava kabarcıkları şırınganın açık ucuna ulaşana kadar namlu şırıngasını hafifçe hareket ettirin ve havayı dışarı atın. Hala hava kabarcıkları varsa, çözeltiyi NaCl kabına geri atın ve hiçbiri kalmayana kadar doldurun.
   NOT: Aşırı hareket etmek, daha fazla hava kabarcığı oluşmasına neden olabilir.
2. Steril bir alanı korumak için her bir şırıngayı plastik ambalaja geri koyun, şırınganın ucu ambalajın kapalı kısmının içindedir.
3. Kafesi açın ve konuyu kuyruğun tabanından veya vücudun gövdesinden yavaşça kaldırın, başkalarının çıkmasını önlemek için kafesin kapağını kapatın. Kişisel tercihlere ve hayvan tepkisine bağlı olarak aşağıda listelenenlerden bir tutma yöntemi seçin.
4. Ergen sıçanlar için sıkıştırma tarzı tutuşu, deneği üst göğüs bölgesine doğru yerleştirerek, deneğin burnu yere bakacak şekilde kullanın. Çubukla çalışmaya başlamadan önce, nesnenin hareketi önleyecek kadar sıkıştırıldığından, ancak tutuşta rahat ve güvenli olduğundan emin olun. Şırıngayı takmadan önce kuyruğu hafifçe bükerek konunun vajinal kanalını ortaya çıkarın.
5. Hayvanın ön pençelerini kafesin üstüne veya yanına yerleştirerek yetişkin sıçanlar için Arka Bacak Kaldırıcısını kullanın, kuyruk ve arka bacaklar birinci ve ikinci parmaklar arasında yumuşak bir tutuşla tutulur ve baş parmağı şırınga^64'ü çalıştırmak için serbest bırakır.
6. Hayvanların taşıma ve izlemeye alışmasına izin verin. Aşırı stresi azaltmak ve araştırmacıyı ısırma gibi saldırganlıktan korumak için hayvanları nazikçe ama güvenli bir şekilde kullanın.
   NOT: İzlemenin ilk birkaç günü, hayvanlar koşullarına alıştıklarından istenen sonuçları vermeyebilir. Alışma döneminde vücut ağırlıklarını toplamak için hayvanları ele almak bu geçişe yardımcı olabilir³³.
7. Şırıngayı işaret parmağı ve orta parmakla sabit tutarken, şırınganın ucunu (en fazla 2 mm) vajinal kanala paralel bir açıyla yerleştirin. Pistonu içeri doğru iterek NaCl'yi yavaşça kanala atın. Şırıngayı kanala daha fazla sokmayın, çünkü bunu yapmak östrus döngüsünü bozabilir.
8. Şırınganın pistonunu epitel astarından (yukarı doğru) çekerek NaCl'yi vajinal kanaldan çıkarın. Bu işlem sırasında nesneyi bekletmede tutmakta zorluk yaşanırsa, NaCl ekstraksiyonunu denemeden önce kısa bir dinlenme süresi için kafese geri yerleştirin.
9. Hücre örneği toplandıktan sonra, konuyu tekrar kafese yerleştirin ve tüm örnekler mikroskop altında değerlendirilmeden önce bu prosedürü her hayvan için tekrarlayın.
   NOT: Alternatif olarak, her örnek bir sonraki hayvana geçmeden önce toplanabilir ve değerlendirilebilir. Bir hayvan, numune kategorize edilemezse ikinci bir lavaj gerektirebilir. İlk koleksiyondaki aynı şırınga, saline doğrudan kapta ve sadece aynı hayvan için temas etmezse tekrar kullanılabilir.

4. Numune değerlendirmesi

1. Ekstrakte edilen vajinal sıvı örneğini inceleyerek kategorizasyona başlayın. Viskoziteyi viskoz veya viskoz olmayan olarak ve renklendirmeyi açıklama belgesine veya başka bir kayıt sistemine opak veya şeffaf olarak kaydedin.
   NOT: Protokolün bu bölümü, örnek toplama sırasında veya daha sonra gerçekleştirilebilir.
2. Sıvının 2-3 damlasını mikroskop slaytına atın ve slaytın üzerine bir mikroskop kapağı camı yerleştirin. Hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için kapak camını mikroskop slaytının üstünden altına veya slaytın bir tarafından diğerine yerleştirin. Mümkünse, daha fazla inceleme gerekiyorsa ve slayta aşırı miktarda sıvı yerleştirilmesini önlemek için toplanan numunenin yaklaşık yarısını şırıngada bırakın.
3. Mikroskop slaytını sahne alanı boyunca hareket ettirerek toplanan hücreleri bulun. Çok az hücre veya yüksek miktarda döküntü varsa, kalan sıvıyı yeni bir slayta atın ve yeniden inceleyin. Şırıngada bırakılan numune miktarı yetersizse veya ikinci damla benzer sorunlar gösteriyorsa, östrus döngüsü aşamasını tanımlamaya çalışmadan önce konudan başka bir örnek toplayın.
4. Hücreler bulunduktan sonra ve bilgisayara veya bilgisayar klavyesine dokunmadan önce, klavyenin kirlenmesini önlemek için bir eldiveni çıkarın.
5. Yazılım panelinin sol tarafındaki Snap etiketli işleve tıklayarak hücre örneklerinin görüntülerini alın.
6. Ardından, sayfanın sol üst köşesindeki Dosya simgesinin altındaki Farklı Kaydet'e tıklayarak dosyayı kaydedin. Fotoğrafı bilgisayardaki önceden etiketlenmiş bir klasörün altına kaydedin.
   NOT: Örnek etiket şablonu: #subjectnumber_date collected_estrous stage_objective lens kullanılır.
7. Her karede çok fazla hücre yoksa, her objektif lenste birden fazla fotoğraf çekin.
   NOT: Birden çok görüntü için örnek etiketler: #1_01/09/2021_EST_4x1 ve #1_01/09/2021_EST_4x2.
8. Birden fazla objektif lens altında toplanan her numune için prosedürü tekrarlayın. 4x gibi en az bir küçük nesneleştirme ve 20x gibi en az bir büyük nesneleştirme ekleyin.
9. Görüntüleri bir ortak sürücüye/klasöre veya harici bir sabit sürücüye yükleyin, böylece ilgili tüm araştırmacılar dosyalara erişebilir ve yedek kopyalar mevcuttur.

5. Sahne kategorisi

1. Bilgisayar ekranını, çekilen fotoğrafları ve kayıt sayfasını aynı anda görüntüleyecek şekilde ayarlayın (Şekil 4A-C).
   NOT: Bu, toplanan örnek görüntülenirken belgelerin oluşturulmasına olanak tanır. Protokolün bu kısmı örnek toplama sırasında veya daha sonra tamamlanabilir.
2. Örnekte hangi hücre tiplerinin bulunduğunu belirleyin. Ölçütleri kullanarak adım 5.2.1-5.2.4'te listelenen dört seçenek arasından seçim yapın ve bulguları kaydedin.
   1. Anüklee keratinize epitel (AKE)/kornifiye epitel hücreleri
      1. Şekil 2B ve Şekil 5C'de görüldüğü gibi, çekirdek eksikliğine rağmen, hücre içinde bir çekirdeğin bir zamanlar bulunduğu yeri temsil eden hafif yuvarlak alanlar (nükleer hayaletler) gösterebilen pürüzlü veya açısal kenarlı hücreleri arayın. Bu tür çekirdekli ve anüklee hücreler arasında ayrım yapmak için 20x ve üstü gibi daha yüksek büyütme kullanın.
      2. İstenirse, hücrenin keratinize veya kornifiye edilmiş kısmını (çekirdekleri olmayan ve keratinle doldurulmuş ince bir hücre tabakası) ayırt etmek için daha yüksek büyütme kullanın.
         NOT: Pürüzlü görünümlerine ek olarak, bunlar keratin çubukları olarak bilinen pürüzlü ve uzun yapılar oluşturarak nasıl katlanabilecekleri veya sökülebilecekleri ile de ayırt edilebilir.
   2. Büyük çekirdekli epitel (LNE) hücreleri
      1. Düzensiz, pürüzlü veya açısal kenarlıklarla kaplanmış bu tipik olarak yuvarlak ila çokgen şekilli hücreleri arayın.
      2. Çekirdeklerinin, Şekil 2B ve Şekil 5D1,2'de görüldüğü gibi, ölüm veya bozulma geçiren bir hücrenin çekirdeğindeki kromatinin geri dönüşümsüz yoğunlaşmasıyla ilgili olarak bozulmamıştan dejenere veya pykontik'e kadar çeşitli formlar alabileceğini gözlemleyin. Bu çekirdeklerin hücre içindeki sitoplazmadan daha az yer kapladığını, küçük epitel hücrelerinden daha düşük bir nükleer-sitoplazmik (N: C) oranına sahip olduğunu not edin. Daha yüksek büyütmelerde görülebilen sitoplazmik granüllere dikkat edin¹³.
   3. Lökositler (LEU'lar)/nötrofiller/polimorfonükleer hücreler
      1. Hücre olgunlaştıkça kaybolan çok loblu çekirdeklere (dolayısıyla polimorfonükleer hücreler olarak bilinir) sahip bu kompakt, küresel hücreleri arayın (Şekil 2B ve Şekil 5A). Çok loblu çekirdekleri gözlemlemek için daha yüksek büyütme (örneğin, 40x) kullanılabilir.
         NOT: Toplama ve hazırlama üzerine, bu hücreler yoğunlaşabilir, katlanabilir veya yırtılabilir.
   4. Küçük çekirdekli epitel (SNE) hücreleri
      1. Yukarıda açıklanan nötrofillerden daha büyük olan bu yuvarlak ila oval şekilli hücrelere dikkat edin.
      2. Bu keratinize olmayan epitel hücrelerinin yuvarlak çekirdeklerini gözlemleyin (Şekil 2B), hücre içindeki sitoplazmadan daha fazla yer kaplar ve büyük epitel hücrelerine göre daha yüksek bir N: C oranı oluşturur.
         NOT: Toplama ve hazırlama işleminden sonra, bu hücreler Şekil 5B1'de gösterildiği gibi bir dizeye veya çubuğa benzeyen bir şekil oluşturmak için katlanabilir veya üst üste binebilir.
3. Örnekte bulunan hücrelerin her nesneleştirme için nasıl düzenlendiğini inceleyin. Genel hücre düzenlemesinin temsili bir görünümünü görüntülemek için 4x gibi daha düşük nesneleştirmeyi kullanın. Hücrelerin bir araya toplanıp kümelenmediğini (C), eşit olarak dağılmış (ED) veya rastgele dağılmış (RD) olup olmadığını kaydedin (bkz. Şekil 4C) ve her hücre tipinin spesifik organizasyonunu not edin (örneğin, küçük çekirdekli epitel hücreleri kümelenir ve nötrofiller eşit olarak dağıtılır).
4. Ardından, toplam hücre miktarını (bir küçük, orta, sayıda) ve bireysel hücre miktarlarını (mevcut her hücre tipinin yüzdesi) görsel olarak tahmin edin ve kaydedin.
   NOT: Bir leke, örnek kategorizasyonunu belirlemek için kullanılabilecek en az sayıda hücreyi temsil eder, çok sayıda, slayttaki alanın tamamını olmasa da çoğunu oluşturan veya üst üste yığılmış sayısız hücrenin varlığını temsil eder ve ılımlı sayıda hücre, nispeten ortalama bir hücre sayısını temsil eder (örnekler Şekil 5A-D ve Şekil 6A-D'de görülür).
5. Listelenen kriterlerden veya 'anormallikler' kategorisindeki belirli bir konu için tipik olan yönlerden herhangi bir sapma olup olmadığına dikkat edin ve gerekirse bir veterinere danışın.
6. Kategorize edici bileşenleri ve aşağıdaki açıklamaları kullanarak numunede hangi östrus döngüsü aşamasının sunulduğunu belirleyin.
   1. Ölmek
      1. LEU'ları, DIE'nin başlangıcında kümelenmiş bir şekilde düzenlenmiş, ancak geç aşamalarda daha dağınık olan baskın veya tek hücre tipi olarak arayın.
         NOT: DIE'ye geçiş yaparken, Şekil 6D1'de görüldüğü gibi, epitel hücreleri parçalanmaya başladıkça hücre miktarı azalabilir. Aynı zamanda, LEU'ların sayısı artmaya başlar ve başlangıçta kümelenmiş bir şekilde düzenlenme eğilimindedirler ve zamanla dağılırlar.
      2. Toplam hücre miktarının, çoğunlukla DIE döneminin sonraki aşamalarında, ikinci veya üçüncü günde nispeten düşük olabileceğini unutmayın.
      3. Bu aşamada mevcut olabilecek ve LEU'ların konsantre iplikçikleri olarak ortaya çıkan yüksek miktarda mukusun gözlenmesi (Şekil 5A1). PRO'ya geçişin geç aşamalarında LEU'lara eşlik eden küçük SNE hücrelerinin kümelerine veya hücresel iplikçiklerine dikkat edin (Şekil 5A1,2).
      4. DIE'ye geçerken vajinal sıvının viskoz ve opak görünümünü gözlemleyin, DIE'ye tamamen geçiş yapın ve DIE'den çıkın.
         NOT: Bu aşamanın ortalama süresi 4 günlük bir döngü sırasında 48 saat ve 5 günlük bir döngü sırasında muhtemelen 72 saattir.
   2. Lehinde
      1. Baskın hücreler olarak SNE hücrelerini ve düşük sayılarda görülebilen LEU'lar, LNE ve / veya AKE hücrelerini arayın. Bu aşamada tipik olarak kümeler, tabakalar veya iplikçikler halinde düzenlenmiş SNE hücrelerinin granüler görünümünü gözlemlemek için yüksek nesnelleştirme kullanın (Şekil 5B1,2).
      2. DIE'den PRO'ya geçerken vajinal sıvının viskoz ve opak görünümünü ve PRO aşamasına tamamen geçildikten sonra nasıl viskoz olmayan ve şeffaf hale geldiğini gözlemleyin (sıçanlarda ortalama süre 14 saattir).
   3. Est
      1. AKE hücrelerinin baskınlığını, EST'deki SNE hücrelerinin azalmasını ve EST^11,13 devam ettikçe hücrelerin sayısında ve boyutunda bir artış arayın.
      2. AKE hücrelerinin keratin çubukları şeklinde veya PRO'dan (Şekil 6B) ve MET'e (Şekil 6C) geçişte daha rastgele dağılabilen hayalet çekirdekler içeren sıklıkla kümelenmiş düzenlemesinin ayırt edici özelliğini not edin.
      3. Sıçanlar EST'ye geçerken beklenebilecek karakteristik viskoz olmayan ve şeffaf vajinal sıvıyı gözlemleyin, tamamen EST'ye geçiş yapar ve EST'den çıkar.
         NOT: EST'nin ilerlemesi çok fazla çeşitlilik içerir (Şekil 5C ve Şekil 6B, C). Aşama tipik olarak 4 günlük bir döngüde ortalama 24 saat veya 5 günlük bir döngüde muhtemelen 48 saat boyunca gerçekleşir.
   4. Tanış
      1. Sıçan MET'e geçerken daha fazla sayıda SNE ve LNE hücresi arayın, ya kanal içindeki hücre oranı açısından baskın ya da LEU'lar^11,13'e eşit orantıya yakın. Ayrıca, EST'yi takip eden epitel hücre çürümesi ve DIE'ye taşınması nedeniyle MET'deki daha fazla miktarda enkaz ve geçişleri diğer aşamalardan daha fazla not edin.
      2. Tüm hücre tipleri ve çeşitli miktarlarda görüldüğü için tutarlı bir düzenleme eksikliğini gözlemleyin (Şekil 5D1-3). Bununla birlikte, başlangıç aşamalarında epitel hücrelerine yakın bir yerde paketlenmiş veya kümelenmiş LEU'ları arayın, bu da DIE'ye geçerken kümelenmiş düzenlemeye geri dönebilir.
      3. Bu aşamada vajinal sıvının viskoz olmayan ve şeffaf görünümünü ve DIE'ye geçerken daha viskoz ve opak bir görünüme geçişi gözlemleyin.
         NOT: Bu aşamanın ortalama süresi 6-8 saattir.
7. Geçişlerdeki örnekleri, konunun hareket ettiği aşama ile etiketleyin, bunların ne zaman toplandığını izlemek için parantez içindeki geçiş. Bu 4 aşama ve geçişleri arasında nasıl ayrım yapılacağı hakkında daha fazla bilgi Temsili Sonuçlar'da bulunabilir.
   NOT: Toplanan örnekler statik ve döngü dinamik olduğundan, slaytlar aşamalar arasındaki geçişleri gösterebilir (Şekil 6A-D'de görülmektedir).
8. İzleme aşaması tamamlanana kadar her hayvan için bu işlemi tamamlayın.
9. Her iki günde de 11 (45 günlük) veya 21 (55 günlük), giyotin dekapitasyonundan önce sıçanları% 5 izofluran ve% 2 oksijen ile ötenazi yapın. Bu zaman noktaları, çalışmanın niteliğine bağlı olarak değişebilir.

Representative Results

Mevcut veriler, erkek SD sıçanlarının varlığında kadın ergen SD Uluslararası Genetik Standardizasyon Programı'nın (IGS) verilerini yansıtmaktadır. Bu hayvanlar, işbirlikçi bir çalışmanın parçası olarak hem Pepperdine Üniversitesi hem de UCLA laboratuvarlarında bulundu. Şekil 5, 4 döngü aşamasının çoklu varyasyonlarını sunmaktadır. Şekil 5A1, çeşitli hücre tiplerinin mevcut olduğu bir diestrus örneği olarak tanımlandı. Bu örnek, daha fazla sayıda epitel hücresine sahip örneklerin, LEU'ların baskınlığı gibi diğer kategorize edici bileşen niteliklerini karşıladıklarında diestrus olarak nitelendirildiğini göstermektedir. Bu örnek ayrıca, PRO aşamasında görülen SNE hücrelerinden oluşan iplikçiklere benzeyen bu aşamada sıklıkla görülen LEU'lardan oluşan mukus iplikçik düzenlemesini de göstermiştir. DIE aşamasındaki bir mukus ipliğini, SNE hücrelerinden oluşan PRO aşamasında ortaya çıkan iplikçiklerden ayırt etmek için, LEU'ların baskınlığını tanımlamak önemlidir. Şekil 5A2,3, sıklıkla gözlemlenen bir hücre düzenleme ilerlemesini göstermektedir - DIE aşamasının sonraki dönemlerinde toplanan örneklerde rastgele (RD) veya hatta ödeme (ED) toplayan ve hareket eden LEU'ların ilk kümelenmesi. Spesifik olarak, Şekil 5A2, çok sayıda hücrenin mevcut olduğu bir DIE örneğiydi. Bu, LEU'lara, LEU'ların baskınlığı ve keratin çubuklarının yokluğu ile metestrus'tan ayırt edilen çok sayıda epitel hücresinin (Şekil 5A1,2) nasıl eşlik edebileceğini yansıtmaktadır. Buna karşılık, Şekil 5A3, düşük bir toplam hücre sayısının (bir leke) genellikle ikinci veya üçüncü gün gibi DIE aşamasının sonraki aşamasında görüldüğünü göstermektedir. PRO aşamasında, SNE hücreleri sıklıkla üst üste yığılmış çok sayıda hücre (Şekil 5 B1) veya daha küçük kümeler halinde düzenlenmiş bir hücre lekesi (Şekil 5B2) ile iplikçikler halinde düzenlenmiştir. Şekil 5B3, SNE hücrelerinin üst üste binen ve EST aşamasında bulunan AKE hücrelerinden oluşan keratin çubuklarıyla karıştırılabilecek çubuklar oluşturan karakteristik tabaka benzeri kümelenme ile bir PRO örneğini örneklemektedir. İkisini ayırt etmek için, PRO'daki SNE hücrelerinin ve EST'deki AKE hücrelerinin baskınlığını tanımlamak önemlidir.

Şekil 5C1,2, EST'de görülen AKE hücrelerinin tipik kümelenme ve rastgele dağılımını göstermektedir; birincisi çok sayıda hücreyi ve ikincisi ılımlı bir sayıyı içermektedir. Bu örneklerde hayalet çekirdekler, keratin bar oluşumları ve sıklıkla bu aşamada toplanan bakteriler görülmektedir. SNE hücreleri zaman zaman EST aşamasında (Şekil 5C1) önceki PRO aşamasının kalıntıları olarak temsil edildi. Konu MET'e doğru ilerledikçe SNE hücrelerinin ortaya çıkmaya başladığı geç EST aşaması, genellikle PRO aşaması ile karıştırılır. İkisini ayırt etmek için, nükleer boyutu dikkate almak önemlidir. Genel olarak, PRO'nun çekirdekli hücreleri daha yüksek bir N: C oranına sahiptir. Şekil 5C3'te gösterilen örneklem, EST aşamasının bir özelliği olarak görülmeyen çok sayıda AKE hücresinin iplikçik benzeri bir düzenlemesini sunmuştur. Bu, her hayvanın benzersiz olduğunu, kriterlerden sapmaların meydana gelebileceğini ve kategorize edici belirleyicilerin kombinasyon halinde incelenmesi gerektiğini göstermektedir.

SNE hücreleri mevcut olduğunda EST ve PRO arasında ayrım yapmak için, EST aşamasında bu hücrelerde daha düşük bir N: C oranının meydana geldiği görülmüştür. EST'de bulunan keratin çubuklarını, PRO aşamasında SNE hücrelerinin üst üste binmesi veya yuvarlanması ile oluşanlardan (Şekil 5B3) ve MET'den geçişte çürüyen epitel hücreleri tarafından oluşturulanlardan (Şekil 6D1), temsil edilen aşamayı ayırt etmek için baskın hücre tipini, düzenini ve miktarını tanımlamak önemlidir. Son olarak, Şekil 5D1,2, MET aşamasını temsil eden rastgele ödemede bulunan tüm hücre tiplerinin kombinasyonunu örneklemektedir. Bu örneklerde bulunan çok sayıda hücreye ek olarak, bu aşamada (Şekil 5D2), EST'yi takiben epitel hücrelerinin çürümesi ve epitel hücrelerinin vajinal kanalını temizlemek için işlev gören LEU'ların baskınlığı ile DIE'ye geçiş nedeniyle daha yüksek miktarda enkaz toplamak yaygındı. Şekil 5D2 ayrıca MET'in daha yüksek epitel hücresi konsantrasyonu ve keratin çubuklarının varlığı ile DIE'den nasıl ayırt edilebileceğini göstermektedir. Genel olarak, bu temsiller her aşamada var olan ve kapsamlı olmayan geniş spektrumu tasvir eder.

4 geçiş aşamasının gösterimleri Şekil 6'da gösterilmiştir. Bu çalışma, geçişteki örnekleri 4 östrus döngüsü aşamasından biri olarak kategorize ederken, geçiş aşamalarını doğru bir şekilde tanımlamak önemlidir. DIE'den PRO'ya geçişte (Şekil 6A), genellikle LEU'ların sayısında genel bir azalma ve SNE hücrelerinin sayısında bir artış olmuştur. LNE ve AKE hücreleri, yüksek miktarlarda olmasa da, zaman zaman bu geçişte mevcuttu (Şekil 6A1). Şekil 6A2-4, bu geçiş sırasında sıklıkla toplanan daha fazla sayıda kümelenmiş ve rastgele dağılmış SNE hücresini, az sayıda rastgele ve eşit dağılmış LEU'yu göstermektedir. Genel olarak, diğer geçiş aşamalarından ayırt edilirken, SNE hücrelerinin baskınlığını ve PRO'da görülen kümelerin ve iplik oluşumlarının başlangıcını not etmek önemliydi. Şekil 6A'daki tüm örnekler, Şekil 6A4 hariç, bir leke ile çok sayıda hücre sayısını temsil eder. Şekil 6B'de, görüntü PRO'dan EST'ye geçişte görülen çok sayıda kümelenmiş SNE ve AKE hücresinin bir örneğini göstermektedir.

Bu geçiş sırasında, SNE hücrelerinin, EST sırasında olduğundan daha az kümelenmiş ve AKE hücrelerinin daha fazla rastgele dağılımı ile daha yüksek sayılarda olduğu görülmektedir. Şekil 6C, AKE, SNE ve LNE'nin ortaya çıkışını ve EST'den MET'e geçişte AKE hücrelerindeki azalmayı göstermektedir. Mevcut enkaz, metestrus'ta sıklıkla görülen önceki östrus aşamasından çürüyen AKE hücrelerini temsil eder. Bu aynı zamanda, epitel hücrelerinin çürümeye ve enkaz üretmeye başladığı MET'den DIE'ye son geçiş aşamasında da görülür (Şekil 6D1,2), birincisinde çok sayıda hücre ve ikincisinde ılımlı bir sayı bulunur. Bu rakamlar, diestrusa geçişte baskın hücre tipi haline gelmek için sayıca artan LEU'ların fenomenini göstermektedir. 20 gün boyunca izlenen grup için (n = 3), geçiş örneklerinin toplandığı 12 gün vardı, ortalama 4 gündü. 10 gün boyunca izlenen grup için (n = 3), geçiş örneklerinin toplandığı 9 gün vardı, ortalama 3 gündü.

Şekil 7, çoğunluğu tekrarlanan lavajları garanti eden olumsuz hücre numunesi koleksiyonlarını temsil etmektedir. Şekil 7A1 , yanlış bir şırınga yerleştirme ve ekstraksiyonu nedeniyle toplanan ve skuamöz hücrelerin vajinal kanal duvarından emilmesine neden olan bir skuamöz hücre kütlesini göstermektedir. Bu hücreler, kütlenin yüksek yoğunluğu ve kompaktlığı ve ayırt edici sınırları nedeniyle kümelenmiş epitel hücrelerinden veya LEU'lardan ayırt edilebilir. Şekil 7B , hiçbir hücrenin çıkarılmadığı, odak düzleminin yanlış olduğu veya slaytın hücreler için tam olarak taranmadığı bir enkaz koleksiyonunu temsil eder. Enkaz, hücre tiplerine aşinalık ve genellikle ayırt edici küçük boyut ve kümelenme yoluyla hücrelerden ayırt edilebilir. Bu enkaz genellikle hayvan yataklarından, saçlarından veya hücre çürümesinden kaynaklanır. Şekil 7C , bir lekenin altındaki hücre sayısını içeren bir slaytı göstermektedir. Düşük hücre sayıları genellikle geç MET ve erken DIE sırasında görülürken, bu, bir aşamaya doğru bir şekilde kategorize etmek için çok az hücreye sahip slaytları temsil eder.

Şekil 7D, mikroskop slaytındaki kanaldan vajinal sıvı ile birleştirilmiş NaCl ekstraksiyon çözeltisinin iki örneğini göstermektedir. İlk görüntüde, Şekil 7D1'de, sıvı mevcuttu ve odak dışıydı, bu da doğru bir şekilde kategorize etme yeteneğini engelliyordu. Şekil 7D2'de, sıvı LEU'ların yanında yapışkan daireler halinde slayt boyunca yayılmıştır. Bu örnek, yüksek hücre varlığı nedeniyle tekrarlanan bir lavaj gerektirmese de, kaymaları önlemek için slayta yerleştirilen sıvı miktarını ve mikroskop kapağı slaytının yerleştirilmesini dikkate almak önemlidir. Genel olarak, bu görüntüler uygun kategorizasyon için kaliteli temsili görüntüler yakalamanın önemini vurgulamaktadır. Bu, hücre çıkarma şeklini, odak düzlemini ve bir görüntüyü yakalamadan önce her slaytı tarayarak görüntünün içeriğini dikkate almayı içerir.

Deney grubundaki (gruplardaki) her hayvanı kategorize ettikten sonra, aşama ilerlemelerini bir çubuk veya çizgi grafik üzerinde grafiklendirmek yaygındır. Bu, araştırmacıların genel döngü modelini incelemelerine ve hayvanın asiklisite olarak bilinen östrus aşamalarının düzensiz bir ilerlemesini ne zaman gösterdiğini belirlemelerine olanak tanır. Numuneler daha sonra bu analiz aracındaki döngü uzunluğu ve aşama ilerleme paterni ile analiz edilebilir. Şekil 8A,B'de gösterilen bu kavram, bu çalışma durumunda, farklı yüksekliklerde çubukların bireysel aşamalara atanmasını ve kaydedilen verilerin (Şekil 4B) x ekseni boyunca çevrilmesini içerir. Bu örneklerde, MET ve DIE en düşük, PRO orta ve EST en yüksek çubuk yükseklikleri ile temsil edilir. MET aşamasının kısa sürmesi nedeniyle, DIE aşaması ile tek bir çubukta birleştirilir. Döngü tamamlamalarını ölçmek için farklı yöntemler olsa da, bir tam döngüyü bir EST'den diğerine hareket olarak saymak yaygındır¹¹. Bununla birlikte, bu bir döngü tamamlanmasını değil, ardışık EST aşamaları olduğunda 2 günlük bir EST aşama süresini yansıtır.

Şekil 8A , MET / DIE, PRO ve EST boyunca tutarlı ve tekrarlayan bir ilerleme boyunca ilerleyen bir sıçandan elde edilen verileri yansıtmaktadır. Ek olarak, bu sıçan ortalama 4.375 uzunluğunda 4 ila 5 günlük döngüler aralığına düşmüştür. Her aşama, asiklisite için tipik bir değerlendirme olan EST'de geçirilen ortalama 1.0625 gün ile standartlaştırılmış uzunluk aralıklarını geçmez. Çıkarılan veriler bu EST'den EST'ye kadar olan modeli düzenli olarak takip ederse, bu sadece deneğin hormon seviyelerinin kabul edilebilir aralıklarda kaldığını değil, aynı zamanda prosedürün sürecin döngüsel doğasını önemli ölçüde kesintiye uğratmadan yürütüldüğünü de doğrular. Son olarak, bu sıçan, EST'den EST çubuklarına kadar olan sayımla belirlenen 16 döngüyü tamamladı.

Şekil 8B , genişletilmiş (EXT olarak görülen) ve kaydedilmemiş aşamalar dahil olmak üzere yaygın asiklik türlerini temsil etmektedir. Bu şekil aynı zamanda hem döngü modelini hem de her aşamada harcanan gün uzunluğunu ve sayısını incelemenin önemini vurgulamaktadır. Spesifik olarak, bu örnekte, EST'deki ortalama döngü uzunluğu ve gün sayısı ana hatlarıyla belirtilen parametrelere girerken, aşama ilerlemesinin döngü paterni anormallikler ortaya koymuştur. Bu nedenle, östrus döngüsünü kapsamlı bir şekilde incelemek önemlidir. Hem genişletilmiş DIE (Ext Diest olarak etiketlenmiş) hem de EST ( Ext Est olarak etiketlenmiş) aşamaları, şekilde gösterilen döngüler boyunca kaydedildi ve PRO aşamasının kaydedilmediği birden fazla döngü vardı. Bu örnek ayrıca, tipik aralıklarda yer alan döngünün ortalama uzunluğunu ve EST'deki günleri incelemek yerine, tipik aralıkların dışında kalan ardışık aşamaların sayısını incelemenin önemini de göstermektedir.

Bu örneklerin nedenleri ve korelasyonları, fizyolojik anormallikler (tümörler, sahte gebelik, uzun süreli stres), zararlı çevresel koşullar (uzun süreli aydınlatma, toksik kimyasallara maruz kalma, yalnız barınma), numune toplamanın yanlış zamanlaması, araştırmacı hatası (zayıf örnek toplama, görüntü yakalama, yanlış evreleme), yaşa bağlı fenomenler (ergenlik ve üreme yaşlanmasında görülen yaygın düzensizlik) veya spesifik olana özgü sapmalar gibi faktörleri içerebilir. hayvan. Araştırmacı hatasını veya numune toplamanın yanlış zamanlamasını ve fiziksel anormallikleri veya yaşa bağlı fenomenleri ayırmak için, 4 kategorize edici bileşeni daha ayrıntılı olarak incelemek yararlı olacaktır. Bu, düzensizliklerin olası nedenlerinin belirlenmesinde yardımcı olabilir veya daha geniş anlamda, östrus döngüsü özelliklerini daha yakından inceleyen çalışmalarda kullanılabilir.

Şekil 9, y eksenindeki toplam ve tek tek hücre miktarlarını, farklı çubuk dolgu renkleriyle temsil edilen hücre tiplerini ve toplam izleme dönemi boyunca grafiklendirilmiş farklı çubuk doldurma desenleriyle temsil edilen hücre düzenlemelerini dahil ederek bu daha yakından incelemeyi göstermektedir. Bu analiz yöntemi, tamamlanan toplam döngü sayısının, her bir döngünün uzunluğunun, aşama ilerlemesinin ve kategorize edici bileşenlerin her bir sıçan için daha ayrıntılı olarak incelenmesine izin verdi. Şekil 9A , ortalama döngü sayısından daha düşük olan bir sıçanı temsil eder, izlenen 10 günde toplam 3 tam döngü vardır - iki 3 günlük döngü ve bir 5 günlük döngü (ortalama 3.67). Günlerin% 50'si ile aşama ilerlemesinde görülen düzensizlik, bir veya daha fazla kaydedilmemiş aşamayı ve toplanan örneklerin% 30'unun geçiş aşamasında olduğunu içeriyordu - 2. gün MET-DIE olarak, 5. gün EST-MET olarak ve 8. gün PRO-DIE geçişi olarak. Bu, numune toplamanın yanlış zamanlaması, araştırmacı hatası, yaşa bağlı bir fenomen veya benzersiz sapmalardan kaynaklanıyor olabilir. Daha fazla izleme, hangisinin uygulandığı konusunda netlik sağlayabilirdi.

Tipik baskın düzenlemeler, hücre tipleri ve bireysel ve toplam hücre miktarları, kaydedilen aşamaların her birinde görülmüştür. EST aşamalarında, LEU'lar, SNE ve LNE hücrelerinin daha düşük varlığı ile bir leke (örneklerin% 25'i), orta derecede (örneklerin% 25'i) ve çok sayıda (örneklerin% 50'si) kümelenmiş AKE hücreleri görülmüştür. Yakalanan bir MET aşamasında, çok sayıda rastgele dağılmış LEU (% 50), AKE hücreleri (% 20), LNE (% 15) ve SNE (% 15) hücrelerinin bir kombinasyonu mevcuttu. DIE aşamaları için, rastgele dağılmış, eşit olarak dağılmış ve baskın LEU'ların bir kombinasyonunun bir miktar (numunelerin% 50'si) ve çok sayıda (numunelerin% 50'si) AKE, LNE ve SNE hücreleri ile serpiştirilmiş olduğu görülmüştür. Toplanan bir PRO aşamasında, düzenlemelerin bir kombinasyonunda bulunan rastgele dağılmış LEU'lar (mevcut hücrelerin% 60'ı) ve SNE hücrelerinin (mevcut hücrelerin% 40'ı) bir lekesi mevcuttu ve DIE'den PRO'ya geçişi temsil ediyordu.

Şekil 9B'de, temsil edilen sıçan, 4 günlük bir döngü paterni ile toplam 3 tam döngüye sahipti. Toplanan örnekler, uzatılmış bir DIE periyodu (6-9. günler) ve kaydedilmemiş aşamaların diğer 5 örneği (2 kaydedilmemiş MET aşaması, 2 kaydedilmemiş PRO aşaması ve 1 kaydedilmemiş EST aşaması) ile tutarlı bir aşama ilerlemesini temsil etmemiştir. Örneklerin sadece% 20'si geçiş aşamasında olduğundan (3. gün DIE-PRO, 5. gün EST-MET, gün 18 MET-DIE ve gün 19 DIE-PRO olarak) ve MET aşaması ve uzatılmış DIE süresi dışında sadece 3 aşama kaydedilmediğinden, numune toplama zamanlamasının bu spesifik hayvan için uygun olduğu sonucuna varılmıştır. İzlenen son 10 gün, 4 aşama boyunca düzenli bir ilerleme içerdiğinden, ilk düzensizlikler ergen yaşına bağlanabilir. İzleme süresi arttıkça (20 gün) bu sonucun ortaya çıkmasına izin verdi.

Kategorize edici bileşenlerin incelenmesi tipik aralıkları ortaya koymuştur. EST aşamaları, daha az LEU, SNE ve LNE hücresine sahip kümelenmiş AKE hücrelerinin çok sayıda miktarına (örneklerin% 50'si) ılımlı (örneklerin% 50'si) baskınlığını yansıtıyordu. Toplanan MET örneklerinde, orta derecede (örneklerin% 33.33'ü) rastgele dağılmış ve kümelenmiş LEU'lara (% 10-90'lık bir miktar aralığında), kümelenmiş SNE (% 0-30), rastgele dağılmış LNE (% 0-10) ve kümelenmiş ve rastgele dağılmış AKE hücrelerine (% 10-90) bir kombinasyon vardı. DIE aşamaları, hem rastgele dağılmış AKE hem de SNE hücrelerinin varlığında, eşit olarak dağılmış, rastgele dağılmış ve kümelenmiş LEU'ların (% 50-100 aralığında) çok sayıda (örneklerin% 80'i) miktarına ılımlı (% 20) bir baskınlık yansıtıyordu. PRO aşamaları, LEU'lar, AKE ve LNE hücrelerinin varlığında rastgele dağılmış ve kümelenmiş SNE (% 10-99) hücrelerinin bir lekesinin (örneklerin% 3.33'ü) ve çok sayıda (örneklerin% 66.67'si) miktarının baskınlığı ile tanımlanmıştır.

Ayıklanan verileri analiz ederken başka bir seçenek, daha önce açıklanan öğeleri dahil ederek östrus döngüsü profillerinin oluşturulmasıdır - y eksenindeki toplam ve bireysel hücre miktarları, farklı çubuk dolgu renkleriyle temsil edilen hücre tipleri ve farklı çubuk doldurma desenleriyle temsil edilen hücre düzenlemeleri, her döngü aşaması için toplam izleme süresi boyunca grafiklendirilir. Bu, sıçan başına veya tüm grubun ortalamaları başına tamamlanabilir. Bu analiz aracının amacı, aşama başına kategorize edici bileşen eğilimlerini incelemektir; bu, genel bilimsel topluluğa, östrus döngüsü aşaması kategorizasyonlarına özgü kategorize edici bileşen ayrımlarını karakterize etmede yardımcı olur. Şekil 10 A1'de, 10 günlük DIE profili, daha az SNE, AKE ve LNE hücresinin yanı sıra orta derecede (örneklerin% 50'si) ve eşit dağılmış LEU'ların (ortalama% 78.25) çok sayıda (örneklerin% 50'si) baskınlığını göstermiştir. Şekil 10 A2'de, 20 günlük diestrus profili, daha az sayıda AKE ve SNE hücresinin yanı sıra, eşit olarak dağılmış, kümelenmiş ve rastgele dağılmış LEU'ların (10 günün tamamında mevcut olan ortalama% 82'si) ılımlı (örneklerin% 20'si) ve çok sayıda (örneklerin% 80'i) bir baskınlık sergilemiştir.

Şekil 10B1'de sergilenen PRO aşaması, LEU'ların ve AKE hücrelerinin varlığında orta sayıda rastgele dağılmış SNE hücresinin (% 60) baskınlığını göstermiştir. Şekil 10B2'deki 20 günlük PRO evre profili, LEU'lar ve AKE hücreleri ile birlikte bir miktar (örneklerin% 33.33'ü) ve düzenlemelerin ve rastgele dağılmış SNE (3 numunenin hepsinde mevcut olan ortalama% 66.33) hücrelerinin bir kombinasyonunun bir miktar (örneklerin% 66.33'ü) baskınlığını göstermiştir. Şekil 10 C1'de görülen 10 günlük EST profili, daha az sayıda LEU, SNE ve LNE hücresinin yanı sıra, düzenlemelerin bir kombinasyonunda ılımlı (örneklerin% 50'si) veya çok sayıda (örneklerin% 50'si) AKE hücresi (mevcut 2 gün için ortalama% 80) baskınlık sergilemiştir. Şekil 10 C2'de, 20 günlük EST profili, orta derecede (örneklerin% 75'i) veya çok sayıda (örneklerin% 15'i) rastgele dağılmış AKE hücrelerinin (mevcut 4 gün için ortalama% 57.5) veya düzenlemelerin bir kombinasyonundakilerin, daha az sayıda LEU, SNE ve LNE hücresinin yanı sıra baskınlık göstermiştir.

Şekil 10 D1'deki 10 günlük MET evre profili, çok sayıda rastgele dağılmış LEU (%50), AKE (%20) hücresi ve SNE (%30) hücresini içeriyordu. Şekil 10 D2'deki 20 günlük MET aşama profili, ılımlı (örneklerin% 3.33'ü) veya çok sayıda (örneklerin% 6.667'si) LEU'ların (3 numunenin hepsinde ortalama% 50), SNE (3 numunenin hepsinde mevcut olan ortalama% 15), AKE hücreleri (mevcut 3 örnekte% 23.33 ile), LNE hücreleri (mevcut 2 numunenin hepsinde ortalama% 15) sergilemiştir. LEU'ların yarısı rastgele dağıldı (1 örnek) ve kalan% 50'si düzenlemelerin bir kombinasyonuydu (1 örnek). SNE hücrelerinin üçte ikisi mevcut olduğunda rastgele dağılırken, geri kalan% 33.33'ü mevcut olduğunda düzenlemelerin bir kombinasyonundaydı (3 örnekten 1'i). Son olarak, AKE hücrelerinin% 66.67'si mevcut örneklerde (2 gün) kümelenirken, kalan% 33.33'ü düzenlemelerin bir kombinasyonunda (1 gün) idi. Tablo 1, iki gruptan kategorize edici determinantların sayısal ortalamalarını içermektedir. Şekil 9A,B ve Şekil 10A-D'deki veriler, bireysel hayvanlardan gelen kategorize edici belirleyiciler hakkında bilgi içerirken, bu tablolar örnek olarak östrus aşaması için ortalamaları içerir. Diğer laboratuvarlarda çoğaltıldığında, bu parametreler aşama tanımlama için standart haline gelebilir. Bu da, şu anda evreleme sürecinde yer alan öznellik seviyesini azaltabilir.

İstatistik
Genel olarak, döngü özelliklerini yorumlarken göz önünde bulundurulması gereken birkaç parametre vardır, ancak neyin "anormal" olarak kabul edildiği konusunda fikir birliği yoktur ve sapmalar tipiktir. Goldman ve ark. "düzenli" yi 24-48 saat EST ve 48-72 saat DIE aşamaları¹¹ ile 4-5 günlük bir döngü olarak tanımlamaktadır. Bu parametrelerden sapma, bir veya daha fazla fizyolojik anormallik, yanlış toplama zamanlaması veya hormon seviyeleri olgunlaştıkça ergen sıçanların sıklıkla yaşadığı ilk asiklik gibi çeşitli faktörlere bağlı olabilir. Laboratuvar veterinerine danışmaya, uygun zamanlamayı sağlamak için bir deneme toplama süresi sağlamaya ve karşılaştırmalı bir zaman çizelgesi oluşturmak için ergenlik döneminden geçmiş hayvanları izlemeye ek olarak, istatistiksel analizler nedenselliği ve / veya korelasyonu herhangi bir anormalliğe atfetmek için yardımcı olabilir. Döngüleri kategorilere ayırdıktan sonra (örneğin, tutarlı ve anormal), bir ki-kare analizi grupları karşılaştırmada yardımcı olabilir. Ek olarak, kategorize edici bileşenler veya genel döngü özellikleri, varyans analizi (ANOVA)¹¹ kullanılarak müdahale sonrası karşılaştırılabilir. Bununla birlikte, bu tür sapmalar, girişte tartışıldığı gibi biyolojik olarak anlamlı olmayabilir ve bu nedenle deneysel bağlam dikkate alınmalıdır.

Şekil 1: Östrus döngüsü aşamalarında hormon ritmisitesi. (A) Belirgin östrus döngüsü aşamalarında değişen seks steroid hormon seviyeleri özetlenmiş ve özetlenmiştir. Aşama ilerlemesi, bina hormonu seviyelerini ve sürecin dairesel ilerlemesini göstermek için metestrus ile başlar ve biter. Dış kaynaktan uyarlanmıştır¹¹. (B) Seks steroid hormonlarının merkezi sinir sisteminden üreme sistemine kan dolaşımı yoluyla akışı. Hipotalamus ve hipofiz bezinden gonadotropin salgılayan hormon (GrH veya LHRH) yoluyla gelen sinyaller ve folikül stimüle edici hormon ve luteinize edici hormon kombinasyonu ile hormon düzeylerinin arttığı görülmektedir. Bu, östradiol ve progesteron konsantrasyonuna bağlı olarak hem pozitif hem de negatif geri besleme döngülerini içerir. Bilgi¹⁷ ve dış kaynaklardan izlenen görüntüler^65,66,67. Kısaltma: LHRH = luteinize edici hormon salgılayan hormon. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Ölçülen determinantları kategorize eden östrus döngüsü. (A) Burada listelenen hücre örnekleri evrelenirken kullanılan bileşenler ve her aşama için baskın bileşenlerdir. Bunların genel parametreler olduğunu ve farklılıkların beklendiğini hatırlamak önemlidir. (B) İşte her aşamada mevcut olan baskın hücre tipleri. Bunlar genel bölünmeler olsa da, her hücre tipi tüm aşamalarda bulunabilir. (C) Burada sunulanlar, bu çalışmada bulunan hücre düzenleme tipleridir. (D) Buradaki görüntü, 4 östrus döngüsü aşamasının her birinde bulunan tipik hücre miktarlarını yansıtır ve kadran hacmi yaklaşık hücre miktarlarını temsil eder. Dış kaynak^13'ten alınmıştır ve daha önce^{uyarlanmış 68}. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Sprague Dawley sıçanlarında vajinal açıklık . (A) Üretral açıklıkla ilişkili olarak vajinal kanala yol açan gelişmemiş dış genital organların ve vajinal açıklığın anatomik oryantasyonu. (B) Bir okla işaretlenmiş gelişmemiş alanın görsel gösterimi. (C) Gelişmiş dış genital organların ve vajinal deliğin üretral açıklıkla ilişkili anatomik yönelimi, tipik olarak 34 günlükken ortaya çıkar. (D) Resim A'da özetlenen gelişmiş alanın görsel temsiline karşılık gelir. Tüm rakamlar dış bir kaynaktan alınmıştır²⁹. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Determinantların veri kayıt şablonunu kategorilere ayırma. (A) Veri kaydı için bir seçenek; belirleyicileri kategorize etmenin açıklamalarını içerir. Bu, izlenen her sıçan için bir tane olmak üzere günlük olarak kullanılmalıdır. (B) Bu şablon, kategorize edici belirleyicilerin ve sıçan tanımlamasının basitleştirilmiş bir kaydı ile veri girişi için bir seçenektir. Bu, notların ikinci PRO kategorizasyonunda veri sayfasına girilmesini sağlar. Üst satırdaki renk, temsil edilen deney grubuna atanan rengi yansıtır ve bu da bir grubu diğerinden ayırt etmeye yardımcı olur. (C) Başka bir şablon seçeneği; tüm kategorize edici belirleyicileri içerir ve kişisel tercihlere veya çalışmanın hedeflerine göre değiştirilebilir. Kısaltmalar: AKE = anüklee keratinize epitel; LEU = lökositler; LNE = büyük çekirdekli epitelyal; SNE = küçük çekirdekli epitelyal; C = kümelenmiş; ED = eşit dağılmış; RD = rastgele dağılmış; COM = birleştirilmiş; SMD = leke; MOD = orta; NUM = sayıca; EXE = egzersiz; SED = hareketsiz; Est = östrus; Die = diestrus; met-die = metestrus-diestrus geçişi; Pro = proestrus; pro-Est = proöstrus-östrus geçişi; ** = Bir yayında yardımcı olabilecek kalite örneği. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Aşama kategorize edici determinant varyasyonlar. (A) Bu görüntü dizisi, diestrus aşamasının çeşitli örneklerini göstermektedir. İlk görüntü (A1), konsantre LEU'ların iplikçikleri tarafından temsil edilen bir mukus birikintisini ve rastgele ödemelerde bulunan epitel hücrelerini göstermektedir. Bu, hem 4x hem de 10x büyütmeyi kullanmanın önemine bir örnektir. Bu 4x büyütme bir proöstrus ipliğine benzer görünür, ancak 10x'te daha yakından incelendiğinde, LEU'ların baskınlığını gösterir. İkinci görüntü (A2), diestrus aşamalarında sıklıkla görülenleri göstermektedir - epitel hücrelerinin kümelenmiş bir düzenlemesiyle birlikte görülen LEU'ların baskınlığı: SNE, LNE ve AKE hücreleri. Bu serideki son görüntü (A3), genellikle vajinal ve tuzlu sıvı damlacıklarının ortasındaki diestrus fazında görülen LEU'ların rastgele bir şekilde dağıtılmasını yansıtmaktadır. (B) Bu görüntü dizisi, proöstrus aşamasının çeşitli örneklerini göstermektedir. İlk görüntü (B1), SNE hücrelerinin iplikçikler halinde kümelenme düzenini göstermektedir. İkinci görüntü (B2), daha düşük toplam hücre sayısına ve SNE hücrelerinin kümelenmesine sahip bir slaytı yansıtır. Üçüncü görüntü (B3), SNE hücrelerinin ortak kümelenmesini ve daha rastgele dağıtılmasını ve düşük sayıda LEU ve AKE hücresini göstermektedir. (C) Bu görüntü dizisi, östrus aşamasının çeşitli örneklerini göstermektedir. İlk görüntü (C1), SNE hücrelerinin varlığında keratin çubuğu oluşumları ile AKE hücrelerinin ortak bir kümelenme düzenlemesini göstermektedir. İkinci görüntü (C2), AKE hücrelerinin hayalet çekirdekler ve bakterilerle kümelenmesini göstermektedir. Son görüntü (C3), AKE hücrelerinin iplikçik benzeri bir düzenlemesini sunmaktadır. (D) Bu görüntü dizisi, metestrus aşamasının çeşitli örneklerini göstermektedir. İlk görüntü (D1), LEU'ların, SNE hücrelerinin, AKE hücrelerinin ve LNE hücrelerinin enkaz varlığında rastgele dağılmasını ve kümelenmesini göstermektedir. İkinci görüntü (D2), keratin çubuklarının yanı sıra kümelenme düzeninde bulunan tüm hücre tiplerini yansıtır. Son görüntü (D3), mevcut LEU'ların, SNE, AKE ve LNE hücrelerinin daha kapsamlı bir düzenlemesini göstermektedir. 4x (A1, A2, B2, B3, D1 ve D3) veya 10x (A3, C1, C2, C3 ve D2) nesnelleştirmede alınan bu rakamlar, kategorizasyon bileşenlerinin daha fazla görselleştirilmesine izin vermek için yakınlaştırılmıştır. Ölçek çubukları = 100 μm. Boyut referansı için; AKE hücreleri yaklaşık 40-52 μm çapa, LEU'lar yaklaşık 10 μm, LNE hücreleri 36-40 μm ve SNE hücreleri yaklaşık 25-32 μm^16'ya sahiptir. Kısaltmalar: SNE = küçük çekirdekli epitel; LNE = büyük çekirdekli epitelyal; AKE = anüklee keratinize epitel; LEU'lar = lökositler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Geçiş aşaması örnekleri . (A) Bu görüntü serisi, DIE ve PRO aşamaları arasındaki geçişin örneklerini göstermektedir. İlk görüntü (A1), büyük kümeleri ve LEU'ların, SNE, LNE ve AKE hücrelerinin rastgele ödenmesini sunar. İkinci görüntü (A2), serpiştirilmiş LEU'ların serpiştirilmiş iplikçiklerine sahip büyük bir kümelenmiş LEU'lar ve SNE kütlesini içerir. Üçüncü görüntü (A3), LEU'ların ve az miktarda SNE'lerin kümelerini ve hatta ödemelerini içerir. Dördüncü ve son görüntü (A4) hem kümelenmiş hem de rastgele dağılmış SNE hücrelerini ve LEU'ları göstermektedir. (B) Bu resim, SNE ve AKE hücrelerinin kümelenmesiyle PRO ve EST aşamaları arasındaki geçişin bir örneğini göstermektedir. (C) Bu görüntü, EST'den MET'e geçişi temsil etmek için enkazın ortasında görülen AKE, SNE ve LNE hücrelerinin kümelenmesini ve rastgele ödenmesini göstermektedir. (D) İlk görüntü (D1), MET ve DIE aşamaları arasındaki geçişin bir örneğini göstermektedir ve çürüyen epitel hücreleri, LEU'lardaki artışa eşlik etmektedir. İkinci görüntü (D2), daha önce tarif edilen kümelenmiş LEU'ların ve SNE hücrelerinin varlığında AKE hücrelerini göstermektedir. 4x (A1, A2, A3, B ve C) veya 10x (A4, D1 ve D2) büyütmede alınan bu rakamlar, kategorizasyon bileşenlerinin daha fazla görselleştirilmesine izin vermek için yakınlaştırılmıştır. Ölçek çubukları = 100 m. Boyut referansı için, AKE hücreleri yaklaşık 40-52 μm çapa, yaklaşık 10 μm LEU'lara, 36-40 μm LNE hücrelerine ve yaklaşık 25-32 μm¹⁶ SNE hücrelerine sahiptir. Kısaltmalar: AKE = anüklee keratinize epitel; LEU'lar = lökositler; LNE = büyük çekirdekli epitelyal; SNE = küçük çekirdekli epitelyal; C = kümelenmiş; EST = östrus; DIE = diestrus; PRO = proestrus; MET = metestrus. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Olumsuz hücre örneği koleksiyonları. (A) Bu iki görüntüde, rastgele dağılmış LEU'lara ek olarak, skuamöz hücreler vajinal kanal duvarından emildi. (B) Bu görüntü, hücrelerin görülmediği veya toplanmadığı düşük miktarda enkaz içerir. (C) Bu örnekte, toplam düşük hücre sayısı görülmüştür. (D) Bu iki görüntüde (D1 ve D2), sodyum klorür (NaCl) ekstraksiyon çözeltisi ve vajinal sıvı görüldü ve mikroskop slaytları boyunca yayıldı. 4x (A1, A2 ve D1) veya 10x (B, C ve D2) büyütmede alınan bu rakamlar, kategorizasyon bileşenlerinin daha fazla görselleştirilmesine izin vermek için yakınlaştırılmıştır. Ölçek çubukları = 100 μm. Boyut referansı için, AKE hücreleri yaklaşık 40-52 μm çapa, yaklaşık 10 μm LEU'lara, 36-40 μm LNE hücrelerine ve yaklaşık 25-32 μm¹⁶ SNE hücrelerine sahiptir. Kısaltmalar: AKE = anüklee keratinize epitel; LEU'lar = lökositler; LNE = büyük çekirdekli epitelyal; SNE = küçük çekirdekli epitelyal. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Düzenli ve düzensiz döngü paterni örneği . (A) Bu görüntü, seks steroid hormonlarının düzenli salınımını yansıtan, tekrarlayan ve tutarlı bir model boyunca ilerleyen toplam 16 tam döngüyü yansıtmaktadır. Bunun içinde, diestrus en düşük, proöstrus orta tarafından temsil edilir ve östrus en yüksek yükseklikteki çubuk tarafından temsil edilir. Bu veriler, östrus aşamaları arasındaki günleri izleyerek analiz edilir ve her östrus-östrus bir tam döngüyü temsil eder. Bu veriler, UCLA'da bulunan dişi sıçanların verilerini yansıtmaktadır. (B) Bu görüntü, 22 sıçanın çeşitli döngüsel olmayan modellerinin teorik bir kombinasyonunu temsil etmektedir. Uzamış östrus, tam yükseklikte birden fazla tekrarlayan bar günü, en düşük bar yüksekliğinde birden fazla tekrarlayan gün ile görülen uzatılmış diestrus ve diestrustan metestrus yoluyla ilerlemenin döngüsel paterninin yokluğu ile görülebilir. Kısaltmalar: Est = östrus; Diest/Die = diestrus. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 9: Bireysel Kategorize Edici Belirleyiciler . (A) Bu yığılmış çubuk grafik, ayrıntılı numune aşamalarında toplanan bireysel numuneleri kategorize etmek için kullanılan araçların her bir bileşenini yansıtır. Burada, 10 gün boyunca izlenen bir konu, çeşitli hücre tiplerini, miktarlarını ve düzenlemelerini gösterir. Bu, ergen hayvanlar için beklenir, çünkü hormonal seviyeler yetişkinliğe kadar tipik olarak tutarlı veya düzenli hale gelmez. (B) Burada, 20 gün boyunca izlenen bir hayvan için östrus profili sunulmaktadır. Benzer düzensizlikler burada da görülebilir, burada denek tipik 1-2'ye karşı 4 gün boyunca diestrus'ta kalmıştır. Bu veriler, Pepperdine Üniversitesi'nde bulunan 6 dişi sıçanı temsil ediyor. Kısaltmalar: AKE = anüklee keratinize epitel; LEU = lökositler; LNE = büyük çekirdekli epitelyal; SNE = küçük çekirdekli epitelyal; C = kümelenmiş; ED = eşit dağılmış; RD = rastgele dağılmış; COM = birleştirilmiş; SMD = leke; MOD = orta; NUM = sayıca; EXE = egzersiz ; SED = hareketsiz; Est = östrus; Die = diestrus; Pro = proestrus; Met = metestrus.

Şekil 10: Aşama profilleri . (A) Bu bölüm, her gün boyunca diestrus olarak kategorize edilen bireysel sıçanlar için kategorize edici belirleyici verileri göstermektedir. İlk görüntü (A1) 10 gün boyunca, ikincisi (A2) ise 20 gün boyunca toplanan verileri temsil eder. (B) Bu bölüm, proestrus olarak kategorize edilen her gün boyunca bireysel sıçanlar için verileri göstermektedir. İlk görüntü (B1) 10 gün boyunca toplanan verileri ve ikincisi (B2) 20 gün boyunca toplanan verileri temsil eder. (C) Bu, östrus aşaması olarak tanımlanan her gün boyunca bireysel sıçanlar için verileri gösterir. İlk görüntü (C1) 10 gün boyunca toplanan verileri, ikincisi (C2) ise 20 gün boyunca toplanan verileri temsil eder. (D) Serinin bu bölümü, metestrus aşaması olarak tanımlanan her gün boyunca bireysel sıçanlar için kategorize edici bileşen verilerini göstermektedir. İlk görüntü (D1), 10 günlük bir süre boyunca toplanan verileri ve ikinci (D2) 20 günlük bir süre boyunca toplanan verileri temsil eder. Bu rakamlardaki veriler, Pepperdine Üniversitesi'nde bulunan 6 dişi sıçanın verilerini yansıtmaktadır. Kısaltmalar: AKE = anüklee keratinize epitel; LEU = lökositler; LNE = büyük çekirdekli epitelyal; SNE = küçük çekirdekli epitelyal; C = kümelenmiş; ED = eşit dağılmış; RD = rastgele dağılmış; COM = birleştirilmiş; SMD = leke; MOD = orta; NUM = sayıca; EXE = egzersiz ; SED = hareketsiz; Est = östrus; Die = diestrus; Pro = proestrus; Met = metestrus. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

EST: 10 gün	Süre (gün)	AKE(%)	LEU (%)	LNE (%)	SNE (%)	Toplam Hücre Sayısı (%)
	3	88	2.78	1.89	7.33	MOD: 44,44 SAYI: 44,44 SMD: 11,11
Aralık	2–4	70–100	0–10	0–17	0–20	Smidge-sayısız
	Düzenleme	C: 50 ED: 0 RD: 50	C: 0 ED: 0 RD: 100	C: 0 ED: 0 RD: 100	C: 50 ED: 0 RD: 50
EST: 20 gün	Süre (gün)	AKE(%)	LEU (%)	LNE (%)	SNE (%)	Toplam Hücre Sayısı (%)
	4	71.92	5.5	2.92	19.67	MOD: 50 SAYI: 50 SMD: 0
Aralık	4–4	10–100	0–20	0–20	0–80	Smidge-sayısız
	Düzenleme	C: 60 ED: 6,67 RD: 33,33	C: 0 ED: 12,5 RD: 87,5	C: 33,33 ED: 0 RD: 66,67	C: 44,44 ED: 0 RD: 55,56

Tablo 1: Ortalama aşama belirleyici örneklem. Bu tablolar, kategorilere ayırma belirleyicilerinin ortalamalarını ve toplanan tüm EST aşamalarına genel bakışı göstermektedir. Üst tablo, 10 gün boyunca izlenen tüm hayvanların ortalamalarını ve 20 gün boyunca alt tablonun ortalamalarını yansıtır. Bu, östrus döngüsünün süresini, hücre tiplerini ve yüzdelerini, hücre düzenlemelerini ve her hücre tipi için görülen her düzenlemenin yüzdesini içerir. Bu veriler, Pepperdine Üniversitesi'nde bulunan 6 dişi sıçanın verilerini yansıtmaktadır. Kısaltmalar: AKE = anüklee keratinize epitel; LEU = lökositler; LNE = büyük çekirdekli epitelyal; SNE = küçük çekirdekli epitelyal; C = kümelenmiş; ED = eşit dağılmış; RD = rastgele dağılmış; EST = östrus.

Discussion

Önemli adımlar ve dikkat edilmesi gereken önemli noktalar
Sağlanan protokoldeki bazı kritik adımlar, özellikle vajinal hücrelerin toplanmasında vurgu gerektirir. Vajinal sıvı ekstraksiyonu sırasında, şırınga yerleştirmenin uygun açısını ve derinliğini sağlamak, tatmin edici sonuçlar vermenin ve sonuçta hayvana tahriş, yaralanma veya servikal stimülasyonu önlemenin anahtarıdır. Serviksin uyarılması, 12-14 günlük lökosit içeren vajinal^smear 11 ile gösterilen bir psödogebelik indüksiyon kaynağı olabilir. Mikroskop değerlendirme aşamasında, toplanan vajinal hücreleri gösteren görsel düzleme odaklanmak çok önemlidir. Bu, bir veya iki hücreyi tanımlayarak ve odak sağlanana kadar görselleştirmeyi ayarlayarak tamamlanır.

Bunu takiben, evreleme için vajinal hücrelerin temsili görüntülerini yakalamak, mikroskop slaytının tamamını tarayarak gerçekleşir. Bu, yakalanan görüntülerin, hayvanların vajinal kanalında toplanan ve mevcut olanın doğru bir tasvirini yansıtmasını sağlar. Kategorizasyondan önce, hücre tiplerini ve her hücre tipinin sahip olabileceği çeşitli dönüşümleri ayırt etmek gibi kategorize edici determinantlara aşinalık gereklidir. Her katılımcının uygun şekilde eğitilmesi ve önceden hazırlanmış uygulama slaytları aracılığıyla sahne tanımlaması yapması önerilir.

Sürece dahil olan önyargı ve öznellik miktarını azaltmak için, kategorizasyon aşamasına iki katılımcının dahil edilmesi önerilir, her ikisi de tedavi grubu ödevlerine kör kalırken, her hayvan için daha önce kaydedilmiş aşama kimliklerini bilir. Örnekleri kategorize etmek için iki katılımcı atamak, konferansa ve tanımlamalarda öznellikte bir azalmaya izin verir. Bununla birlikte, katılımcılar numuneleri ayrı ayrı kategorize edeceklerse, uzmanlık geliştirildikçe değerlendiriciler arası güvenilirliği artırmak için bir başlangıç işbirliği dönemi olması önerilir. Kategorizasyondan sonra veri setlerinin değiş tokuşu ve ilk değerlendirmeleri doğrulamak için fotoğrafların kullanılması gibi tutarsız bulguları önlemek için ikincil bir sınav sistemi kullanılabilir.

Sınırlamalar ve değişiklikler
Mevcut tekniğin sınırlamaları, uygulanabilirlik süresini içerir. Bir şırınganın tekrar tekrar yerleştirilmesine eşlik edebilecek yaralanma veya tahriş nedeniyle, uzun süreli ve tekrarlayan izleme, hayvanların uygun bakımı ve kullanımı ile uyumlu değildir. Bu nedenle, uzunlamasına bir çalışma yaparken, lavajın sıklığını azaltarak prosedürü değiştirmek gerekebilir. Örneğin, her hayvanı günde bir kez izlemek yerine, sıçanlar hafta boyunca farklı günlerde izlenen gruplara ayrılabilir. İkinci bir sınırlama, hücresel bileşenlerin renge göre ayrılması olmaksızın, ana hatlarıyla belirtilen süreçte numune boyama işleminin olmamasını içerir ve yukarıdaki protokolde listelenen kategorizasyon belirleyicilerine daha fazla güven duyulmasını sağlar.

Ek olarak, bu tür kategorizasyon belirleyicileri içinde, kesin çoğaltmayı sınırlayabilecek öznellik unsurları vardır. Spesifik olarak, toplanan örneklerdeki hücre miktarı yüzdeleri kişisel tahminlere dayanmaktadır. Bu konudaki değişiklikler, mevcut bireysel hücre tiplerini ölçmek için matematiksel bir algoritma geliştirmeyi içerebilir. Alternatif modifikasyonlar, bir mikroskop slaytına bırakılan numune sayısını içerebilir ve bu, slaytın ve kapağın boyutuna bağlı olarak artırılabilir. Diğer sınırlamalar, bu çalışmada vajinal sıvı verilerinin eksikliğini içerebilir - gelecekteki çalışmaların bir modifikasyonu, evre kategorizasyonuna bir katkı olarak toplanan vajinal sıvının koşullarının kaydedilmesini içerebilir. Protokolün ek modifikasyonları, hücre ekstraksiyonu için fosfat tamponlu salin¹³ gibi aynı sonuçları üretecek başka bir izotonik sıvının kullanılmasını içerebilir. Son olarak, bu prosedürü farklı yaşlardaki veya suşlardaki sıçanlara uygularken, vücut büyüklüğü veya aktivite seviyesi nedeniyle hayvan taşıma teknikleri gibi değişiklikler gerekebilir. Bu, yetişkinler için kavrama yöntemi⁶⁹ ve Forelimb Crisscross 64 yöntemlerini ve genç sıçanlar için kullanılan Tek ve İki Elli Kısıtlama⁶⁴ yöntemini içerebilir.

Alternatif yöntemler
Alternatif östrus döngüsü izleme yöntemleriyle karşılaştırıldığında, vajinal lavaj doğruluğu, üretilen bilgi miktarı, minimum invazivliği ve düşük ilişkili maliyetleri bakımından benzersizdir. Rahim ve yumurtalıkların histolojik muayenesi, döngü aşamalarını tanımlamak için kullanılabilir, ancak daha müdahalecidir ve sürekli izlemeye izin vermez. Seks steroid hormon seviyelerinin ölçülmesi, östrus döngüsünün izlenmesine yardımcı olurken, kan alımı gerektirir ve her bir deneğin benzersiz hücresel veya vajinal sıvı profilinin karakterizasyonuna izin vermez. Dış genital organların gelişimi dolaylı olarak seks steroid hormon seviyeleri ile ilişkili olduğundan, vajinal açıklığın incelenmesi cinsel olgunlaşma hakkında bilgi sağlayabilir. Ek olarak, dokunun renklenmesi, nem seviyesi, büyüklüğü ve vajinal açıklığın şişmesi, östrus döngüsü aşamaları⁷⁰ ile ilişkilendirilmiştir. Bununla birlikte, sıçanlarda vajinal kanalın açılmasına yol açan kesin fizyoloji henüz tam olarak bildirilmemiştir. Son yayınlar, bunun üreme gelişiminin sadece dolaylı bir belirteci olduğunu ve her zaman tüylenme ile uyumlu olmadığını bulmuştur^31,34. İdrar örneklerinin biyokimyasal analizi uygun maliyetlidir ve kolayca yapılır, ancak diğer yöntemlerin özgüllüğüne ve güvenilirliğine izin vermez⁷¹. Bu nedenle, vajinal kanalda bulunan hücreleri incelemek kadar güvenilir veya geçerli değildir.

Ek olarak, elektriksel empedansın ölçümü, östrus döngüsünü izlemek için kullanılmıştır ve sıvı lavajdan daha az fiziksel olarak tahriş edicidir. Ancak, bu yöntem kategorilere ayırma bileşenleri hakkında çok fazla bilgi sağlamaz. Bu cihaz, seks steroid hormon seviyelerinin en yüksek^72,73,74 olduğu zamanı ölçerek kasıtlı çiftleşmenin zamanlamasını optimize etmek için özel olarak tasarlanmıştır. Ek olarak, bu yöntemin EST ve EST olmayan arasında ayrım yapmak için etkili olduğu, ancak bu^75'in dışındaki östrus döngüsünü izleme yeteneğinde sınırlı olduğu bildirilmiştir. Genel olarak, bu yöntemin güvenilmez olduğu, her zaman uygun maliyetli olmadığı ve literatürde sıklıkla kullanılmadığı ve karşılaştırılabilir veri eksikliğine yol açtığı bildirilmiştir⁷⁴. Vajinal çubuk, sağladığı bilgilerdeki lavaja en çok benzemekle birlikte, hücreleri almak için vajinal kanalın astarına doğrudan temas etmeyi gerektirdiğinden, tahriş veya yaralanma riskinin artmasını içerir. Son olarak, mikroskop slaytlarının boyanması hücre tipleri arasında daha keskin bir kontrast sağlayabilir ve numunenin korunmasına izin verebilirken, ıslak montaj^53'ten daha zaman alıcı ve maliyetli bir çabadır. Genel olarak, her izleme tekniğinin sınırlamaları ve avantajları vardır ve kemirgen östrus döngüsünün kapsamlı bir incelemesini almak için bu yöntemlerin bir kombinasyonunu kullanmak faydalı olabilir.

Uygulama
Mevcut çalışmayı daha büyük bilimsel topluluk ve genel halk bağlamında görmek önemlidir. Bu metodoloji, dişi hayvanları incelemeyi içeren herhangi bir projede kullanılabilir - yalnızca kasıtlı üremeye odaklanan çalışmalarda değil, anormalliklerle ortaya çıkan hayvanları ve / veya hipotalamik-hipofiz-yumurtalık ekseninin işlevini dışlamak için değil, aynı zamanda tedavi grupları içindeki temel bilgiler için de kullanılabilir. Daha spesifik olarak, bu prosedür i) farmakolojik çalışmalarda etkilidir, çünkü çeşitli ilaçlar ve kimyasallar üreme sistemini bozar veya değiştirir ve östrus döngüsü 11,27,76; ii) seks steroid hormonları ve sinir sistemi arasındaki etkileşimlere bağlı travmatik beyin yaralanmaları, biliş veya dejeneratif bozukluklara odaklananlar gibi nörolojik çalışmalar⁷⁷; iii) miyositler üzerinde bulunan seks steroid hormon reseptörleri ve sonraki etkileşimler nedeniyle dolaşım sistemi araştırması⁷⁷; iv) kemik büyümesi ile ilgili araştırmalar³⁸; endokrin sisteme^11,78; v) diğer üreme dışı çalışmalar³.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AmScope 40X-1000X LED Student Microscope + 5MP USB Camera	AmScope	Part Number: M150C-E5 EAN: 0608729747796 Model Number: M150C-E5	https://www.amazon.com/AmScope-40X-1000X-Student-Microscope-Camera/dp/B00O9GNOTA/ref=sr_1_15?crid=2W9CHTG8YSOTV& keywords=usb+camera+for+microscope& qid=1572477663&s=industrial &sprefix=USB+camera+for+micr%2Cindustrial%2C177&sr=1-15
BD PrecisionGlide Needle Pack, 20G x 1, Short Bevel	Fischer Scientific	14-815-526	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-precisionglide-single-use-needles-short-bevel-regular-wall-4/14815526#?keyword=BD%20PrecisionGlide%20Needle%20Pack,%2020G%20x%201
Bed O Cob 1/8	NEWCO	93009	https://andersonslabbedding.com/cob-products/bed-ocobs-8b/
Corning™ Plain Microscope Slides Plain water-white glass	Fischer Scientific	12-553-7A	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-plain-microscope-slides-microscope-slides-75-x-25mm/125537a
Corning™ Rectangular Cover Glasses	Fischer Scientific	12-553-464	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-square-rectangular-cover-glasses-rectangle-no-1-thickness-0-13-0-17mm-size-24-x-50mm/12553464#?keyword=true
Kimberly-Clark Professional™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fischer Scientific	06-666	https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/p-211240?crossRef=kimwipes
Labdiet Rodent Lab Chow 50lb, 15001	NEWCO Specialty and LabDiet	5012	https://www.labdiet.com/products/standarddiets/rodents/index.html
Linear LED Bulb, UL Type A, T8, Medium Bi-Pin (G13), 4,000 K Color Temperature, Lumens 2550 lm	Grainger	36UX10	https://www.grainger.com/product/36UX10?gclid=CjwKCAjw_ LL2BRAkEiwAv2Y3SW1WdNdkf7 zdIxoT9R6n2DGnrToJHjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRoCi4 cQAvD_BwE&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696 !p!!g!!led18et8%2F4%2F840&ef_id= CjwKCAjw_LL2BRAkEiwAv2Y3SW 1WdNdkf7zdIxoT9R6n2DGnrToJ Hjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRo Ci4cQAvD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&cm_mmc= PPC:+Google+PPC
Sodium Chloride Injection Bags, 0.9%	Live Action Safety	ABB079830939	https://www.liveactionsafety.com/injection-iv-solution-9-sodium-chloride-1000ml-bags/
Syringe Sterile 1ml  with Luer Slip Tip - 100 Syringes by BH Supplies	BH Supplies	ASIN: B07BQDRDC2 UPC: 638632928821	https://www.amazon.com/1ml-Syringe-Sterile-Luer-Slip/dp/B07BQDRDC2/ref=sr_1_1_sspa?crid=13S8EGEUK90G7& keywords=1ml+sterile+syringe&qid= 1572478649&s=industrial &sprefix=1+ml+steri%2Cindustrial%2C187&sr=1-1-spons&psc=1&spLa= ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVy PUEyRlo4NFdZWkJLWkxGJm VuY3J5cHRlZElkPUEwMDEzODQ yMjNWNzdWM0hTNzVBRCZlbmNy eXB0ZWRBZElkPUEwNDI3NzAzM 0E5SzVKMkxaQVc2JndpZGdldE5h bWU9c3BfYXRmJmFjdGlvbj1jbGlja 1JlZGlyZWN0JmRvTm90TG9nQ2 xpY2s9dHJ1ZQ==
Wire lids and floors Mouse Maternity Wire Bar LidUsed with Rat Cage (10" X 19" x 8"H )Overall dimen	Allentown	LV40326013	https://www.labx.com/item/wire-lids-and-floors-mouse-maternity-wire-bar-lidused/LV40326013#description
Ultra Lightweight Tissue and Plastic 17' x 24' Disposable Underpad	Medline	EAN: 0480196288558  Global Trade Identification Number: 40080196288558	https://www.amazon.com/Medline-Industries-MSC281224C-Lightweight-Disposable/dp/B00A2G67YU/ref=sr_1_4?keywords=medline+industries+surgical+pads&qid=1572475853& sr=8-4