Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Yinelemeli epigenomik analizler için yeniden kullanılabilir tek hücre

Published: February 11, 2022 doi: 10.3791/63456
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 1
1Laboratory of Cellular Oncology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Biostatistics and Data Management Section, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 3CCR Collaborative Bioinformatics Resource (CCBR), Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 4Advanced Biomedical Computational Science, Frederick National Laboratory for Cancer Research sponsored by the National Cancer Institute

Summary

Mevcut protokol, yeniden kullanılabilir tek bir hücre kullanarak yinelemeli epigenomik analizler için tek hücreli bir yöntemi açıklamaktadır. Yeniden kullanılabilir tek hücre, aynı tek hücrede birden fazla epigenetik işaretin analizine ve sonuçların istatistiksel olarak doğrulanmasına izin verir.

Abstract

Mevcut tek hücreli epigenom analizleri tek kullanım için tasarlanmıştır. Hücre tek bir kullanımdan sonra atılır, tek bir hücrede çoklu epigenetik işaretlerin analizini önler ve sinyali tek bir hücredeki deneysel arka plan gürültüsünden ayırt etmek için diğer hücrelerden veri gerektirir. Bu makalede, yinelemeli epigenomik analizler için aynı tek hücreyi yeniden kullanma yöntemi açıklanmaktadır.

Bu deneysel yöntemde, hücresel proteinler ilk önce protein ve DNA'ya çapraz bağlamak yerine bir poliakrilamid polimere bağlanır ve yapısal önyargıyı hafifletir. Bu kritik adım, aynı tek hücreyle tekrarlanan deneylere izin verir. Daha sonra, yakınlık ligasyonu için bir iskele dizisine sahip rastgele bir astar, genomik DNA'ya tavlanır ve genomik dizi, bir DNA polimeraz kullanılarak genişletilerek primer'e eklenir. Daha sonra, her biri farklı DNA probları ile etiketlenmiş bir epigenetik belirteç ve kontrol IgG'ye karşı bir antikor, aynı tek hücredeki ilgili hedeflere bağlanır.

Rastgele primer ve antikor arasında, rastgele primer ve antikor-DNA probunun iskele dizisine tamamlayıcı dizilere sahip bir bağlayıcı DNA eklenerek yakınlık ligasyonu indüklenir. Bu yaklaşım, antikor bilgisini ve yakındaki genom dizilerini, yakınlık ligasyonunun tek bir DNA ürününde bütünleştirir. Aynı tek hücreyle tekrarlanan deneylere olanak tanıyarak, bu yöntem nadir bir hücreden veri yoğunluğunda bir artışa ve aynı hücreden sadece IgG ve antikor verilerini kullanarak istatistiksel analize izin verir. Bu yöntemle hazırlanan yeniden kullanılabilir tek hücreler en az birkaç ay saklanabilir ve daha sonra epigenetik karakterizasyonu genişletmek ve veri yoğunluğunu artırmak için tekrar kullanılabilir. Bu yöntem araştırmacılara ve projelerine esneklik sağlar.

Introduction

Tek hücreli teknoloji, bireysel tek hücreli omik teknolojilerini entegre eden tek hücreli multiomik çağına giriyor1. Son zamanlarda, tek hücreli transkriptomikler, kromatin erişilebilirliğini (scNMT-seq2 ve SHARE-seq3) veya histon modifikasyonlarını (Paired-seq4 ve Paired-Tag5) tespit etmek için yöntemlerle birleştirilmiştir. Daha yakın zamanlarda, tek hücreli transkriptomik ve proteomik, kromatin erişilebilirliği ile entegre edilmiştir (DOGMA-seq6). Bu yöntemler, kromatin erişilebilirliğini veya histon modifikasyonlarını tespit etmek için transpozaz tabanlı etiketleme kullanır.

Transpozaz bazlı yaklaşımlar genomik DNA'yı parçalara ayırır ve genomik DNA fragmanının sonuna bir DNA barkodu ekler. Her parçalanmış genomik parça sadece iki DNA barkodunu (= bölünme bölgesi başına bir epigenetik işaret) kabul edebilir ve bölünme bölgesindeki genomik DNA kaybolur. Bu nedenle, bölünmeye dayalı yaklaşımlar, test edilen epigenetik işaretlerin sayısı ile sinyal yoğunluğu arasında bir dengeye sahiptir. Bu, aynı tek hücredeki çoklu epigenetik işaretlerin analizini engeller. Bu sorunun üstesinden gelmek için genomik DNA'yı parçalamayan tek hücreli bir epigenomik yöntem geliştirilmiştir 7,8.

Yukarıda bahsedilen bölünme kaynaklı soruna ek olarak, transpozaz tabanlı yaklaşımların başka sınırlamaları da vardır. Tek hücreli epigenom analizinde, histonların ve DNA ile ilişkili proteinlerin genom üzerindeki yerini bilmek çok önemlidir. Mevcut yaklaşımlarda bu, sabit olmayan tek hücreler kullanılarak ve protein-DNA ve protein-protein etkileşimlerinin tutulmasıyla gerçekleştirilir. Bununla birlikte, bu, histon modifikasyonlarının analizinde bile erişilebilir kromatin bölgelerine güçlü bir önyargı oluşturur 9. Histonların ve genomla ilişkili proteinlerin genom üzerindeki yeri, bir poliakrilamid iskelesi 7,8 kullanılarak protein-DNA ve protein-proteini çapraz bağlamadan korunabilir. Bu yaklaşım, protein-DNA ve protein-protein etkileşimlerine dayanan mevcut yaklaşımlarda gözlenen yapısal önyargıyı azaltır.

Transpozaz tabanlı yaklaşımlar, tek bir hücreden yalnızca bir kez sinyal alabilir. Bu nedenle, sinyallerin düşmesi nedeniyle tek bir hücrenin tam epigenomunu tanımlamak zordur. Yeniden kullanılabilir tek hücreler, aynı tek hücrede yinelemeli epigenomik analize izin vererek mevcut sınırlamaların üstesinden gelmek için geliştirilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: yöntemin şematik bir gösterimi Şekil 1'de gösterilmiştir.

Figure 1
Şekil 1: Protokol iş akışının şematik gösterimi. Adım 7.2-13 şematik gösterimlerle açıklanmaktadır. Her satır protokoldeki bir adımı gösterir. Yeşil renkli bir hücresel protein, kristal bir yapıya (PDB: 6M4G) dayanarak üretilen bir insan nükleozomudur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

1. Tuzdan arındırma kolonlarının dengelenmesi

NOT: Tuzdan arındırma spin sütunları aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi dengelenir. Dengelenmiş tuzdan arındırma sütunları adım 2.1, 3.4 ve 4.6'da kullanılır.

  1. Bir tuzdan arındırma kolonunun alt kapağını çıkarın (7 kDa kesme, 0,5 mL reçine boncuk hacmi, Malzeme Tablosuna bakın) ve tuzdan arındırma kolonunun üstündeki kapağı gevşetin.
  2. Kolonu 1,5 mL protein düşük bağlayıcı bir tüpe (bir toplama tüpü, Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin ve kolondaki depolama çözeltisini çıkarmak için oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 1.500 × g'da santrifüj.
    NOT: Boncuk yatağının üstünü düzleştirmek için bir salıncak rotor santrifüjü kullanın.
  3. 1,5 mL tüpteki akışı çıkarın ve reçine yatağının üzerine 300 μL 150 mM NaCl/100 mM fosfat tamponu, pH 8,0 (bakınız Tablo 1) ekleyin.
  4. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 1.500 × g'da santrifüj yapın ve toplama borusundaki akışı giderin.
  5. 1.3-1.4 arasındaki adımları üç kez daha yineleyin.
  6. Tamponu toplama tüpünden atın ve sütunu yeni bir toplama tüpüne yerleştirin.
  7. Adım 2.1, 3.4 ve 4.4'teki dengeli tuzdan arındırma sütununu kullanın.

2. Antikorların tampon değişimi

NOT: Anti-H3K27ac 10, anti-H3K27me3 10, anti-Med111 ve anti-Pol II10'dan gliserol, arginin ve sodyum azidi çıkarın (bkz. DNaz kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki tüm prosedürler temiz bir başlık altında gerçekleştirilir. Süre: 1 saat

  1. Antikor çözeltisini (100 μL, bakınız Tablo 2) 1. adımı takiben hazırlanan dengeli bir tuzdan arındırma kolonuna uygulayın.
  2. 4 ° C'de 2 dakika boyunca 1.500 × g'da santrifüj yapın ve akışı toplama tüpünden 1,5 mL protein düşük bağlayıcı tüpe aktarın.
  3. IgG konsantrasyonunu 280 nm12'de absorbans kullanarak ölçün (bir mikrohacim spektrofotometresi kullanın).
  4. Antikor çözeltisini bir ultrafiltrasyon kasetine aktarın (moleküler ağırlık kesme 100 kDa, 0,5 mL, Malzeme Tablosuna bakın) ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 12.000 × g'da santrifüj.
  5. 280 nm'deki absorbansı kullanarak IgG konsantrasyonunu ölçün.
  6. IgG konsantrasyonu 1 mg / mL'ye ulaşana kadar 2.4-2.5 adımlarını tekrarlayın.

3. Antikor aktivasyonu

NOT: DNaz kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki prosedür temiz bir başlık altında gerçekleştirilir. Süre: 2.5 saat

  1. 1 mg süksinimidil 6-hidrazinonikotinat aseton hidrazonu (S-HyNic, Malzeme Tablosuna bakınız) 100 μL susuz N, N-dimetilformamid (DMF, Malzeme Tablosuna bakınız) ile çözün.
    NOT: DMF, yanıcı bir organik çözücüdür ve cilt yoluyla emilen güçlü bir karaciğer toksinidir. Eldiven, güvenlik gözlüğü ve laboratuvar önlüğü giyin. Kurumsal güvenlik yönergelerine uyun. Kullanılan laboratuvar yazılımlarını kurumsal yönergelere göre atın.
  2. 100 μL antikor çözeltisine 0.6 μL S-HyNic/DMF ekleyin (150 mM NaCl/100 mM Sodyum fosfat içinde 1 mg/mL, pH8.0). Kullanılan antikorlar ve kontrol IgG için Tablo 2'ye bakınız.
  3. Oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin (ışıktan koruyun).
  4. Numuneyi toplamak için dengelenmiş tuzdan arındırma kolonunun tepesine 100 μL S-Hynic reaksiyonlu antikor uygulayın (bkz. adım 1) ve 4 °C'de 2 dakika boyunca 1.500 × g'da santrifüj yapın.
  5. Kullandıktan sonra tuzdan arındırma sütununu atın.
    NOT: HyNic gruplarının proteinler ve diğer biyomoleküller üzerindeki kararlılığı değişir. Hynic modifiye biyomoleküllerin derhal konjuge edilmesi önerilir.

4. DNA probunun aktivasyonu

NOT: DNaz kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki prosedür temiz bir başlık altında gerçekleştirilir. Süre: 2.5 saat

  1. Antikor veya kontrol IgG (Antikor Probu, Tablo 3) için amin modifiye edilmiş bir DNA probunun bir peletini 20 μL 150 mM NaCl / 100 mM Sodyum Fosfat tamponu, pH 8.0 ile çözün.
    NOT: Tüpün altında ince, şeffaf bir pelet/film olup olmadığına bakın. Tamponu doğrudan peletin üzerine uygulayın. Pelet görünmüyorsa, pelet ayrılmış ve duvara veya kapağa yapışmış olabilir. Bu durumda, tüpü santrifüj edin ve tüpün dibinde bir pelet arayın.
  2. 1 mg süksinimidil 4-formilbenzoat (S-4FB, Malzeme Tablosuna bakınız) 50 μL susuz DMF ile çözün ve çözünmüş Antikor Probuna 10 μL DMF ekleyin.
  3. Adım 4.2'de hazırlanan 4 μL S-4FB / DMF ekleyin, karıştırın ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edin (ışıktan koruyarak).
  4. Dengelenmiş tuzdan arındırma kolonunun üst kısmına 34 μL S-4FB reaksiyonlu Antikor Probu uygulayın (bkz. adım 1).
  5. Numune tamamen emildikten sonra jel yatağının üstüne 15 μL 150 mM NaCl/100 mM Sodyum fosfat tamponu, pH 8.0 uygulayın ve S-4FB modifiye Antikor Probunu toplamak için 4 °C'de 2 dakika boyunca 1.500 × g'da santrifüj yapın.
  6. Sonraki konjugasyon için akışı kullanın; absorbansı 260 nm'de ölçmek; ve Antikor Probunun iyileşme oranını hesaplayın.

5. S-HyNic-modifiye antikor ve S-4FB-modifiye Antikor Probunun konjugasyonu

NOT: DNaz kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki prosedür temiz bir başlık altında gerçekleştirilir. Süre: 2 saat

  1. S-Hynic modifiye antikoru ve S-4FB modifiye Antikor Probunu karıştırın ve karıştırmak için çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyin.
  2. Oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin (ışıktan koruyarak).
  3. Reaksiyonu söndürmek için, 478.8 μL Söndürme ve Depolama çözeltisi ekleyin (bkz. Tablo 1).
  4. Antikor Probu konjuge antikor çözeltisini bir ultrafiltrasyon kasetine aktarın (moleküler ağırlık kesme 100 kDa).
  5. 12.000 × g, 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj.
  6. Pipetleme ile kasetin içindeki çözeltinin hacmini kontrol edin.
  7. Ses seviyesi 100 μL'ye ulaşana kadar 5,5-5,6 arasındaki adımları tekrarlayın ve -20 °C'de saklayın.
    NOT: IgG konsantrasyonu, bir IgG standardı kullanılarak sandviç ELISA13,14,15 ile ölçülür.

6. Çekirdek manyetik boncukların hazırlanması

NOT: Bu yöntemde, tek bir hücre iki katmanlı bir akrilamid boncuğuna gömülür (bkz. Şekil 2). Çekirdek manyetik bir poliakrilamid boncuktur. Dış tabaka tek başına poliakrilamid dir. Çekirdek manyetik boncuklar bu bölümde üretilir. Bu bölüm deneme için gerekli değildir. Süre: 3 saat

Figure 2
Şekil 2: REpi-seq deneylerinde görünürlük ve kolay kullanım için iki katmanlı bir poliakrilamid boncuğun yapısı . (A) Santrifüjlemeden sonra adım 6.6'dan itibaren manyetik nanopartiküller. Manyetik nanopartiküller monomerik akrilamid ile modifiye edilir ve B'de gösterilen poliakrilamid manyetik boncuğuna entegre edilir. (B) Poliakrilamid manyetik boncuk ile yeniden kullanılabilir tek bir hücrenin şematik gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

  1. 50 μL 1 M sodyum bikarbonat tamponu, pH 8.5 ve 450 μL% 40 akrilamid çözeltisini karıştırın.
    NOT: Akrilamid bir nörotoksindir. Eldiven, göz koruyucu ve laboratuvar önlüğü giyin. Kurumsal güvenlik yönergelerine uyun. Kullanılan laboratuvar yazılımlarını kurumsal yönergelere göre atın.
  2. Akrilamid / sodyum bikarbonat tamponunda 1 g NHS ester fonksiyonelleştirilmiş 30 nm demir oksit tozunu ( Malzeme Tablosuna bakınız) askıya alın ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Akrilamid boncuklar şeffaf olduğundan, boncukların konumunu görmek ve manipüle etmek zor olabilir. Demir oksitten yapılmış bir çekirdek boncuğun dahil edilmesi görünürlüğü arttırır ve manipülasyonu kolaylaştırır, çünkü boncukların konumu bir mıknatıs kullanılarak kontrol edilebilir. Bununla birlikte, kullanıcılar REpi-seq deneylerine aşina ise, çekirdek manyetik poliakrilamid boncuklarının kullanımı atlanabilir.
  3. Nanoboncuk süspansiyonunu 2 tüpe (1,5 mL) aktarın, 4 ° C'de 1 saat boyunca 21.300 × g'da santrifüj yapın (açılı bir rotor kullanın) ve süpernatanı çıkarın.
  4. Alt bulamacı 1 mL% 40 Akrilamid/Bis-akrilamid ile askıya alın (19:1, Malzeme Tablosuna bakınız).
    NOT: Bis-akrilamid bir nörotoksindir. Eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin. Kurumsal güvenlik yönergelerine uyun. Kullanılan laboratuvar yazılımlarını kurumsal yönergelere göre atın.
  5. 4 °C'de 1 saat boyunca 21.300 × g'da santrifüj (açılı rotor kullanın).
  6. 4 °C'de 30 dakika boyunca 5.000 × g'da santrifüj yapın (frensiz bir salıncak rotoru kullanın).
  7. Düşük hızlı aspirasyona sahip bir P1000 pipet kullanarak süpernatantı çıkarın.
  8. Ses seviyesini 400 μL %40 Akrilamid/Bis-akrilamid olarak ayarlayın (19:1, Malzeme Tablosuna bakın).
  9. 25 μL% 10'luk amonyum persülfat çözeltisi ekleyin (bkz. Tablo 1).
    NOT: Amonyum persülfat güçlü bir oksitleyici ajandır. Amonyum persülfat içeren havadaki toz, temas ettiğinde gözü, burnu, boğazı, akciğeri ve cildi tahriş edebilir. Eldiven, güvenlik gözlüğü ve laboratuvar önlüğü giyin. Kurumsal güvenlik yönergelerine uyun. Kullanılan laboratuvar yazılımlarını kurumsal yönergelere göre atın.
  10. Çekirdek manyetik poliakrilamid boncukları üretmek için, akrilamid modifiye demir oksit süspansiyonunun 0.5 μL'sini bir PCR tüpüne aktarın.
  11. 50 μL% 4 N,N,N',N'-tetrametiletilendiamin/mineral yağ (TEMED, bakınız Tablo 1) ekleyin ve gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    NOT: TEMED yanıcı bir çözücüdür. Bir kaputun altında çalışın. Nefes almayın. Açık alevlerden, sıcak yüzeylerden ve tutuşma kaynaklarından uzak tutun. Eldiven, güvenlik gözlüğü ve laboratuvar önlüğü giyin. Kurumsal güvenlik yönergelerine uyun. Kullanılan laboratuvar yazılımlarını kurumsal yönergelere göre atın.

7. Hücresel proteinlerin amino grubunun monomer akrilamid ile değiştirilmesi

NOT: REpi-seq, fare ve insan hücrelerinin epigenomunu tek hücre seviyesinde analiz etmek için tasarlanmıştır. Bu yöntemi fare veya insan dışındaki türlerin hücrelerinde kullanırken her adım optimize edilmelidir.

  1. Hücrelerin toplanması
    NOT: Süre: 30 dk
    1. Bir hücre sayacı kullanarak hücre konsantrasyonunu ve canlılığını ölçün ( Malzeme Tablosuna bakınız).
      NOT: Bu adımdaki hücrelerin yaşayabilirliği, veri analizinde kaç hücrenin canlı hücre olduğunu etkiler.
    2. Hücre konsantrasyonunu% 10 fetal sığır serumu içeren kültür ortamı (*) ile 1 × 105 hücre / mL'ye ayarlayın.
      NOT: *Kültür ortamı, ilgilenilen hücreler için en uygun kültür ortamıdır.
    3. Hücre süspansiyonunun 1 mL'sini 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
    4. Hücre süspansiyonunu 240 × g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın.
    5. 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin, hücreleri nazik pipetleme ile karıştırın ve hücre süspansiyonunu 240 × g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.
    6. Supernatan'ı çıkarın.
      NOT: Yukarıdaki tüm adımlar, kontaminasyonu önlemek için laminer akışlı temiz bir davlumbazda gerçekleştirilmelidir.
  2. Hücresel proteinlerin amino grubunun monomerik akrilamid ile değiştirilmesi
    NOT: DNaz kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki prosedür temiz bir başlık altında gerçekleştirilir. Süre: 1.5 saat
    1. Hücre peletine 1 mL Amino Grubu Modifikasyon çözeltisi (bakınız Tablo 1) ekleyin ve hücre peletini nazik pipetleme ile askıya alın.
    2. Tüpü buz üzerinde 1 saat boyunca inkübe edin ve hücre süspansiyonunu 240 × g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.
    3. Süpernatantı çıkarın ve DNA için bir interkalatör boya içeren 100 mL% 4 akrilamid / 1 mM EDTA / PBS içeren hücreleri yeniden askıya alın (bakınız Tablo 1, 1 hücre / μL).

8. Yeniden kullanılabilir tek hücrelerin hazırlanması

  1. Yeniden kullanılabilir tek hücrelerin hazırlanması (manuel versiyon)
    NOT: DNaz kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki prosedür temiz bir başlık altında gerçekleştirilir. Zaman: 9 saat/96 hücre
    1. DNA için bir interkalatör boya içeren hücre süspansiyonunun 1 mL'sini (1 hücre/μL) ve 199 mL'lik 1 mM EDTA/PBS'yi karıştırın (bakınız Tablo 1).
    2. Hücre süspansiyonunun 200 μL'sini düz tabanlı 96 delikli plakaların her bir kuyucuğuna aktarın (toplam 10 plaka, Malzeme Tablosuna bakınız).
    3. Kapağı 96 delikli plakanın üzerine yerleştirin ve tek bir hücre içeren kuyucukları tanımlamak için bir tarama mikroskobu kullanarak 10 plakayı tarayın ( Malzeme Tablosuna bakın).
    4. Tek bir hücre içeren kuyucuğun içeriğini bir PCR tüpüne aktarın.
      1. Plakayı (operatöre doğru) eğin ve tek hücre kuyunun alt kenarına batana kadar birkaç dakika bekleyin.
      2. Pipet ucunu alt köşeye yerleştirin ve tek hücreyi ve tamponu (aspire 210 μL/kuyu = 200 μL tampon + 10 μL hava) bir PCR tüpüne aktarın.
        NOT: P200 düşük tutma özelliğine sahip bir ipucu kullandığınızdan emin olun.
      3. Aktarımı onaylamak için bir floresan mikroskobu kullanarak kuyucuğu kontrol edin.
      4. Tek bir hücre hala kuyuda ise, DNA için bir interkalatör boya içeren 1 mM EDTA / PBS'nin 200 μL / kuyusunu ekleyin.
      5. Ardından, aktarımı tekrarlayın.
    5. PCR tüpünü frensiz bir dönüş rotoru kullanarak 4 °C'de 5 dakika boyunca 240 × g'da santrifüjleyin.
      NOT: Frenleme, tüpte dönen bir su akışına neden olur ve bu da tek hücrenin çökelmesini bozar. Frensiz sallanan bir rotorla santrifüj yaparken, tek hücre her zaman tüpün dibine batar. Bununla birlikte, açılı bir rotor kullanılırsa, tek hücre PCR tüpünün yan duvarına yapışır ve kaybolabilir.
    6. Süpernatantın 195 μL'sini çok yavaş bir pipetleme hızıyla çıkarın.
    7. 195 μL/tüp Akrilamid/Bis-akrilamid/APS çözeltisi ekleyin (bkz. Tablo 1).
    8. PCR tüpünü frensiz bir dönüş rotoru kullanarak 4 °C'de 5 dakika boyunca 240 × g'da santrifüjleyin.
    9. Süpernatantın 195 μL'sini çok yavaş pipetleme hızıyla çıkarın.
    10. Alt 3 μL'yi% 4 TEMED / mineral yağ ve manyetik bir poliakrilamid boncuk (adım 6'da üretilen) içeren PCR tüpüne aktarın.
      NOT: P10 düşük tutma özelliğine sahip bir ipucu kullandığınızdan emin olun. Hücreyi manyetik poliakrilamid boncuğun yakınında dağıtın. Mineral yağda, tek hücreyi içeren sıvı, manyetik poliakrilamid boncuğun yüzeyine yüzey gerilimi ile yapışır.
    11. Gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
      NOT: Bu işlem iki katmanlı bir akrilamid jel boncuk üretir. Çekirdek manyetik bir jel boncuktur. Dış tabaka, tek bir hücre içeren poliakrilamid jeldir. Tek hücre, jelin dış tabakasına gömülüdür. Güvenli durma noktası: Yeniden kullanılabilir tek hücreler %50 gliserol/1 mM EDTA/%0,05 Tween %20/0,5 BSA/TBS tamponu ile yıkandıktan sonra, yeniden kullanılabilir tekli hücreler -20 °C'de 6 aya kadar saklanabilir.
  2. Yeniden kullanılabilir tek hücrelerin hazırlanması (yarı otomatik versiyon)
    NOT: DNaz kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki prosedür temiz bir başlık altında gerçekleştirilir. Zaman: 3 saat/96 hücre
    1. DNA için bir interkalatör boya içeren 1 mL hücre süspansiyonu (1 hücre/μL) ve 199 mL 1 mM EDTA/PBS'yi karıştırın (bkz. Tablo 1).
    2. Hücre süspansiyonunun 200 μL'sini 4 nL'lik bir nanowell plakasının her bir kuyucuğuna aktarın (Şekil 3'e ve Malzeme Tablosuna bakın) ve 4 nL nanowell plakasını otomatik bir tek hücreli toplama robotuna yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın).
    3. Otomatik tek hücreli toplama robotuna varış plakası olarak 96 delikli bir PCR plakası yerleştirin. Her bir kuyucuğun 200 μL/kuyu Akrilamid / Bis-akrilamid / APS çözeltisi içerdiğinden emin olun (bkz. Tablo 1).
    4. Tek bir hücreyi 4 nL'lik bir nano kuyudan 96 delikli PCR plakasının bir kuyucuğuna aktarın (bkz.
    5. 96 delikli PCR plakasının üzerine bir kapak yerleştirin ve frensiz bir salıncak rotoru kullanarak 96 delikli plakayı 240 × g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.
    6. 96 delikli PCR plakasını otomatik bir sıvı taşıma robotunun güvertesine yerleştirin ( Malzeme Tablosu, Şekil 4 ve Ek Kod 1'e bakınız).
    7. Ek Kod 1'i sürükleyip sıvı taşıma robotunun yazılım penceresine (Malzeme Tablosuna bakın) bırakın.
    8. Programı otomatik sıvı taşıma robotunda çalıştırın (bkz. Ek Video S2 ve Ek Video S3).
      1. Süpernatantın 195 μL'sini çok yavaş bir pipetleme hızıyla çıkarın.
      2. 50 μL %4 TEMED/mineral yağ ekleyin.
        NOT: 8.2.8.1-8.2.8.2 adımları manuel pipetleme ile gerçekleştirilebilir.
    9. Gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin (Şekil 5). Güvenli durma noktası: Yeniden kullanılabilir tek hücreleri %50 gliserol/1 mM EDTA/%0,05 Tween %20/0,5 BSA/TBS tamponu ile yıkadıktan sonra, yeniden kullanılabilir tek hücreleri -20 °C'de 6 aya kadar saklayın.

Figure 3
Şekil 3: Otomatik tek hücreli toplama ve adım 8.2'de 96 delikli bir PCR plakasına aktarma . (A) Tek bir hücre toplama sistemine genel bakış. Tek bir hücre toplama robotu, kontaminasyonu önlemek için laminer akışlı temiz bir davlumbazdadır. (B) Kuyunun içinde 4 nL nano kuyucuklu 24 delikli bir plaka. (C) 24 delikli plakadan bir kuyucuktaki hücre dağılımı. Yeşil noktalar, her 4 nL nano kuyuda tek bir hücre olarak tanımlanan hücrelerdir. Macenta noktalar, çiftler veya hücre katları olarak tanımlanan hücrelerdir. (D) 24 delikli plakadaki kuyunun parlak alan görüntüsü. Yeşil bir kare, tek bir hücre içeren 4 nL'lik bir nanowell'dir. Bir macenta kare, birden fazla hücre içeren 4 nL'lik bir nanowell'dir. (E) Bazı 4 nL nanowelllerin büyütülmüş alanı. Parlak noktalar 4 nL nanowelllerde tek hücrelerdir. Tek hücre toplama sistemi, DAPI boyamalı hücrelerin parlak alan ve floresan görüntülerini elde ederek tek bir hücre içeren nanokuyucukları tanımlar. Tanımlanan tek hücreler, 4 nL nanowell'den 96 delikli bir PCR plakasının bir kuyusuna aktarılır. Ölçek çubukları = 2 mm (C, D), 100 μm (E). Kısaltma = DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Bir sıvı taşıma robotu kullanarak yeniden kullanılabilir tek hücreler üretmek . (A) Sıvı taşıma robotunun bir güvertesi. Güvertede pipet ucu rafları için 11 yuva (P300 ipucu: Yuva 1-3, P20 uç: Yuva 5-6), 2 mL derin kuyucuklu 96 delikli plaka (Yuva 4), kuyucuk başına tek bir hücre içeren iki adet 96 delikli PCR plakası (Yuva 7 ve 10) ve sıvı atıklar için iki adet düz tabanlı 96 delikli plaka (Yuva 8 ve 11) bulunur. (B) Laboratuvar gereçlerini yerleştirdikten sonraki güverte. (C) Adım 8.8.1'de robotik pipetlemenin şematik gösterimi. Program, 96 delikli PCR plakasının altından tek bir hücreyi aspire etmeden süpernatantı çıkarır. (D) Ek Kod 1 kullanılarak oluşturulan yeniden kullanılabilir tek hücreler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

9. Rastgele astar tavlama ve uzatma

NOT: DNaz kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki prosedür temiz bir başlık altında gerçekleştirilir. Aşağıdaki adımlardaki yıldız işaretleri (*) tüp içinde yeniden kullanılabilir tek bir hücre içeren poliakrilamid boncukların konumunu kontrol etmek için manyetik bir ayırıcının kullanılabileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, manyetik ayırıcının kullanılması zorunlu değildir. Pipet ucundan tüpün duvarı boyunca yavaşça aşağı doğru hareket ettirilerek, boncuklar yıkama veya tampon değişimi için yukarı itilir. Süre: 9 saat

  1. Mineral yağı pipetleme(*) ile çıkarın ve 200 μL 1x TP Mg(-) tampon ile 5 kez yıkayın (*) (10x TP Mg(-) tamponunu ultra saf su ile 1x tampona seyreltin, bkz.
  2. Süpernatantı (*) çıkarın ve 15 μL Tavlama tamponu ekleyin (bkz. Tablo 1).
  3. Buz üzerinde 1 saat inkübe edin.
    NOT: Bu inkübasyonun amacı, plazma ve nükleer membranları geçirgen hale getirmek ve rastgele astarı hücre çekirdeğine vermektir.
  4. PCR tüplerini bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve 3 dakika boyunca 94 ° C'de ısıtın.
    NOT: Tüp boyutu 0,2 mL'dir. Çözeltinin hacmi, poliakrilamid boncuğun hacmi de dahil olmak üzere yaklaşık 20 μL'dir. Termal döngü kapağının sıcaklığı 105 °C'dir.
  5. Tüpleri buz soğutmalı metal bir bloğa aktarın ve 2 dakika boyunca inkübe edin.
  6. 4 μL MgSO4/NaCl/dNTP karışımı ekleyin ( bakınız Tablo 1) ve orta hızda bir vorteks karıştırıcı ile karıştırın.
  7. 1 μL Bst polimeraz, büyük parça ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve orta hızda bir vorteks karıştırıcı kullanarak karıştırın.
  8. Bir çalkalayıcıda 4 saat inkübe edin (4 ° C'de 600 rpm).
    NOT: Bu inkübasyonun amacı, Bst polimerazı hücre çekirdeğine vermektir.
  9. PCR tüpünü bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve aşağıdaki programlardan birini çalıştırın.
    1. 4 saatlik bir program çalıştırın: 30 dakika boyunca 10 °C, 30 dakika için 20 °C ve 180 dakika için 25 °C.
    2. Alternatif olarak, bir gecelik program çalıştırın: 4 saat için 4 °C, 2 saat için 10 °C, 2 saat için 20 °C, 4 saat için 25 °C ve 4 °C'de tutun.
      NOT: Tüp boyutu 0,2 mL'dir. Çözeltinin hacmi, poliakrilamid boncuğun hacmi de dahil olmak üzere yaklaşık 25 μL'dir. Termal döngü kapağının sıcaklığı 105 ° C'dir. Güvenli durma noktası: Yeniden kullanılabilir tek hücreleri 4 ° C'de saklayarak deneyi burada 1 güne kadar durdurun.

10. Antikor bağlama

NOT: DNaz kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki prosedür temiz bir başlık altında gerçekleştirilir. Süre: 1.5 saat

  1. 1,625 μL NaCl/EDTA/BSA çözeltisi ekleyin ( bkz. Tablo 1) ve düşük hızda vorteks yaparak karıştırın.
    NOT: Bu adım, 1) EDTA ile Mg 2 + şelasyonunu kolaylaştırmayı,2 ) genişletilmiş 1. st rastgele primerin 300 mM NaCl ile bağlanmasını stabilize etmeyi ve 3) sonraki reaksiyonda sığır serum albümini (BSA) kullanarak antikorların spesifik olmayan bağlanmasını engellemeyi amaçlamaktadır.
  2. Buz üzerinde 1 saat inkübe edin ve antikorun her birine 0.1 μg / mL ekleyin ve Antikor Probu ile konjuge edilmiş IgG'yi kontrol edin (5. adımda hazırlanır).
  3. Bir çalkalayıcı üzerinde hafifçe sallayarak gece boyunca buz üzerinde inkübe edin.

11. Antikor probunun yakınlık ligasyonu ve proksimal olarak genişletilmiş rastgele astar

NOT: DNaz kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki prosedür temiz bir başlık altında gerçekleştirilir. Aşağıdaki adımlardaki yıldız işaretleri (*) tüp içinde yeniden kullanılabilir tek bir hücre içeren poliakrilamid boncukların konumunu kontrol etmek için manyetik bir ayırıcının nerede kullanılabileceğini gösterir. Bununla birlikte, manyetik ayırıcının kullanılması zorunlu değildir. Pipet ucundan tüpün duvarı boyunca yavaşça aşağı doğru hareket ettirilerek, boncuklar yıkama veya tampon değişimi için yukarı itilebilir. Süre: 6 saat

  1. Buz üzerinde 200 μL 1x TPM-T tamponu (her yıkamada 20 dakikalık inkübasyon) ile iki kez yıkayın (*) 10x TPM-T tamponunu (Tris-HCl / Potasyum klorür / Magnezyum sülfat / Triton X-100) ultra saf su ile 1x'e seyreltin).
  2. Süpernatantı (*) çıkarın ve (*) bir kez 1x T4 DNA ligaz tamponu ile yıkayın (bkz.
  3. Süpernatantı (*) çıkarın ve 19 μL Ligasyon Adaptörü Çözeltisi ekleyin (bkz. Tablo 1).
  4. 25 ° C'de 1 saat inkübe edin.
  5. 1 μL T4 DNA ligaz ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve tüpü bir vorteks karıştırıcı üzerinde orta hızda karıştırın.
  6. Tüpü bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın: yakınlık ligasyon programı, 16 ° C'de 4 saat ve 25 ° C'de 30 dakika.
    NOT: Tüp boyutu 0,2 mL'dir. Çözeltinin hacmi, poliakrilamid boncuğun hacmi de dahil olmak üzere yaklaşık 25 μL'dir. Termal döngü kapağının sıcaklığı oda sıcaklığıdır.
  7. 200 μL 1x Bst Mg(-) EDTA(+) tamponu ile iki kez kısaca yıkayın (*) (bakınız Tablo 1; 10x stok tamponundan 1x tampon hazırlayın) ve hücreyi gece boyunca 4 °C'de saklayın. Güvenli durma noktası: Yeniden kullanılabilir tek hücreleri 4 °C'de depolayarak deneyi burada 1 güne kadar durdurun.

12. 1. rastgele astarın tam uzantısı

NOT: DNaz kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki prosedür temiz bir başlık altında gerçekleştirilir. Süre: 4.5 saat

  1. 200 μL 1x Bst Mg(-) EDTA(-) tamponu ile iki kez yıkayın (bakınız Tablo 1, 10x stok tamponundan 1x tampon hazırlayın), süpernatanı çıkarın ve 20 μL Bst/dNTP/MgSO4 karışımı ekleyin (bkz. Tablo 1).
  2. Orta hızda bir vorteks karıştırıcı ile karıştırın ve yörüngesel bir çalkalayıcıda (6 ° C ve 500 rpm'de) 4 saat boyunca inkübe edin.
  3. Tüpü bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın: tam uzatma programı: 1 saat için 10 °C, 1 saat için 20 °C, 1 saat için 30 °C, 1 saat için 40 °C, 1 saat için 50 °C, 1 saat için 65 °C, 10 dakika boyunca 94 °C ve 4 °C'de tutun.
    NOT: Güvenli durma noktası: Yeniden kullanılabilir tek hücreler 4 °C'de saklanarak deney burada 1 güne kadar durdurulabilir.

13. Çoklu deplasman amplifikasyonu

NOT: DNaz kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki prosedür temiz bir başlık altında gerçekleştirilir. Süre: 2,5 saat (13.1-13.2 arası adımlar) + 15 dakika (13.3-13.4 arası adımlar) + 1 gün (13.5-13.10 arası adımlar)

  1. 0,4 μL 100 μM 2nd rastgele astar ekleyin (bakınız Tablo 3) ve orta hızda bir vorteks karıştırıcı ile karıştırın.
  2. Bir yörüngesel çalkalayıcıda 6 ° C'de 2 saat ve 500 rpm'de inkübe edin ve tüpü bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve 3 dakika boyunca 94 ° C'de ısıtın.
    NOT: Tüp boyutu 0,2 mL'dir. Çözeltinin hacmi, poliakrilamid boncuğun hacmi de dahil olmak üzere yaklaşık 25.4 μL'dir. Termal döngü kapağının sıcaklığı 105 °C'dir.
  3. Tüpleri buz soğutmalı metal bir bloğa yerleştirin ve 1 μL / tüp Bst DNA polimeraz ekleyin.
  4. Vorteksi yavaş hızda, tüpleri bir termal çevrimleyiciye yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın:
    4 saat boyunca 4 °C, 30 dakika için 10 °C, 30 dakika için 20 °C, 30 dakika için 30 °C, 30 dakika için 40 °C, 30 dakika için 50 °C, 60 dakika için 65 °C, 3 dakika boyunca 94 °C ve 4 °C'de tutun.
    NOT: Tüp boyutu 0,2 mL'dir. Çözeltinin hacmi, poliakrilamid boncuğun hacmi de dahil olmak üzere yaklaşık 26.4 μL'dir. Termal döngü kapağının sıcaklığı 105 ° C'dir. Güvenli durma noktası: Yeniden kullanılabilir tek hücreleri 4 ° C'de saklayarak deneyi burada 1 güne kadar durdurun.
  5. Süpernatantı (yaklaşık 20 μL) toplayın ve bir PCR tüpüne aktarın.
  6. Toplanan süpernatantı -80 ° C'de saklayın.
  7. Yeniden kullanılabilir tek hücreyi içeren bir PCR tüpüne 20 μL/tüp %0,05 Tween 20/0,1x TE tamponu ekleyin (bakınız Tablo 1) ve yeniden kullanılabilir tek hücreyi bir gecede 4 °C'de inkübe edin. Güvenli durma noktası: Kuluçka süresini uzatarak deneyi burada birkaç günlüğüne durdurun.
  8. Süpernatantı toplayın ve süpernatantı adım 13.5'te toplanan örnekle birleştirin.
  9. 13.7-13.8 arasındaki adımları bir kez daha yineleyin. Yeniden kullanılabilir tek hücreyi %50 gliserol/5 mM EDTA/%0,5 BSA/%0,05 Tween20/TBS tamponunda bekletin ve yörüngesel çalkalayıcıda (4 °C, 600 rpm) 30 dakika boyunca inkübe edin. Yeniden kullanılabilir tek hücreyi bir sonraki deneye kadar -20 ° C'de saklayın.
  10. 40 μL Exo-master karışımı ekleyin (bakınız Tablo 1) ve tüpü bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın: i) 5 dakika boyunca 95 °C, ii) 30 s için 95 °C, iii) 60 °C 30 s, iv) 30 s için 72 °C, v) ii-iv adımlarını 19 kez tekrarlayın, vi) 5 dakika boyunca 72 °C, vii) 4 °C'de tutun.
    NOT: Tüp boyutu 0,2 mL'dir. Çözeltinin hacmi, poliakrilamid boncuğun hacmi de dahil olmak üzere yaklaşık 45 μL'dir. Termal döngü kapağının sıcaklığı 105 ° C'dir. Güvenli durma noktası: Deney, numune -80 ° C'de saklanarak en az birkaç gün boyunca burada durdurulabilir.

14. Fenol-kloroform saflaştırma ve polietilen glikol çökeltme

NOT: DNaz kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki prosedür temiz bir başlık altında gerçekleştirilir. Süre: 1.5 saat

  1. Ürünü 0.5 mL DNA düşük bağlayıcı bir tüpe aktarın ve 100 μL Fenol: Kloroform: İzoamil Alkol ekleyin.
    NOT: Fenol: Kloroform: İzoamil Alkol tahrişe neden olur ve muhtemelen temas yoluyla yanar. Eldiven, güvenlik gözlüğü ve laboratuvar önlüğü giyin. Sadece yeterli havalandırma ile kullanın veya uygun bir solunum cihazı kullanın. Kurumsal güvenlik yönergelerine uyun. Kullanılan laboratuvar yazılımlarını kurumsal yönergelere göre atın.
  2. Elle 30 sn çalkalayın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 12.000 × g'da santrifüj yapın.
  3. Sulu fazı (80 μL) 0.5 mL DNA düşük bağlayıcı bir tüpe toplayın ve 40.84 μL / tüp Doğrusal akrilamid / MgCl2 karışımı ekleyin (bakınız Tablo 1).
  4. 47,06 μL/tüp %50 (w/v) PEG8000 (RNase içermeyen) ekleyin ve pipetleme ile karıştırın.
  5. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 240 × g'da santrifüj yapın.
  6. Süpernatantı çıkarın ve 400 μL/tüp %80 etanol (EtOH) ekleyin.
  7. % 80 EtOH ile yıkayın, bir aspiratör kullanarak süpernatantı çıkarın ve peletleri havada kurutun.
  8. Peletleri 20 μL 1 mM EDTA/10 mM Tris-HCl, pH 7,4 tampon ile askıya alın ve çözeltiyi -80 °C'de saklayın.
    NOT: DNA konsantrasyonunu çift sarmallı DNA'ya özgü bir interkalatör boya kullanarak ölçün ( Malzeme Tablosuna bakınız). Güvenli durma noktası: Deney burada en az bir hafta boyunca güvenli bir şekilde durdurulabilir.

15. In vitro transkripsiyon

NOT: DNaz ve RNaz kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki prosedür temiz bir başlık altında gerçekleştirilir. Süre: 5 saat

  1. Tek hücreli türetilmiş ürünlerin DNA'sını çözün (14. adımdan itibaren) ve DNA ürünlerinin 2 μL / hücresini (toplam hacim 20 μL) karıştırarak tek hücreli türetilmiş ürünlerin karışık bir kütüphanesini hazırlayın.
  2. 26 μL In vitro transkripsiyon ana karışımı ekleyin ( Malzeme Tablosuna ve üreticinin protokolüne bakın) ve pipetleme ile karıştırın.
  3. PCR tüpünü bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve 37 ° C'de 4 saat inkübe edin.
    NOT: Tüp boyutu 0,2 mL'dir. Çözeltinin hacmi 46 μL'dir. Termal döngü kapağının sıcaklığı 105 °C'dir.
  4. 5 μL 10x DNaz I tamponu ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın) ve 4 μL DNaz I ekleyin (RNase içermez, 4 U, Malzeme Tablosuna bakın).
  5. 37 ° C'de 15 dakika boyunca karıştırın ve inkübe edin ve numuneyi 0,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
  6. 300 μL / tüp Guanidinium tiyosiyanat-fenol-kloroform ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve nazik vorteksleme ile karıştırın.
    NOT: Guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform temas yoluyla ciddi kimyasal yanıklara yol açabilir. Eldiven, güvenlik gözlüğü ve laboratuvar önlüğü giyin. Sadece yeterli havalandırma ile kullanın veya uygun bir solunum cihazı kullanın. Kurumsal güvenlik yönergelerine uyun. Kullanılan laboratuvar yazılımlarını kurumsal yönergelere göre atın.
  7. Bir çalkalayıcıda R.T.'de 5 dakika inkübe edin ve ardından numuneleri -80 ° C'de 3 güne kadar saklayın.
    NOT: Güvenli durma noktası: Deney burada 3 güne kadar güvenle durdurulabilir.

16. RNA saflaştırma

NOT: DNaz ve RNaz kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki prosedür temiz bir başlık altında gerçekleştirilir. Süre: 2 saat

  1. Adım 15.7'den itibaren numuneye 80 μL/tüp kloroform ekleyin ve tüpü 15 saniye boyunca elle kuvvetlice çalkalayın.
  2. Oda sıcaklığında 2-15 dakika inkübe edin ve numuneyi 4 ° C'de 15 dakika boyunca 12.000 × g'da santrifüj edin.
  3. Numunenin sulu fazını (~ 200 μL) toplayın ve yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.
  4. 600 μL/tüp Guanidinium tiyosiyanat-fenol-kloroform ekleyin ve numuneyi 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
  5. 180 μL/tüp Kloroform ekleyin ve tüpü 15 saniye boyunca elle kuvvetlice çalkalayın.
  6. Numuneyi 12.000 × g'da 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj edin.
  7. Numunenin sulu fazını (~ 450 μL) toplayın ve 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
  8. 60 μL / tüp Lineer Akrilamid (5 μg / μL) ekleyin ve sulu faza 400 μL / tüp % 100 izopropanol ekleyin.
  9. Tüpü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 12.000 × g'da santrifüj edin.
  10. Supernatant'ı dikkatlice çıkarın.
  11. RNA peletini 200 μL% 75 etanol (EtOH / RNaz içermeyen su) ile 3 kez yıkayın, süpernatanı çıkarın ve RNA peletini havayla kurutun.
    NOT: RNA'nın tamamen kurumasına izin vermeyin, çünkü pelet çözünürlüğünü kaybedebilir.
  12. RNA peletini bir RNAse inhibitörü (1 μL/20 μL) içeren 20 μL RNaz içermeyen suda tekrar askıya alın ve pipetleme ile pelet çözün.
  13. Absorbansı 260 nm'de ölçün.

17. Ters transkripsiyon

NOT: DNaz kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki prosedür temiz bir başlık altında gerçekleştirilir. Süre: 1 saat

  1. 7 μL / tüp Ters Transkripsiyon astarı + dNTP karışımı ekleyin (bakınız Tablo 1 ve Tablo 3) ve tüpleri bir termal döngüleyiciye yerleştirin.
    NOT: Tüp boyutu 0,2 mL'dir. Çözeltinin hacmi 27 μL'dir. Termal döngü kapağının sıcaklığı 105 °C'dir.
  2. 65 ° C'de 5 dakika ısıtın ve tüpleri en az 1 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
  3. 14 μL/tüp Ters transkriptaz ana karışımı ekleyin ( bkz. Tablo 1) ve pipetleme ile karıştırın.
  4. Tüpleri bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve 10 dakika boyunca 55 ° C'de ve daha sonra 10 dakika boyunca 80 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Tüp boyutu 0,2 mL'dir. Çözeltinin hacmi 60 μL'dir. Termal döngü kapağının sıcaklığı 105 °C'dir.

18. İkinci iplik sentezi

NOT: DNaz kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki prosedür temiz bir başlık altında gerçekleştirilir. Süre: 2.5 saat

  1. 40 μL / tüp ultra saf su ekleyin ve 100 μL çözeltiyi iki 0.2 mL PCR tüpüne (50 μL / tüp) bölün.
  2. 60 μL/tüp İkinci İplikçik Sentezi karışımı ekleyin (bakınız Tablo 1) ve tüpleri bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın: i) 5 dakika boyunca 95 °C, ii) 30 s için 95 °C, iii) 30 s için 60 °C, iv) 30 s için 72 °C, v) ii-iv adımlarını 20 kez tekrarlayın ve vi) 4 °C'de tutun.
    NOT: Tüp boyutu 0,2 mL'dir. Çözeltinin hacmi 110 μL'dir. Termal döngü kapağının sıcaklığı 105 °C'dir.
  3. 4,4 μL/tüp 0,5 M EDTA (son 20 mM) ekleyin ve gece boyunca -80 °C'de saklayın.
    NOT: Güvenli durma noktası: Deney burada birkaç güne kadar güvenle durdurulabilir.
  4. DNA'yı fenol-kloroform saflaştırma ve polietilen glikol çökeltme ile saflaştırın (adım 14'te açıklanmıştır).
    NOT: Güvenli durma noktası: Deney burada en az bir hafta boyunca güvenli bir şekilde durdurulabilir.

19. Restriksiyon enzim sindirimi ve boyut seçimi

NOT: DNaz kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki prosedür temiz bir başlık altında gerçekleştirilir. Zaman: 3 saat (adımlar 19.1-19.7)

  1. Saflaştırılmış DNA'nın DNA konsantrasyonunu (adım 18.4'ten itibaren) 260 nm'de absorbansı ölçerek ölçün.
  2. Bir PCR tüpüne 6 μg DNA aktarın, 30 μL 10x Sindirim tamponu ekleyin ve hacmi ultra saf su ile 294 μL'ye ayarlayın.
  3. 6 μL BciVI kısıtlama enzimi ekleyin ve 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  4. EtOH çökeltmesini Lineer poliakrilamid ile gerçekleştirin.
    1. 60 μL/tüp 3 M sodyum asetat (pH 5.2) ekleyin ve ardından 40 μL/tüp Lineer akrilamid ekleyin (5 mg/mL, Malzeme Tablosuna bakınız).
    2. 400 μL/tüp EtOH ekleyin ve gece boyunca -20 °C'de inkübe edin.
      NOT: Güvenli durma noktası: Deney burada bir günlüğüne güvenli bir şekilde durdurulabilir.
    3. 12.000 × g'ı 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın.
    4. Peletleri %80 EtOH ile iki kez yıkayın ve kurutun.
    5. Peletleri 20 μL 1xTE tamponu ile çözün ve 4 μL/tüp taze 6x Jel Yükleme tamponu ekleyin.
  5. Numuneyi %5 agaroz jeli/0,5x TAE tamponuna yükleyin ve elektroforez yapın (40 dakika boyunca 50 V).
  6. Jeli 50 bp'nin üzerinde kesin ve toplayın (bkz. Şekil 6) ve bir Jel Ekstraksiyon kiti kullanarak DNA'yı çıkarın.
    NOT: Güvenli durma noktası: Deney burada en az bir hafta boyunca güvenli bir şekilde durdurulabilir.
  7. Bir DNA kütüphanesi hazırlama kiti kullanarak dizileme kütüphanesini oluşturun (Malzeme Tablosuna bakınız)16,17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

K562 tek hücreleri, adım 8'de açıklanan protokol kullanılarak oluşturulmuştur (bkz. Şekil 5). Tek hücreler poliakrilamid boncuğun dış tabakasına gömüldü. Hücre DNA'sı, DNA boyaması için bir interkalatör boya kullanılarak boyandı ve görselleştirildi.

Figure 5
Şekil 5: Oluşturulan yeniden kullanılabilir tek hücreler. Hücreler DNA için bir interkalatör boya ile boyanır (yeşil floresan). Beyaz oklar, poliakrilamid boncukların dış tabakasına gömülü tek hücreleri gösterir. Yeniden kullanılabilir tek hücre, 96 delikli düz tabanlı bir plakaya yerleştirilir. Görüntüler BZ-X710 tarama mikroskobu ile çekildi. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6'da gösterilen sonuçlar, istenen DNA ürünlerinin üretimini desteklemiştir. Adım 19.7'deki DNA ürünleri, BciVI kısıtlama enzimi tarafından 19-20 bp, 31-32 bp, 49 bp ve >49 bp parçalarına bölündü. Bu sonuçlar, çoğu ürünün Antikor Probu türevi sekanslar ve 2. rastgele primer türevli sekanslar içerdiği sonucunu desteklemiştir. DNA ürünleri daha sonra bir TruSeq Nano kiti kullanılarak Illumina adaptörü ile bağlandı ve bir Illumina NovaSeq6000 sıralayıcı kullanılarak sıralandı.

Figure 6
Şekil 6: BciVI kısıtlama enzim sindiriminden önce ve sonra DNA ürünleri. (A) BciVI sindirimi, beklenen 19-20 bp fragmanlarını, 31-32 bp fragmanlarını ve Antikor Barkodu, Ligated sekans, genomik DNA ve Hücre barkodu içeren istenen ürünleri (>49 bp) üretti. (B) Nihai ürünlerin 19.7 adımının sonundaki boyut dağılımı. Oluşturulan DNA kütüphanesi kılcal elektroforez ile analiz edildi. Açık pembe çizgi, sıralama adaptörleri, antikor barkodu ve hücre barkodu içeren istenen ürünleri gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Sıralama sonuçları, 7-19. adımları izleyerek üretilen ürünlerin Antikor Probu, bağlı dizi, genom dizisi ve hücre barkodu içerdiğini göstermiştir. Anti-H3K27ac ve anti-H3K27me3'ten gelen benzersiz haritalanmış okumalar, kontrol IgG'sinden önemli ölçüde daha fazlaydı (bkz. Şekil 7A). Bu, anti-H3K27ac ve anti-H3K27me3'ün spesifik bağlanmasının, istenen ürünlerin sayısını artırdığını gösterir. Tek hücreli epigenom analizi için en gelişmiş teknoloji olan Paired-Tag, çekirdek başına yaklaşık 2.000 benzersiz H3K27ac okuması ve 1.500 benzersiz H3K27me3 okuması elde eder. Sonuçlarımız çok daha fazla sayıda benzersiz okuma gösterdi (ortalama 699.398 H3K27ac sinyali / hücresi ve 505.433 H3K27me3 sinyali / hücresi). Sonuçlar ayrıca, aynı yeniden kullanılabilir tek hücreyi kullanan tekrarlanan deneylerin sinyal kaybını azalttığı ve sinyal yoğunluğunu arttırdığı sonucunu da destekledi.

Şekil 7A'da gösterilen REpi-seq sinyalleri, REpi-seq verileri ile toplu ChIP-seq verileri karşılaştırılarak değerlendirilmiştir. Şekil 7B'de, ortalama olarak, REpi-seq'ten gelen H3K27ac sinyallerinin% 91 ±% 3.24'ü, toplu ChIP-seq'teki H3K27ac zirveleriyle çakıştı. Bu analiz, tek hücreli epigenom analizindeki "hassasiyet" seviyesini ölçer18. Aktif histon işareti H3K4me3 için mevcut tek hücreli epigenomik yöntemlerin hassasiyeti% 53'tür (Drop-ChIP; H3K4me3)18, %50 (scChIC-seq; H3K4me3)19 ve %60 (ACT-seq; H3K4me3)20. Ek olarak, aktif olmayan histon işareti H3K27me3 için REpi-seq'in hassasiyeti ortalama olarak% 52.09 ±% 3.71 idi (Şekil 7C), oysa H3K27me3 için hassasiyet tek hücreli ChIC-seq19'da% 47 idi. Sonuç olarak, REpi-seq, H3K27ac ve H3K27me3'ü tespit etmede yüksek hassasiyet gösterir.

Ayrıca, REpi-seq tarafından üretilen okumalarla kaç tane toplu ChIP-seq pikinin tespit edildiğini ölçen REpi-seq'in "hassasiyetini"18 analiz ettik (Şekil 7D, E). REpi-seq duyarlılığı H3K27ac'de %55.30 ve H3K27me3'te %50.94 idi. Diğer tek hücreli epigenom yöntemlerinde duyarlılık Drop-ChIP (H3K4me3)18'de %5, ACT-seq (H3K4me3)20'de %5 ve scChIC-seq (H3K27me3)19'da %9,5'tir. Bu sonuçlar, REpi-seq'in epigenetik sinyalleri tespit etmede hassas olduğunu göstermektedir.

Figure 7
Şekil 7: REpi-seq'te sinyal sayıları, hassasiyet ve hassasiyet. Aynı deneyler, aynı yeniden kullanılabilir tek hücre (bir K562 hücresi) ile 3 kez tekrarlandı. (A) Aynı sekiz tek hücreden alınan sinyaller. Her nokta, yeniden kullanılabilir tek bir hücreyi temsil eder. Aynı tek hücredeki kontrol IgG (siyah), anti-H3K27me3 (mavi) ve anti-H3K27ac'den (kırmızı) gelen benzersiz sinyaller sayıldı. Anti-H3K27me3 ve anti-H3K27ac sinyalleri kontrol IgG'den anlamlı derecede yüksekti, bu da antikorların spesifik bağlanmasının kontrol IgG'den daha verimli sinyaller ürettiğini gösteriyor. Çubuk: ortalama, hata çubuğu: standart sapma. (B, C) REpi-seq H3K27ac (B) ve H3K27me3 (C) benzersiz okumalarının hassasiyeti. REpi-seq'ten türetilen benzersiz okumaların hassasiyeti, K562 toplu hücre analizinden bilinen ChIP-seq pikleriyle örtüşmeye dayanıyordu (H3K27ac: SRR3144862; H3K27me3: SRR069083). ChIP-seq pikleri tarafından onaylanan REpi-seq H3K27ac ve H3K27me3 okumalarının yüzdeleri her bir hücrede hesaplandı. Sonuçlar, 8 tek hücrenin ortalama yüzdesi olarak ifade edilir. (D, E) REpi-seq'in H3K27ac (D) ve H3K27me3 (E) bilinen piklerini tespit etmedeki hassasiyeti. REpi-seq'in benzersiz okumaları kullanıldı. ECODE Projesi'nde K562 yığın hücrelerinin ChIP-seq ile tanımlanan H3K27ac ve H3K27me3 pikleri (H3K27ac: ENCFF038DDS; H3K27me3: ENCFF031FSF) REpi-seq benzersiz okumaları tarafından tanındı. Sonuçlar, REpi-seq benzersiz okumaları tarafından tanınan ChIP-seq zirvelerinin ortalama yüzdesi olarak ifade edilir. B-E panelleri Ohnuki ve ark.7'den çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Bu protokolde kullanılan tamponlar. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 2: Bu protokolde kullanılan antikorlar ve IgG kontrolü. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 3: Bu protokolde kullanılan oligonükleotid DNA'sı. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Video S1: Otomatik tek hücreli toplama ve 96 delikli PCR plakasına aktarma (adım 8.2.4). Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S2: Bir sıvı taşıma robotu kullanılarak tek bir hücre içeren bir kuyudan süpernatant çıkarılması (adım 8.2.8.1). Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S3: Bir sıvı taşıma robotu kullanılarak tek bir hücre içeren bir kuyuya %4 TEMED/mineral yağ eklenmesi (adım 8.2.8.2). Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Kod 1: 8.2.8.1-8.2.8.2 adımlarından sıvı taşıma robotunun otomatik programı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu makalede, yeniden kullanılabilir tek hücreler7 kullanılarak yakın zamanda bildirilen tek hücreli multiepigenomik analiz için adım adım protokol açıklanmaktadır. Sonraki paragraflarda, protokoldeki potansiyel sınırlamaları vurgulayarak kritik noktaları tartışıyoruz.

Protokol boyunca kritik noktalardan biri (7.2-13. adımlardan itibaren) DNaz kontaminasyonunu önlemektir. Tek bir hücre, genomik DNA'nın sadece iki kopyasına sahiptir. Bu nedenle, genomik DNA'ya zarar vermek, sinyal sayısını kritik derecede azaltır. DNaz ile kontaminasyondan kaçınmak, genomik DNA'nın bütünlüğünü korumak için esastır.

Reaktiflerin hücre zarı / hücre duvarı boyunca geçirgenliği de protokol boyunca kritik öneme sahiptir. REpi-seq, fare ve insan hücrelerinin epigenomunu tek hücre seviyesinde analiz etmek için tasarlanmıştır. Bu deneysel yöntem için en uygun koşulların, hücre tiplerinin ve nükleer membranın her bir reaktife geçirgenliğine bağlı olarak değişmesi beklenmektedir. Bu nedenle, yöntem bitki hücreleri, maya ve bakteri gibi fare ve insan hücreleri dışındaki hücrelere uygulandığında, her adımdaki koşulların optimizasyona ihtiyacı vardır.

Adım 9.5'e özgü kritik bir noktanın (ilk rastgele astarın tavlanması), genomik DNA'nın denatüre edilmesinden sonra hızlı soğutma hızı olduğuna inanıyoruz. Denatürasyondan sonra yavaş ve kademeli soğutma, genomik DNA'ya bağlanan rastgele primerlerin tavlama verimliliğini azaltabilir. Ayrıca, adım 11'de (yakınlık ligasyonu), kritik bir nokta tampon bileşimidir. Polietilen glikol (PEG) içeren tamponlar, moleküler biyoloji uygulamalarında daha hızlı ligasyon yöntemleri için yaygın olarak kullanılmaktadır. Düşük bir PEG konsantrasyonu (örneğin, % <7.5), DNA çökelmesi olmadan çift sarmallı DNA'nın hızlı oluşumunu teşvik eder. Bununla birlikte, PEG içeren ligasyon tamponunun, tek hücreyi (yeniden kullanılabilir tek hücre) içeren tek hücreli jel boncuğun büzülmesine neden olduğunu gözlemledik, bu da poliakrilamid iskelesinin ağ boyutunun küçüldüğünü düşündürmektedir. Bu büzülme, T4 DNA ligazının erişilebilirliğinin azalmasına neden olabileceğinden, REpi-seq için daha hızlı ligasyon protokolünü kullanmamaya karar verdik.

REpi-seq'te sonuçlar, aynı tek hücrelerdeki sinyallerin yeniden algılama frekansı ile değerlendirilebilir. Yeniden algılama frekansı, antikor probu ve ilk rastgele astar ile yakınlık ligasyonu dahil olmak üzere reaksiyonları izlemek için yararlıdır. Daha önce7'yi , bir deneydeki H3K27ac okumalarının% 62.03'ünün iki çoğaltma deneyinde doğrulandığını, bireysel deneylerde yakınlık ligasyonunun etkinliğinin, tekrarlanan deneylerdeki genel yeniden algılama yüzdesinden daha yüksek olduğunu düşündürdüğünü bildirmiştik.

Ayrıca daha önce7 yeniden kullanılabilir tek hücrede DNA'ya bağlanan RNA polimeraz II'nin (Pol II) başarılı bir şekilde tespit edildiğini bildirmiştik. Pol II bağlanması, bu bağlanmanın zamansal ve kararsız doğası nedeniyle mevcut tek hücreli epigenom yöntemleriyle yakalanması zordur.

Tek hücreli epigenom analizi için mevcut transpozaz bazlı CUT&Tag yaklaşımları, nükleozom-DNA etkileşiminin korunmasını gerektirir. Spesifik bir antikor bir histon modifikasyonuna bağlanır; Daha sonra, antikora bağlı transpozaz, genomik DNA'yı parçalara ayırır ve DNA bölünme bölgesine bir DNA barkodu yerleştirir. Bu reaksiyon nükleozom (histon)-DNA etkileşimine bağlıdır. Bu nedenle, nükleozom-DNA etkileşimlerinin ve hücresel proteinlerin ve kromatinin yapısının bozulmadan kalması esastır. Bu nedenle, CUT&Tag yaklaşımları, histon modifikasyonlarının analizinde kaçınılmaz olarak kromatin yapısının erişilebilir bölgelerine önyargılıdır.

Erişilebilir kromatin bölgelerine yönelik kaçınılmaz önyargı, tek hücreli epigenom analizinde epigenetik sinyallerin sayısının artmasını engellemektedir. Kromatin yapıları, nükleozomla ilişkili proteinler yoluyla DNA-nükleozom ve nükleozom-nükleozom etkileşimleri dahil olmak üzere çoklu moleküler etkileşimler tarafından oluşturulur. Bu nedenle, hücresel proteinlerin yerini korurken, yeniden kullanılabilir tek hücrelerdeki DNA-protein ve protein-protein etkileşimlerini korumamayı seçtik. Bu özellik, monomerik akrilamid ve proteini proteine veya proteini DNA'ya çapraz bağlamak yerine hücresel proteinler üzerindeki amino grubunu değiştiren bir paraformaldehit karışımı (protokol adım 7) kullanılarak gerçekleştirilir.

Histonların ve genomla ilişkili proteinlerin yeri, poliakrilamid polimerine bağlantı ile korunur. Nükleozomlar 71-74 °C21 civarında denatüre edilir. Bu nedenle, yeniden kullanılabilir tek hücrede, histonlar muhtemelen 1.rastgele astarın (94 ° C) tavlama adımından sonra denatüre edilir ve birbirlerinden gevşetilir / ayrışır. Bu, heterokromatin yapısını gevşetebilir ve antikorların ve diğer moleküllerin heterokromatin bölgelerine erişilebilirliğini artırabilir. Bu sonuç, kromatin yapısıyla ilişkili önyargının, CUT&Tag yaklaşımları9'a kıyasla yeniden kullanılabilir tek hücrelerde azaldığını gösteren raporlanmış sonuçlarımızla desteklenmektedir7.

Histon H3'ün poliakrilamid ile bağlantısı, yeniden kullanılabilir tek hücredeki histonların yeri tekrarlanan deneyler 7 ile korunduğundan, en az 3 tur ısı denatürasyonundan sonra korunur. Bu özellik, aynı tek hücreyi kullanarak aynı deneyin tekrarlanmasına izin verir. Tekrarlanan deneyler, CUT&Tag yaklaşımlarına kıyasla tek bir hücreden gelen sinyal sayısının artmasına katkıda bulunur.

Doğrulanabilirlik, bilimde temel bir ilkedir. Bununla birlikte, tek bir hücrenin deneysel sonuçlarını doğrulamak, aynı hücrelerle tekrarlanan deneyler mümkün olmadığından, CUT&Tag yaklaşımlarında mümkün değildir. Genomik DNA transpozaz tarafından parçalanır ve bir epigenetik işaret için DNA barkodunu alır. Parçalanmış genomik DNA, orijinal konumundan serbest bırakılır. Bu nedenle, CUT&Tag yaklaşımı, aynı tek hücredeki çoklu epigenetik işaretlerin analizi için dezavantajlıdır. CUT&Tag yöntemlerinin bu özelliği, azalan sinyal yoğunluğunun tek bir hücre başına artan sayıda epigenetik işaretle dengelenmesinin altında yatmaktadır.

Bu sorunu önlemek için, genomu kesmek yerine genomik DNA'yı kopyaladık ve daha sonra kopyalanan genomik DNA'yı bir antikor DNA probu ile etiketledik. REpi-seq, aynı tek hücrelerin analizine izin verir ve sinyal yoğunluğunu arttırır. Ayrıca, deneysel sonuçların doğrulanabilirliği, epigenomik analizin çoğullanması ve CUT&Tag yaklaşımlarında ödünleşim sorununun çözülmesi için bir araç sağlar. Yöntem, transpozaz bazlı epigenomik analizin sınırlamalarının üstesinden gelmesine rağmen, henüz tek hücre düzeyinde çok sayıda hücreyi analiz etme yeteneğine sahip değildir. Daha fazla gelişmeye ihtiyaç vardır.

Sonuç olarak, REpi-seq genomu kesmek yerine genomik DNA'yı kopyalar ve daha sonra kopyalanan genomik DNA'yı bir antikor DNA probu ile etiketler. REpi-seq hala emekleme aşamasındadır ve hücrelerin verimini arttırması gerekir. Bununla birlikte, REpi-seq, mevcut tek hücreli epigenom yöntemlerindeki sınırlamaların üstesinden gelen güçlü yönlere sahiptir: 1) aynı tek hücrelerde tekrarlanan deneyler yoluyla sinyallerin düşmesini azaltarak sinyal yoğunluğunu arttırmak; 2) kromatin yapısına dayalı erişilemeyen bölgeleri azaltarak yapısal önyargıyı azaltmak; 3) Aynı tek hücrede tekrarlanan deneylerle deneysel sonuçların doğrulanabilirliğini sağlamak, 4) her bir hücrede aynı sinyalin yeniden algılanma olasılığına dayanan sinyal tanımlama; 5) Epigenetik işaretler arasında rekabet olmadan aynı tek hücredeki çoklu epigenetik işaretleri analiz etmek. Bu ilerlemeler, epigenetik mekanizmaların tek bir hücrede analiz edilmesine izin verir, bu da önemli bir uygulamadır ve diğer tek hücreli epigenomik yöntemlerle mümkün değildir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ohnuki ve Tosato, "Yeniden kullanılabilir tek bir hücre hazırlama yöntemleri ve tek bir hücrenin epigenomunu, transkriptomunu ve genomunu analiz etme yöntemleri" (EP3619307 ve US20200102604) başlıklı bir patentin ortak mucitleridir. Patent başvurusu kısmen mevcut makalede açıklanan teknolojiyle ilgili ön sonuçlara dayanarak yapılmıştır. Bu patent başvurusunda açıklanan ve iddia edilen buluş veya icatlar, mucitler ABD Hükümeti'nin tam zamanlı çalışanlarıyken yapılmıştır. Bu nedenle, 45 Federal Düzenlemeler Yasası Bölüm 7 uyarınca, bu patent başvurusuna ilişkin tüm haklar, unvanlar ve menfaatler yasa gereği ABD Hükümetine devredilmiştir veya verilmelidir. ABD Hükümeti, aldığı telif haklarının bir kısmını 15 ABD Kodu § 3710c uyarınca çalışan mucitlerine aktarır.

Acknowledgments

Dr. David Sanchez-Martin ve Christopher B. Buck'a projenin kavramsallaştırma aşamasındaki yorumları için teşekkür ederiz. Ayrıca, ön deneylerde yardım için Genomics Core, Center for Cancer Research, National Cancer Institutes, National Institute of Health'e ve hesaplamalı analizde tavsiye için Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH'ye teşekkür ederiz. Yöntemde kullanılan DNA polimerazlarının optimizasyonuna yardımcı olduğu için Bayan Anna Word'e teşekkür ederiz. Bu çalışmada NIHHPC Biowulf kümesinin (http://hpc.nih.gov) hesaplama kaynakları kullanılmıştır. Bu proje, Kanser Araştırmaları Merkezi'nin Intramural Programı, Ulusal Kanser Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri, NCI Direktörünün İnovasyon Ödülü (#397172) ve Ulusal Kanser Enstitüsü'nden HHSN261200800001E Sözleşme No'lu Federal fonlar tarafından desteklenmektedir. Dr. Tom Misteli, Carol Thiele, Douglas R. Lowy ve Hücresel Onkoloji Laboratuvarı'nın tüm üyelerine verimli yorumları için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x CutSmart buffer New England BioLabs B6004 10x Digestion buffer
200 proof ethanol Warner-Graham Company 200 proof Ethanol
5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Monoclonal Antibody [HMC/4D9] Epigentek A-1018-100 Anti-5hmC
Acridine Orange/Propidium Iodide Stain Logos Biosystems F23001 Cell counter
Acrylamide solution, 40% in H2O, for molecular biology MilliporeSigma 01697-500ML 40% acrylamide solution
All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710 Keyence BZ-X710 Scanning microscope
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit MilliporeSigma UFC510024 Ultrafiltration cassette
Ammonium persulfate for molecular biology MilliporeSigma A3678-100G Ammonium persulfate powder
Anhydrous DMF Vector laboratories S-4001-005 Anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF)
Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) antibody [4H8] Abcam ab5408 Anti-Pol II
Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457) antibody Abcam ab60950 Anti-Med1
BciVI New England BioLabs R0596L BciVI
Bovine Serum Albumin solution, 20 mg/mL in H2O, low bioburden, protease-free, for molecular biology MilliporeSigma B8667-5ML 20% BSA (Table 7)
Bst DNA Polymerase, Large Fragment New England BioLabs M0275L Bst DNA polymerase
BT10 Series 10 µl Barrier Tip NEPTUNE BT10 P10 low-retention tip
CellCelector Automated Lab Solutions N/A Automated single cell picking robot
CellCelector 4 nl nanowell plates for single cell cloning, Plate S200-100 100K, 24 well,ULA Automated Lab Solutions CC0079 4 nL nanowell plate
Chloroform MilliporeSigma Chloroform
Corning Costar 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate Corning 3596 Flat-bottom 96-well plates
Deep Vent (exo-) DNA Polymerase New England BioLabs M0259L Exo- DNA polymerase
DNA LoBind Tubes, 0.5 mL Eppendorf 30108035 0.5 mL DNA low-binding tube
DNA Oligo, 1st random primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 1st random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#01 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#02 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#03 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#04 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#05 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#06 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#07 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#08 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#09 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#10 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#11 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#12 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd synthesis primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd synthesis primer
DNA Oligo, Ligation Adaptor Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 Ligation Adaptor
DNA Oligo, Reverse Transcription primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 Reverse Transcription primer
DNase I (RNase-free) New England BioLabs M0303L DNase I (RNase-free, 4 U).
DNase I Reaction Buffer New England BioLabs B0303S 10x DNase I buffer (NEB)
dNTP Mix (10 mM each) Thermo Fisher R0192 10 mM dNTPs
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat-inactivated MilliporeSigma F4135-500ML Fetal bovine serum
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England BioLabs E2040S In-vitro-transcription master mix
Histone H3K27ac antibody Active motif 39133 Anti-H3K27ac
Histone H3K27me3 antibody Active motif 39155 Anti-H3K27me3
IgG from rabbit serum Millipore Sigma I5006-10MG Control IgG
Iron oxide(II,III) magnetic nanopowder, 30 nm avg. part. size (TEM), NHS ester functionalized MilliporeSigma 747467-1G NHS ester functionalized 30 nm iron oxide powder
K-562 American Type Culture Collection (ATCC) CCL-243 cells
Linear Acrylamide (5 mg/mL) Thermo Fisher AM9520 Linear Acrylamide
LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter Logos Biosystems L20001 Cell counter
LUNA Cell Counting Slides, 50 Slides Logos Biosystems L12001 Cell counter
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil MilliporeSigma M5904-500ML Mineral oil
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine for molecular biology MilliporeSigma T7024-100ML N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine
NaCl (5 M), RNase-free Thermo Fisher AM9760G 5M NaCl
NanoDrop Lite Thermo Fisher 2516  Microvolume spectrophotometer
NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom Opentrons N/A 2 mL deep well 96-well plate
Non-skirted 96-well PCR plate Genesee Scientific 27-405 96-well PCR plate
NuSive GTG Agarose Lonza 50081 Agarose
OmniPur Acrylamide: Bis-acrylamide 19:1, 40% Solution MilliporeSigma 1300-500ML 40%Acrylamide/Bis-acrylamide
OT-2 lab robot Opentrons OT2 Automated liquid handling robot
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified, 20% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 15713 20% Pararmaldehyde
PBS (10x), pH 7.4 Thermo Fisher 70011044 10x PBS
PIPETMAN Classic P1000 GILSON F123602 A P1000 pipette
Protein LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 925000090 1.5 mL Protein low-binding tube
QIAgen Gel Extraction kit Qiagen 28706 A P1000 pipette
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Thermo Fisher P11495  dsDNA specific intercalator dye
Quick Ligation kit New England BioLabs M2200L T4 DNA ligase (NEB)
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor Thermo Fisher 10777019 RNAse inhibitor
S-4FB Crosslinker (DMF-soluble) Vector laboratories S-1004-105 Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB)
S-HyNic Vector laboratories S-1002-105 Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone (S-HyNic)
Sodium Acetate, 3 M, pH 5.2, Molecular Biology Grade MilliporeSigma 567422-100ML 3M Sodium acetate (pH 5.2)
Sodium bicarbonate, 1M buffer soln., pH 8.5 Alfa Aesar J60408 1M sodium bicarbonate buffer, pH 8.5
Sodium phosphate dibasic for molecular biology MilliporeSigma S3264-250G Na2HPO4
Sodium phosphate monobasic for molecular biology MilliporeSigma S3139-250G NaH2PO4
SuperScript IV reverse transcriptase Thermo Fisher 18090050 Reverse transcriptase
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000x Concentrate in DMSO) Thermo Fisher S11494 An intercalator dye for DNA
T4 DNA Ligase Reaction Buffer New England BioLabs B0202S 10x T4 DNA ligase reaction buffer
ThermoPol Reaction Buffer Pack New England BioLabs B9004S 10x TPM-T buffer (Tris-HCl/Pottasium chloride/Magnesium sulfate/Triton X-100)
TRIzol LS reagent Thermo Fisher 10296-028 Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction
TruSeq Nano DNA library prep kit Illumina 20015965 A DNA library preparation kit (see also the manufacturer's instruction)
Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for control IgG
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher 15575020 0.5M EDTA, pH 8.0
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Thermo Fisher 10977023 Ultrapure water
Zeba Splin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Fisher 89882 Desalting column

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perkel, J. M. Single-cell analysis enters the multiomics age. Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).
  2. Clark, S. J., et al. scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells. Nature Communications. 9 (1), 781 (2018).
  3. Ma, S., et al. Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin. Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).
  4. Zhu, C., et al. An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).
  5. Zhu, C., et al. Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain. Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).
  6. Mimitou, E. P., et al. Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells. Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).
  7. Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Iterative epigenomic analyses in the same single cell. Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).
  8. Tosato, G., Ohnuki, H. Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell. , EP 3619307, US 202001026704 (2021).
  9. Harada, A., et al. A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input. Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).
  10. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
  11. Marina, R. J., et al. TET-catalyzed oxidation of intragenic 5-methylcytosine regulates CTCF-dependent alternative splicing. EMBO Journal. 35 (3), 335-355 (2016).
  12. Weast, R. C., et al. Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn. Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H. , Chemical Rubber Company Press. (1975).
  13. Aydin, S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 72, 4-15 (2015).
  14. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12 (2013).
  15. Porstmann, T., Kiessig, S. T. Enzyme immunoassay techniques. An overview. Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).
  16. Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
  17. Song, Y., et al. A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples. BMC Genomics. 19 (1), 696 (2018).
  18. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  19. Ku, W. L., et al. Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification. Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).
  20. Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).
  21. Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).

Tags

Geri Çekme Sayı 180
Yinelemeli epigenomik analizler için yeniden kullanılabilir tek hücre
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov,… More

Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses. J. Vis. Exp. (180), e63456, doi:10.3791/63456 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter