Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Singola cellula riutilizzabile per analisi epigenomiche iterative

Published: February 11, 2022 doi: 10.3791/63456
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 1
1Laboratory of Cellular Oncology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Biostatistics and Data Management Section, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 3CCR Collaborative Bioinformatics Resource (CCBR), Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 4Advanced Biomedical Computational Science, Frederick National Laboratory for Cancer Research sponsored by the National Cancer Institute

Summary

Il presente protocollo descrive un metodo a singola cellula per analisi epigenomiche iterative utilizzando una singola cellula riutilizzabile. La singola cellula riutilizzabile consente l'analisi di più segni epigenetici nella stessa singola cellula e la convalida statistica dei risultati.

Abstract

Le attuali analisi dell'epigenoma monocellulare sono progettate per l'uso singolo. La cellula viene scartata dopo un singolo utilizzo, impedendo l'analisi di più segni epigenetici in una singola cellula e richiedendo dati da altre cellule per distinguere il segnale dal rumore di fondo sperimentale in una singola cellula. Questo articolo descrive un metodo per riutilizzare la stessa singola cellula per analisi epigenomiche iterative.

In questo metodo sperimentale, le proteine cellulari vengono prima ancorate a un polimero di poliacrilammide invece di reticolarle a proteine e DNA, alleviando i pregiudizi strutturali. Questo passaggio critico consente esperimenti ripetuti con la stessa singola cellula. Successivamente, un primer casuale con una sequenza di scaffold per la legatura di prossimità viene ricotto al DNA genomico e la sequenza genomica viene aggiunta al primer per estensione utilizzando una DNA polimerasi. Successivamente, un anticorpo contro un marcatore epigenetico e IgG di controllo, ciascuno marcato con diverse sonde di DNA, sono legati ai rispettivi bersagli nella stessa singola cellula.

La legatura di prossimità viene indotta tra il primer casuale e l'anticorpo aggiungendo un DNA connettore con sequenze complementari alla sequenza di scaffold del primer casuale e della sonda anticorpo-DNA. Questo approccio integra le informazioni sugli anticorpi e le sequenze del genoma vicino in un singolo prodotto del DNA di legatura di prossimità. Consentendo esperimenti ripetuti con la stessa singola cellula, questo metodo consente un aumento della densità dei dati da una cellula rara e analisi statistiche utilizzando solo IgG e dati anticorpali dalla stessa cellula. Le singole cellule riutilizzabili preparate con questo metodo possono essere conservate per almeno alcuni mesi e riutilizzate in seguito per ampliare la caratterizzazione epigenetica e aumentare la densità dei dati. Questo metodo offre flessibilità ai ricercatori e ai loro progetti.

Introduction

La tecnologia a cella singola sta entrando nell'era della multiomica a cella singola, che integra le tecnologie omiche a singola cella individuale1. Recentemente, la trascrittomica a singola cellula è stata combinata con metodi per rilevare l'accessibilità della cromatina (scNMT-seq2 e SHARE-seq3) o le modifiche istoniche (Paired-seq4 e Paired-Tag5). Più recentemente, la trascrittomica e la proteomica a singola cellula sono state integrate con l'accessibilità della cromatina (DOGMA-seq6). Questi metodi utilizzano la marcatura basata sulla trasposasi per rilevare l'accessibilità della cromatina o le modifiche degli istoni.

Gli approcci basati sulla trasposasi scindono il DNA genomico e aggiungono un codice a barre del DNA alla fine del frammento di DNA genomico. Ogni frammento genomico scisso può accettare solo fino a due codici a barre del DNA (= un segno epigenetico per sito di scissione) e il DNA genomico nel sito di scissione viene perso. Pertanto, gli approcci basati sulla scissione hanno un compromesso tra il numero di segni epigenetici testati e la densità del segnale. Ciò ostacola l'analisi di più segni epigenetici nella stessa singola cellula. Un metodo epigenomico unicellulare che non fende il DNA genomico è stato sviluppato per superare questo problema 7,8.

Oltre al problema derivato dalla scissione sopra menzionato, gli approcci basati sulla trasposasi hanno altre limitazioni. Nell'analisi dell'epigenoma a singola cellula, è fondamentale conoscere la posizione degli istoni e delle proteine associate al DNA sul genoma. Negli approcci attuali, questo si ottiene utilizzando singole cellule non fissate e la conservazione delle interazioni proteina-DNA e proteina-proteina. Tuttavia, ciò genera una forte distorsione verso le regioni della cromatina accessibili, anche nell'analisi delle modificazioni istoniche 9. La posizione degli istoni e delle proteine associate al genoma sul genoma può essere preservata senza reticolare proteina-DNA e proteina-proteina, utilizzando un'impalcatura di poliacrilammide 7,8. Questo approccio riduce la distorsione strutturale osservata negli approcci attuali che dipendono dalle interazioni proteina-DNA e proteina-proteina.

Gli approcci basati sulla trasposasi possono acquisire segnali solo una volta da una singola cellula. Pertanto, è difficile delineare l'epigenoma completo di una singola cellula a causa della caduta dei segnali. Le singole cellule riutilizzabili sono state sviluppate per superare i limiti attuali consentendo l'analisi epigenomica iterativa nella stessa singola cellula.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOTA: una rappresentazione schematica del metodo è illustrata nella Figura 1.

Figure 1
Figura 1: Rappresentazione schematica del flusso di lavoro del protocollo. I passaggi 7.2-13 sono spiegati attraverso rappresentazioni schematiche. Ogni riga indica un passaggio nel protocollo. Una proteina cellulare colorata in verde è un nucleosoma umano generato sulla base di una struttura cristallina (PDB: 6M4G). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

1. Equilibrazione delle colonne di dissalazione

NOTA: le colonne di spin di dissalazione sono bilanciate come descritto nei passaggi seguenti. Le colonne di dissalazione equilibrate vengono utilizzate nei passaggi 2.1, 3.4 e 4.6.

  1. Rimuovere la chiusura inferiore di una colonna di dissalazione (taglio di 7 kDa, volume del tallone di resina di 0,5 ml, vedere la tabella dei materiali) e allentare il tappo nella parte superiore della colonna di dissalazione.
  2. Porre la colonna in una provetta proteica a basso legame da 1,5 mL (una provetta di raccolta, vedere la Tabella dei materiali) e centrifugare a 1.500 × g per 1 minuto a temperatura ambiente per rimuovere la soluzione di conservazione nella colonna.
    NOTA: Utilizzare una centrifuga a rotore oscillante per appiattire la parte superiore del letto a tallone.
  3. Rimuovere il flusso nel tubo da 1,5 mL e aggiungere 300 μL di tampone fosfato 150 mM NaCl/100 mM, pH 8,0 (vedere Tabella 1), sopra il letto di resina.
  4. Centrifugare a 1.500 × g per 1 minuto a temperatura ambiente e rimuovere il flusso nel tubo di raccolta.
  5. Ripetere i passaggi 1.3-1.4 altre tre volte.
  6. Eliminare il buffer dal tubo di raccolta e posizionare la colonna in un nuovo tubo di raccolta.
  7. Utilizzare la colonna di dissalazione equilibrata nei punti 2.1, 3.4 e 4.4.

2. Scambio tampone di anticorpi

NOTA: Rimuovere glicerolo, arginina e azoturo di sodio da anti-H3K27ac 10, anti-H3K27me3 10, anti-Med111 e anti-Pol II10 (vedere la composizione del tampone mostrata nella Tabella 1). Tutte le seguenti procedure vengono eseguite sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Tempo: 1 h

  1. Applicare la soluzione anticorpale (100 μL; vedere Tabella 2) su una colonna di desalinizzazione equilibrata preparata dopo la fase 1.
  2. Centrifugare a 1.500 × g per 2 minuti a 4 °C e trasferire il flusso dalla provetta di raccolta a una provetta proteica a basso legame da 1,5 ml.
  3. Misurare la concentrazione di IgG utilizzando l'assorbanza a 280 nm12 (utilizzare uno spettrofotometro a microvolume).
  4. Trasferire la soluzione anticorpale in una cassetta di ultrafiltrazione (cut-off del peso molecolare 100 kDa, 0,5 mL, vedere la tabella dei materiali) e centrifugare a 12.000 × g per 5 minuti a 4 °C.
  5. Misurare la concentrazione di IgG utilizzando l'assorbanza a 280 nm.
  6. Ripetere i passaggi 2,4-2,5 fino a quando la concentrazione di IgG raggiunge 1 mg/ml.

3. Attivazione anticorpale

NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Tempo: 2.5 h

  1. Sciogliere 1 mg di succinimidil 6-idrazinonicotinato acetone hydrazone (S-HyNic; vedere la tabella dei materiali) con 100 μL di N,N-dimetilformammide anidra (DMF; vedere la tabella dei materiali).
    NOTA: DMF è un solvente organico infiammabile e una potente tossina epatica assorbita attraverso la pelle. Indossare guanti, occhiali di sicurezza e un camice da laboratorio. Seguire le linee guida di sicurezza istituzionali. Scartare gli oggetti da laboratorio usati secondo le linee guida istituzionali.
  2. Aggiungere 0,6 μL di S-HyNic/DMF a 100 μL della soluzione anticorpale (1 mg/mL in 150 mM NaCl/100 mM di fosfato di sodio, pH8,0. Vedere Tabella 2 per gli anticorpi usati e le IgG di controllo.
  3. Incubare a temperatura ambiente per 2 ore (proteggere dalla luce).
  4. Applicare 100 μL di anticorpo S-HyNic-reagito sulla parte superiore della colonna di desalinizzazione equilibrata (vedere punto 1) e centrifugare a 1.500 × g per 2 minuti a 4 °C per raccogliere il campione.
  5. Eliminare la colonna di dissalazione dopo l'uso.
    NOTA: La stabilità dei gruppi HyNic su proteine e altre biomolecole varia. Si raccomanda di coniugare immediatamente le biomolecole modificate da HyNic.

4. Attivazione della sonda del DNA

NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Tempo: 2.5 h

  1. Sciogliere un pellet di una sonda di DNA modificata dall'ammina per gli anticorpi o controllare le IgG (Antibody Probe, Tabella 3) con 20 μL di tampone fosfato di sodio 150 mM NaCl/100 mM, pH 8,0.
    NOTA: Cercare un pellet/film sottile e trasparente sul fondo del tubo. Applicare il tampone direttamente sul pellet. Se il pellet non è visibile, il pellet potrebbe essersi staccato e aderito alla parete o al coperchio. In questo caso, centrifugare il tubo e cercare un pellet sul fondo del tubo.
  2. Sciogliere 1 mg di succinimidil 4-formilbenzoato (S-4FB; vedere la tabella dei materiali) con 50 μL di DMF anidro e aggiungere 10 μL di DMF alla sonda anticorpale disciolta.
  3. Aggiungere 4 μL di S-4FB/DMF preparato al punto 4.2, mescolare e incubare a temperatura ambiente per 2 ore (proteggendo dalla luce).
  4. Applicare 34 μL di sonda anticorpale con reazione S-4FB sulla parte superiore della colonna di desalinizzazione equilibrata (vedere punto 1).
  5. Applicare 15 μL di tampone fosfato di sodio 150 mM NaCl/100 mM, pH 8,0, sulla parte superiore del letto di gel dopo che il campione è stato completamente assorbito e centrifugare a 1.500 × g per 2 minuti a 4 °C per raccogliere la sonda anticorpale modificata S-4FB.
  6. Utilizzare il flowthrough per la successiva coniugazione; misurare l'assorbanza a 260 nm; e calcolare il tasso di recupero della sonda anticorpale.

5. Coniugazione dell'anticorpo modificato S-HyNic e della sonda anticorpale modificata da S-4FB

NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Tempo: 2 h

  1. Mescolare l'anticorpo modificato S-HyNic e la sonda anticorpale modificata S-4FB e pipettare la soluzione su e giù per miscelare.
  2. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente (proteggendo dalla luce).
  3. Per estinguere la reazione, aggiungere 478,8 μL di soluzione di tempra e conservazione (vedere Tabella 1).
  4. Trasferire la soluzione anticorpale coniugata con sonda anticorpale in una cassetta di ultrafiltrazione (cut-off del peso molecolare 100 kDa).
  5. Centrifugare per 5 min a 12.000 × g, 4 °C.
  6. Controllare il volume della soluzione all'interno della cassetta mediante pipettaggio.
  7. Ripetere i punti 5,5-5,6 fino a raggiungere il volume di 100 μL e conservare a -20 °C.
    NOTA: La concentrazione di IgG viene misurata mediante sandwich ELISA13,14,15 utilizzando uno standard IgG.

6. Preparazione di perle magnetiche del nucleo

NOTA: In questo metodo, una singola cella è incorporata in una perla di acrilammide a doppio strato (vedere Figura 2). Il nucleo è una perla magnetica in poliacrilammide. Lo strato esterno è solo poliacrilammide. Le perle magnetiche del nucleo sono generate in questa sezione. Questa sezione non è essenziale per l'esperimento. Tempo: 3 h

Figure 2
Figura 2: Struttura di una perla di poliacrilammide a doppio strato per la visibilità e la facilità d'uso negli esperimenti REpi-seq . (A) Nanoparticelle magnetiche della fase 6.6 dopo la centrifugazione. Le nanoparticelle magnetiche sono modificate con acrilammide monomerica e integrate nella perla magnetica di poliacrilammide mostrata in B. (B) Rappresentazione schematica di una singola cella riutilizzabile con una perla magnetica di poliacrilammide. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

  1. Mescolare 50 μL di tampone bicarbonato di sodio 1 M, pH 8,5, e 450 μL di soluzione di acrilammide al 40%.
    NOTA: L'acrilammide è una neurotossina. Indossare guanti, una protezione per gli occhi e un camice da laboratorio. Seguire le linee guida di sicurezza istituzionali. Scartare gli oggetti da laboratorio usati secondo le linee guida istituzionali.
  2. Sospendere 1 g di polvere di ossido di ferro funzionalizzata con estere NHS (vedere la tabella dei materiali) nel tampone acrilammide/bicarbonato di sodio e incubare a 4 °C per una notte.
    NOTA: Poiché le perle di acrilammide sono trasparenti, potrebbe essere difficile vedere e manipolare la posizione delle perle. L'inclusione di una perla di anima in ossido di ferro migliora la visibilità e facilita la manipolazione perché la posizione delle perle può essere controllata utilizzando un magnete. Tuttavia, se gli utenti hanno familiarità con gli esperimenti REpi-seq, l'uso delle perle magnetiche di poliacrilammide può essere saltato.
  3. Trasferire la sospensione di nanobead in 2 tubi (1,5 ml), centrifugare a 21.300 × g per 1 ora (utilizzare un rotore angolato) a 4 °C e rimuovere il surnatante.
  4. Sospendere il liquame inferiore con 1 mL di acrilammide/bisacrilammide al 40% (19:1, vedere la tabella dei materiali).
    NOTA: Bis-acrilammide è una neurotossina. Indossare guanti e camice da laboratorio. Seguire le linee guida di sicurezza istituzionali. Scartare gli oggetti da laboratorio usati secondo le linee guida istituzionali.
  5. Centrifugare a 21.300 × g per 1 h (utilizzare un rotore angolato) a 4 °C.
  6. Centrifugare a 5.000 × g per 30 minuti (utilizzare un rotore oscillante senza freno) a 4 °C.
  7. Rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta P1000 con aspirazione a bassa velocità.
  8. Regolare il volume a 400 μL di acrilammide/bisacrilammide (19:1, vedere la tabella dei materiali).
  9. Aggiungere 25 μL di soluzione di persolfato di ammonio al 10% (vedere Tabella 1).
    NOTA: Il persolfato di ammonio è un forte agente ossidante. La polvere sospesa nell'aria contenente persolfato di ammonio può irritare l'occhio, il naso, la gola, i polmoni e la pelle al contatto. Indossare guanti, occhiali di sicurezza e un camice da laboratorio. Seguire le linee guida di sicurezza istituzionali. Scartare gli oggetti da laboratorio usati secondo le linee guida istituzionali.
  10. Per generare perle magnetiche di poliacrilammide, trasferire 0,5 μL della sospensione di ossido di ferro modificato con acrilammide in un tubo PCR.
  11. Aggiungere 50 μL di 4% di N,N,N' ,N'-TETRAMETILETILENDIAMMINA/OLIO MINERALE (TEMED, vedere Tabella 1) e incubare per una notte a temperatura ambiente.
    NOTA: TEMED è un solvente infiammabile. Lavora sotto un cofano. Non inalare. Tenere lontano da fiamme libere, superfici calde e fonti di accensione. Indossare guanti, occhiali di sicurezza e un camice da laboratorio. Seguire le linee guida di sicurezza istituzionali. Scartare gli oggetti da laboratorio usati secondo le linee guida istituzionali.

7. Modifica del gruppo amminico delle proteine cellulari con acrilammide monomero

NOTA: REpi-seq è stato progettato per analizzare l'epigenoma di cellule di topo e umane a livello di singola cellula. Ogni passaggio deve essere ottimizzato quando si utilizza questo metodo su cellule di specie diverse dal topo o dall'uomo.

  1. Raccolta delle cellule
    NOTA: Tempo: 30 min
    1. Misurare la concentrazione e la vitalità delle celle utilizzando un contatore di celle (vedere la tabella dei materiali).
      NOTA: la vitalità delle celle in questa fase influisce sul numero di celle vive nell'analisi dei dati.
    2. Regolare la concentrazione cellulare a 1 × 105 cellule/ml con terreno di coltura (*) contenente il 10% di siero fetale bovino.
      NOTA: *Il terreno di coltura è un terreno di coltura ottimale per le cellule di interesse.
    3. Trasferire 1 mL della sospensione cellulare in un tubo da 1,5 mL.
    4. Centrifugare la sospensione cellulare a 240 × g per 5 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante.
    5. Aggiungere 1 mL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS), mescolare le cellule mediante pipettaggio delicato e centrifugare la sospensione cellulare a 240 × g per 5 minuti a 4 °C.
    6. Rimuovere il surnatante.
      NOTA: tutti i passaggi precedenti devono essere eseguiti in una cappa pulita a flusso laminare per evitare contaminazioni.
  2. Modifica del gruppo amminico delle proteine cellulari con acrilammide monomerica
    NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Tempo: 1.5 h
    1. Aggiungere 1 mL di soluzione di modifica del gruppo amminico (vedere Tabella 1) al pellet cellulare e sospendere il pellet cellulare mediante pipettaggio delicato.
    2. Incubare la provetta su ghiaccio per 1 ora e centrifugare la sospensione cellulare a 240 × g per 5 minuti a 4 °C.
    3. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule con 100 ml di acrilammide al 4% / 1 mM EDTA / PBS contenenti un colorante intercalatore per DNA (vedere Tabella 1, 1 cellula/μL).

8. Preparazione di singole celle riutilizzabili

  1. Preparazione di singole celle riutilizzabili (versione manuale)
    NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Tempo: 9 h/96 celle
    1. Mescolare 1 mL della sospensione cellulare (1 cellula/μL) e 199 mL di 1 mM EDTA/PBS contenente un colorante intercalatore per il DNA (vedere Tabella 1).
    2. Trasferire 200 μL della sospensione cellulare in ciascun pozzetto di piastre a fondo piatto a 96 pozzetti (totale 10 piastre, vedere la tabella dei materiali).
    3. Posizionare il coperchio sulla piastra a 96 pozzetti e scansionare le 10 piastre utilizzando un microscopio a scansione (vedere la tabella dei materiali) per identificare i pozzetti contenenti una singola cellula.
    4. Trasferire il contenuto del pozzetto contenente una singola cellula in un tubo PCR.
      1. Inclinare la piastra (verso l'operatore) e attendere alcuni minuti fino a quando la singola cella non è affondata sul bordo inferiore del pozzetto.
      2. Posizionare la punta della pipetta nell'angolo inferiore e trasferire la singola cella e il tampone (aspirare 210 μL/pozzetto = 200 μL di tampone + 10 μL di aria) in una provetta PCR.
        NOTA: assicurarsi di utilizzare una punta P200 a bassa ritenzione.
      3. Controllare il pozzetto utilizzando un microscopio a fluorescenza per confermare il trasferimento.
      4. Se una singola cellula è ancora nel pozzo, aggiungere 200 μL/pozzetto di 1 mM EDTA/PBS contenente un colorante intercalatore per il DNA.
      5. Quindi, ripeti il trasferimento.
    5. Centrifugare il tubo PCR a 240 × g per 5 minuti a 4 °C utilizzando un rotore oscillante senza freno.
      NOTA: La frenata provoca un flusso vorticoso di acqua nel tubo, che interrompe la precipitazione della singola cellula. Quando si centrifuga con un rotore oscillante senza freno, la singola cella affonderà sempre sul fondo del tubo. Tuttavia, se viene utilizzato un rotore angolato, la singola cella si attacca alla parete laterale del tubo PCR e potrebbe essere persa.
    6. Rimuovere 195 μL del surnatante con una velocità di pipettaggio molto lenta.
    7. Aggiungere 195 μL/tubo di soluzione di acrilammide/bis-acrilammide/APS (vedere tabella 1).
    8. Centrifugare il tubo PCR a 240 × g per 5 minuti a 4 °C utilizzando un rotore oscillante senza freno.
    9. Rimuovere 195 μL del surnatante con una velocità di pipettaggio molto lenta.
    10. Trasferire i 3 μL inferiori alla provetta PCR contenente il 4% di TEMED/olio minerale e una perla magnetica in poliacrilammide (generata nella fase 6).
      NOTA: assicurarsi di utilizzare una punta P10 a bassa ritenzione. Erogare la cella vicino al tallone magnetico in poliacrilammide. Nell'olio minerale, il liquido contenente la singola cellula aderisce alla superficie del tallone magnetico di poliacrilammide per tensione superficiale.
    11. Incubare durante la notte a temperatura ambiente.
      NOTA: Questo processo genera una perla di gel di acrilammide a doppio strato. Il nucleo è una perla di gel magnetico. Lo strato esterno è un gel di poliacrilammide contenente una singola cellula. La singola cellula è incorporata nello strato esterno del gel. Punto di arresto sicuro: dopo aver lavato le singole celle riutilizzabili con glicerolo al 50% / 1 mM EDTA / tampone BSA / TBS al 20% / 0,5%, le singole celle riutilizzabili possono essere conservate a -20 ° C per un massimo di 6 mesi.
  2. Preparazione di celle singole riutilizzabili (versione semiautomatica)
    NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Tempo: 3 h/96 celle
    1. Mescolare 1 mL di sospensione cellulare (1 cellula/μL) e 199 mL di 1 mM EDTA/PBS contenente un colorante intercalatore per DNA (vedere Tabella 1).
    2. Trasferire 200 μL della sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra di nanopozzetti da 4 nL (vedere la Figura 3 e la Tabella dei materiali) e posizionare la piastra dei nanopozzetti da 4 nL su un robot automatizzato di prelievo a cella singola (vedere la Tabella dei materiali).
    3. Posizionare una piastra PCR a 96 pozzetti come piastra di destinazione sul robot automatizzato di prelievo a cella singola. Assicurarsi che ogni pozzetto contenga 200 μL/pozzetto Soluzione di acrilammide/Bis-acrilammide/APS (vedere Tabella 1).
    4. Trasferire una singola cellula da un nanopozzetto da 4 nL a un pozzetto della piastra PCR a 96 pozzetti (vedere Video supplementare S1).
    5. Mettere un coperchio sopra la piastra PCR a 96 pozzetti e centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 240 × g per 5 minuti a 4 °C utilizzando un rotore oscillante senza freno.
    6. Posizionare la piastra PCR a 96 pozzetti sul ponte di un robot automatico per la gestione dei liquidi (vedere la tabella dei materiali, figura 4 e codice supplementare 1).
    7. Trascinare e rilasciare il codice supplementare 1 nella finestra del software (vedere la tabella dei materiali) del robot per la gestione dei liquidi.
    8. Eseguire il programma sul robot automatico per la gestione dei liquidi (vedere Video supplementare S2 e Video supplementare S3).
      1. Rimuovere 195 μL del surnatante con una velocità di pipettaggio molto lenta.
      2. Aggiungere 50 μL di TEMED al 4%.
        NOTA: i passaggi da 8.2.8.1 a 8.2.8.2 possono essere eseguiti mediante pipettaggio manuale.
    9. Incubare durante la notte a temperatura ambiente (Figura 5). Punto di arresto sicuro: dopo aver lavato le singole cellule riutilizzabili con glicerolo al 50% / 1 mM EDTA / tampone BSA / TBS al 20% / 0,5%, conservare le singole celle riutilizzabili a -20 ° C per un massimo di 6 mesi.

Figure 3
Figura 3: Prelievo automatico di una singola cellula e trasferimento in una piastra PCR a 96 pozzetti nella fase 8.2 . (A) Panoramica di un sistema di prelievo a singola cella. Un robot di prelievo a cella singola è in una cappa pulita a flusso laminare per evitare la contaminazione. (B) Una piastra da 24 pozzetti con 4 nanopozzetti nL all'interno del pozzetto. (C) Distribuzione cellulare in un pozzetto dalla piastra a 24 pozzetti. I punti verdi sono cellule identificate come una singola cellula in ogni nanopozzetto da 4 nL. I punti magenta sono cellule identificate come doppietti o multipletti di cellule. (D) Immagine in campo chiaro del pozzo nella piastra a 24 pozzetti. Un quadrato verde è un nanopozzetto da 4 nL contenente una singola cellula. Un quadrato magenta è un nanopozzetto da 4 nL contenente più cellule. (E) Campo ingrandito di circa 4 nanopozzetti nL. I punti luminosi sono singole cellule in nanopozzetti da 4 nL. Il sistema di prelievo di singole cellule identifica i nanopozzetti contenenti una singola cellula acquisendo immagini in campo chiaro e fluorescenza di cellule con colorazione DAPI. Le singole cellule identificate vengono trasferite dal nanopozzetto da 4 nL a un pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti. Barre di scala = 2 mm (C, D), 100 μm (E). Abbreviazione = DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Generazione di singole celle riutilizzabili utilizzando un robot per la gestione dei liquidi. (A) Un ponte del robot per la gestione dei liquidi. Il deck dispone di 11 slot per rack di punta per pipette (punta P300: slot 1-3, punta P20: slot 5-6), 2 mL di piastra da 96 pozzetti (slot 4), due piastre PCR a 96 pozzetti contenenti una singola cella per pozzetto (slot 7 e 10) e due piastre a fondo piatto a 96 pozzetti per rifiuti liquidi (slot 8 e 11). (B) Il mazzo dopo aver posizionato l'attrezzatura da laboratorio. (C) Rappresentazione schematica del pipettaggio robotizzato nella fase 8.8.1. Il programma rimuove il surnatante senza aspirare una singola cellula dal fondo della piastra PCR a 96 pozzetti. (D) Celle singole riutilizzabili generate utilizzando il codice supplementare 1. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

9. Ricottura ed estensione del primer casuale

NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Gli asterischi (*) nei passi seguenti indicano che un separatore magnetico può essere utilizzato per controllare la posizione delle sfere di poliacrilammide contenenti una singola cella riutilizzabile nel tubo. Tuttavia, l'uso del separatore magnetico non è essenziale. Spostandosi lentamente lungo la punta della pipetta lungo la parete del tubo, le perline vengono spinte verso l'alto per il lavaggio o lo scambio di tampone. Tempo: 9 h

  1. Rimuovere l'olio minerale mediante pipettaggio(*) e lavare (*) 5 volte con 200 μL di tampone 1x TP Mg(-) (diluire 10x tampone TP Mg(-) in 1x tampone con acqua ultrapura, vedere Tabella 1).
  2. Rimuovere il surnatante (*) e aggiungere 15 μL di tampone di ricottura (vedere Tabella 1).
  3. Incubare per 1 ora su ghiaccio.
    NOTA: Lo scopo di questa incubazione è quello di permeabilizzare il plasma e le membrane nucleari e fornire il primer casuale al nucleo cellulare.
  4. Posizionare i tubi PCR su un termociclatore e riscaldare a 94 °C per 3 minuti.
    NOTA: La dimensione del tubo è 0,2 ml. Il volume della soluzione è di circa 20 μL, compreso il volume della perla di poliacrilammide. La temperatura del coperchio del termociclatore è di 105 °C.
  5. Trasferire i tubi in un blocco metallico raffreddato a ghiaccio e incubare per 2 minuti.
  6. Aggiungere 4 μL di miscela MgSO4/NaCl/dNTP (vedere Tabella 1) e mescolare con un miscelatore a vortice a velocità media.
  7. Aggiungere 1 μL di Bst polimerasi, frammento grande (vedere la tabella dei materiali) e mescolare utilizzando un miscelatore a vortice a velocità media.
  8. Incubare per 4 ore su uno shaker (600 rpm a 4 °C).
    NOTA: Lo scopo di questa incubazione è quello di fornire la Bst polimerasi al nucleo cellulare.
  9. Posizionare il tubo PCR su un termociclatore ed eseguire uno dei seguenti programmi.
    1. Eseguire un programma di 4 ore: 10 °C per 30 min, 20 °C per 30 minuti e 25 °C per 180 min.
    2. In alternativa, eseguire un programma notturno: 4 °C per 4 ore, 10 °C per 2 ore, 20 °C per 2 ore, 25 °C per 4 ore e tenere a 4 °C.
      NOTA: La dimensione del tubo è 0,2 ml. Il volume della soluzione è di circa 25 μL, compreso il volume della perla di poliacrilammide. La temperatura del coperchio del termociclatore è di 105 °C. Punto di arresto sicuro: interrompere l'esperimento qui per un massimo di 1 giorno conservando le singole celle riutilizzabili a 4 °C.

10. Legame anticorpale

NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Tempo: 1.5 h

  1. Aggiungere 1,625 μL di soluzione di NaCl/EDTA/BSA (vedere Tabella 1) e mescolare a vortice a bassa velocità.
    NOTA: Questo passaggio mira a 1) facilitare la chelazione di Mg2+ da parte dell'EDTA, 2) stabilizzare il legame del 1° primer casuale esteso di 300 mM NaCl e 3) bloccare il legame aspecifico degli anticorpi usando l'albumina sierica bovina (BSA) nella reazione successiva.
  2. Incubare per 1 ora su ghiaccio e aggiungere 0,1 μg/ml ciascuno di anticorpi e IgG di controllo coniugati con la sonda anticorpale (preparata al punto 5).
  3. Incubare durante la notte sul ghiaccio agitando delicatamente su uno shaker.

11. Legatura di prossimità della sonda anticorpale e primer casuale esteso prossimalmente

NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Gli asterischi (*) nei passi seguenti indicano dove un separatore magnetico può essere utilizzato per controllare la posizione delle sfere di poliacrilammide contenenti una singola cella riutilizzabile nel tubo. Tuttavia, l'uso del separatore magnetico non è essenziale. Spostandosi lentamente lungo la punta della pipetta lungo la parete del tubo, le perline possono essere spinte verso l'alto per il lavaggio o lo scambio tampone. Tempo: 6 h

  1. Lavare (*) due volte con 200 μL di 1x tampone TPM-T (20 minuti di incubazione in ogni lavaggio) su ghiaccio. Diluire 10x tampone TPM-T (Tris-HCl/cloruro di potassio/solfato di magnesio/Triton X-100) a 1x con acqua ultrapura).
  2. Rimuovere (*) il surnatante e lavare (*) una volta con 1x tampone T4 DNA ligasi (vedere la tabella dei materiali).
  3. Rimuovere (*) il surnatante e aggiungere 19 μL di soluzione adattatore di legatura (vedere Tabella 1).
  4. Incubare per 1 h a 25 °C.
  5. Aggiungere 1 μL di T4 DNA ligasi (vedere la tabella dei materiali) e mescolare il tubo su un miscelatore a vortice a velocità media.
  6. Posizionare il tubo su un termociclatore ed eseguire il seguente programma: programma di legatura di prossimità, 4 ore a 16 °C e 30 minuti a 25 °C.
    NOTA: La dimensione del tubo è 0,2 ml. Il volume della soluzione è di circa 25 μL, compreso il volume della perla di poliacrilammide. La temperatura del coperchio del termociclatore è a temperatura ambiente.
  7. Lavare (*) due volte brevemente con 200 μL di 1x tampone Bst Mg(-) EDTA(+) (vedere Tabella 1; preparare 1x tampone da 10x tampone stock) e conservare la cella a 4 °C, durante la notte. Punto di arresto sicuro: interrompere l'esperimento qui per un massimo di 1 giorno conservando le singole celle riutilizzabili a 4 °C.

12. Estensione completa del 1 ° primer casuale

NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Tempo: 4.5 h

  1. Lavare due volte con 200 μL di tampone Bst Mg(-) EDTA(-) (vedere Tabella 1, preparare 1x tampone da 10x tampone stock), rimuovere il surnatante e aggiungere 20 μL di miscela Bst/dNTPs/MgSO4 (vedere Tabella 1).
  2. Mescolare con un miscelatore a vortice a media velocità e incubare per 4 ore su uno shaker orbitale (a 6 °C e 500 giri/min).
  3. Posizionare il tubo su un termociclatore ed eseguire il seguente programma: programma di estensione completa: 10 °C per 1 ora, 20 °C per 1 ora, 30 °C per 1 ora, 40 °C per 1 ora, 50 °C per 1 ora, 65 °C per 1 ora, 94 °C per 10 minuti e tenere a 4 °C.
    NOTA: Punto di arresto sicuro: l'esperimento può essere interrotto qui per un massimo di 1 giorno conservando le singole celle riutilizzabili a 4 °C.

13. Amplificazione a spostamento multiplo

NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Tempo: 2,5 h (fasi 13.1-13.2) + 15 min (fasi 13.3-13.4) + 1 giorno (fasi 13.5-13.10)

  1. Aggiungere 0,4 μL di 100 μM 2° primer casuale (vedi Tabella 3) e mescolare con un miscelatore a vortice a media velocità.
  2. Incubare per 2 ore a 6 °C e 500 giri/min su uno scuotitore orbitale, posizionare il tubo su un termociclatore e riscaldare a 94 °C per 3 minuti.
    NOTA: La dimensione del tubo è 0,2 ml. Il volume della soluzione è di circa 25,4 μL, compreso il volume del tallone di poliacrilammide. La temperatura del coperchio del termociclatore è di 105 °C.
  3. Posizionare i tubi in un blocco metallico raffreddato a ghiaccio e aggiungere 1 μL/tubo di Bst DNA polimerasi.
  4. Vortice a bassa velocità, posizionare i tubi su un termociclatore ed eseguire il seguente programma:
    4 °C per 4 ore, 10 °C per 30 min, 20 °C per 30 min, 30 °C per 30 min, 40 °C per 30 min, 50 °C per 30 min, 65 °C per 60 min, 94 °C per 3 min, e tenere a 4 °C.
    NOTA: La dimensione del tubo è 0,2 ml. Il volume della soluzione è di circa 26,4 μL, compreso il volume del cordone di poliacrilammide. La temperatura del coperchio del termociclatore è di 105 °C. Punto di arresto sicuro: interrompere l'esperimento qui per un massimo di 1 giorno conservando le singole celle riutilizzabili a 4 °C.
  5. Raccogliere il surnatante (circa 20 μL) e trasferirlo in un tubo PCR.
  6. Conservare il surnatante raccolto a -80 °C.
  7. Aggiungere 20 μL/tubo di tampone Tween 20/0.1x TE allo 0,05% a una provetta PCR contenente la singola cellula riutilizzabile (vedere Tabella 1) e incubare la singola cella riutilizzabile a 4 °C, durante la notte. Punto di arresto sicuro: interrompere l'esperimento qui per alcuni giorni prolungando il tempo di incubazione.
  8. Raccogliere il surnatante e combinarlo con il campione raccolto al punto 13.5.
  9. Ripetere ancora una volta i passaggi 13.7-13.8. Immergere la singola cella riutilizzabile in un tampone 50% glicerolo/5 mM EDTA/0,5% BSA/0,05% Tween20/TBS e incubarlo per 30 minuti su uno shaker orbitale (4 °C, 600 rpm). Conservare la singola cella riutilizzabile a -20 °C fino al prossimo esperimento.
  10. Aggiungere 40 μL di Exo-master mix (vedere Tabella 1) e posizionare il tubo su un termociclatore ed eseguire il seguente programma: i) 95 °C per 5 min, ii) 95 °C per 30 s, iii) 60 °C 30 s, iv) 72 °C per 30 s, v) ripetere i passaggi ii-iv 19 volte, vi) 72 °C per 5 min, vii) tenere a 4 °C.
    NOTA: La dimensione del tubo è 0,2 ml. Il volume della soluzione è di circa 45 μL, compreso il volume della perla di poliacrilammide. La temperatura del coperchio del termociclatore è di 105 °C. Punto di arresto sicuro: l'esperimento può essere fermato qui per almeno alcuni giorni conservando il campione a -80 °C.

14. Purificazione fenolo-cloroformio e precipitazione di polietilenglicole

NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Tempo: 1.5 h

  1. Trasferire il prodotto in una provetta a basso legame di DNA da 0,5 mL e aggiungere 100 μL di fenolo:cloroformio:alcool isoamilico.
    NOTA: Fenolo: Cloroformio: Isoamil L'alcol provoca irritazione e possibilmente ustioni per contatto. Indossare guanti, occhiali di sicurezza e un camice da laboratorio. Utilizzare solo con un'adeguata ventilazione o indossare un respiratore appropriato. Seguire le linee guida di sicurezza istituzionali. Scartare gli oggetti da laboratorio usati secondo le linee guida istituzionali.
  2. Agitare per 30 s a mano e centrifugare a 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C.
  3. Raccogliere la fase acquosa (80 μL) in una provetta a basso legame di DNA da 0,5 mL e aggiungere 40,84 μL/tubo di miscela lineare acrilammide/MgCl2 (vedere Tabella 1).
  4. Aggiungere 47,06 μL/tubo al 50% (p/v) PEG8000 (senza RNasi) e miscelare mediante pipettaggio.
  5. Incubare per 20 min a temperatura ambiente e centrifugare a 240 × g per 10 min a temperatura ambiente.
  6. Rimuovere il surnatante e aggiungere 400 μL/tubo di etanolo all'80% (EtOH).
  7. Lavare con 80% di EtOH, rimuovere il surnatante con un aspiratore e asciugare all'aria il pellet.
  8. Sospendere il pellet con 20 μL di 1 mM EDTA/10 mM Tris-HCl, tampone pH 7,4, e conservare la soluzione a -80 °C.
    NOTA: Misurare la concentrazione di DNA utilizzando un colorante intercalatore specifico per DNA a doppio filamento (vedere la Tabella dei materiali). Punto di arresto sicuro: l'esperimento può essere tranquillamente fermato qui per almeno una settimana.

15. Trascrizione in vitro

NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi e RNasi. Tempo: 5 h

  1. Scongelare il DNA dei prodotti derivati da singole cellule (dalla fase 14) e preparare una libreria mista di prodotti derivati da singole cellule mescolando 2 μL/cellula dei prodotti a base di DNA (volume totale 20 μL).
  2. Aggiungere 26 μL di master mix di trascrizione in vitro (vedere la tabella dei materiali e il protocollo del produttore) e miscelare mediante pipettaggio.
  3. Posizionare il tubo PCR su un termociclatore e incubare per 4 ore a 37 °C.
    NOTA: La dimensione del tubo è 0,2 ml. Il volume della soluzione è di 46 μL. La temperatura del coperchio del termociclatore è di 105 °C.
  4. Aggiungere 5 μL di tampone 10x DNasi I (vedere la Tabella dei Materiali) e aggiungere 4 μL di DNasi I (senza RNasi, 4 U, vedere la Tabella dei Materiali).
  5. Mescolare e incubare per 15 minuti a 37 °C e trasferire il campione in una provetta da 0,5 ml.
  6. Aggiungere 300 μL/tubo di guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio (vedere la tabella dei materiali) e mescolare mediante vortice delicato.
    NOTA: Il guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio può causare gravi ustioni chimiche per contatto. Indossare guanti, occhiali di sicurezza e un camice da laboratorio. Utilizzare solo con un'adeguata ventilazione o indossare un respiratore appropriato. Seguire le linee guida di sicurezza istituzionali. Scartare gli oggetti da laboratorio usati secondo le linee guida istituzionali.
  7. Incubare per 5 minuti a RT su uno shaker e quindi conservare i campioni a -80 °C per un massimo di 3 giorni.
    NOTA: punto di arresto sicuro: l'esperimento può essere tranquillamente interrotto qui per un massimo di 3 giorni.

16. Purificazione dell'RNA

NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi e RNasi. Tempo: 2 h

  1. Aggiungere 80 μL/tubo di cloroformio al campione del punto 15.7 e agitare vigorosamente la provetta a mano per 15 s.
  2. Incubare per 2-15 minuti a temperatura ambiente e centrifugare il campione a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C.
  3. Raccogliere e trasferire la fase acquosa del campione (~200 μL) in una nuova provetta da 1,5 ml.
  4. Aggiungere 600 μL/tubo di guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio e trasferire il campione in una provetta da 1,5 ml.
  5. Aggiungere 180 μL/tubo di cloroformio e agitare vigorosamente il tubo a mano per 15 s.
  6. Centrifugare il campione a 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C.
  7. Raccogliere e trasferire la fase acquosa del campione (~450 μL) in una provetta da 1,5 ml.
  8. Aggiungere 60 μL/tubo di acrilammide lineare (5 μg/μL) e aggiungere 400 μL/tubo di isopropanolo al 100% alla fase acquosa.
  9. Incubare il tubo a temperatura ambiente per 10 minuti e centrifugarlo a 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C.
  10. Rimuovere accuratamente il surnatante .
  11. Lavare il pellet di RNA 3 volte con 200 μL di etanolo al 75% (acqua priva di EtOH / RNasi), rimuovere il surnatante e asciugare all'aria il pellet di RNA.
    NOTA: Non lasciare asciugare completamente l'RNA perché il pellet può perdere solubilità.
  12. Risospendere il pellet di RNA in 20 μL di acqua priva di RNasi contenente un inibitore della RNAsi (1 μL/20 μL) e sciogliere il pellet mediante pipettaggio.
  13. Misurare l'assorbanza a 260 nm.

17. Trascrizione inversa

NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Tempo: 1 h

  1. Aggiungere 7 μL/tubo di primer a trascrizione inversa + miscela dNTP (vedere Tabella 1 e Tabella 3) e posizionare i tubi su un termociclatore.
    NOTA: La dimensione del tubo è 0,2 ml. Il volume della soluzione è di 27 μL. La temperatura del coperchio del termociclatore è di 105 °C.
  2. Riscaldare a 65 °C per 5 minuti e posizionare i tubi sul ghiaccio per almeno 1 min.
  3. Aggiungere 14 μL/tubo di master mix di trascrittasi inversa (vedere Tabella 1) e miscelare mediante pipettaggio.
  4. Posizionare i tubi su un termociclatore e incubarli a 55 °C per 10 minuti e poi a 80 °C per 10 minuti.
    NOTA: La dimensione del tubo è 0,2 ml. Il volume della soluzione è di 60 μL. La temperatura del coperchio del termociclatore è di 105 °C.

18. Sintesi del secondo filamento

NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Tempo: 2.5 h

  1. Aggiungere 40 μL/tubo di acqua ultrapura e dividere la soluzione da 100 μL in due provette da 0,2 mL di PCR (50 μL/tubo).
  2. Aggiungere 60 μL/tubo di miscela di sintesi del secondo filamento (vedere Tabella 1) e posizionare i tubi su un termociclatore ed eseguire il seguente programma: i) 95 °C per 5 minuti, ii) 95 °C per 30 s, iii) 60 °C per 30 s, iv) 72 °C per 30 s, v) ripetere i passaggi ii-iv 20 volte e vi) tenere a 4 °C.
    NOTA: La dimensione del tubo è 0,2 ml. Il volume della soluzione è di 110 μL. La temperatura del coperchio del termociclatore è di 105 °C.
  3. Aggiungere 4,4 μL/tubo di 0,5 M EDTA (finale 20 mM) e conservare a -80 °C, per tutta la notte.
    NOTA: punto di arresto sicuro: l'esperimento può essere tranquillamente interrotto qui per un massimo di alcuni giorni.
  4. Purificare il DNA mediante purificazione fenolo-cloroformio e precipitazione del glicole polietilenico (descritto nella fase 14).
    NOTA: Punto di arresto sicuro: l'esperimento può essere tranquillamente interrotto qui per almeno una settimana.

19. Digestione enzimatica di restrizione e selezione delle dimensioni

NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Tempo: 3 h (passi 19.1-19.7)

  1. Misurare la concentrazione di DNA del DNA purificato (dal punto 18.4) misurando l'assorbanza a 260 nm.
  2. Trasferire 6 μg di DNA in una provetta PCR, aggiungere 30 μL di tampone di digestione 10x e regolare il volume a 294 μL con acqua ultrapura.
  3. Aggiungere 6 μL di enzima di restrizione BciVI e incubare a 37 °C per 1 ora.
  4. Eseguire la precipitazione EtOH con poliacrilammide lineare.
    1. Aggiungere 60 μL/tubo di acetato di sodio 3 M (pH 5,2) e quindi aggiungere 40 μL/tubo di acrilammide lineare (5 mg/ml; vedere la tabella dei materiali).
    2. Aggiungere 400 μL/tubo di EtOH e incubare per una notte a -20 °C.
      NOTA: Punto di arresto sicuro: l'esperimento può essere tranquillamente fermato qui per un giorno.
    3. Centrifugare 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante.
    4. Lavare il pellet due volte con l'80% di EtOH e asciugare il pellet.
    5. Sciogliere il pellet con 20 μL di tampone 1xTE e aggiungere 4 μL/tubo di tampone 6x Gel Loading fresco.
  5. Caricare il campione in un gel di agarosio al 5% / tampone TAE 0,5x ed eseguire l'elettroforesi (50 V per 40 minuti).
  6. Tagliare e raccogliere il gel oltre 50 bp (vedere Figura 6) ed estrarre il DNA utilizzando un kit di estrazione del gel.
    NOTA: Punto di arresto sicuro: l'esperimento può essere tranquillamente interrotto qui per almeno una settimana.
  7. Costruire la libreria di sequenziamento usando un kit di preparazione della libreria del DNA (vedi la Tabella dei Materiali)16,17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Le singole celle K562 sono state generate utilizzando il protocollo descritto nel passaggio 8 (vedere la Figura 5). Le singole celle sono state incorporate nello strato esterno della perla di poliacrilammide. Il DNA cellulare è stato colorato e visualizzato utilizzando un colorante intercalatore per la colorazione del DNA.

Figure 5
Figura 5: Celle singole riutilizzabili generate. Le cellule sono colorate con un colorante intercalatore per il DNA (fluorescenza verde). Le frecce bianche indicano singole celle incorporate nello strato esterno di perle di poliacrilammide. La singola cella riutilizzabile è collocata in una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti. Le immagini sono state scattate da un microscopio a scansione, BZ-X710. Barra della scala = 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I risultati mostrati nella Figura 6 hanno supportato la generazione dei prodotti del DNA desiderati. I prodotti a base di DNA della fase 19.7 sono stati scissi dall'enzima di restrizione BciVI in frammenti di 19-20 bp, 31-32 bp, 49 bp e >49 bp. Questi risultati hanno supportato la conclusione che la maggior parte dei prodotti contiene sequenze derivate da sonde anticorpali e sequenze derivate da primer casuali 2° . I prodotti DNA sono stati successivamente legati all'adattatore Illumina utilizzando un kit TruSeq Nano e sequenziati utilizzando un sequenziatore Illumina NovaSeq6000.

Figure 6
Figura 6: Prodotti del DNA prima e dopo la digestione enzimatica di restrizione BciVI. (A) La digestione BciVI ha generato i frammenti attesi di 19-20 bp, frammenti di 31-32 bp e i prodotti desiderati (>49 bp) contenenti codice a barre anticorpale, sequenza legata, DNA genomico e codice a barre cellulare. (B) Distribuzione dimensionale dei prodotti finali alla fine della fase 19.7. La libreria di DNA costruita è stata analizzata mediante elettroforesi capillare. La linea rosa chiaro indica i prodotti desiderati contenenti adattatori di sequenziamento, codice a barre anticorpale e codice a barre cellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

I risultati del sequenziamento hanno indicato che i prodotti generati seguendo le fasi 7-19 contengono la sonda anticorpale, la sequenza legata, la sequenza del genoma e il codice a barre cellulare. Le letture mappate uniche da anti-H3K27ac e anti-H3K27me3 erano significativamente più numerose rispetto alle IgG di controllo (vedi Figura 7A). Ciò indica che il legame specifico di anti-H3K27ac e anti-H3K27me3 aumenta il numero dei prodotti desiderati. La tecnologia più avanzata per l'analisi dell'epigenoma a singola cellula, Paired-Tag, acquisisce circa 2.000 letture uniche di H3K27ac e 1.500 letture uniche di H3K27me3 per nucleo. I nostri risultati hanno mostrato un numero molto più elevato di letture uniche (media 699.398 segnali H3K27ac / cella e 505.433 segnali H3K27me3 / cella). I risultati hanno anche supportato la conclusione che esperimenti ripetuti utilizzando la stessa singola cella riutilizzabile riducono la perdita di segnale e aumentano la densità del segnale.

I segnali REpi-seq mostrati nella Figura 7A sono stati valutati confrontando i dati REpi-seq con i dati ChIP-seq di massa. Nella Figura 7B, in media, il 91% ± il 3,24% dei segnali H3K27ac provenienti da REpi-seq si sovrapponevano ai picchi H3K27ac in massa ChIP-seq. Questa analisi misura il livello di "precisione" nell'analisi dell'epigenoma a singola cellula18. La precisione degli attuali metodi epigenomici a singola cellula per il marchio istonico attivo H3K4me3 è del 53% (Drop-ChIP; H3K4me3)18, 50% (scChIC-seq; H3K4me3)19, e 60% (ACT-seq; H3K4me3)20. Inoltre, la precisione di REpi-seq per il marchio istonico inattivo H3K27me3 era, in media, del 52,09% ± 3,71% (Figura 7C), mentre la precisione per H3K27me3 era del 47% in ChIC-seq19 a cella singola. In conclusione, REpi-seq mostra un'elevata precisione nel rilevare H3K27ac e H3K27me3.

Abbiamo anche analizzato la "sensibilità"18 di REpi-seq, che misura quanti picchi di ChIP-seq di massa sono stati rilevati dalle letture riprodotte da REpi-seq (Figura 7D,E). La sensibilità di REpi-seq è stata del 55,30% in H3K27ac e del 50,94% in H3K27me3. In altri metodi di epigenoma a singola cellula, la sensibilità è del 5% in Drop-ChIP (H3K4me3)18, del 5% in ACT-seq (H3K4me3)20 e del 9,5% in scChIC-seq (H3K27me3)19. Questi risultati indicano che REpi-seq è sensibile nel rilevare segnali epigenetici.

Figure 7
Figura 7: Numeri di segnale, precisione e sensibilità in REpi-seq. Gli stessi esperimenti sono stati ripetuti 3 volte con la stessa singola cellula riutilizzabile (una cella K562). (A) Segnali acquisiti dalle stesse otto singole celle. Ogni punto rappresenta una singola cella riutilizzabile. Sono stati contati segnali unici provenienti da IgG di controllo (nero), anti-H3K27me3 (blu) e anti-H3K27ac (rosso) nelle stesse singole celle. I segnali anti-H3K27me3 e anti-H3K27ac erano significativamente più alti delle IgG di controllo, indicando che il legame specifico degli anticorpi genera segnali in modo più efficiente rispetto alle IgG di controllo. Bar: media, barra di errore: deviazione standard. (B, C) Precisione delle letture uniche REpi-seq H3K27ac (B) e H3K27me3 (C). La precisione delle letture uniche derivate da REpi-seq si basava sulla sovrapposizione con i picchi ChIP-seq noti dall'analisi delle celle di massa K562 (H3K27ac: SRR3144862; H3K27me3: SRR069083). Le percentuali di lettura REpi-seq H3K27ac e H3K27me3 confermate dai picchi ChIP-seq sono state calcolate in ogni singola cella. I risultati sono espressi come percentuale media di 8 singole cellule. (D, E) Sensibilità di REpi-seq alla rilevazione dei picchi noti di H3K27ac (D) e H3K27me3 (E). Sono state utilizzate letture uniche di REpi-seq. Picchi H3K27ac e H3K27me3 identificati da ChIP-seq di celle bulk K562 nel progetto ECODE (H3K27ac: ENCFF038DDS; H3K27me3: ENCFF031FSF) sono stati riconosciuti dalle letture uniche REpi-seq. I risultati sono espressi come la percentuale media di picchi ChIP-seq riconosciuti dalle letture uniche REpi-seq. I pannelli B-E sono stati riprodotti da Ohnuki et al.7. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: buffer utilizzati in questo protocollo. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Anticorpi e controllo delle IgG utilizzati in questo protocollo. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: DNA oligonucleotidico utilizzato in questo protocollo. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Video supplementare S1: prelievo e trasferimento automatizzati di singole cellule in una piastra PCR a 96 pozzetti (fase 8.2.4). Clicca qui per scaricare questo video.

Video supplementare S2: Rimozione del surnatante da un pozzo contenente una singola cella utilizzando un robot per la manipolazione dei liquidi (fase 8.2.8.1). Clicca qui per scaricare questo video.

Video supplementare S3: Aggiunta del 4% di TEMED/olio minerale a un pozzetto contenente una singola cella utilizzando un robot per la manipolazione dei liquidi (fase 8.2.8.2). Clicca qui per scaricare questo video.

Codice supplementare 1: Programma automatizzato del robot di movimentazione dei liquidi dalle fasi 8.2.8.1-8.2.8.2. Clicca qui per scaricare questo file.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Questo articolo descrive il protocollo passo-passo per l'analisi multiepigenomica a singola cellula recentemente riportata utilizzando singole cellule riutilizzabili7. Nei paragrafi successivi, discutiamo i punti critici, sottolineando i potenziali limiti nel protocollo.

Uno dei punti critici in tutto il protocollo (dai passaggi 7.2-13) è evitare la contaminazione da DNasi. Una singola cellula ha solo due copie di DNA genomico. Pertanto, danneggiare il DNA genomico riduce criticamente il numero di segnali. Evitare la contaminazione con DNasi è essenziale per proteggere l'integrità del DNA genomico.

Anche la permeabilità dei reagenti attraverso la membrana cellulare / parete cellulare è fondamentale in tutto il protocollo. REpi-seq è stato progettato per analizzare l'epigenoma di cellule di topo e umane a livello di singola cellula. Si prevede che le condizioni ottimali per questo metodo sperimentale varino a seconda della permeabilità dei tipi di cellule e della membrana nucleare a ciascun reagente. Pertanto, quando il metodo viene applicato a cellule diverse dalle cellule di topo e umane, come cellule vegetali, lieviti e batteri, le condizioni in ogni fase devono essere ottimizzate.

Riteniamo che un punto critico specifico per la fase 9.5 (ricottura del primo primer casuale) sia la rapida velocità di raffreddamento dopo la denaturazione del DNA genomico. Il raffreddamento lento e graduale dopo la denaturazione può ridurre l'efficienza di ricottura dei primer casuali che si legano al DNA genomico. Inoltre, nella fase 11 (legatura di prossimità), un punto critico è la composizione del buffer. I tamponi contenenti glicole polietilenico (PEG) sono ampiamente utilizzati per metodi di legatura più rapidi nelle applicazioni di biologia molecolare. Una bassa concentrazione di PEG (ad esempio, <7,5%) promuove la rapida formazione di DNA a doppio filamento senza precipitazione del DNA. Tuttavia, abbiamo osservato che il tampone di legatura contenente PEG induce il restringimento del cordone di gel unicellulare contenente la singola cellula (singola cellula riutilizzabile), suggerendo che la dimensione della maglia dello scaffold in poliacrilammide si era ridotta. Poiché questo restringimento può causare una ridotta accessibilità della T4 DNA ligasi, abbiamo deciso di non utilizzare il protocollo di legatura più veloce per REpi-seq.

In REpi-seq, i risultati possono essere valutati dalla frequenza di ririlevazione dei segnali nelle stesse singole celle. La frequenza di ririlevazione è utile per monitorare le reazioni, compresa la legatura di prossimità con la sonda anticorpale e il primo primer casuale. In precedenza abbiamo riportato7 che il 62,03% delle letture di H3K27ac in un esperimento è stato confermato in due esperimenti replicati, suggerendo che l'efficienza della legatura di prossimità nei singoli esperimenti è superiore alla percentuale complessiva di ririlevazione negli esperimenti ripetuti.

Abbiamo anche precedentemente riportato7 il successo della rilevazione del legame della RNA polimerasi II (Pol II) al DNA in singole cellule riutilizzabili. Il legame Pol II è difficile da catturare con gli attuali metodi di epigenoma a singola cellula a causa della natura temporale e instabile di questo legame.

Gli attuali approcci CUT&Tag basati sulla trasposasi per l'analisi dell'epigenoma a singola cellula richiedono la conservazione dell'interazione nucleosoma-DNA. Un anticorpo specifico si lega a una modifica dell'istone; quindi, la trasposasi attaccata all'anticorpo fende il DNA genomico e inserisce un codice a barre del DNA nel sito di scissione del DNA. Questa reazione dipende dall'interazione nucleosoma (istone)-DNA. Pertanto, è essenziale che le interazioni nucleosoma-DNA e la struttura delle proteine cellulari e della cromatina rimangano intatte. Quindi, gli approcci CUT&Tag sono inevitabilmente orientati verso regioni accessibili della struttura della cromatina nell'analisi delle modificazioni degli istoni.

L'inevitabile pregiudizio verso le regioni della cromatina accessibili ostacola l'aumento del numero di segnali epigenetici nell'analisi dell'epigenoma a singola cellula. Le strutture della cromatina sono formate da molteplici tipi di interazioni molecolari, comprese le interazioni DNA-nucleosoma e nucleosoma-nucleosoma attraverso proteine associate ai nucleosomi. Quindi, abbiamo scelto di non preservare le interazioni DNA-proteina e proteina-proteina nelle singole cellule riutilizzabili, preservando la posizione delle proteine cellulari. Questa caratteristica è ottenuta con l'uso di acrilammide monomerica e una miscela di paraformaldeide (fase 7 del protocollo), che modifica il gruppo amminico sulle proteine cellulari piuttosto che reticolare la proteina in proteina o la proteina in DNA.

La posizione degli istoni e delle proteine associate al genoma viene mantenuta dalla connessione al polimero di poliacrilammide. I nucleosomi sono denaturati intorno a 71-74 °C21. Pertanto, nella singola cellula riutilizzabile, gli istoni sono probabilmente denaturati e rilassati/dissociati l'uno dall'altro dopo la fase di ricottura del 1°primer casuale (94 °C). Ciò può rilassare la struttura dell'eterocromatina e migliorare l'accessibilità degli anticorpi e di altre molecole alle regioni dell'eterocromatina. Questa conclusione è supportata dai nostri risultati riportati7 che mostrano che la distorsione associata alla struttura della cromatina è ridotta nelle singole cellule riutilizzabili rispetto agli approcci CUT&Tag9.

La connessione dell'istone H3 al poliacrilammide viene mantenuta dopo almeno 3 cicli di denaturazione termica poiché la posizione degli istoni nella singola cellula riutilizzabile viene preservata nel corso di esperimenti ripetuti7. Questa funzione consente la ripetizione dello stesso esperimento utilizzando la stessa singola cella. Esperimenti ripetuti contribuiscono ad aumentare il numero di segnali provenienti da una singola cellula rispetto agli approcci CUT&Tag.

La verificabilità è un principio fondamentale nella scienza. Tuttavia, la verifica dei risultati sperimentali di una singola cellula non è fattibile negli approcci CUT&Tag, poiché non sono possibili esperimenti ripetuti con le stesse cellule. Il DNA genomico viene scisso dalla trasposasi e riceve il codice a barre del DNA per un marchio epigenetico. Il DNA genomico scisso viene rilasciato dalla sua posizione originale. Pertanto, l'approccio CUT&Tag è svantaggiato per l'analisi di più segni epigenetici nella stessa singola cellula. Questa caratteristica dei metodi CUT&Tag è alla base del compromesso tra una diminuzione della densità del segnale e un aumento del numero di segni epigenetici per singola cellula.

Per evitare questo problema, abbiamo copiato il DNA genomico piuttosto che tagliare il genoma e quindi etichettato il DNA genomico copiato con una sonda di DNA anticorpale. REpi-seq permette l'analisi delle stesse singole celle e aumenta la densità del segnale. Fornisce inoltre un mezzo per la verificabilità dei risultati sperimentali, il multiplexing dell'analisi epigenomica e la risoluzione del problema del trade-off negli approcci CUT&Tag. Sebbene il metodo superi i limiti dell'analisi epigenomica basata sulla trasposasi, non è ancora in grado di analizzare un gran numero di cellule a livello di singola cellula. Sono necessari ulteriori sviluppi.

In conclusione, REpi-seq copia il DNA genomico piuttosto che tagliare il genoma e quindi etichetta il DNA genomico copiato con una sonda di DNA anticorpale. REpi-seq è ancora agli inizi e ha bisogno di aumentare la produttività delle cellule. Tuttavia, REpi-seq ha punti di forza, che superano i limiti negli attuali metodi di epigenoma a singola cellula: 1) aumentare la densità del segnale riducendo i drop-out dei segnali attraverso esperimenti ripetuti nelle stesse singole cellule; 2) ridurre la distorsione strutturale riducendo le regioni inaccessibili in base alla struttura della cromatina; 3) fornire verificabilità dei risultati sperimentali mediante esperimenti ripetuti nella stessa singola cellula, 4) identificazione del segnale basata sulla probabilità di ririlevazione dello stesso segnale in ogni singola cellula; 5) analizzare più marcature epigenetiche nella stessa singola cellula senza competizione tra i marcatori epigenetici. Questi progressi consentono di analizzare i meccanismi epigenetici in una singola cellula, che è un'applicazione importante e non fattibile con gli altri metodi epigenomici a singola cellula.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ohnuki e Tosato sono co-inventori di un brevetto intitolato "Metodi per la preparazione di una singola cellula riutilizzabile e metodi per analizzare l'epigenoma, il trascrittoma e il genoma di una singola cellula" (EP3619307 e US20200102604). La domanda di brevetto è stata depositata in parte sulla base dei risultati preliminari relativi alla tecnologia descritta nel manoscritto corrente. L'invenzione o le invenzioni descritte e rivendicate in questa domanda di brevetto sono state fatte mentre gli inventori erano dipendenti a tempo pieno del governo degli Stati Uniti. Pertanto, ai sensi del 45 Code of Federal Regulations Part 7, tutti i diritti, i titoli e gli interessi relativi a questa domanda di brevetto sono stati o dovrebbero essere assegnati per legge al governo degli Stati Uniti. Il governo degli Stati Uniti trasmette una parte delle royalties che riceve ai suoi inventori dipendenti ai sensi del 15 Codice degli Stati Uniti § 3710c.

Acknowledgments

Ringraziamo i dottori David Sanchez-Martin e Christopher B. Buck per i commenti durante la fase di concettualizzazione del progetto. Ringraziamo anche il Genomics Core, il Center for Cancer Research, il National Cancer Institute, il National Institutes of Health per l'aiuto negli esperimenti preliminari e la Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH per i consigli nell'analisi computazionale. Ringraziamo la signora Anna Word per l'aiuto nell'ottimizzazione delle DNA polimerasi utilizzate nel metodo. Questo lavoro ha utilizzato le risorse computazionali del cluster NIHHPC Biowulf (http://hpc.nih.gov). Questo progetto è supportato dal programma intramurale del Center for Cancer Research, dal National Cancer Institute, dal National Institutes of Health, dal NCI Director's Innovation Award (# 397172) e dai fondi federali del National Cancer Institute con contratto n. HHSN261200800001E. Ringraziamo i dottori Tom Misteli, Carol Thiele, Douglas R. Lowy e tutti i membri del Laboratorio di Oncologia Cellulare per i commenti produttivi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x CutSmart buffer New England BioLabs B6004 10x Digestion buffer
200 proof ethanol Warner-Graham Company 200 proof Ethanol
5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Monoclonal Antibody [HMC/4D9] Epigentek A-1018-100 Anti-5hmC
Acridine Orange/Propidium Iodide Stain Logos Biosystems F23001 Cell counter
Acrylamide solution, 40% in H2O, for molecular biology MilliporeSigma 01697-500ML 40% acrylamide solution
All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710 Keyence BZ-X710 Scanning microscope
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit MilliporeSigma UFC510024 Ultrafiltration cassette
Ammonium persulfate for molecular biology MilliporeSigma A3678-100G Ammonium persulfate powder
Anhydrous DMF Vector laboratories S-4001-005 Anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF)
Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) antibody [4H8] Abcam ab5408 Anti-Pol II
Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457) antibody Abcam ab60950 Anti-Med1
BciVI New England BioLabs R0596L BciVI
Bovine Serum Albumin solution, 20 mg/mL in H2O, low bioburden, protease-free, for molecular biology MilliporeSigma B8667-5ML 20% BSA (Table 7)
Bst DNA Polymerase, Large Fragment New England BioLabs M0275L Bst DNA polymerase
BT10 Series 10 µl Barrier Tip NEPTUNE BT10 P10 low-retention tip
CellCelector Automated Lab Solutions N/A Automated single cell picking robot
CellCelector 4 nl nanowell plates for single cell cloning, Plate S200-100 100K, 24 well,ULA Automated Lab Solutions CC0079 4 nL nanowell plate
Chloroform MilliporeSigma Chloroform
Corning Costar 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate Corning 3596 Flat-bottom 96-well plates
Deep Vent (exo-) DNA Polymerase New England BioLabs M0259L Exo- DNA polymerase
DNA LoBind Tubes, 0.5 mL Eppendorf 30108035 0.5 mL DNA low-binding tube
DNA Oligo, 1st random primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 1st random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#01 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#02 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#03 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#04 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#05 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#06 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#07 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#08 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#09 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#10 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#11 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#12 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd synthesis primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd synthesis primer
DNA Oligo, Ligation Adaptor Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 Ligation Adaptor
DNA Oligo, Reverse Transcription primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 Reverse Transcription primer
DNase I (RNase-free) New England BioLabs M0303L DNase I (RNase-free, 4 U).
DNase I Reaction Buffer New England BioLabs B0303S 10x DNase I buffer (NEB)
dNTP Mix (10 mM each) Thermo Fisher R0192 10 mM dNTPs
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat-inactivated MilliporeSigma F4135-500ML Fetal bovine serum
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England BioLabs E2040S In-vitro-transcription master mix
Histone H3K27ac antibody Active motif 39133 Anti-H3K27ac
Histone H3K27me3 antibody Active motif 39155 Anti-H3K27me3
IgG from rabbit serum Millipore Sigma I5006-10MG Control IgG
Iron oxide(II,III) magnetic nanopowder, 30 nm avg. part. size (TEM), NHS ester functionalized MilliporeSigma 747467-1G NHS ester functionalized 30 nm iron oxide powder
K-562 American Type Culture Collection (ATCC) CCL-243 cells
Linear Acrylamide (5 mg/mL) Thermo Fisher AM9520 Linear Acrylamide
LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter Logos Biosystems L20001 Cell counter
LUNA Cell Counting Slides, 50 Slides Logos Biosystems L12001 Cell counter
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil MilliporeSigma M5904-500ML Mineral oil
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine for molecular biology MilliporeSigma T7024-100ML N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine
NaCl (5 M), RNase-free Thermo Fisher AM9760G 5M NaCl
NanoDrop Lite Thermo Fisher 2516  Microvolume spectrophotometer
NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom Opentrons N/A 2 mL deep well 96-well plate
Non-skirted 96-well PCR plate Genesee Scientific 27-405 96-well PCR plate
NuSive GTG Agarose Lonza 50081 Agarose
OmniPur Acrylamide: Bis-acrylamide 19:1, 40% Solution MilliporeSigma 1300-500ML 40%Acrylamide/Bis-acrylamide
OT-2 lab robot Opentrons OT2 Automated liquid handling robot
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified, 20% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 15713 20% Pararmaldehyde
PBS (10x), pH 7.4 Thermo Fisher 70011044 10x PBS
PIPETMAN Classic P1000 GILSON F123602 A P1000 pipette
Protein LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 925000090 1.5 mL Protein low-binding tube
QIAgen Gel Extraction kit Qiagen 28706 A P1000 pipette
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Thermo Fisher P11495  dsDNA specific intercalator dye
Quick Ligation kit New England BioLabs M2200L T4 DNA ligase (NEB)
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor Thermo Fisher 10777019 RNAse inhibitor
S-4FB Crosslinker (DMF-soluble) Vector laboratories S-1004-105 Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB)
S-HyNic Vector laboratories S-1002-105 Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone (S-HyNic)
Sodium Acetate, 3 M, pH 5.2, Molecular Biology Grade MilliporeSigma 567422-100ML 3M Sodium acetate (pH 5.2)
Sodium bicarbonate, 1M buffer soln., pH 8.5 Alfa Aesar J60408 1M sodium bicarbonate buffer, pH 8.5
Sodium phosphate dibasic for molecular biology MilliporeSigma S3264-250G Na2HPO4
Sodium phosphate monobasic for molecular biology MilliporeSigma S3139-250G NaH2PO4
SuperScript IV reverse transcriptase Thermo Fisher 18090050 Reverse transcriptase
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000x Concentrate in DMSO) Thermo Fisher S11494 An intercalator dye for DNA
T4 DNA Ligase Reaction Buffer New England BioLabs B0202S 10x T4 DNA ligase reaction buffer
ThermoPol Reaction Buffer Pack New England BioLabs B9004S 10x TPM-T buffer (Tris-HCl/Pottasium chloride/Magnesium sulfate/Triton X-100)
TRIzol LS reagent Thermo Fisher 10296-028 Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction
TruSeq Nano DNA library prep kit Illumina 20015965 A DNA library preparation kit (see also the manufacturer's instruction)
Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for control IgG
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher 15575020 0.5M EDTA, pH 8.0
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Thermo Fisher 10977023 Ultrapure water
Zeba Splin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Fisher 89882 Desalting column

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perkel, J. M. Single-cell analysis enters the multiomics age. Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).
  2. Clark, S. J., et al. scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells. Nature Communications. 9 (1), 781 (2018).
  3. Ma, S., et al. Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin. Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).
  4. Zhu, C., et al. An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).
  5. Zhu, C., et al. Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain. Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).
  6. Mimitou, E. P., et al. Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells. Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).
  7. Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Iterative epigenomic analyses in the same single cell. Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).
  8. Tosato, G., Ohnuki, H. Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell. , EP 3619307, US 202001026704 (2021).
  9. Harada, A., et al. A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input. Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).
  10. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
  11. Marina, R. J., et al. TET-catalyzed oxidation of intragenic 5-methylcytosine regulates CTCF-dependent alternative splicing. EMBO Journal. 35 (3), 335-355 (2016).
  12. Weast, R. C., et al. Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn. Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H. , Chemical Rubber Company Press. (1975).
  13. Aydin, S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 72, 4-15 (2015).
  14. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12 (2013).
  15. Porstmann, T., Kiessig, S. T. Enzyme immunoassay techniques. An overview. Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).
  16. Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
  17. Song, Y., et al. A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples. BMC Genomics. 19 (1), 696 (2018).
  18. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  19. Ku, W. L., et al. Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification. Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).
  20. Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).
  21. Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).

Tags

Ritrattazione numero 180
Singola cellula riutilizzabile per analisi epigenomiche iterative
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov,… More

Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses. J. Vis. Exp. (180), e63456, doi:10.3791/63456 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter