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Analisi di campioni di rizoma di Cyperi grezzi e lavorati mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem in ratti con dismenorrea primaria

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64691
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Chongqing Engineering Research Center of Pharmaceutical Evaluation of Chinese Medicine, Chongqing Academy of Chinese Materia Medica

Summary

Qui, viene presentata un'analisi comparativa di campioni grezzi e lavorati di rizoma di Cyperi (CR) utilizzando la spettrometria di massa tandem ad altissima prestazione per cromatografia liquida ad alta risoluzione (UPLC-MS / MS) nei ratti con dismenorrea primaria. Le variazioni dei livelli ematici dei metaboliti e dei costituenti del campione sono state esaminate tra ratti trattati con CR e CR trattati con aceto (CRV).

Abstract

Cyperi rhizoma (CR) è ampiamente usato in ginecologia ed è una medicina generale per il trattamento delle malattie delle donne in Cina. Poiché l'effetto analgesico della CR è potenziato dopo la lavorazione con aceto, la CR elaborata con aceto (CRV) viene generalmente utilizzata clinicamente. Tuttavia, il meccanismo con cui l'effetto analgesico è potenziato dalla lavorazione dell'aceto non è chiaro. In questo studio, la tecnica di spettrometria di massa tandem per cromatografia liquida ad altissima pressione (UPLC-MS/MS) è stata utilizzata per esaminare i cambiamenti nei livelli ematici dei costituenti esogeni e dei metaboliti tra ratti trattati con CR e ratti trattati con CRV con dismenorrea. I risultati hanno rivelato livelli diversi di 15 costituenti e due metaboliti nel sangue di questi ratti. Tra questi, i livelli di (-)-mirtenolo e acido [(1R,2S,3R,4R)-3-idrossi-1,4,7,7-tetrametilbiciclo[2.2.1]ep-2-il]acetico nel gruppo CRV erano considerevolmente più alti rispetto al gruppo CR. Il CRV ha ridotto il livello di prostanoidi della serie 2 e dei leucotrieni della serie 4 con attività proinfiammatorie, di aggregazione piastrinica e di vasocostrizione e ha fornito effetti analgesici modulando il metabolismo dell'acido arachidonico e dell'acido linoleico e la biosintesi degli acidi grassi insaturi. Questo studio ha rivelato che la lavorazione dell'aceto migliora l'effetto analgesico della CR e contribuisce alla nostra comprensione del meccanismo d'azione del CRV.

Introduction

La dismenorrea primaria (PD) è la condizione più diffusa in ginecologia clinica. È caratterizzata da mal di schiena, gonfiore, dolore addominale o disagio prima o durante le mestruazioni senza patologia pelvica nel sistema riproduttivo1. Un rapporto sulla sua prevalenza ha mostrato che l'85,7% degli studenti soffre di PD2. I contraccettivi orali a basso dosaggio sono la terapia standard, ma i loro effetti collaterali avversi, come la trombosi venosa profonda, hanno attirato una crescente attenzione3. La prevalenza della trombosi venosa profonda tra gli utilizzatori di contraccettivi orali è di >1 per 1.000 donne e il rischio è più alto durante i primi 6-12 mesi e negli utenti di età superiore ai 40 anni4.

A lungo utilizzato nella medicina tradizionale cinese (MTC), Cyperi rhizoma (CR) deriva dal rizoma essiccato del Cyperus rotundus L. della famiglia delle Cyperaceae. La CR regola i disturbi mestruali e allevia la depressione e il dolore5. La CR è ampiamente usata in ginecologia ed è considerata una medicina generale per il trattamento delle malattie femminili6. La CR trattata con aceto (CRV) è tipicamente utilizzata clinicamente. Rispetto alla CR, la CRV mostra una maggiore regolazione delle mestruazioni e del sollievo dal dolore. Studi moderni hanno dimostrato che la CR inibisce la cicloossigenasi-2 (COX-2) e la successiva sintesi delle prostaglandine (PG), ottenendo così un effetto antinfiammatorio. Nel frattempo, CR mostra un effetto analgesico senza effetti collaterali7, rendendo CR una buona scelta per i pazienti con dismenorrea. Tuttavia, il meccanismo alla base della regolazione delle mestruazioni e della fornitura di sollievo dal dolore da parte della CRV non è chiaro. La ricerca sulla CR si è concentrata principalmente sui cambiamenti nei suoi componenti chimici attivi e nelle attività farmacologiche, come i suoi effetti antinfiammatori, antidepressivi e analgesici 8,9,10,11,12.

Sebbene gli ingredienti della MTC siano complessi, vengono assorbiti nel sangue e devono raggiungere una concentrazione ematica specifica per essere efficaci13. L'ambito dello screening dei principi attivi della MTC può essere ristretto utilizzando la strategia di determinazione dei costituenti nel sangue. La cecità può essere evitata nello studio dei componenti chimici in vitro e l'unilateralità può essere evitata nello studio dei singoli costituenti14. Confrontando le composizioni di CR e CRV nel sangue, i cambiamenti nei principi attivi della CR elaborata possono essere rilevati in modo efficace e rapido. L'efficacia del farmaco è il processo attraverso il quale un farmaco influenza il corpo. I cambiamenti nei componenti del farmaco dovuti alla risposta metabolica del corpo, che possono essere correlati al meccanismo d'azione del farmaco, possono essere determinati con la metabonomia. La metabonomica mira a misurare le risposte metaboliche complessive e dinamiche, il che è coerente con la determinazione dell'efficacia complessiva della medicina tradizionale cinese15. Inoltre, i metaboliti sono il prodotto finale dell'espressione genica, che è più strettamente correlata ai fenotipi16. Pertanto, la metabonomica può essere adatta per esplorare le differenze nelle vie metaboliche tra CR e CRV nel trattamento della malattia di Parkinson. La metabolomica non mirata basata sulla cromatografia liquida tandem ad alta risoluzione (LC-MS/MS) è caratterizzata da elevata produttività, alta sensibilità e alta risoluzione e può essere utilizzata per misurare molti diversi piccoli componenti molecolari17,18 . Questo metodo può determinare simultaneamente i metaboliti endogeni e i costituenti esogeni assorbiti nel sangue. La metabonomica è stata ampiamente utilizzata negli studi su MTC19, tossicologia dei farmaci 20, gestione della salute 21, sport22, cibo 23 e altri campi.

In questo studio, le differenze nei costituenti esogeni assorbiti nel sangue e nei metaboliti endogeni sono state misurate tra ratti modello di dismenorrea trattati con CRV e dismenorrea trattati con CRV utilizzando metabolomica non mirata basata su LC-MS / MS per rivelare i meccanismi degli effetti analgesici del CRV.

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Protocol

Tutti gli esperimenti relativi agli animali sono stati condotti con l'approvazione del Comitato etico degli esperimenti dell'Istituto di MTC di Chongqing. In questo esperimento sono stati utilizzati ventiquattro ratti femmina di Sprague Dawley (SD) che avevano 8-10 settimane e pesavano 200 g ± 20 g.

1. Preparazione dell'estrazione

  1. Calcolo
    1. Pianificare la somministrazione dell'estratto di CR o CRV a un gruppo di trattamento di sei ratti Sprague-Dawley (10 g/[kg∙giorno]) per 3 giorni. Utilizzare una concentrazione di estratto CR o CRV di 1 g / ml (1 ml dell'estratto è ottenuto da 1 g di erbe).
      NOTA: Il dosaggio di CR è 6-10 g. In questo studio, la dose massima di 10 g è stata utilizzata come dosaggio. Poiché il peso medio di una persona adulta è di 60 kg, la dose per adulti è di 0,1667 g/kg. Secondo l'algoritmo di conversione del peso24, poiché il coefficiente di conversione della dose tra uomo e ratto è 6,3, il dosaggio per i ratti è di 1,05 g / kg. Il dosaggio del farmaco è stato aumentato di 10 volte a 10,5 g / kg per i ratti. Il dosaggio è stato fissato a 10 g / kg per comodità di calcolo e l'esperimento effettivo. Ad esempio, secondo il calcolo, se è necessario un totale di 36 g di CR o CRV, la fitoterapia cinese dovrebbe essere preparata almeno due volte. Pertanto, sono stati necessari 200 g di CR: 100 g di CR sono stati utilizzati come CR e 100 g di CR sono stati trasformati in CRV.
    2. Calcolare il volume di CR o CRV da applicare per ratto utilizzando l'equazione (1):
      V = 10 g/(kg∙giorno) × 200 g/(1 g/ml) = 2 mL (1)
  2. Elaborazione del CRV
    1. Mescolare accuratamente 100 g di CR e 20 g di aceto (>5,5 g di acido acetico/100 ml) e incubare per 12 ore.
      NOTA: Per garantire che l'interno del CR fosse inumidito dall'aceto dopo 12 ore, il CR e l'aceto sono stati mescolati, mescolati bene e poi mescolati di nuovo fino a quando la parte interna era umida.
    2. Soffriggere il composto in una padella di ferro per 10 minuti a 110-120 °C. Quindi, estrarre il composto e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente.
      NOTA: Per evitare che il CR si scotti, è necessario mescolare continuamente durante il riscaldamento. Se il CRV trattato è troppo umido, può essere essiccato a 60 °C. Quando la superficie del CR è seppia, la frittura può essere interrotta.
  3. Estrazione
    1. Estratto di CR
      1. Aggiungere 10 volte (la quantità di CR) acqua pura al CR e immergere per 2 ore. Assicurarsi che i materiali medicinali siano al di sotto del livello del liquido durante l'immersione.
        NOTA: Il CR deve essere tagliato a metà solo prima dell'estrazione. Lo scopo dell'ammollo è quello di estrarre i costituenti attivi in modo più efficace. Il processo di ammollo è essenziale.
      2. Portare a ebollizione la miscela di acqua e medicine a fuoco alto e tenerla bollente a fuoco basso per 20 minuti. Filtrare con un panno filtrante (100 maglie) e raccogliere il filtrato.
        NOTA: Durante il decotto, è stato utilizzato un calore elevato prima dell'ebollizione e un calore basso è stato utilizzato per mantenere l'ebollizione.
      3. Ripetere una volta il punto 1.3.1.2 e unire i filtrati.
      4. Concentrare l'estratto con un evaporatore rotante a 1 g/mL (in base al medicinale originale, la temperatura di concentrazione deve essere inferiore a 60 °C).
        NOTA: I componenti attivi in CR sono volatili, quindi la temperatura di concentrazione non deve essere superiore a 60 °C.
    2. Estratto di CRV
      1. Eseguire gli stessi passaggi (1.3.1.1-1.3.1.3) del metodo di estrazione CR.
    3. Estratto di CR per test
      1. Pipettare 500 μL di estratto CR e 500 μL di metanolo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e vortice per 30 s da miscelare.
        NOTA: Una miscela di metanolo e acqua estrae meglio i componenti attivi. L'estratto non deve essere filtrato direttamente per il test.
      2. Centrifugare ogni campione per 15 minuti a 1,6502 × g a 4 °C. Filtrare il surnatante, quindi trasferirlo nel flaconcino del campione per il test.
        NOTA: Dopo la centrifugazione ad alta velocità della miscela di metanolo ed estratto, il surnatante può essere trasferito direttamente al flacone del campione per la determinazione senza filtrazione. A causa del calore generato dal processo di centrifugazione, è preferibile utilizzare una centrifuga criogenica.
    4. Estratto di CRV per test
      1. Eseguire i passaggi 1.3.3.1-1.3.3.2 per preparare l'estratto CRV per il test.

2. Animali

  1. Calcolo
    1. Prendere 50 mg di estradiolo benzoato e aggiungerlo a 50 ml di olio d'oliva per preparare una soluzione da 1 mg / ml. Prendere 50 mg di ossitocina e aggiungerli a 50 ml di soluzione salina normale per preparare una soluzione da 1 mg/ml.
      NOTA: La dose dell'iniezione intraperitoneale di estradiolo benzoato e ossitocina è di 10 mg/(kg∙die). L'estradiolo benzoato viene sciolto nell'olio d'oliva e l'ossitocina viene sciolta nella normale soluzione salina. L'estradiolo benzoato non è facile da sciogliere nell'olio d'oliva e può essere trattato con ultrasuoni per accelerare la dissoluzione. Sia le soluzioni di estradiolo benzoato che di ossitocina devono essere preparate quotidianamente.
    2. Calcolare il volume di soluzione di estradiolo benzoato da applicare per ratto (cioè V = 10 mg/[kg∙giorno] × 200 g/[1 g/ml] = 2 ml). Calcolare il volume della soluzione di ossitocina da applicare per ratto (cioè V = 10 mg/[kg∙giorno] × 200 g/[1 g/ml] = 2 ml).
  2. Raggruppamento e somministrazione degli animali
    NOTA: Dieci giorni sono stati assegnati per la somministrazione25,26. Durante il trattamento, i ratti avevano accesso illimitato al chow e all'acqua standard. Entro 30 minuti dalla somministrazione di ossitocina, è stata monitorata l'attività di contorcersi di ciascun ratto. Il modello di ratto PD è stato sviluppato con successo, come evidenziato dalle risposte di torsione dei ratti modello, che includevano la contrazione uterina, la rotazione di un arto, l'estensione degli arti posteriori, un tronco cavo e la contrazione addominale26.
    1. Assegnare 24 femmine di ratto Sprague-Dawley (ratti SD, 8-10 settimane di età, del peso di 200 g ± 20 g) in quattro gruppi a controllo casuale, modello, CR e CRV e nutrirli per 7 giorni.
    2. Somministrazione animale
      1. Iniettare per via intraperitoneale ratti nei gruppi modello, CR e CRV con 2 ml di soluzione di estradiolo benzoato ogni giorno. Iniettare per via intraperitoneale i ratti nel gruppo di controllo con 2 ml di soluzione salina normale.
      2. Dal giorno 8, completare il passaggio 2.2.2.1. Quindi, somministrare per via intragastrica 2 ml di estratto di CRV ai ratti nel gruppo CRV, 2 ml di estratto di CR ai ratti nel gruppo CR e 2 ml di soluzione salina normale ai ratti nei gruppi di controllo e modello.
      3. Il giorno 10, completare il passaggio 2.2.2.2. Quindi, iniettare per via intraperitoneale i ratti nei gruppi modello, CR e CRV con 2 ml di soluzione di ossitocina e i ratti nel gruppo di controllo con 2 ml di soluzione salina normale.
    3. Registrare i tempi di contorcersi dei ratti entro 30 minuti dall'iniezione di ossitocina.
  3. Raccolta di campioni
    1. Raccogliere campioni di sangue dell'aorta addominale, asportare l'utero rapidamente e completamente e separare accuratamente il tessuto connettivo e il grasso aderente alla parete uterina.
      NOTA: Il sangue è stato raccolto il più vicino possibile entro 1 ora dopo l'ultima dose.
    2. Utilizzare tubi di microcentrifuga per preservare e trasferire il tessuto uterino in azoto liquido. Conservare i campioni di tessuto a -80 °C.
    3. Centrifugare i campioni di sangue per 10 minuti a 4.125 × g. Rimuovere il surnatante contenente siero e centrifugare a 16.502 × g per 10 minuti a 4 °C. Centrifugare il siero e tenerlo nel tubo a -80 °C per la conservazione.
      NOTA: I campioni di sangue devono essere lasciati a temperatura ambiente per 1 ora per il ritrattamento.
  4. Elaborazione dei campioni
    1. Campioni di siero
      1. Mettere 400 μL di metanolo e 200 μL di siero in una provetta da microcentrifuga e vortice per 30 s per mescolare. Centrifugare ogni campione per 15 minuti a 16.502 × g a 4 °C. Riempire i flaconi campione con il surnatante dopo la raccolta e la filtrazione. Mescolare tutti i surnatanti di ciascun campione con lo stesso volume per preparare i campioni di controllo qualità per i test.
    2. Campioni di tessuto uterino
      1. Prendi 100 mg di tessuto uterino dal segmento omolaterale e macinalo con un volume nove volte superiore di soluzione salina normale. Centrifugare l'omogenato per 10 minuti a 4.125 × g e raccogliere il surnatante. Porre il surnatante in frigorifero a 4 °C per la prova o a -80 °C se non deve essere sottoposto a prova lo stesso giorno.
      2. Posizionare le normali sfere saline, di tessuto e di acciaio in una provetta da microcentrifuga da 2 ml, mettere la provetta della microcentrifuga in azoto liquido per 3-5 s, quindi mettere il tessuto in una smerigliatrice per tessuti per la macinazione.
  5. Test a campione
    1. Utilizzare un saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per misurare il contenuto di PGF2α e PGE2 nei tessuti uterini dei campioni di ratto.
      NOTA: Il kit PGE 2 ELISA del ratto è stato utilizzato per misurare il contenuto di PGE 2 e il kit PGF 2α ELISA del ratto è stato utilizzato per misurare il livello di PGF2α. I passaggi dettagliati possono essere trovati nelle istruzioni del produttore. I dettagli del kit sono riportati nella tabella dei materiali.
    2. Valutare il campione di siero, l'estratto di CR e l'estratto di CRV utilizzando UPLC-MS / MS.
      1. Per UPLC, utilizzare una colonna C18 (2,6 μm, 2,1 mm x 100 mm) e un metodo a gradiente binario con fase mobile A contenente acido formico allo 0,1% e fase mobile B contenente acetonitrile. Impostare il gradiente di eluizione come segue: da 0 min a 1 min, 15% B; da 1 min a 8,5 min, dal 15% all'85% B; da 8,5 min a 11,5 min, 85% B; da 11,5 min a 11,6 min, dal 99% all'1% B; e da 11,6 min a 15 min, 15% B. Impostare la portata su 0,35 mL/min e il volume di iniezione su 2 μL.
      2. Per MS, impostare la temperatura su 600 °C, la portata del gas a tenda (CUR) su 0,17 MPa e la guaina e la portata del gas ausiliario su 0,38 MPa. Impostare la tensione di spruzzatura ionica del modo ione positivo e del modo ione negativo su 5,5 kV e -4,5 kV, rispettivamente, la tensione del potenziale di declustering (DP) su 80 V o -80 V, l'energia di collisione (CE) su 40 eV o -25 eV e la sovrapposizione dell'energia di collisione (CES) su 35 eV ± 15 eV.
      3. Eseguire il test seguendo il protocollo del produttore utilizzando UPLC-MS/MS. Eseguire MS per un intervallo di massa di 50-1.000 m/z.
      4. Ottenere i risultati UPLC-MS/MS utilizzando il programma workstation corrispondente in combinazione con l'acquisizione dipendente dalle informazioni della modalità di rilevamento, il filtro per difetti di massa multipli e la deduzione dinamica in background. Utilizzare i campioni di controllo qualità del siero aggregato per testare la ripetibilità e la stabilità delle apparecchiature UPLC-MS/MS per verificare l'approccio convenzionale. Prima dei campioni di ricerca, iniettare i campioni di controllo qualità per quattro cicli successivi e quindi iniettarli dopo ogni cinque campioni di siero.

3. Trattamento dei dati

  1. Preparazione dei dati
    1. Utilizzare il software di conversione per convertire i dati grezzi nel formato mzXML. Normalizzare i dati di corrente ionica totale (TIC) di ciascun campione.
      NOTA: un'applicazione interna basata su R (www.lims2.com) basata su XCMS è stata utilizzata per analizzare le informazioni per l'integrazione, l'allineamento, l'estrazione e il rilevamento dei picchi27.
    2. Eseguire l'annotazione dei metaboliti utilizzando un database MS2 proprietario (www.lims2.com). Impostare la soglia di annotazione su 0,328.
      NOTA: I metaboliti endogeni sono stati identificati in ciascun gruppo.
  2. Analisi delle componenti principali e analisi ortogonale parziale del discriminante del minimo quadrato
    1. Utilizzare il software di analisi per eseguire l'analisi dei componenti principali (PCA) e la modellazione. Importare i dati standardizzati dei metaboliti nel software di analisi. Utilizzare quindi l'adattamento automatico per compilare il modello di analisi. Infine, utilizzare il punteggio per ottenere il grafico a dispersione del punteggio della PCA.
      NOTA: Il raggruppamento di ciascun gruppo è stato ottenuto con il grafico a dispersione del punteggio della PCA. PCA è una modalità di analisi non supervisionata che raggruppa principalmente i campioni attraverso la riduzione dimensionale senza intervento.
    2. Utilizzare il software di analisi per eseguire l'analisi ortogonale parziale del discriminante del minimo quadrato (OPLS-DA).
      1. Importare i dati standardizzati sui metaboliti nei gruppi CR e CRV nel software di analisi.
      2. Importare i dati dal gruppo CR nel gruppo CR creato e importare i dati dal gruppo CRV nel gruppo CRV creato.
        NOTA: OPLS-DA è una modalità di analisi supervisionata ed è necessario raggruppare i campioni.
      3. Quindi, utilizzare l'adattamento automatico per creare il modello di analisi e utilizzare il punteggio per ottenere il grafico a dispersione del punteggio di OPLS-DA. Infine, utilizzare VIP per ottenere la significatività variabile nel valore di proiezione (VIP) nell'OPLS-DA.
        NOTA: La significatività variabile nei valori di proiezione (VIP) dei metaboliti nei gruppi CR e CRV è stata ottenuta attraverso l'OPLS-DA.
  3. Identificazione dei potenziali metaboliti differenziali
    1. Escludere i metaboliti con valori VIP superiori a 1 al punto 3.2.2.3.
    2. Utilizzare un software statistico per calcolare il valore P dei metaboliti che sono stati selezionati nel passaggio 3.3.1 dal test t di Student.
      NOTA: Differenze significative nei potenziali metaboliti differenziali nei gruppi CR e CRV sono state determinate da un test t di Student. I potenziali metaboliti differenziali erano quelli con un valore p del test t di Student < 0,05 e una significatività variabile nella proiezione (VIP) maggiore di 1. La rappresentazione è stata realizzata utilizzando un appezzamento vulcanico.
  4. Identificazione dei metaboliti differenziali
    1. Escludere i potenziali metaboliti differenziali nella fase 3.3. Utilizzare i risultati del punto 3.1.2 per identificare questi metaboliti differenziali.
      NOTA: È stato identificato un piccolo numero di potenziali metaboliti differenziali che sono diventati i metaboliti differenziali candidati.
    2. Escludere i metaboliti differenziali da abbinare nella banca dati KEGG. Mostra i cambiamenti nei metaboliti differenziali nei gruppi CR e CRV disegnando una mappa di calore.
      NOTA: Un piccolo numero di metaboliti differenziali candidati sono stati abbinati e sono diventati i metaboliti differenziali.
  5. Esame delle potenziali vie metaboliche
    1. Carica i diversi metaboliti nel database Metaboanalyst (www.metaboanalyst.ca).
    2. Utilizzare l'analisi dei percorsi per ottenere le potenziali vie metaboliche.
      NOTA: Le potenziali vie metaboliche sono state ottenute nei gruppi CR e CRV. Il valore P e il valore di impatto sono stati due indicatori molto importanti nella selezione dei percorsi critici. Il valore P era più importante del valore di impatto. La significatività era definita da un valore P < 0,05; Valori di impatto più elevati sono stati associati a migliori correlazioni.
    3. Analizzare le potenziali vie metaboliche caricando i diversi metaboliti nel database KEGG (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html).
      NOTA: Deve essere considerata anche la relazione tra la funzione della via metabolica e la malattia di Parkinson. Sono state ottenute le vie metaboliche critiche.
  6. Identificazione dei costituenti assorbiti nel sangue
    1. Identificare i costituenti chimici negli estratti CR e CRV utilizzando il database MS2 interno (www.lims2.com), il database del metaboloma umano (HMDB) e i database Massbank e Chemspider.
    2. Determinare i costituenti assorbiti nel sangue nei gruppi CR e CRV e confrontare i costituenti tra i gruppi CR e CRV.
      NOTA: I costituenti assorbiti nel sangue devono essere rilevati nei gruppi CR o CRV ma non possono essere rilevati nel gruppo di controllo.
  7. Analisi statistica
    1. Analizzare i dati utilizzando l'analisi univariata (UVA) e metodi statistici multivariati, tra cui l'analisi della varianza (ANOVA) e il test t di Student.
      NOTA: Le informazioni sperimentali sono state presentate utilizzando un software statistico come media ± deviazione standard (±SD). P < 0,01 era considerato una differenza altamente significativa e P < 0,05 rappresentava una differenza significativa28.

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Representative Results

Analisi dell'esperimento modello di dismenorrea
Non c'è stata alcuna risposta di contorsione entro 30 minuti nel gruppo di controllo perché questi ratti non sono stati iniettati per via intraperitoneale con ossitocina ed estradiolo benzoato per causare dolore. I ratti nei gruppi modello, CR e CRV hanno mostrato sostanziali reazioni di contorcersi dopo l'iniezione di ossitocina. Questi risultati dimostrano l'efficacia della combinazione di estradiolo benzoato e ossitocina per indurre dismenorrea. Le differenze nei livelli PGF 2α, PGE 2 e PGF2α/PGE 2 tra il modello e i gruppi di controllo erano significative (P < 0,001, P < 0,05), dimostrando l'efficacia del modello (Figura 1).

Figure 1
Figura 1: Il contenuto di PGF 2 α e PGE2 nel tessuto uterino e il numero di contorsioni in ciascun gruppo. (A) Il PGF2α contenuto nel tessuto uterino in ciascun gruppo. (B) Il contenuto di PGE2 nel tessuto uterino in ciascun gruppo. (C) Il contenuto di PGF 2 α / PGE2 nel tessuto uterino in ciascun gruppo. (D) Il numero di contorsione in ciascun gruppo. Le colonne rappresentano la media ± SEM di quattro gruppi (sei topi per gruppo). * P < 0,05 o ** P < 0,01 rappresentano una differenza significativa rispetto al gruppo modello, e Δ P < 0,05 o ΔΔ P < 0,01 rappresentano una differenza significativa rispetto al gruppo CR. I ratti nei gruppi modello, CR e CRV hanno mostrato una sostanziale reazione di contorsione dopo l'iniezione di ossitocina. Abbreviazioni: PG = prostaglandina; CR = rizoma di Cyperi; CRV = CR lavorato con aceto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Le concentrazioni di PGF 2α e PGF2α/PGE2 sono state ridotte nei gruppi CRV e CR, e questa riduzione è stata più marcata nel gruppo CRV. Ci sono state anche differenze significative (P < 0,001 e P < 0,05) nelle concentrazioni di PGF 2α e PGF2α / PGE2 tra i gruppi CRV e CR. Rispetto al gruppo modello, la concentrazione di PGE2 era significativamente maggiore nei gruppi CRV e CR (P < 0,001), con il livello che aumentava maggiormente nel gruppo CRV.

Controllo qualità
È stata osservata una buona corrispondenza tra i tempi di ritenzione dei picchi cromatografici BPC e le intensità del segnale nei campioni di controllo qualità, dimostrando un elevato livello di stabilità dello strumento e una qualità dei dati notevolmente costante (Supplementary File 1-Supplementary Figure 1 e Supplementary Figure 2). Inoltre, tutti i campioni di controllo qualità erano entro ±2 deviazioni standard (Figura 2A,B) e la correlazione tra i campioni di controllo qualità era maggiore di 0,7 (Figura 2C,D). Questi risultati suggeriscono che la procedura era affidabile e che i risultati erano credibili.

Figure 2
Figura 2: Distribuzione unidimensionale PCA-X dei campioni di controllo qualità. (A) modalità positiva, (B) modalità negativa; analisi di correlazione dei campioni di controllo qualità in modalità (C) positiva e (D) negativa. Tutti i campioni di controllo qualità erano entro ±2 deviazioni standard e le correlazioni tra i campioni di controllo qualità erano superiori a 0,7. Questi risultati hanno suggerito che la procedura era affidabile e le informazioni erano credibili. Abbreviazioni: PC = componente principale; PCA = analisi delle componenti principali; controllo qualità; CR = rizoma di Cyperi; CRV = CR lavorato con aceto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Analisi delle componenti principali
Come mostrato nella figura 3, il PC delle ascisse (1) indicava i punteggi dei primi componenti principali, mentre il PC di ordinate (2) indicava i punteggi dei secondi componenti principali. Nella figura, il cerchio verde indica il gruppo di controllo, il cerchio rosso rappresenta il gruppo di modelli, il cerchio blu indica il gruppo CR, il cerchio bianco indica il gruppo CRV e il cerchio rosa indica il gruppo di controllo qualità.

Figure 3
Figura 3: Grafico a dispersione del punteggio della PCA . (A) Modalità positiva e (B) Modalità negativa. I campioni di controllo qualità si sovrappongono, il che indica che lo strumento era molto stabile. Ogni gruppo è distribuito nella propria area, con solo il gruppo CR e il gruppo CRV che occasionalmente si incrociano. Abbreviazioni: PC = componente principale; PCA = analisi delle componenti principali; QC = controllo qualità; CR = rizoma di Cyperi; CRV = CR lavorato con aceto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

I risultati dell'analisi PCA hanno dimostrato che i cluster del CR e dei gruppi modello erano significativamente separati in entrambe le modalità di ioni positivi e negativi. I cluster sono stati significativamente separati tra il CRV e i gruppi modello nelle modalità di ioni positivo e negativo. I gruppi di controllo qualità, modello e controllo sono stati separati dagli altri gruppi di trattamento (CR, CRV). I gruppi CR e CRV occasionalmente si sovrapponevano in modalità ione positivo. Nella modalità ione negativo, ogni gruppo è stato separato in modo significativo.

Analisi discriminante del metodo dei minimi quadrati parziali ortogonali
OPLS-DA è stato utilizzato per lo screening delle differenze metaboliche. Il grafico a dispersione OPLS-DA ha mostrato che tutti i campioni erano all'interno dell'intervallo di confidenza del 95% (ellisse quadrata a T di Hotelling). Le figure 4A,C dimostrano che i gruppi CR e CRV erano separati. L'overfitting del modello è stato testato utilizzando il test di permutazione (n = 200) ed è stata valutata la significatività statistica del modello. Nella figura 4B,D, l'ordinata rappresenta il valore di R 2 Y oil valore Q2 e l'ascissa indica la conservazione della sostituzione. R 2Y è rappresentato dal punto verde, Q2 è rappresentato dal punto quadrato blu e le due linee tratteggiate rappresentano le corrispondenti linee di regressione. Nelle modalità positiva e negativa, i valori di R2 Y erano 0,8 e 0,84 e i valori Q2 erano rispettivamente -0,59 e -0,57. Ciò dimostra l'elevata affidabilità del modello e l'assenza di overfitting.

Figure 4
Figura 4: Modelli OPLS-DA per il gruppo CR rispetto al gruppo CRV. Grafico a dispersione del punteggio in (A) modalità positiva e (C) modalità negativa. Test di permutazione del modello OPLS-DA per il gruppo CR rispetto al gruppo CRV in modalità (B) positiva e (D) negativa. R 2Y era 0,8 e 0,84 e Q2 era -0,59 e -0,57 rispettivamente nelle modalità positiva e negativa. Ciò dimostra l'elevata affidabilità del modello e l'assenza di comportamento di overfitting. Abbreviazioni: OPLS-DA = analisi discriminante dei minimi quadrati parziali ortogonali; CR = rizoma di Cyperi; CRV = CR lavorato con aceto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Analisi statistica univariata
Sono state eseguite analisi statistiche univariate per identificare le variazioni metaboliche. Nell'ambito dello screening standard di VIP > 1 e P < 0,05, sono stati rilevati 339 e 394 potenziali metaboliti differenziali rispettivamente nelle modalità ionica positiva e negativa. Un grafico del vulcano è mostrato nella Figura 5, in cui ogni punto corrisponde a un metabolita diverso. L'ordinata mostra il valore P del test t di Student e l'ascissa riflette molteplici cambiamenti nel livello di ciascuna molecola nel gruppo. La dimensione di dispersione rappresenta il valore VIP del modello OPLS-DA; il valore VIP aumenta con la dimensione dello scatter. I punti rossi indicano un aumento, i punti blu indicano una diminuzione e il grigio non indica alcuna differenza significativa.

Un'analisi qualitativa dei metaboliti differenziali candidati è stata eseguita utilizzando la spettrometria di massa secondaria. Sono state osservate variazioni significative in 63 metaboliti in modalità positiva (Fascicolo supplementare 1-Tabella supplementare 1) e in 30 metaboliti in modalità negativa (File supplementare 1-Tabella supplementare 2). I metaboliti differenziali sono stati determinati utilizzando i database KEGG e HDMB. I composti accuratamente abbinati sono stati identificati come metaboliti differenziali, e questi sono elencati nella Tabella 3 e nella Tabella 4.

Figure 5
Figura 5: Grafico del vulcano per il gruppo CR rispetto al gruppo CRV . (A) Modalità positiva e (B) modalità negativa. Nel grafico del vulcano rappresentato, ogni punto corrisponde a un metabolita diverso. L'ordinata mostra il valore P del test t dello studente e l'ascissa riflette i molteplici cambiamenti in ciascuna sostanza nel gruppo. La dimensione dello scatter rappresenta il valore VIP del modello OPLS-DA. Il valore VIP aumenta con la dimensione dello scatter. I punti rossi indicano aumenti, i punti blu indicano diminuzioni e il grigio indica che non ci sono differenze significative. Abbreviazioni: OPLS-DA = analisi discriminante dei minimi quadrati parziali ortogonali; VIP = significato variabile nella proiezione; CR = rizoma di Cyperi; CRV = CR lavorato con aceto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Confronti dei metaboliti
È stata calcolata la matrice euclidea delle distanze dei valori quantitativi dei metaboliti differenziali tra i gruppi CR e CRV e i metaboliti differenziali sono stati raggruppati utilizzando un approccio di correlazione globale.

Le ascisse rappresentano diversi gruppi sperimentali, mentre l'ordinata rappresenta il livello relativo nella Figura 6. Il posizionamento delle macchie di colore indica come ciascun metabolita è espresso rispetto agli altri. Nella modalità ione positivo, rispetto al gruppo CR, i livelli di quattro metaboliti differenziali nel gruppo CRV sono aumentati, mentre i livelli di 11 metaboliti differenziali sono diminuiti. Nella modalità a ioni negativi, rispetto al gruppo CR, i livelli di quattro metaboliti differenziali nel gruppo CRV sono aumentati e i livelli di 7 metaboliti differenziali sono diminuiti.

Figure 6
Figura 6: Analisi della mappa di calore per il gruppo CRV rispetto al gruppo CR . (A) Modalità positiva e (B) modalità negativa. L'ascissa rappresenta i diversi gruppi sperimentali e l'ordinata rappresenta i relativi livelli di espressione. Il posizionamento delle macchie di colore indica come ciascun metabolita è espresso rispetto agli altri. Abbreviazioni: CR = Cyperi rizoma; CRV = CR lavorato con aceto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Rispetto al gruppo CR, i metaboliti che sono aumentati nel gruppo CRV sono stati sfingosina 1-fosfato, nobiletina, glicerofosfocolina, lysopc (18: 1 (9z)), acido 2-idrossi-6-pentadecilbenzoico, acido 9,10-epossiottadecenoico, acido 13s-idrossiottadecadienoico e 2-metossiestrone, mentre quelli che sono diminuiti sono stati corticosterone, acido indoleacetico, acido glicocolico, berberina, dibutilftalato, retinolo, leucotriene B4, prostaglandina J2, 21-idrossipregnenolone, zeranolo, omocisteina, acido propinoico, acido stearico, acido docosaesaenoico, fenilacetilglicina, L-fenilalanina, estrone glucuronide e acido citrico (Figura 7).

Figure 7
Figura 7: Andamento del livello relativo dei potenziali metaboliti nei gruppi CRV e CR. (A) Modalità positiva e (B) Modalità negativa. In modalità positiva, rispetto al gruppo CR, i livelli di quattro metaboliti differenziali sono aumentati nel gruppo CRV e i livelli di 11 sono diminuiti. In modalità negativa, i livelli di quattro metaboliti differenziali sono aumentati nel gruppo CRV e i livelli di sette metaboliti differenziali sono diminuiti. Le colonne rappresentano la media ± SEM di quattro gruppi (sei topi per gruppo). * P < 0,05, ** P < 0,01 o *** P < 0,01 rappresentano una differenza significativa tra i gruppi CRV e CR. Abbreviazioni: CR = Cyperi rizoma; CRV = CR lavorato con aceto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Analisi del percorso KEGG
I metaboliti differenziali sono stati annotati e sono stati analizzati i percorsi KEGG. I risultati hanno mostrato che i metaboliti differenziali erano associati a nove percorsi nelle modalità positiva e negativa, rispettivamente (Tabella 1 e Tabella 2). Nella Figura 8, le vie metaboliche sono rappresentate ciascuna da una bolla nel grafico a bolle, con una scala più significativa che indica un fattore di effetto maggiore. La dimensione del percorso che influenza i fattori nell'analisi topologica è rappresentata dalle ascisse del grafico a bolle e dalla dimensione della bolla. L'ordinata del grafico a bolle e il colore della bolla indicano il valore P dell'analisi di arricchimento (prendendo il logaritmo naturale negativo, cioè −ln (p)). Il grado di arricchimento è più significativo, il valore P è più piccolo, il valore di ordinata è più prominente e il colore è più scuro. Il valore P e il valore di impatto sono due indicatori molto importanti nella selezione dei percorsi critici. In genere, il valore P è più importante del valore di impatto.

Figure 8
Figura 8: Analisi del percorso per il gruppo CRV rispetto al gruppo CR . (A) Modalità positiva e (B) modalità negativa. Le vie metaboliche sono rappresentate da una bolla nel grafico a bolle. L'ascissa del grafico a bolle e la dimensione della bolla indicano la dimensione dei fattori che influenzano il percorso nell'analisi topologica. L'ordinata del grafico a bolle e il colore della bolla indicano il valore P dell'analisi di arricchimento. Le principali vie metaboliche includono la biosintesi degli acidi grassi insaturi e il metabolismo dell'acido linoleico. Abbreviazioni: CR = Cyperi rizoma; CRV = CR lavorato con aceto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

La Tabella 3 e la Tabella 4 mostrano le vie metaboliche con differenze significative: metabolismo della fenilalanina e metabolismo dell'acido linoleico, nonché la biosintesi degli acidi grassi insaturi, fenilalanina, tirosina e triptofano. Sebbene le vie metaboliche includessero la biosintesi degli ormoni steroidei, lo sfingolipide e il metabolismo dell'acido arachidonico, non c'erano differenze significative, che erano correlate alla dismenorrea. I risultati hanno mostrato che il metabolismo dell'acido linoleico e la biosintesi degli acidi grassi insaturi erano le vie metaboliche critiche associate alla maggiore efficacia del CRV.

Costituenti assorbiti nel sangue
Quindici costituenti e due prodotti del metabolismo dagli estratti CRV e CR sono stati rilevati nel siero di ratto nei gruppi CR e CRV (Tabella 5). Tutti i 17 componenti sono stati trovati in modalità ioni positivi.

I livelli costitutivi relativi nei campioni di sangue dei due gruppi sono stati confrontati utilizzando il test t dello studente. L'ascissa in Figura 9 mostra vari gruppi sperimentali; L'ordinata rappresenta il valore di risposta dello spettro di massa. C'erano due componenti con differenze significative. L'analisi ha mostrato che i livelli di questi due componenti erano elevati nel gruppo CRV rispetto al gruppo CR, mentre i livelli di 15 elementi non hanno mostrato cambiamenti significativi.

Figure 9
Figura 9: Costituenti assorbiti nel sangue per il gruppo CRV rispetto al gruppo CR. C'erano 15 costituenti e due prodotti del metabolismo dagli estratti CRV e CR nel siero di ratto nei gruppi CR e CRV. L'analisi ha mostrato che i livelli ematici di due componenti erano aumentati nel gruppo CRV rispetto al gruppo CR, mentre i livelli ematici di 15 componenti non hanno mostrato cambiamenti significativi. Tra questi, il livello di (-)-mirtenolo e acido [(1R,2S,3R,4R)-3-idrossi-1,4,7,7-tetrametilbiciclo[2.2.1]ep-2-il]acetico nel gruppo CRV era considerevolmente più alto che nel gruppo CR. * P < 0,05 o ** P < 0,01 rappresentano una differenza significativa tra il gruppo CRV e il gruppo CR. Abbreviazioni: CR = Cyperi rizoma; CRV = CR lavorato con aceto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Differenze metaboliche in modalità positiva. Abbreviazioni: KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; VIP = significato variabile nella proiezione; RT = tempo di conservazione. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Differenze metaboliche in modalità negativa. Abbreviazioni: KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; VIP = significato variabile nella proiezione; RT = tempo di conservazione. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Analisi delle vie metaboliche in modalità positiva. Abbreviazione: KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 4 Analisi delle vie metaboliche in modalità negativa. Abbreviazione: KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 5: Identificazione degli ingredienti prototipo e dei metaboliti nel siero di ratto. Nota: M1 e M2 sono metaboliti; Altri costituenti sono ingredienti prototipo. Clicca qui per scaricare questa tabella.

File supplementare 1: diagrammi BPC e cromatogramma MS2 dei costituenti assorbiti nel sangue di topi nudi. Diagrammi BPC di tutti i campioni di controllo qualità in modalità positiva e negativa; MS2 cromatogramma dei 17 costituenti assorbiti nel sangue dei ratti: D-canfene, (-)-mirtenolo, etilparabene, calamenene, α-cyperone, (+)-nootkatone, (1R,2S,3R,4R)-3-idrossi-1,4,7,7-tetrametilbiciclo[2.2.1]ep-2-il]acido acetico, acido 4-(2-(2.2.1)-bicicloeptilmetil)benzoico, 10,12-perossicalamenene, (1aS,10aR)-1a,5,9-trimetil-1a,3,6,10a-tetraidroossinero[4,5]ciclodeca[1,2-b]furan-10(2H)-one, pterosina D, acido terreciclico, acetato di sugeonile, 3-acetil-13-deossifomionome, isocurcumenolo, liguciperonolo, procurcumadiolo. Sono inclusi anche i metaboliti differenziali identificati dalla spettrometria di massa secondaria, nonché i database HDMB e KEGG, nelle modalità ioni positivo e negativo. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

A causa della grande varietà e della diversa natura dei TCM, queste erbe a volte non funzionano nella pratica clinica, e questo può essere dovuto alla lavorazione e al decotto inappropriati dei TCM. I meccanismi della MTC stanno diventando più evidenti con l'uso della scienza e della tecnologia contemporanee29,30. Questo studio mostra che sia la CR che la CRV hanno effetti terapeutici nei ratti modello PD e che l'effetto terapeutico del CRV è più sostanziale. Il meccanismo d'azione del CRV potrebbe essere correlato al fatto che la lavorazione dell'aceto può influenzare i costituenti della CR che vengono assorbiti nel sangue e potrebbe essere associata al metabolismo dell'acido linoleico e alla biosintesi degli acidi grassi insaturi. La figura 10 illustra i potenziali percorsi dell'azione del CRV nel sollievo dal dolore.

Figure 10
Figura 10: Meccanismi dell'effetto analgesico potenziato del CRV. I risultati hanno mostrato che 15 costituenti e due metaboliti sono stati trovati nel sangue. Tra questi, i livelli di (-)-mirtenolo e acido [(1R,2S,3R,4R)-3-idrossi-1,4,7,7-tetrametilbiciclo[2.2.1]ep-2-il]acetico nel gruppo CRV erano considerevolmente più alti rispetto al gruppo CR. Il CRV può ridurre il livello di prostanoidi della serie 2 e dei leucotrieni della serie 4 a base di ARA e ottenere effetti analgesici attraverso la modulazione del metabolismo dell'acido arachidonico, la biosintesi degli acidi grassi insaturi e il metabolismo dell'acido linoleico. Abbreviazioni: ARA = acido arachidonico; COX = cicloossigenasi; LA = acido linoleico; PUFA = acidi grassi polinsaturi; GLA =acido γ-linolenico; DGLA = diomo-γ-linolenico; PD = dismenorrea primaria; PG = prostaglandine; LT = leucotrieni; TX = trombossano; SDA = acido stearidonico; ETA = acido eicosatetraenoico; EPA = acido eicosapentaenoico; CR = rizoma di Cyperi; CRV = CR lavorato con aceto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Precauzioni durante l'esperimento
Poiché l'olio del componente efficace di CR è volatile, il tempo per estrarre il CR non deve superare i 20 minuti e, quando bolle, dovrebbe essere a fuoco basso con una temperatura non superiore a 60 ° C durante la concentrazione. Per garantire il successo dell'estrazione degli ingredienti efficaci, le erbe devono essere immerse in acqua per almeno 2 ore prima del decotto in modo che le erbe siano bagnate quando l'ammollo è completo. Durante la lavorazione CR, l'aceto deve essere ben miscelato con le erbe in modo che l'aceto possa penetrare completamente in esse. Se il volume dell'aceto è troppo basso per bagnare accuratamente le erbe, è possibile aggiungere una piccola quantità di acqua per diluire l'aceto, e quindi l'aceto può essere completamente miscelato con le erbe. Quando la miscelazione è completa, le erbe assorbiranno tutto l'aceto. Poiché l'aceto contiene acido acetico, la miscela non deve entrare in contatto con il ferro per evitare una reazione chimica.

Nell'esperimento sul ratto, la prima iniezione intraperitoneale di estradiolo benzoato viene somministrata il giorno 10, quindi viene somministrata la somministrazione intragastrica dell'estratto di CR o CRV e, infine, viene somministrata l'iniezione intraperitoneale di ossitocina. Dopo l'iniezione intraperitoneale di ossitocina, l'animale viene osservato per 30 minuti e il sangue viene immediatamente prelevato. Di solito, la concentrazione ematica raggiunge un picco entro 1 ora dopo la somministrazione intragastrica13, che è il momento migliore per prelevare sangue.

Nel determinare i campioni di estratto e siero mediante LC-MS/MS, essi devono essere determinati nello stesso lotto per garantire che il tempo di ritenzione dello stesso componente in campioni diversi sia coerente. In questo esperimento, l'identificazione dei componenti era un punto difficile. Sebbene un database relativamente maturo possa essere utilizzato per i metaboliti endogeni, non esisteva un database corrispondente per identificare i costituenti assorbiti nel sangue, quindi è necessario prestare maggiore attenzione nell'identificazione.

Differenze nei costituenti assorbiti nel sangue tra i gruppi CR e CRV
Per determinare il principio attivo della CR, questo esperimento ha studiato i costituenti assorbiti nel sangue nei ratti modello di dismenorrea. In questo esperimento, è stato riscontrato che 15 costituenti e due metaboliti nel sangue differivano tra i gruppi CR e CRV. Tra questi, i livelli di (-)-mirtenolo e acido [(1R,2S,3R,4R)-3-idrossi-1,4,7,7-tetrametilbiciclo[2.2.1]ep-2-il]acetico nel gruppo CRV erano considerevolmente più alti rispetto al gruppo CR, ma i livelli di altri componenti non erano significativamente diversi. L'acido (-)-mirtenolo e l'acido [(1R,2S,3R,4R)-3-idrossi-1,4,7,7-tetrametilbiciclo[2.2.1]epto-2-il]acetico sono terpenoidi e sono considerati i componenti efficaci del CRV.

Il liguciperonolo e il procurcumadiolo sono prodotti dall'ossidazione del α-cyperone e dell'isocurcumenolo, rispettivamente, e il α-cyperone ha un forte effetto analgesico. Il meccanismo d'azione proposto può ridurre l'espressione di COX-2 indotta da LPS e la sintesi di PGE2 attraverso la regolazione negativa del segnale NF-kB31. (+)-Nootkatone inibisce anche l'attività della COX-232,33. L'isocurcumenolo è il componente principale del rizoma Curcumae nel trattamento della dismenorrea3 e il suo metabolita procurcumadiol può avere un effetto analgesico. Rispetto al gruppo CR, il gruppo CRV ha mostrato livelli considerevolmente più elevati di (-)-mirtenolo, che ha un effetto analgesico34. Il possibile meccanismo d'azione potrebbe essere che i cambiamenti nell'espressione di COX-2 35 aumentano i livelli di citochine antinfiammatorie (IL-10, IFN-γ) e riducono i livelli di citochine pro-infiammatorie (TNF-α, IL-1β) livelli36. La lavorazione con aceto migliora i livelli dei principi attivi nel sangue, motivo per cui i prodotti prodotti con aceto sono più efficaci.

Differenze nelle vie metaboliche tra i gruppi CR e CRV
L'analisi del percorso ha mostrato percorsi metabolici significativamente diversi tra i gruppi CR e CRV, anche in termini di metabolismo della fenilalanina, biosintesi degli acidi grassi insaturi, biosintesi di fenilalanina, tirosina e triptofano e metabolismo dell'acido linoleico. Tuttavia, le vie metaboliche del metabolismo della fenilalanina e della biosintesi della fenilalanina, della tirosina e del triptofano non sono correlate al PD. Questi risultati mostrano che le vie metaboliche associate alla maggiore efficacia del CRV sono il metabolismo dell'acido linoleico e la biosintesi degli acidi grassi insaturi.

Gli acidi grassi insaturi includono due tipi: omega-3 e omega-637. Tre precursori di mediatori, tra cui l'acido eicosapentaenoico (20:5ω3; EPA), acido docosaesaenoico (22:5ω3; DHA) e acido arachidonico (20:5ω6; ARA), sono coinvolti nella biosintesi della via degli acidi grassi insaturi37,38. Il metabolismo EPA e ARA produce entrambi prostaglandine e leucotrieni sotto l'azione della COX. ARA produce prostanoidi serie 2, tra cui PGF 2 α, PGE 2, PGI 2 e trombossano (TXA 2, TXB 2), e leucotrieni di serie 4, tra cui leucotriene A 4 (LTA 4), leucotriene B 4 (LTB 4), leucotriene C 4 (LTC 4) e leucotriene D 4 (LTD 4). I prostanoidi della serie 3 includono la prostaglandina E 3 (PGE 3), la prostaciclina I 3 (PGI 3) e il trombossano A2 (TXA 3), e i leucotrieni della serie 5 includono il leucotriene A 5 (LTA 5), il leucotriene B 5 (LTB 5), il leucotriene C 5 (LTC 5) e il leucotriene D 5 (LTD 5), che sono in gran parte prodotti dall'EPA.

Il processo di trasformazione dell'EPA è lo stesso di quello dell'ARA ed è mediato da enzimi simili39. I prostanoidi della serie 2 e i leucotrieni della serie 4 hanno principalmente effetti pro-infiammatori, di aggregazione piastrinica e vasocostritzione. Al contrario, i prostanoidi della serie 3 e i leucotrieni della serie 5 mostrano effetti antinfiammatori, antipiastrinici e vasodilatatori38. TXA 2 e TXB2 sono prodotti da ARA, causando il restringimento dei vasi sanguigni. PGI 3, PGE3 e TXA3 derivati dall'EPAagiscono solo come vasodilatatori38,40. EPA e ARA competono per la conversione in PG da parte dell'enzima COX. Quando il rapporto EPA/AA di membrana è aumentato, gli eicosanoidi IGP 2 e TXA2, che promuovono l'aggregazione, possono essere trasformati in TXA 3 e PGI3, che promuovono l'antiaggregazione, con conseguenti effetti antinfiammatori e antiaggregatori40. Inoltre, l'uso combinato di EPA, DHA e acido linoleico (C18:2ω6; LIN) può ridurre il rilascio di PGF 2 α e PGE2 nell'endometrio bovino e nel trofoblasto41,42.

La malattia di Parkinson è probabilmente causata dalla produzione di PG e leucotrieni 43,44,45, in particolare PG 46. Nel frattempo, uno squilibrio in vasopressina, β-endorfine, estrogeni, progesterone, neurotrasmettitori, IL, ET-1 e NO può anche essere correlato alla dismenorrea47. Secondo i risultati ELISA, i livelli di PGF 2α e PGF2α / PGE 2 nel gruppo CRV sono diminuiti, mentre il livello di PGE 2 è aumentato rispetto al gruppo CR. Inoltre, il leucotriene B4 (C02165) e la prostaglandina J2 (C05957) erano più bassi nel gruppo CRV. Ciò indica che, nel gruppo CRV, c'erano livelli più bassi di prostanoidi della serie 2 a base di ARA, incluso PGF2α, che è il fattore più importante per la dismenorrea. La terapia con PGE 2 ad alte concentrazioni dilata i vasi sanguigni e PGE2 causa vasocostrizione a basse concentrazioni48. Pertanto, l'utero è rilassato con la vasodilatazione e la dismenorrea è alleviata.

Poiché il corpo umano non può sintetizzare una quantità sufficiente di acidi grassi insaturi C18, l'acido linoleico e l'acido α-linolenico, che sono l'unica fonte di acidi grassi insaturi C18, sono molto importanti38. L'acido linoleico e l'acido α-linolenico sono la fonte del metabolismo degli acidi grassi insaturi omega-6 e omega-3, rispettivamente. In particolare, il precursore della sintesi delle prostaglandine è l'ARA e l'ARA è sintetizzato dall'acido linoleico49. L'acido linoleico è un precursore e da esso vengono sintetizzati una serie di metaboliti, tra cui ARA, prostaglandine (PGF 2 α, PGE 2), prostaciclina (PGI 2) e trombossano (TXA 2) 50. L'acido linoleico è strettamente correlato all'effetto analgesico potenziato del CRV. Inoltre, la via metabolica della biosintesi degli ormoni steroidei può produrre progesterone 51,52,53 e sfingosina-1-fosfato (C06124), che sono prodotti dalla via metabolica del metabolismo degli sfingolipidi, inducono COX-2 e producono PGE2 attraverso TNF54,55,56,57. Questi possono anche essere correlati al PD.

Ci sono alcune limitazioni al protocollo. Sono stati confrontati solo i livelli relativi dei costituenti e il campione standard non è stato utilizzato per quantificare i costituenti nell'erba e quelli assorbiti nel sangue. Le feci e l'urina dei ratti non sono state raccolte negli esperimenti sugli animali, con conseguente scoperta di un minor numero di metaboliti di CR in vivo. Gli esperimenti di convalida dovrebbero confermare ulteriormente il meccanismo scoperto dall'analisi metabonomica.

La strategia e il protocollo utilizzati in questo studio hanno evitato la cecità nello studio dei componenti chimici in vitro e lo studio unilaterale dei singoli componenti in vivo. Pertanto, era molto adatto per l'esplorazione del meccanismo. La strategia può far risparmiare molto tempo e lavoro e può identificare con precisione i costituenti critici e il meccanismo per l'efficacia terapeutica.

In questo studio, è stato riscontrato che c'erano 15 costituenti e due metaboliti nel sangue. Tra questi, i livelli di (-)-mirtenolo e acido [(1R,2S,3R,4R)-3-idrossi-1,4,7,7-tetrametilbiciclo[2.2.1]ep-2-il]acetico sono aumentati significativamente nel gruppo CRV rispetto al gruppo CR, dimostrando che la lavorazione con aceto può aumentare i livelli dei principi attivi nel sangue. Dopo che la CR è stata elaborata con aceto, i livelli di prostanoidi della serie 2 e dei leucotrieni della serie 4 con proprietà pro-infiammatorie, aggregazione piastrinica e vasocostrizione sono diminuiti, tra cui PGF2α, leucotriene B4 e prostaglandina J2. Questo può essere il meccanismo attraverso il quale CRV dimostra un effetto analgesico potenziato.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Commissione municipale per la salute e la pianificazione familiare di Chongqing Progetto di scienza e tecnologia della medicina cinese (numero di progetto: ZY201802297), Progetto generale della Fondazione di scienze naturali di Chongqing (Numero progetto: cstc2019jcyj-msxmX065), Piano di team building per l'innovazione del sistema di innovazione del sistema di innovazione della zona montuosa moderna di Chongqing 2022 [10] e Progetto di costruzione della disciplina chiave della Commissione sanitaria municipale di Chongqing di Chinese Materia Elaborazione Medica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile  Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 197164
BECKMAN COULTER Microfuge 20 Beckman Coulter, Inc. MRZ15K047
Estradiol benzoate Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd C10042616
formic acid Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 177799
LC 30A system Shimadzu, Kyoto, Japan 228-45162-46
Olive oil Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd H25A11P111909
Oxytocin synthetic Zhejiang peptide biology Co., Ltd  2019092001
Rat PGF2α ELISA kit Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd 202101
Rat PGFE2 ELISA kit Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd EDL202006217
SPF Sprague-Dawley rats Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd Certificate number SCXK (Hunan) 2019-0004
Tecan Infinite 200 PRO   Tecan Austria GmbH, Austria 1510002987
Triple TOF 4600 system SCIEX, Framingham, MA, USA BK20641402
water Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 152720

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Ritrattazione numero 190
Analisi di campioni di rizoma di Cyperi grezzi e lavorati mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem in ratti con dismenorrea primaria
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Chen, Y., Li, N., Wang, D., Fan, J., … More

Chen, Y., Li, N., Wang, D., Fan, J., Chu, R., Li, S. Analysis of Raw and Processed Cyperi Rhizoma Samples Using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry in Rats with Primary Dysmenorrhea. J. Vis. Exp. (190), e64691, doi:10.3791/64691 (2022).

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