Summary
Здесь мы описываем рабочий процесс протеомики для характеристики протеома клеточной поверхности различных типов клеток. Этот рабочий процесс включает обогащение белков клеточной поверхности, последующую подготовку образцов, анализ с использованием платформы ЖХ-МС/МС и обработку данных с помощью специализированного программного обеспечения.
Abstract
За последнее десятилетие протеомика на основе масс-спектрометрии позволила провести углубленную характеристику биологических систем в широком спектре приложений. Протеом клеточной поверхности («поверхностный») при заболеваниях человека представляет значительный интерес, поскольку белки плазматической мембраны являются основной мишенью большинства клинически одобренных терапевтических средств, а также ключевой функцией, с помощью которой можно диагностически отличать больные клетки от здоровых тканей. Тем не менее, целенаправленная характеристика мембранных и поверхностных белков клетки остается сложной, в первую очередь из-за сложности клеточных лизатов, которые маскируют интересующие белки другими белками с высоким содержанием. Чтобы преодолеть этот технический барьер и точно определить протеом клеточной поверхности различных типов клеток с помощью масс-спектрометрической протеомики, необходимо обогатить лизат клетки белками клеточной поверхности перед анализом на масс-спектрометре. В этой статье представлен подробный рабочий процесс маркировки белков клеточной поверхности раковых клеток, обогащения этих белков из клеточного лизата и последующей подготовки образцов для масс-спектрометрического анализа.
Introduction
Белки служат основными единицами, с помощью которых осуществляется большинство клеточных функций. Характеристика структуры и функции соответствующих белков является важным шагом для понимания биологических процессов. За последнее десятилетие достижения в области технологии масс-спектрометрии, программного обеспечения для анализа и баз данных позволили точно обнаруживать и измерять белки в масштабе всегопротеома1. Протеомика на основе масс-спектрометрии может быть использована в самых разных приложениях, от фундаментального научного анализа биохимических путей до идентификации новых мишеней для лекарств в трансляционных условиях, диагностики и мониторинга заболеваний в клинике2. При скрининге новых мишеней для лекарств характеристика протеома клеточной поверхности особенно важна, поскольку более 65% одобренных в настоящее время лекарств для человека нацелены на белкиклеточной поверхности 3. Область иммунотерапии рака также полностью полагается на специфические для рака клеточные поверхностные антигены для нацеливания и специфического уничтожения опухолевых клеток4. Таким образом, протеомика на основе масс-спектрометрии может служить многообещающим инструментом для идентификации новых белков клеточной поверхности для терапевтических вмешательств.
Тем не менее, существует несколько ограничений при использовании традиционных методов протеомики для исследования опухолевых клеток на предмет новых белковых мишеней клеточной поверхности. Основная проблема заключается в том, что поверхностные белки составляют очень небольшую долю от общего количества белковых молекул в клетке. Поэтому фрагменты этих белков маскируются высоким содержанием внутриклеточных белков при проведении масс-спектрометрического анализа цельноклеточного лизата5. Это ограничение затрудняет точную характеристику протеома клеточной поверхности с помощью традиционного рабочего процесса протеомики. Чтобы решить эту проблему, необходимо разработать способы обогащения белков клеточной поверхности из цельноклеточного лизата перед анализом на масс-спектрометре. Один из таких методов включает окисление и мечение биотином гликозилированных белков клеточной поверхности в интактных клетках и последующее обогащение этих биотинилированных белков из лизата с помощью вытягивания нейтравидина, процесс, который был назван «захватом клеточной поверхности»6. Поскольку считается, что ~ 85% белков поверхности клеток млекопитающих гликозилированы7, это служит эффективным методом обогащения протеома клеточной поверхности из всего клеточного лизата. В этой статье описывается полный рабочий процесс, начиная с культивируемых клеток, маркировки биотина на клеточной поверхности и последующей подготовки образцов для масс-спектрометрического анализа (рис. 1). В течение нескольких реплик этот метод обеспечивает надежное покрытие протеома клеточной поверхности конкретного образца. Использование этого метода для характеристики протеома клеточной поверхности как опухолевых, так и здоровых клеток может способствовать открытию новых антигенов клеточной поверхности для идентификации потенциальных иммунотерапевтических мишеней8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки плазмоцитомы AMO1 были использованы для этого эксперимента с протеомом клеточной поверхности. Тот же протокол может быть использован и для других типов клеток, включая широкий спектр суспензионных и адгезивных клеточных линий9, а также различных типов первичных образцов10. Однако количество клеток (исходный материал для эксперимента) обычно должно быть оптимизировано для эквивалентного покрытия протеома. Подробную информацию о материалах и оборудовании см. в таблице материалов. Подробную информацию о буферах и растворах реагентов и их составе см. в таблице 1.
1. Маркировка клеточной поверхности биотином
- Подсчитайте культивируемые клетки и гранулы примерно 3,5 × 107 живых клеток центрифугированием (5 мин при 500 × г, 24 °C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки плазмоцитомы AMO1 проходили через свежую среду каждые 3 дня перед сбором. - Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу, добавив 1 мл холодного (4 °C) фосфатно-буферного физиологического раствора Дульбекко (D-PBS) (без кальция, без магния) и осторожно пипеткой вверх и вниз.
- Снова измельчите ячейки (как на шаге 1.1) и повторите этап промывки (шаг 1.2) еще раз (всего две стирки).
- После второй промывки гранулируйте ячейки (как на шаге 1.1) и ресуспендируйте их в 990 мкл холодного D-PBS путем осторожного пипетирования.
- Заранее приготовьте исходный раствор 160 мМ метапериодата натрия (NaIO4). Разделить на аликвоты по 50 мкл и хранить при температуре -20 °C до 6 месяцев. Добавьте 10 мкл 160 мМ раствора метапериодата натрия в клеточную суспензию на этапе 1.4, тщательно перемешайте и инкубируйте на сквозном роторе в течение 20 мин при 4 °C.
- После завершения инкубации гранулируют клетки (как на этапе 1.1), декантируют надосадочную жидкость и ресуспендируют в 1 мл холодного D-PBS. Повторите этот этап стирки дважды (всего три стирки). После третьей промывки ресуспендируют клетки в 989 мкл D-PBS.
- Заранее приготовьте исходный раствор 100 мМ гидразида биоцитина. Разделить на аликвоты по 50 мкл и хранить при температуре -20 °C до 6 месяцев. Добавьте 1 мкл анилина и 10 мкл 100 мМ гидразида биоцитина в клеточную суспензию на этапе 1.6, тщательно перемешайте и инкубируйте на сквозном роторе в течение 60 мин при 4 ° C.
- После завершения инкубации гранулируют клетки (как на этапе 1.1), декантируют надосадочную жидкость и ресуспендируют в 1 мл холодного D-PBS. Повторите этот этап стирки дважды (всего три стирки).
- После третьей промывки тщательно аспирируйте надосадочную жидкость пипеткой и заморозьте гранулу ячейки, поместив пробирку в жидкость N2. Поместите замороженные гранулы при -80 ° C до тех пор, пока они не будут готовы приступить к лизису и вытягиванию.
2. Лизис клеток и вытягивание биотина
- Разморозьте замороженную клеточную гранулу на льду.
- Добавьте в гранулу 500 мкл 2-кратного буфера для лизиса, тщательно перемешайте и перемешивайте в течение 30 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для полного лизиса гранул может потребоваться энергичное пипетирование и вихревое движение. Некоторый нерастворимый мусор (т.е. ДНК) является приемлемым, так как он удаляется на последующем этапе обработки ультразвуком. - Ультразвуком лизат клетки на льду (три всплеска по 20 с каждый, 60% рабочего цикла).
- Центрифугируйте лизат для гранулирования остатков мусора (10 мин при 17 200 × г при 4 °C).
- Во время центрифугирования лизата добавьте 100 мкл гранул нейтравидин-агарозной смолы в фильтрационную колонну. Прикрепите колонку к вакуумному коллектору, примените мягкий вакуум и промойте шарики, нанеся на них 3 мл промывочного буфера 1.
- Снимите фильтрационную колонну с вакуумного коллектора, закройте дно и добавьте лизат осветленных клеток в колонку с шариками. Закройте верхнюю часть колонны и инкубируйте лизат с шариками на сквозном роторе в течение 120 минут при 4 ° C.
ПРИМЕЧАНИЕ: При закрытии верхней части колонны крепко удерживайте нижнюю крышку на месте, иначе она может сместиться, и лизат клетки может вытечь во время инкубации. - Приготовьте промывочные буферы 1, 2 и 3 (приблизительно 5 мл каждого моющего буфера на образец, см. Таблицу 1) и поместите их на водяную баню с температурой 42 °C
- После того, как лизат закончит инкубацию, поместите фильтрационную колонну обратно в вакуумный коллектор, примените мягкий вакуум и промойте шарики, нанеся на них 5 мл промывочного буфера 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для стирки можно использовать более 5 мл буферов для стирки; Дополнительная стирка может уменьшить фоновое, неспецифическое сцепление с бусинами. - Повторите этап стирки с 5 мл буфера для стирки 2.
- Повторите этап стирки с 5 мл буфера для стирки 3.
- После того, как последний буфер для промывки полностью пройдет через шарики, снимите колонну с коллектора. Добавьте 100 мкл раствора «Лизе» в шарики и перенесите их в микроцентрифужную пробирку с низким содержанием белка объемом 1,7 мл с помощью пипетки. Ненадолго покрутите трубку, чтобы шарики осели, и удалите 50 мкл раствора, не нарушая осевшие шарики.
ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты на этом этапе и на всех последующих этапах используют коммерчески доступный набор для протеомной пробоподготовки. Комплект обеспечивает оптимизированный и упрощенный рабочий процесс пробоподготовки. Однако эти этапы также могут быть выполнены независимо от набора, используя традиционный рабочий процесс протеомики, как описано в Verma et al.9. Если бусины остаются прилипшими к боковой или нижней части колонны, дайте шарикам, которые были перенесены в трубку, оседать, и используйте дополнительный раствор «Lyse» в трубке, чтобы перенести оставшиеся бусины. - Поместите трубку на нагревательный блок/шейкер при температуре 65 °C и встряхивайте при 1,000 об/мин в течение 10 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап необходим для восстановления и алкилирования остатков цистеина перед пищеварением.
3. Переваривание белка
- Ресуспендировать высушенный трипсин (пробирка «Дайджест» в наборе, хранится при -20 °C), добавив 210 мкл раствора «Ресуспендирования». Пипетите раствор вверх и вниз несколько раз, чтобы убедиться, что весь высушенный трипсин ресуспендирован.
- После завершения инкубации добавьте 50 мкл ресуспендированного раствора трипсина в шарики. Инкубируют пробирку при 37 °C, встряхивая при 500 об/мин не менее 90 мин, чтобы переварить белок.
- После завершения разложения перенесите раствор, содержащий шарики, в спиновую колонну и вставьте колонку в микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл с низким связыванием белка. Отжимают пробирку (500 × г в течение 5 мин при комнатной температуре [RT]), чтобы отделить расщепленный пептидный раствор от шариков.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе обработка PNGase может быть выполнена на шариках после их отделения от пептидного раствора для элюирования биотинилированных пептидных фрагментов из шариков стрептавидина. Затем этот пептидный образец может быть перенесен на оставшуюся часть рабочего процесса в виде отдельного вторичного пептидного образца, который можно анализировать и сравнивать с первичным образцом трипсинизации на шарике. Подход PNGase, вероятно, предоставит дополнительные данные о трипсинизации на шариках, учитывая дополнительную специфичность для захваченных N-гликозилированных аспарагинов на основе MS-обнаруживаемой модификации боковой цепи12. Однако недостатком этого подхода с последовательным элюированием является требование удвоенного увеличения времени прибора масс-спектрометра на анализ образца. - Добавьте 100 мкл раствора «Стоп», чтобы остановить реакцию пищеварения и подкислить раствор пептида.
4. Обессоливание пептидов
- Используя адаптер для пробирки, поместите обессоливающую колонку в микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл с низким связыванием белка. Добавьте в колонку весь подкисленный раствор пептида. Открутите колонку (3 800 × г в течение 3 мин) так, чтобы раствор вытек через колонну. Пептиды теперь связаны с колонкой; Откажитесь от проточного потока.
- Добавьте в колонку 200 мкл раствора «Wash 1» и отжимайте (3 800 × г в течение 3 мин, RT). Откажитесь от проточной части.
- Добавьте в колонку 200 мкл раствора «Wash 2» и отжимайте (3 800 × г в течение 3 мин, RT). Откажитесь от проточной части.
- Перенесите колонку в новую, помеченную микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл с низким связыванием белка. Добавьте в колонку 100 мкл раствора «Элюте» и отжимайте (3 800 × г в течение 3 мин, RT). Добавьте в колонку еще 100 мкл раствора «Элюте» и отжимайте (3 800 × г в течение 3 мин, RT). Пептиды теперь элюируются из колонки в пробирку.
- Поместите раствор пептида в вакуумную центрифугу и дайте ему высохнуть в течение ночи. Поместите высохшие пептиды при -80 ° C до готовности к количественному определению и проанализируйте на масс-спектрометре.
5. Ресуспендирование пептидов и количественное определение
- Ресуспендировать высушенные пептиды в 20 мкл растворителя А (0,1% муравьиной кислоты, 2% ацетонитрила).
- Центрифугируют ресуспендированные пептиды (17 200 × г в течение 10 мин) для гранулирования нерастворимого мусора.
- Подготовьте стандарты пептидов для количественного анализа колориметрических пептидов.
- Поместите 5 мкл 1,000 мг / мл исходного раствора пептида в одну лунку 96-луночного планшета.
- Выполните семиступенчатое последовательное разведение в пластине деионизированной (DI) водой следующим образом: по 5 мкл каждого стандарта на лунку: 1000 мг/мл, 500 мг/мл, 250 мг/мл, 125 мг/мл, 62,5 мг/мл, 31,25 мг/мл и 15,625 мг/мл. Поместите 5 мкл деионизированной воды в восьмую лунку для заготовки.
- Поместите 4 мкл деионизированной воды в три отдельные скважины 96-луночной плиты. Добавьте 1 мкл ресуспендированного раствора пептида в каждую лунку, чтобы получить общий объем 5 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: При пипетировании пептидного раствора для количественного определения осторожно пипетируйте сверху раствора, чтобы не нарушить осевший мусор. - Рассчитайте, сколько рабочего реагента необходимо (45 мкл на скважину). Подготовить необходимый объем колориметрического пробного рабочего реагента; Вихревите рабочий реагент, чтобы обеспечить правильное смешивание компонентов.
- Добавьте по 45 мкл рабочего реагента в каждую из стандартных и пробоотборных лунок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте стандарты в двух экземплярах и используйте многоканальную пипетку, чтобы обеспечить минимальную разницу во времени добавления реагента в скважины. - Накройте пластину алюминиевой фольгой и выдерживайте при 37 °C в течение 15 минут.
- Проанализируйте пластину на автоматическом считывателе пластин. Используйте значения поглощения, записанные для стандартных образцов, чтобы построить линейную стандартную кривую. Определите уравнение стандартной кривой и значение R2 . Если значение R2 является разумным (≥0,95), используйте стандартную кривую для определения концентрации ресуспендированных пептидов с учетом пятикратного разведения в колориметрической тестовой пластине.
6. Жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия (ЖХ-МС/МС) анализ расщепленных пептидов
- Отрегулируйте концентрацию образцов пептидов до 0,2 мкг/мкл, добавив растворитель А, и перенесите 10 мкл в пробирку с низким связыванием белка объемом 0,6 мл.
- Поместите трубку в автоподатчик LC.
- Установите параметры LC и MS/MS в соответствии с рисунками 2 и 3.
- Введите 5 мкл (1 мкг) образца пептида в установку ЖХ-МС/МС для анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенные здесь настройки LC-MS/MS являются репрезентативными только для иллюстраций. В зависимости от наличия приборов LC и MS пользователи могут изменять настройки градиента LC и параметров MS/MS для получения глубокого покрытия протеома. Для этой статьи анализ данных MS был выполнен с использованием MaxQuant https://www.maxquant.org/, вторичный анализ данных был выполнен с использованием Perseus https://maxquant.net/perseus/, а анализ путей с использованием https://reactome.org/.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для этого эксперимента мы охарактеризовали протеом клеточной поверхности опухолевой клеточной линии, пометив N-гликозилированные мембранные белки интактных клеток биотином и обогатив эти меченые белки из всего клеточного лизата с помощью вытягивания нейтравидина (рис. 1). Кроме того, мы провели анализ протеома с использованием ЖХ-МС / МС для характеристики обогащенных белков клеточной поверхности. В отличие от анализа протеома всей клетки, здесь цель состояла в том, чтобы охарактеризовать только белки клеточной поверхности. Следовательно, мы начали с ввода образца из 3,5 ×10 7 клеток плазмоцитомы АМО-1. Мы получили конечную концентрацию пептида ~ 630 нг / мкл на основе количественного анализа колориметрического пептида, а общий выход составил ~ 12,6 мкг пептидов (в 20 мкл) (рис. 2A). Затем мы ввели 1 мкг образца пептида в систему ЖХ-МС / МС и повторили инъекцию три раза для технических повторений. Используемые параметры LC и MS были оптимизированы на основе предыдущих экспериментов (рис. 2C и рис. 3A). Мы использовали длинный градиент LC продолжительностью 4 часа, чтобы обеспечить максимальное покрытие.
Данные ЖХ-МС/МС анализировались с помощью MaxQuant; Мы смогли идентифицировать 2 221 белок, по крайней мере, с одним уникальным пептидом, и 1 764 белка, по крайней мере, с двумя уникальными пептидами во всех трех репликах. Всего было идентифицировано 12 307 уникальных пептидов. Мы определили обогащение белка клеточной поверхности в образце с помощью скрипта Python (точный сценарий, который мы использовали, можно найти на дополнительном рисунке S1), который сравнивает результаты, полученные от MaxQuant, с несколькими установленными наборами данных белков клеточной поверхности. Эти наборы данных включают ранее описанный «in silico surfaceome»3 и набор данных, созданный из белков, аннотированных как мембранно-локализованные в UniProt13 (наборы данных доступны в дополнительной таблице S1). Этот анализ дал 601 поверхностный белок в нашей выборке (примерно 27% всех идентифицированных белков) (рис. 4A). Была выполнена онтологическая аннотация генов (http://geneontology.org/), которая показала, что примерно 30% белков канонически локализованы в плазматической мембране. Анализ пути реактома (https://reactome.org/) также показал относительное обогащение мембранных белков, участвующих в трансмембранном транспорте и взаимодействиях клеточной поверхности (рис. 5 и дополнительная таблица S2).
Рисунок 1: Рабочий процесс маркировки поверхности клеток и последующей подготовки образцов для масс-спектрометрического анализа. Во-первых, белки на поверхности желаемого клеточного образца помечаются биотином. Затем эти клетки лизируют с последующей инкубацией с гранулами нейтравидина, которые связывают белки, меченные биотином. Затем шарики многократно промывают, чтобы удалить внутриклеточные белки и другие загрязнения. Затем образец белка подвергается расщеплению с добавлением трипсина. Полученный образец пептидных фрагментов затем подвергается обессоливанию для удаления загрязнений с этапов промывки и сбраживания. Затем окончательный образец пептида высушивают и готовы к масс-спектрометрическому анализу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Стандартная кривая количественного определения колориметрического пептида и градиент LC. (A) Восьмиточечная стандартная кривая, полученная с помощью колориметрического анализа количественного определения пептидов, используемого для определения концентрации пептидов в обработанных образцах. В) Иллюстрация системы ЖХ-МС/МС, используемой для обработки проб. (C) Градиент жидкостной хроматографии и скорость потока, используемые для впрыска образцов в масс-спектрометр. Сокращения: ЖХ-МС/МС = жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Параметры масс-спектрометрии и репрезентативная хроматограмма . (A) Параметры, использованные для этого эксперимента с использованием масс-спектрометра Orbitrap. (B) Репрезентативная хроматограмма, полученная с помощью масс-спектрометрического анализа по протоколу «захвата клеточной поверхности» для градиента 4 часа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Анализ обогащения белками клеточной поверхности и сравнение технических репликатов. Эти наборы данных включают ранее зарегистрированный «in silico surfaceome»3 и набор данных, созданный из белков, аннотированных как мембранно-локализованные в UniProt13. (A) Количество белков и пептидов, идентифицированных с другим пороговым значением после удаления загрязняющих веществ, обратных белков и q-значения > 0,05. (B) График представляет собой распределение идентифицированного белка и оценкиAndromeda 14. (C) Точечная диаграмма иллюстрирует корреляцию между выборками. Ранговая корреляция Спирмена измеряет силу и направление связи между двумя ранжированными переменными. (D) Блочные диаграммы, изображающие вариации от пробега к прогону. (E) График распределения по выборкам, отражающий качество данных репликатов. Аббревиатура: LFQ = количественное определение без меток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Анализ путей. Анализ путей проводился с использованием Reactome версии 8222. Иллюстративное изображение взаимодействий клеточной поверхности на сосудистой стенке, демонстрирующее обогащение протеома клеточной поверхности для ключевых взаимодействий, участвующих во взаимодействии тромбоцитов и лейкоцитов с эндотелием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Название реагента | Состав | Хранение | |||||
| 100 мМ гидразид биоцитина | порошкообразная форма биоцитина гидразида, растворенного в ДМСО | Разделить на аликвоты по 50 мкл и хранить при температуре -20 °C до 6 месяцев. | |||||
| 160 мМ метапериодат натрия (NaIO4) | твердый NaIO4 , растворенный в деионизированной воде | Разделить на аликвоты по 50 мкл и хранить при температуре -20 °C до 6 месяцев. | |||||
| 2x буфер для лизиса RIPA | 2x буфер для лизиса RIPA, 1,25 мМ ЭДТА, одноразовый коктейль ингибитора протеазы | Готовьте свежий каждый раз перед использованием 10-кратного буфера для лизиса RIPA. | |||||
| Рабочий реагент для пептидного колориметрического анализа | 50% Реагент А, 48% Реагент В, 2% Реагент С | Готовьте свежий каждый раз перед употреблением. Храните компоненты при температуре 4 °C. | |||||
| Растворитель А | 0,1% муравьиной кислоты, 2% ацетонитрила | Можно приготовить заранее и хранить при комнатной температуре | |||||
| Буфер для стирки 1 | 1x буфер для лизиса RIPA, 1 мМ ЭДТА | Можно заранее подготовить большую партию и хранить при комнатной температуре | |||||
| Буфер для стирки 2 | 1x PBS, 1 M NaCl | Можно заранее подготовить большую партию и хранить при комнатной температуре | |||||
| Буфер для стирки 3 | 2 М мочевины, 50 мМ бикарбоната аммония | Готовьте каждый раз свежим, так как мочевина со временем быстро разлагается. | |||||
Таблица 1: Буферы и растворы реагентов, используемые в этом протоколе.
Дополнительный рисунок S1: Скрипт Python для сравнения результатов, полученных с помощью MaxQuant, с несколькими установленными наборами данных белков клеточной поверхности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица S1: Наборы данных белков клеточной поверхности. Эти наборы данных включают ранее зарегистрированный «in silico surfaceome»3 и набор данных, созданный из белков, аннотированных как мембранно-локализованные в UniProt13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица S2: Здесь представлены 10 наиболее релевантных путей (отсортированных по значению p ). Сокращения: FDR = частота ложных обнаружений; SLC = носитель растворенного вещества; TCR = рецептор Т-клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протеомика на основе масс-спектрометрии является мощным инструментом, который позволил объективно охарактеризовать тысячи неизвестных белков в ранее невозможном масштабе. Этот подход позволяет нам идентифицировать и количественно оценить белки, а также получить ряд сведений о структурных и сигнальных способностях клеток и тканей, характеризуя разнообразие белков, присутствующих в конкретном образце. Выходя за рамки глобального профилирования белков в образце, масс-спектрометрия позволяет нам охарактеризовать различные посттрансляционные модификации (PTM) этих белков, обеспечивая еще более глубокое представление о стадиях сигнальных путей и динамики белков, недоступных при анализе на уровне ДНК или РНК1. На пути к разработке новых методов лечения рака протеомика на основе масс-спектрометрии позволяет нам сравнивать белковый профиль злокачественных опухолевых клеток со здоровыми тканями, чтобы идентифицировать потенциальные лекарственные мишени.
Быстро растущая область иммунотерапии рака опирается на антигены, экспрессируемые на поверхности злокачественных клеток, для выявления и избирательного уничтожения опухолей. Поскольку разработка новых иммунотерапий рака ограничена отсутствием уникальных специфических для рака антигенов, которые отсутствуют в здоровых тканях, крайне важно идентифицировать больше новых антигенов, специфичных для опухолевых клеток15. Опухолевые специфические антигены не обязательно должны быть цельными белками, уникальными для опухолевой клетки, но также могут быть специфическими белковыми конформациями или PTM, отсутствующими в здоровых тканях16,17. Протеомный анализ белков клеточной поверхности как на опухолевых, так и на здоровых клетках может дать новые мишени для специфических для рака антигенов. Протеомика клеточной поверхности требует обогащения поверхностных белков из цельноклеточного лизата перед масс-спектрометрическим анализом, чтобы уменьшить сложность образца и избежать ионного подавления желаемых мембранных белков (часто с низким содержанием) высокоэкспрессируемыми внутриклеточными белками18. В то время как используемая здесь стратегия захвата клеточной поверхности является одним из наиболее часто используемых подходов к обогащению для протеомики клеточной поверхности, существуют и другие методы обогащения белка клеточной поверхности, которые были интегрированы с рабочим процессом масс-спектрометрии, включая селективное ультрацентрифугирование клеточных мембран, мечение поверхностных лизинов NHS-биотином и опосредованное ферментами биотинилирование белков клеточной поверхности19, 20. Непосредственные сравнения показывают, что подход к захвату клеточной поверхности обеспечивает оптимальный баланс простоты использования и успешного, относительно непредвзятого обогащения белков клеточной поверхности с наименьшей фоновой маркировкой внутриклеточных белков20.
В этой статье представлен эффективный и эффективный по времени протокол рабочего процесса протеомики клеточной поверхности путем интеграции процедуры маркировки и вытягивания клеточной поверхности с оптимизированным рабочим процессом протеомной пробоподготовки (рис. 1). Вся процедура, от сбора культивируемых клеток до анализа на масс-спектрометре, может быть выполнена в течение 3 дней. Для получения наиболее надежного покрытия поверхностного протеома может потребоваться оптимизация начального ввода клеток в зависимости от используемого типа клеток. Для обеспечения максимального охвата рекомендуется провести пилотный эксперимент с различным входом клеток, варьирующимся от нескольких миллионов клеток до 50 миллионов клеток. Кроме того, если наблюдается большое количество высокоэкспрессирующих внутриклеточных белков, повышенная промывка шариков нейтравидина после инкубации с лизатом может свести к минимуму неспецифическое связывание белков с шариками.
Мы рекомендуем проводить эксперимент по крайней мере с тремя биологическими репликами и тремя техническими репликами для каждого состояния, чтобы повысить уверенность в том, что идентифицированные маркеры клеточной поверхности действительно присутствуют на большинстве клеток. Кроме того, при выполнении рабочего процесса захвата клеточной поверхности для нового типа образца может быть полезно проанализировать лизат целой клетки с использованием обычного подхода21 к протеомике дробовика для сравнения с результатами захвата клеточной поверхности. Анализ необработанных данных масс-спектрометрии может быть выполнен с помощью различных поисковых и программных пакетов баз данных - здесь мы использовали MaxQuant - для получения списка идентифицированных белков22,23. Этот список может быть отфильтрован по различным известным базам данных 3,24 поверхностных белков, чтобы составить список белков клеточной поверхности, идентифицированных в одном эксперименте. После того, как список белков клеточной поверхности установлен, они могут быть дополнительно проанализированы на предмет их роли в соответствующих биохимических путях25 или кандидатах на лекарственные мишени26. Этот рабочий процесс может быть применен к широкому спектру типов клеток, включая суспензионные и адгезивные клеточные линии (для адгезивных клеток мы рекомендуем лифтинг клеток без использования трипсина перед подготовкой образца, чтобы избежать расщепления белков клеточной поверхности), а также первичные образцы.
Используя этот рабочий процесс, мы смогли уверенно охарактеризовать протеом клеточной поверхности конкретной клеточной линии. Сравнивая поверхностный протеом линий опухолевых клеток со здоровыми клетками и сопоставляя их с базой данных секвенирования РНК для нормальных тканей, можно было составить список потенциальных иммунотерапевтических мишеней 8,13. Ограничением этого метода является то, что, несмотря на значительное обогащение белков клеточной поверхности по сравнению со стандартным экспериментом с лизатом целых клеток, большинство белков, идентифицированных масс-спектрометрическим анализом в этом рабочем процессе, по-прежнему аннотируются как внутриклеточные. В зависимости от строгости используемой базы данных поверхностных белков приблизительно 25-30% идентифицированных белков находятся на поверхности клетки. Мы предполагаем, что значительная часть неповерхностного фона, вероятно, исходит из фонового белка, неспецифически связанного с шариками (например, как охарактеризовано анализом CRAPome27), в то время как другие представляют собой проникновение в клетки меченого реагента для реакции с N-гликозилированными белками в эндоплазматическом ретикулуме, Гольджи или других внутриклеточных компартментах.
В то время как альтернативные методы элюирования пептидов, такие как обработка PNGase, приводят к гораздо большему обогащению N-гликозитов среди общего количества проанализированных пептидов, этот подход позволяет идентифицировать только отдельные глициозированные пептиды и теряет ценную информацию из негликозилированного остатка вытянутой белковой последовательности12. Эта дополнительная информация может быть получена с помощью этого подхода к трипсинизации на шариках, хотя и с потенциальным компромиссом пониженной специфичности для N-гликозилированных белков, анализируемых в масс-спектрометре. Кроме того, даже элюирование PNGase не решает проблему маркировки внутриклеточных гликозилированных белков, а элюирование PNGase обычно приводит только к одному пептиду на белок; Это приводит к значительной вариабельности в идентификации белка, согласно опыту нашей лаборатории, тогда как описанное здесь переваривание на гранулах приводит к нескольким пептидам на захваченный белок. Поэтому, в зависимости от цели эксперимента, потенциально можно выбрать различные стратегии использования стратегии захвата клеточной поверхности. Эти стратегии включают миниатюризацию и автоматизацию протокола захвата клеточной поверхности для небольших входов28 образца и использование стрептавидиновых шариков с различной связывающей способностью29 в зависимости от применения. Метод и рабочий процесс, проиллюстрированные здесь, служат надежной, простой в исполнении общей стратегией обогащения белками клеточной поверхности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора Камаля Мандала (Департамент лабораторной медицины, UCSF) за помощь в настройке запуска LC-MS/MS, Диптарупа Бисваса (BSBE, IIT Bombay) за помощь в анализе данных и доктора Одри Ривз (Департамент лабораторной медицины, UCSF) за помощь в анализе данных. Соответствующая работа в лаборатории APW поддерживается NIH R01 CA226851 и Chan Zuckerberg Biohub. Рисунок 1 и рисунок 2B были сделаны с использованием BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| 96X iST Sample Preparation Kit | PreOmics | P.O.00027 | Proteomics sample preparation kit. Includes reagents for reduction, alkylation, and digestion. Also include desalting columns and reagents. |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo | 23275 | Peptide quantification kit. Includes peptide standards and components of working reagents. |
| Reagents | |||
| Acetonitrile | Fisher | A955-1 | |
| Ammonium bicarbonate | Millipore Sigma | 09830-1KG | |
| Biocytin hydrazide | Biotium | 90060 | |
| D-PBS (w/o Calcium and Magnesium Salts) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003-225B01 | |
| Formic Acid | Honeywell | 94318 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Single-Use Cocktail | Thermo | 1861280 | |
| High Capacity Neutravidin Agarose Resin | Thermo | 29204 | |
| Phosphate Buffered Saline | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001-22J01 | |
| RIPA Lysis Buffer, 10x | Millipore Sigma | 20-188 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Sodium metaperiodate | Alfa Aesar | 13798 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | |
| Urea (Proteomics Grade) | VWR | M123-1KG | |
| Equipment | |||
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | |
| PrismR Microcentrifuge | Labnet International | C2500-R-230V | |
| Sonicator | VWR | Branson Sonifier 240 | |
| Vacuum Manifold | Promega | Promega Vac-Man | |
| Shaking Heatblock | Eppendorf | Eppendorf Thermomixer C | |
| End-to-End rotator | Labnet | Revolver Adjustable Rotator | |
| LC | Thermo | Ultimate 3000 HPLC and UHPLC | |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrapole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| Microplate Reader | Biotek | Biotek Synergy 2 | |
| Vacuum Concentrator | Labconco | 7810010 | |
| Supplies | |||
| 1.5 mL Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | |||
| Filtration Columns | Bio-Rad | 7326008 | |
| Spin Columns | Thermo | 69725 |
References
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
- Aslam, B., Basit, M. B., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. Proteomics: technologies and their applications. Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).
- Bausch-Fluck, D., et al.
- Takahashi, Y., et al. Research advance in tumor specific antigens: A narrative review. AME Medical Journal. 6, 35 (2021).
- Li, Y., Qin, H., Ye, M. An overview on enrichment methods for cell surface proteome profiling. Journal of Separation Science. 43 (1), 292-312 (2020).
- Wollscheid, B., et al. Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins. Nature Biotechnology. 27 (4), 378-386 (2009).
- Chandler, K. B., Costello, C. C. Glycomics and glycoproteomics of membrane proteins and cell-surface receptors: present trends and future opportunities. Electrophoresis. 37 (11), 1407-1419 (2016).
- Ferguson, I. D., et al. The surfaceome of multiple myeloma cells suggests potential immunotherapeutic strategies and protein markers of drug resistance. Nature Communications. 13 (1), 4121 (2022).
- Karcini, A., Lazar, I. M. The SKBR3 cell-membrane proteome reveals telltales of aberrant cancer cell proliferation and targets for precision medicine applications. Scientific Reports. 12 (1), 10847 (2022).
- Köhnke, T., et al. Integrated multiomic approach for identification of novel immunotherapeutic targets in AML. Biomarker Research. 10 (1), 43 (2022).
- Verma, A., Kumar, V., Ghantasala, S., Mukherjee, S., Srivastava, S. Comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples. Journal of Visualized Experiments. (177), e61786 (2021).
- Leung, K. K., et al. Broad and thematic remodeling of the surfaceome and glycoproteome on isogenic cells transformed with driving proliferative oncogenes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (14), 7764-7775 (2020).
- Nix, M. A., et al. Surface proteomics reveals CD72 as a target for in vitro-evolved nanobody-based CAR-T cells in KMT2A/MLL1-rearranged B-ALL. Cancer Discovery. 11 (8), 2032-2049 (2021).
- Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
- Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
- Hosen, N., et al. The activated conformation of integrin β7 is a novel multiple myeloma-specific target for CAR T cell therapy. Nature Medicine. 23 (12), 1436-1443 (2017).
- Costa, A. F., Campos, D., Reis, C. A., Gomes, C. Targeting glycosylation: A new road for cancer drug discovery. Trends in Cancer. 6 (9), 757-766 (2020).
- Gundry, R. L., Boheler, K. R., Van Eyk, J. E., Wollscheid, B. A novel role for proteomics in the discovery of cell-surface markers on stem cells: Scratching the surface. Proteomics. Clinical Applications. 2 (6), 892-903 (2008).
- Itzhak, D. N., et al. A mass spectrometry-based approach for mapping protein subcellular localization reveals the spatial proteome of mouse primary neurons. Cell Reports. 20 (11), 2706-2718 (2017).
- Kirkemo, L. L., et al. Cell-surface tethered promiscuous biotinylators enable comparative small-scale surface proteomic analysis of human extracellular vesicles and cells. eLife. 11, 73982 (2022).
- Wojtkiewicz, M., Berg Luecke, L., Kelly, M. I., Gundry, R. L. Facile preparation of peptides for mass spectrometry analysis in bottom-up proteomics workflows. Current Protocols. 1 (3), 85 (2021).
- Välikangas, T., Suomi, T., Elo, L. L. A comprehensive evaluation of popular proteomics software workflows for label-free proteome quantification and imputation. Briefings in Bioinformatics. 19 (6), 1344-1355 (2018).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Bausch-Fluck, D., et al. A mass spectrometric-derived cell surface protein atlas. PLoS One. 10 (3), 0121314 (2015).
- Griss, J., et al. ReactomeGSA-efficient multi-omics comparative pathway analysis. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (12), 2115-2125 (2020).
- Waas, M., et al. SurfaceGenie: a web-based application for prioritizing cell-type-specific marker candidates. Bioinformatics. 36 (11), 3447-3456 (2020).
- Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).
- van Oostrum, M., et al. Classification of mouse B cell types using surfaceome proteotype maps. Nature Communications. 10 (1), 5734 (2019).
- Berg Luecke, L., Gundry, R. L. Assessment of streptavidin bead binding capacity to improve quality of streptavidin-based enrichment studies. Journal of Proteome Research. 20 (2), 1153-1164 (2021).
