Summary
Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho proteômico para caracterização do proteoma de superfície celular de vários tipos celulares. Esse fluxo de trabalho inclui enriquecimento de proteínas de superfície celular, preparação subsequente de amostras, análise usando uma plataforma LC-MS/MS e processamento de dados com software especializado.
Abstract
Na última década, a proteômica baseada em espectrometria de massa permitiu uma caracterização aprofundada de sistemas biológicos em uma ampla gama de aplicações. O proteoma de superfície celular ("surfaceome") na doença humana é de interesse significativo, uma vez que as proteínas da membrana plasmática são o alvo primário da maioria das terapêuticas clinicamente aprovadas, bem como uma característica chave para distinguir diagnóstica células doentes de tecidos saudáveis. No entanto, a caracterização focada de proteínas de membrana e superfície da célula tem permanecido desafiadora, principalmente devido à complexidade dos lisados celulares, que mascaram proteínas de interesse por outras proteínas de alta abundância. Para superar essa barreira técnica e definir com precisão o proteoma de superfície celular de vários tipos celulares usando proteômica por espectrometria de massas, é necessário enriquecer o lisado celular para proteínas de superfície celular antes da análise no espectrômetro de massa. Este artigo apresenta um fluxo de trabalho detalhado para marcar proteínas de superfície celular de células cancerosas, enriquecendo essas proteínas fora do lisado celular, e subsequente preparação de amostras para análise de espectrometria de massa.
Introduction
As proteínas servem como as unidades fundamentais pelas quais a maioria das funções celulares são realizadas. Caracterizar a estrutura e função de proteínas relevantes é um passo essencial para a compreensão de processos biológicos. Na última década, os avanços na tecnologia de espectrometria de massas, softwares de análise e bancos de dados permitiram a detecção e a medição precisas de proteínas em escala proteômica1. A proteômica baseada em espectrometria de massa pode ser utilizada em diversas aplicações, desde a análise científica básica de vias bioquímicas, até a identificação de novos alvos de drogas em um ambiente translacional, até o diagnóstico e monitoramento de doenças naclínica2. Na triagem de novos alvos de drogas, a caracterização do proteoma de superfície celular é particularmente importante, com mais de 65% das drogas humanas atualmente aprovadas tendo como alvo proteínas de superfície celular3. O campo da imunoterapia do câncer também depende totalmente de antígenos de superfície celular específicos do câncer para atingir e eliminar especificamente as células tumorais4. A proteômica baseada em espectrometria de massa pode, portanto, servir como uma ferramenta promissora para identificar novas proteínas de superfície celular para intervenções terapêuticas.
No entanto, existem várias limitações ao utilizar métodos proteômicos convencionais para pesquisar células tumorais em busca de novos alvos de proteínas de superfície celular. Uma preocupação primária é que as proteínas de superfície compõem uma fração muito pequena do total de moléculas de proteína em uma célula. Portanto, fragmentos dessas proteínas são mascarados por uma alta abundância de proteínas intracelulares ao realizar a análise por espectrometria de massa do lisado de célulasinteiras 5. Essa limitação torna desafiador caracterizar com precisão o proteoma de superfície celular com um fluxo de trabalho proteômico tradicional. Para enfrentar esse desafio, é necessário desenvolver maneiras de enriquecer proteínas de superfície celular a partir do lisado de células inteiras, antes da análise no espectrômetro de massa. Um desses métodos envolve a oxidação e a marcação de biotina de proteínas de superfície celular glicosiladas nas células intactas e o subsequente enriquecimento dessas proteínas biotiniladas a partir do lisado com um pulldown de neutravidina, um processo que tem sido denominado "captura da superfície celular"6. Uma vez que ~85% das proteínas de superfície celular de mamíferos são consideradas glicosiladas7, isso serve como um método eficaz de enriquecer o proteoma da superfície celular fora de todo o lisado celular. Este artigo descreve um fluxo de trabalho completo, começando com células cultivadas, de marcação de biotina de superfície celular e subsequente preparação de amostras para análise por espectrometria de massa (Figura 1). Ao longo de várias replicações, este método fornece cobertura robusta do proteoma de superfície celular de uma determinada amostra. A utilização deste método para caracterizar o proteoma de superfície celular de células tumorais e normais pode facilitar a descoberta de novos antígenos de superfície celular para identificar potenciais alvos imunoterapêuticos8.
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Protocol
NOTA: Células de plasmocitoma AMO1 foram usadas para este experimento de proteoma de superfície celular. O mesmo protocolo também poderia ser usado para outros tipos celulares, incluindo uma ampla gama de linhagens celulares em suspensão eaderentes9, bem como vários tipos de amostras primárias10. No entanto, o número de células (material de partida para o experimento) normalmente tem que ser otimizado para uma cobertura de proteoma equivalente. Para detalhes relacionados a materiais e equipamentos, consulte a Tabela de Materiais. Para obter detalhes relacionados a buffers e soluções de reagentes e sua composição, consulte a Tabela 1.
1. Marcação da superfície celular com biotina
- Contar as células cultivadas e o pellet aproximadamente 3,5 × 107 células vivas por centrifugação (5 min a 500 × g, 24 °C).
NOTA: As células do plasmocitoma AMO1 foram passadas com meio fresco a cada 3 dias antes da coleta. - Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet adicionando 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (D-PBS) de Dulbecco (sem cálcio, sem magnésio) e pipetando suavemente para cima e para baixo.
- Pellet as células novamente (como no passo 1.1) e repetir o passo de lavagem (passo 1.2) mais uma vez (duas lavagens no total).
- Após a segunda lavagem, pastilhar as células (como no passo 1.1) e ressuspendê-las em 990 μL de D-PBS frio por pipetagem suave.
- Preparar previamente uma solução-mãe de metaperiodato de sódio 160 mM (NaIO4). Divida em alíquotas de 50 μL e armazene a -20 °C por até 6 meses. Adicionar 10 μL de solução de metaperiodato de sódio 160 mM à suspensão celular no passo 1.4, misturar cuidadosamente e incubar num rotor de ponta a ponta durante 20 minutos a 4 °C.
- Após a incubação completa, pastilha as células (como na etapa 1.1), decantar o sobrenadante e ressuspender em 1 mL de D-PBS frio. Repita esta etapa de lavagem duas vezes (três lavagens no total). Após a terceira lavagem, ressuspender as células em 989 μL de D-PBS.
- Preparar previamente uma solução-mãe de hidrazida de biocitina 100 mM. Divida em alíquotas de 50 μL e armazene a -20 °C por até 6 meses. Adicionar 1 μL de anilina e 10 μL de hidrazida de biocitina 100 mM à suspensão celular do passo 1.6, misturar cuidadosamente e incubar num rotor de ponta a ponta durante 60 minutos a 4 °C.
- Após a incubação completa, pastilha as células (como na etapa 1.1), decantar o sobrenadante e ressuspender em 1 mL de D-PBS frio. Repita esta etapa de lavagem duas vezes (três lavagens no total).
- Após a terceira lavagem, aspirar cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e congelar rapidamente o pellet de células colocando o tubo no líquido N2. Colocar o pellet congelado a -80 °C, até que esteja pronto para prosseguir com a lise e o pulldown.
2. Lise celular e puxada de biotina
- Descongele a pastilha de células congeladas no gelo.
- Adicione 500 μL de tampão de lise 2x ao pellet, misture bem e vomite por 30 s.
NOTA: Podem ser necessárias pipetagem vigorosa e vórtice para lisar completamente o pellet. Alguns detritos insolúveis (ou seja, DNA) são aceitáveis, pois são removidos na etapa subsequente de sonicação. - Sonicar o lisado celular no gelo (três explosões, 20 s cada, 60% ciclo de trabalho).
- Centrifugar o lisado para pellet de quaisquer detritos remanescentes (10 min a 17.200 × g a 4 °C).
- Enquanto o lisado estiver centrifugindo, adicione 100 μL de esferas de resina de agarose neutravidin a uma coluna de filtração. Fixe a coluna a um coletor de vácuo, aplique um vácuo suave e lave as contas passando 3 mL de tampão de lavagem 1 sobre elas.
- Remova a coluna de filtração do coletor de vácuo, tampe o fundo e adicione o lisado de células clarificadas à coluna com as contas. Tampe o topo da coluna e incube o lisado com as contas em um rotor de ponta a ponta por 120 min a 4 °C.
NOTA: Ao tampar a parte superior da coluna, segure firmemente a tampa inferior no lugar, caso contrário, ela pode se deslocar e o lisado celular pode vazar durante a incubação. - Preparar os tampões de lavagem 1, 2 e 3 (aproximadamente 5 mL de cada tampão de lavagem por amostra, consulte a Tabela 1) e colocá-los em banho-maria a 42 °C
- Depois que o lisado terminar a incubação, coloque a coluna de filtração de volta no coletor de vácuo, aplique um vácuo suave e lave as esferas passando 5 mL de tampão de lavagem 1 sobre elas.
NOTA: Mais de 5 mL dos tampões de lavagem podem ser usados para lavagem; A lavagem extra pode reduzir a ligação de fundo e não específica às contas. - Repetir o passo de lavagem com 5 ml de tampão de lavagem 2.
- Repetir o passo de lavagem com 5 mL de tampão de lavagem 3.
- Uma vez que o tampão de lavagem final tenha fluído inteiramente através das contas, remova a coluna do coletor. Adicionar 100 μL de solução de "Lyse" às esferas e transferi-las para um tubo de microcentrífuga de 1,7 ml de baixa ligação a proteínas com uma pipeta. Gire brevemente o tubo para assentar as contas e remova 50 μL da solução sem perturbar as contas assentadas.
NOTA: Os reagentes nesta etapa e em todas as etapas subsequentes usam um kit de preparação de amostras proteômicas disponível comercialmente. O kit fornece um fluxo de trabalho otimizado e simplificado de preparação de amostras. No entanto, essas etapas também podem ser realizadas independentemente do kit, utilizando um fluxo de trabalho proteômico tradicional, como descrito em Verma et al.9. Se as contas permanecerem presas na lateral ou na parte inferior da coluna, permita que as contas que foram transferidas para o tubo se assentem e use uma solução extra de "Lyse" no tubo para transferir as contas restantes. - Coloque o tubo em um bloco de calor/agitador a 65 °C e agite a 1.000 rpm por 10 min.
NOTA: Esta etapa é necessária para a redução e alquilação de resíduos de cisteína antes da digestão.
3. Digestão de proteínas
- Ressuspender o tubo de tripsina seca ("Digest" no kit, armazenado a -20 °C) adicionando 210 μL da solução "Resuspend". Pipetar a solução para cima e para baixo várias vezes para garantir que toda a tripsina seca seja ressuspensa.
- Após a incubação completa, adicionar 50 μL da solução de tripsina ressuspensa às contas. Incubar o tubo a 37 °C, agitando a 500 rpm durante pelo menos 90 minutos para digerir a proteína.
- Quando a digestão estiver completa, transfira a solução que contém as esferas para uma coluna de spin e insira a coluna em um tubo de microcentrífuga de baixa ligação a proteínas de 1,7 mL. Gire o tubo (500 × g por 5 min à temperatura ambiente [TR]) para separar a solução peptídica digerida das contas.
NOTA: Nesta fase, o tratamento com PNGase pode ser realizado nas esferas uma vez que elas são separadas da solução peptídica, para eluir fragmentos peptídicos biotinilados das esferas de estreptavidina. Essa amostra de peptídeo pode então ser transportada pelo restante do fluxo de trabalho como uma amostra separada de peptídeo secundário que pode ser analisada e comparada com a amostra primária de tripsinização em pé. É provável que a abordagem PNGase forneça dados complementares à tripsinização on-bead, dada a especificidade adicional para asparaginas N-glicosiladas capturadas com base na modificação da cadeia lateral detectável por MS12. No entanto, a desvantagem desta abordagem de eluição sequencial é a exigência de duas vezes o tempo do instrumento do espectrômetro de massa por análise de amostra. - Adicionar 100 μL da solução "Stop" para interromper a reação de digestão e acidificar a solução peptídica.
4. Dessalinização de peptídeos
- Usando um adaptador de tubo, coloque uma coluna de dessalinização em um tubo de microcentrífuga de baixa ligação a proteínas de 1,7 mL. Adicione toda a solução peptídica acidificada à coluna. Gire a coluna (3.800 × g por 3 min) para que a solução flua através da coluna. Os peptídeos agora estão ligados à coluna; Descartar o fluxo.
- Adicionar 200 μL de solução "Wash 1" à coluna e girar (3.800 × g por 3 min, RT). Descarte o fluxo.
- Adicionar 200 μL da solução "Wash 2" à coluna e girar (3.800 × g por 3 min, RT). Descarte o fluxo.
- Transfira a coluna para um novo tubo de microcentrífuga de baixa ligação a proteínas marcado com 1,7 mL. Adicionar 100 μL de solução "Elute" à coluna e gire (3.800 × g por 3 min, RT). Adicionar mais 100 μL de solução "Elute" à coluna e gire (3.800 × g por 3 min, RT). Os peptídeos agora são eluídos da coluna para o tubo.
- Coloque a solução peptídica em uma centrífuga a vácuo e deixe secar durante a noite. Colocar os péptidos secos a -80 °C até estarem prontos para quantificar e analisar no espectrómetro de massa.
5. Ressuspensão e quantificação de peptídeos
- Ressuspender os peptídeos secos em 20 μL de solvente A (0,1% ácido fórmico, 2% acetonitrila).
- Centrifugar os peptídeos ressuspendidos (17.200 × g por 10 min) para pellet de quaisquer detritos insolúveis.
- Preparar padrões peptídicos para o ensaio de quantificação de peptídeos colorimétricos.
- Colocar 5 μL de 1.000 mg/mL de solução estoque de peptídeo em um poço de uma placa de 96 poços.
- Realizar uma diluição seriada em sete etapas na placa com água deionizada (DI), da seguinte forma, com 5 μL de cada padrão por poço: 1.000 mg/mL, 500 mg/mL, 250 mg/mL, 125 mg/mL, 62,5 mg/mL, 31,25 mg/mL e 15.625 mg/mL. Coloque 5 μL de água DI em um oitavo poço para o branco.
- Coloque 4 μL de água DI em três poços separados da placa de 96 poços. Adicionar 1 μL da solução peptídica ressuspensa a cada poço, para um volume total de 5 μL.
NOTA: Ao pipetar a solução peptídica para quantificação, pipetar cuidadosamente a partir do topo da solução para evitar perturbar quaisquer detritos sedimentados. - Calcular a quantidade de reagente de trabalho necessária (45 μL necessários por poço). Preparar o volume necessário do reagente de trabalho do ensaio colorimétrico; Vórtice o reagente de trabalho para garantir a mistura adequada dos componentes.
- Adicionar 45 μL do reagente de trabalho a cada um dos poços padrão e de amostra.
NOTA: Faça os padrões em duplicado e use um pipet multicanal para garantir uma diferença mínima no tempo de quando o reagente é adicionado aos poços. - Cubra a placa em papel alumínio e incube a 37 °C por 15 min.
- Analise a placa em um leitor de chapas automatizado. Use os valores de absorbância registrados para as amostras padrão para gerar uma curva padrão linear. Determine a equação da curva padrão e o valor de R2 . Se o valor de R2 for razoável (≥0,95), utilizar a curva padrão para determinar a concentração de peptídeos ressuspensos, contabilizando a diluição de cinco vezes na placa de ensaio colorimétrico.
6. Análise por cromatografia líquida-espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) dos peptídeos digeridos
- Ajustar a concentração das amostras de peptídeos para 0,2 μg/μL adicionando solvente A e transferir 10 μL para um tubo de 0,6 mL de baixa ligação a proteínas.
- Coloque o tubo no amostrador automático LC.
- Defina os parâmetros LC e MS/MS, conforme Figura 2 e Figura 3.
- Injetar 5 μL (1 μg) da amostra peptídica na configuração LC-MS/MS para análise.
NOTA: As configurações de LC-MS/MS mostradas aqui são representativas apenas para as ilustrações. Dependendo da disponibilidade do instrumento LC e MS, os usuários podem modificar as configurações para os parâmetros de gradiente LC e MS/MS para obter cobertura proteoma profunda. Para este trabalho, a análise dos dados de SM foi realizada usando MaxQuant https://www.maxquant.org/, a análise de dados secundários foi realizada usando Perseus https://maxquant.net/perseus/ e a análise de vias usando https://reactome.org/.
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Representative Results
Para este experimento, caracterizamos o proteoma de superfície celular de uma linhagem de células tumorais marcando proteínas de membrana N-glicosiladas de células intactas com biotina, e enriquecendo essas proteínas marcadas de todo o lisado celular com um pulldown neutravidin (Figura 1). Além disso, realizamos análise de proteoma usando LC-MS/MS para caracterizar proteínas de superfície celular enriquecidas. Ao contrário da análise do proteoma de células inteiras, o objetivo foi caracterizar apenas proteínas de superfície celular. Assim, iniciamos com uma entrada de amostra de 3,5 × 107 células de plasmocitoma AMO-1. Obtivemos uma concentração final de peptídeos de ~630 ng/μL com base no ensaio de quantificação de peptídeos colorimétricos, e o rendimento total foi de ~12,6 μg de peptídeos (em 20 μL) (Figura 2A). Em seguida, injetamos 1 μg de amostra de peptídeo no sistema LC-MS/MS e repetimos a injeção três vezes para réplicas técnicas. Os parâmetros de CL e SM utilizados foram otimizados com base em experimentos prévios (Figura 2C e Figura 3A). Utilizamos um gradiente longo de CL de 4 h para garantir a máxima cobertura.
Os dados de LC-MS/MS foram analisados usando MaxQuant; Conseguimos identificar 2.221 proteínas com pelo menos um peptídeo único e 1.764 proteínas com pelo menos dois peptídeos únicos em todas as três replicações. No total, foram identificados 12.307 peptídeos únicos. Determinamos o enriquecimento de proteínas de superfície celular na amostra utilizando um script Python (o script exato que usamos pode ser encontrado na Figura Suplementar S1) que compara os resultados obtidos do MaxQuant com vários conjuntos de dados estabelecidos de proteínas de superfície celular. Esses conjuntos de dados incluem o " in silico surfaceome" relatado anteriormente3 e um conjunto de dados estabelecido a partir de proteínas anotadas como localizadas na membrana no UniProt13 (os conjuntos de dados estão disponíveis na Tabela Suplementar S1). Essa análise resultou em 601 proteínas de superfície em nossa amostra (aproximadamente 27% de todas as proteínas identificadas) (Figura 4A). Foi realizada anotação ontológica gênica (http://geneontology.org/), que indicou aproximadamente 30% das proteínas canonicamente localizadas na membrana plasmática. A análise da via do reatoma (https://reactome.org/) também indicou relativo enriquecimento das proteínas de membrana envolvidas no transporte transmembrana e nas interações da superfície celular (Figura 5 e Tabela Suplementar S2).
Figura 1: Fluxo de trabalho para marcação de superfície celular e subsequente preparação de amostras para análise de espectrometria de massa. Primeiro, as proteínas na superfície da amostra celular desejada são marcadas com biotina. Essas células são então lisadas, seguidas de incubação com esferas neutravidin que se ligam a proteínas marcadas com biotina. As contas são então lavadas repetidamente para remover proteínas intracelulares e outros contaminantes. A amostra de proteína então passa por uma digestão no talão com a adição de tripsina. A amostra resultante de fragmentos peptídicos então sofre dessalinização para remover contaminantes das etapas de lavagem e digestão. A amostra final de peptídeo é então seca e pronta para ser submetida à análise por espectrometria de massa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Curva padrão de quantificação do peptídeo colorimétrico e gradiente de LC. (A) Curva padrão de oito pontos gerada pelo ensaio de quantificação de peptídeo colorimétrico usado para determinar a concentração de peptídeo em amostras processadas. (B) Uma ilustração do sistema LC-MS/MS usado para processar amostras. (C) Gradiente de cromatografia líquida e vazão utilizados para injeção de amostras no espectrômetro de massas. Abreviaturas: LC-MS/MS = cromatografia líquida-espectrometria de massas em tandem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Parâmetros de espectrometria de massas e cromatograma representativo . (A) Parâmetros utilizados para este experimento utilizando um espectrômetro de massas Orbitrap. (B) Cromatograma representativo gerado por análise por espectrometria de massas seguindo protocolo de "captura de superfície celular" para um gradiente de 4 h. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise do enriquecimento de proteínas de superfície celular e comparação de réplicas técnicas. Esses conjuntos de dados incluem o "in silico surfaceome" relatado anteriormente3 e um conjunto de dados estabelecido a partir de proteínas anotadas como localizadas na membrana em UniProt13. (A) O número de proteínas e peptídeos identificados com um ponto de corte diferente após a remoção de contaminantes, proteínas reversas e um valor q > 0,05. (B) O gráfico representa a distribuição da proteína identificada e o escore de Andrômeda14. (C) O gráfico de dispersão ilustra a correlação amostra-amostra. A correlação de postos de Spearman mede a força e a direção da associação entre duas variáveis ranqueadas. (D) Gráficos de caixa representando a variação run-to-run. (E) Gráfico de distribuição por amostra que representa a qualidade dos dados das réplicas. Abreviação: LFQ = quantificação sem rótulo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Análise de vias. A análise dos trajetos foi realizada utilizando-se o Reactome versão 8222. Uma representação ilustrativa das interações da superfície celular na parede vascular, exibindo o enriquecimento do proteoma da superfície celular para as principais interações envolvidas na interação plaquetária e leucocitária com o endotélio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome do reagente | Composição | Armazenamento | |||||
| Hidrazida de biocitina 100 mM | forma de pó de hidrazida de biocitina dissolvida em DMSO | Divida em alíquotas de 50 μL e armazene a -20 °C por até 6 meses. | |||||
| Metaperiodato de sódio 160 mM (NaIO4) | NaIO4 sólido dissolvido em água DI | Divida em alíquotas de 50 μL e armazene a -20 °C por até 6 meses. | |||||
| 2x Buffer de lise RIPA | 2x Tampão de lise RIPA, EDTA 1,25 mM, coquetel de inibidor de protease de uso único | Prepare fresco cada vez antes de usar 10x RIPA Lysis Buffer. | |||||
| Peptídeo Colorimétrico Ensaio Reagente de Trabalho | 50% Reagente A, 48% Reagente B, 2% Reagente C | Prepare fresco cada vez antes de usar. Conservar os componentes a 4 °C. | |||||
| Solvente A | 0,1% ácido fórmico, 2% acetonitrila | Pode preparar com antecedência e armazenar à temperatura ambiente | |||||
| Tampão de lavagem 1 | 1x Buffer de lise RIPA, 1 mM EDTA | Pode preparar grande lote de antemão e armazenar à temperatura ambiente | |||||
| Buffer de lavagem 2 | 1x PBS, 1 M NaCl | Pode preparar grande lote de antemão e armazenar à temperatura ambiente | |||||
| Buffer de lavagem 3 | 2 M Ureia, 50 mM Bicarbonato de amónio | Prepare fresco cada vez, pois a ureia irá degradar-se rapidamente com o tempo. | |||||
Tabela 1: Buffers e soluções de reagentes utilizados neste protocolo.
Figura suplementar S1: Script Python para comparar resultados obtidos de MaxQuant com vários conjuntos de dados estabelecidos de proteínas de superfície celular. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela suplementar S1: Conjuntos de dados de proteínas de superfície celular. Esses conjuntos de dados incluem o "in silico surfaceome" relatado anteriormente3 e um conjunto de dados estabelecido a partir de proteínas anotadas como localizadas na membrana em UniProt13. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Suplementar S2: As 10 vias mais relevantes (ordenadas por valor de p ) são apresentadas aqui. Abreviações: FDR = taxa de descoberta falsa; SLC = transportador de soluto; TCR = receptor de células T. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
A proteômica baseada em espectrometria de massa é uma ferramenta poderosa que permitiu a caracterização imparcial de milhares de proteínas desconhecidas em uma escala anteriormente impossível. Esta abordagem permite identificar e quantificar as proteínas, bem como obter uma gama de conhecimentos para as capacidades estruturais e de sinalização de células e tecidos, caracterizando a variedade de proteínas presentes em uma determinada amostra. Indo além do perfil global de proteínas em uma amostra, a espectrometria de massa nos permite caracterizar várias modificações pós-traducionais (PTMs) nessas proteínas, fornecendo um vislumbre ainda mais profundo dos estágios das vias de sinalização e da dinâmica proteica não disponíveis quando analisadas no nível1 de DNA ou RNA. Em direção ao desenvolvimento de novas terapêuticas contra o câncer, a proteômica baseada em espectrometria de massa nos permite comparar o perfil proteico de células tumorais malignas versus tecidos saudáveis, para identificar potenciais alvos farmacológicos.
O campo em rápido crescimento da imunoterapia contra o câncer depende de antígenos expressos na superfície das células malignas para identificar e destruir seletivamente os tumores. Uma vez que o desenvolvimento de novas imunoterapias contra o câncer é limitado pela falta de antígenos cancerígenos específicos únicos, que estão ausentes em tecidos saudáveis, é fundamental identificar mais antígenos novos específicos para células tumorais15. Os antígenos tumorais específicos não precisam ser proteínas inteiras exclusivas da célula tumoral, mas também podem ser conformações proteicas específicas ou MPTs ausentes em tecidos sadios16,17. A análise proteômica de proteínas de superfície celular em células tumorais e saudáveis pode produzir novos alvos antígenos específicos para o câncer. A proteômica de superfície celular requer o enriquecimento de proteínas de superfície do lisado de células inteiras antes da análise por espectrometria de massa, para reduzir a complexidade da amostra e evitar a supressão iônica das proteínas de membrana desejadas (muitas vezes de baixa abundância) por proteínas intracelulares altamente expressas18. Embora a estratégia de captura de superfície celular empregada aqui seja uma das abordagens de enriquecimento mais comumente usadas para proteômica de superfície celular, existem outros métodos para enriquecimento de proteínas de superfície celular que foram integrados a um fluxo de trabalho de espectrometria de massa, incluindo ultracentrifugação seletiva de membranas celulares, marcação de lisinas superficiais por NHS-biotina e biotinilação mediada por enzimas de proteínas de superfície celular19, 20º. Comparações diretas sugerem que a abordagem de captura de superfície celular fornece o equilíbrio ideal de facilidade de uso e enriquecimento bem-sucedido e relativamente imparcial de proteínas de superfície celular com a marcação de fundo mais baixa de proteínas intracelulares20.
Este artigo apresenta um protocolo efetivo e eficiente em termos de tempo para um fluxo de trabalho de proteômica de superfície celular, integrando o procedimento de marcação e pulldown da superfície celular com um fluxo de trabalho otimizado de preparação de amostras proteômicas (Figura 1). Todo o procedimento, desde a colheita das células cultivadas até a análise no espectrômetro de massa, pôde ser realizado ao longo de 3 dias. Para obter uma cobertura mais robusta do proteoma de superfície, a entrada inicial de células pode precisar ser otimizada com base no tipo de célula que está sendo usada. A realização de um experimento piloto com entrada celular variável, variando de alguns milhões de células até 50 milhões de células, é recomendada para garantir a máxima cobertura. Além disso, se uma grande quantidade de proteínas intracelulares altamente expressivas for observada, o aumento da lavagem das esferas neutravidin após a incubação com o lisado poderia minimizar a ligação inespecífica das proteínas às contas.
Recomendamos a realização do experimento com pelo menos três réplicas biológicas e três réplicas técnicas por condição, para aumentar a confiança de que os marcadores de superfície celular identificados estão realmente presentes na maioria das células. Além disso, ao realizar o fluxo de trabalho de captura de superfície celular para um novo tipo de amostra, poderia ser útil analisar um lisado de célula inteira usando uma abordagem proteômica convencional de espingarda21, para comparar com os resultados de captura de superfície celular. A análise dos dados brutos de espectrometria de massas pode ser realizada por meio de várias buscas em bancos de dados e pacotes de software - aqui, usamos MaxQuant - para produzir uma lista de proteínas identificadas22,23. Essa lista pode ser filtrada contra vários bancos de dados conhecidos 3,24 de proteínas de superfície para estabelecer uma lista das proteínas de superfície celular identificadas em um único experimento. Uma vez estabelecida uma lista de proteínas de superfície celular, elas podem ser analisadas quanto ao seu papel em vias bioquímicas relevantes25 ou candidatas-alvo afármacos 26. Esse fluxo de trabalho pode ser aplicado a uma ampla variedade de tipos celulares, incluindo linhagens celulares em suspensão e aderentes (para células aderentes, recomendamos levantar células sem o uso de tripsina antes da preparação da amostra, para evitar a clivagem das proteínas da superfície celular), bem como amostras primárias.
Usando esse fluxo de trabalho, fomos capazes de caracterizar com confiança o proteoma de superfície celular de uma determinada linhagem celular. Comparando-se o proteoma de superfície de linhagens tumorais com células sadias e cruzando-se com um banco de dados de sequenciamento de RNA para tecidos normais, pode-se estabelecer uma lista de potenciais alvos imunoterapêuticos 8,13. Uma limitação deste método é que, apesar do enriquecimento significativo de proteínas de superfície celular versus um experimento padrão de lisado de células inteiras, a maioria das proteínas identificadas por análise de espectrometria de massa neste fluxo ainda é anotada como intracelular. Dependendo do rigor do banco de dados de proteínas de superfície utilizado, aproximadamente 25%-30% das proteínas identificadas são da superfície celular. Nós antecipamos que uma parte significativa do fundo não-superficial provavelmente emana da proteína de fundo não especificamente ligada a esferas (por exemplo, como caracterizado pela análise CRAPome27), enquanto outros representam a penetração celular do reagente de marcação para reagir com proteínas N-glicosiladas no retículo endoplasmático, Golgi, ou outros compartimentos intracelulares.
Enquanto métodos alternativos de eluição de peptídeos, como o tratamento com PNGase, resultam em um enriquecimento muito maior de N-glicosídeos entre os peptídeos totais analisados, essa abordagem permite apenas a identificação de peptídeos gliciosilados individuais e perde informações valiosas do restante não glicosilado da sequência de proteínas puxadas para baixo12. Esta informação extra pode ser capturada com esta abordagem de tripsinização on-bead, embora no potencial tradeoff de especificidade reduzida para proteínas N-glicosiladas analisadas no espectrômetro de massa. Além disso, mesmo a eluição de PNGase não supera o desafio de marcar proteínas glicosiladas intracelulares, e uma eluição de PNGase leva a tipicamente apenas um único peptídeo por proteína; Isso leva a uma variabilidade significativa na identificação de proteínas, de acordo com a experiência de nosso laboratório, enquanto a digestão em esferas descrita aqui leva a múltiplos peptídeos por proteína capturada. Portanto, dependendo do objetivo do experimento, pode-se potencialmente escolher diferentes estratégias para empregar a estratégia de captura da superfície celular. Essas estratégias incluem miniaturização e automação do protocolo de captura de superfície celular para pequenas entradas de amostra28 e utilização de esferas de estreptavidina de capacidade de ligaçãovariável 29 dependendo da aplicação. O método e o fluxo de trabalho ilustrados aqui servem como uma estratégia geral robusta e fácil de executar para o enriquecimento de proteínas de superfície celular.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Kamal Mandal (Departamento de Medicina Laboratorial, UCSF) pela ajuda na criação da corrida LC-MS/MS, ao Deeptarup Biswas (BSBE, IIT Bombaim) pela ajuda com a análise de dados e à Dra. Audrey Reeves (Departamento de Medicina Laboratorial, UCSF) pela ajuda com a análise de dados. O trabalho relacionado no laboratório A.P.W. é apoiado pelo NIH R01 CA226851 e pelo Chan Zuckerberg Biohub. A Figura 1 e a Figura 2B foram confeccionadas utilizando-se BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| 96X iST Sample Preparation Kit | PreOmics | P.O.00027 | Proteomics sample preparation kit. Includes reagents for reduction, alkylation, and digestion. Also include desalting columns and reagents. |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo | 23275 | Peptide quantification kit. Includes peptide standards and components of working reagents. |
| Reagents | |||
| Acetonitrile | Fisher | A955-1 | |
| Ammonium bicarbonate | Millipore Sigma | 09830-1KG | |
| Biocytin hydrazide | Biotium | 90060 | |
| D-PBS (w/o Calcium and Magnesium Salts) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003-225B01 | |
| Formic Acid | Honeywell | 94318 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Single-Use Cocktail | Thermo | 1861280 | |
| High Capacity Neutravidin Agarose Resin | Thermo | 29204 | |
| Phosphate Buffered Saline | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001-22J01 | |
| RIPA Lysis Buffer, 10x | Millipore Sigma | 20-188 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Sodium metaperiodate | Alfa Aesar | 13798 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | |
| Urea (Proteomics Grade) | VWR | M123-1KG | |
| Equipment | |||
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | |
| PrismR Microcentrifuge | Labnet International | C2500-R-230V | |
| Sonicator | VWR | Branson Sonifier 240 | |
| Vacuum Manifold | Promega | Promega Vac-Man | |
| Shaking Heatblock | Eppendorf | Eppendorf Thermomixer C | |
| End-to-End rotator | Labnet | Revolver Adjustable Rotator | |
| LC | Thermo | Ultimate 3000 HPLC and UHPLC | |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrapole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| Microplate Reader | Biotek | Biotek Synergy 2 | |
| Vacuum Concentrator | Labconco | 7810010 | |
| Supplies | |||
| 1.5 mL Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | |||
| Filtration Columns | Bio-Rad | 7326008 | |
| Spin Columns | Thermo | 69725 |
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