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Biochemistry

सेल सरफेस प्रोटिओम के लेबल-फ्री परिमाणीकरण के लिए "सेल सरफेस कैप्चर" वर्कफ़्लो

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64952
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3,4
1Department of Laboratory Medicine, University of California, San Francisco, 2Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Bombay, 3Deptartment of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, 4Chan Zuckerberg Biohub

Summary

यहां, हम विभिन्न सेल प्रकारों के सेल सतह प्रोटिओम के लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटिओमिक्स वर्कफ़्लो का वर्णन करते हैं। इस वर्कफ़्लो में सेल सतह प्रोटीन संवर्धन, बाद में नमूना तैयारी, एलसी-एमएस / एमएस प्लेटफॉर्म का उपयोग करके विश्लेषण और विशेष सॉफ़्टवेयर के साथ डेटा प्रोसेसिंग शामिल है।

Abstract

पिछले दशक में, मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटिओमिक्स ने अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में जैविक प्रणालियों के गहन लक्षण वर्णन को सक्षम किया है। मानव रोग में कोशिका सतह प्रोटिओम ("सरफेसोम") महत्वपूर्ण रुचि का है, क्योंकि प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन अधिकांश नैदानिक रूप से अनुमोदित चिकित्सीय का प्राथमिक लक्ष्य है, साथ ही एक प्रमुख विशेषता है जिसके द्वारा स्वस्थ ऊतकों से रोगग्रस्त कोशिकाओं को नैदानिक रूप से अलग किया जा सकता है। हालांकि, कोशिका की झिल्ली और सतह प्रोटीन का केंद्रित लक्षण वर्णन चुनौतीपूर्ण बना हुआ है, मुख्य रूप से सेलुलर लाइसेट की जटिलता के कारण, जो अन्य उच्च-बहुतायत प्रोटीन द्वारा रुचि के प्रोटीन को मुखौटा करते हैं। इस तकनीकी बाधा को दूर करने और मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटिओमिक्स का उपयोग करके विभिन्न सेल प्रकारों के सेल सतह प्रोटिओम को सटीक रूप से परिभाषित करने के लिए, मास स्पेक्ट्रोमीटर पर विश्लेषण से पहले सेल सतह प्रोटीन के लिए सेल लाइसेट को समृद्ध करना आवश्यक है। यह पेपर कैंसर कोशिकाओं से सेल सतह प्रोटीन को लेबल करने, इन प्रोटीनों को सेल लाइसेट से समृद्ध करने और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए बाद में नमूना तैयार करने के लिए एक विस्तृत वर्कफ़्लो प्रस्तुत करता है।

Introduction

प्रोटीन मौलिक इकाइयों के रूप में काम करते हैं जिसके द्वारा अधिकांश सेलुलर कार्य किए जाते हैं। जैविक प्रक्रियाओं को समझने के लिए प्रासंगिक प्रोटीन की संरचना और कार्य को चिह्नित करना एक आवश्यक कदम है। पिछले दशक में, मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रौद्योगिकी, विश्लेषण सॉफ्टवेयर और डेटाबेस में प्रगति ने प्रोटिओम-वाइड स्केल1 पर प्रोटीन का सटीक पता लगाने और माप को सक्षम किया है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटिओमिक्स का उपयोग विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोगों में किया जा सकता है, जैव रासायनिक मार्गों के बुनियादी विज्ञान विश्लेषण से लेकर, ट्रांसलेशनल सेटिंग में नई दवा लक्ष्यों की पहचान करने के लिए, क्लिनिक2 में रोगों के निदान और निगरानी तक। जब नई दवा लक्ष्यों के लिए स्क्रीनिंग की जाती है, तो सेल सतह प्रोटिओम का लक्षण वर्णन विशेष रूप से महत्वपूर्ण होता है, वर्तमान में अनुमोदित मानव दवाओं के 65% से अधिक सेल सतह प्रोटीनको लक्षित करते हैं। कैंसर इम्यूनोथेरेपी का क्षेत्र भी पूरी तरह से कैंसर-विशिष्ट सेल सतह एंटीजन पर निर्भर करता है ताकि ट्यूमर कोशिकाओं को लक्षित और विशेष रूप से समाप्त कियाजा सके। मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटिओमिक्स इस प्रकार चिकित्सीय हस्तक्षेप की ओर नए सेल सतह प्रोटीन की पहचान करने के लिए एक आशाजनक उपकरण के रूप में काम कर सकता है।

हालांकि, नए सेल सतह प्रोटीन लक्ष्यों के लिए ट्यूमर कोशिकाओं का सर्वेक्षण करने के लिए पारंपरिक प्रोटिओमिक्स विधियों का उपयोग करते समय कई सीमाएं हैं। एक प्राथमिक चिंता यह है कि सतह प्रोटीन एक कोशिका में कुल प्रोटीन अणुओं का एक बहुत छोटा अंश बनाते हैं। इसलिए, पूरे सेल लाइसेट5 के मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण करते समय इन प्रोटीनों के टुकड़े इंट्रासेल्युलर प्रोटीन की एक उच्च बहुतायत से नकाबपोश होते हैं। यह सीमा पारंपरिक प्रोटिओमिक्स वर्कफ़्लो के साथ सेल सतह प्रोटिओम को सटीक रूप से चिह्नित करना चुनौतीपूर्ण बनाती है। इस चुनौती का समाधान करने के लिए, मास स्पेक्ट्रोमीटर पर विश्लेषण से पहले, पूरे सेल लाइसेट से सेल सतह प्रोटीन को समृद्ध करने के तरीके विकसित करना आवश्यक है। ऐसी एक विधि में बरकरार कोशिकाओं में ग्लाइकोसिलेटेड सेल सतह प्रोटीन का ऑक्सीकरण और बायोटिन लेबलिंग शामिल है, और बाद में लाइसेट से इन बायोटिनीलेटेड प्रोटीन का संवर्धन न्यूट्राविडिन पुलडाउन के साथ होता है, एक प्रक्रिया जिसे "सेल सतह कैप्चर" कहा जाता है। चूंकि स्तनधारी कोशिका सतह प्रोटीन के ~ 85% को ग्लाइकोसिलेटेड7 माना जाता है, इसलिए यह पूरे सेल लाइसेट से सेल सतह प्रोटिओम को समृद्ध करने की एक प्रभावी विधि के रूप में कार्य करता है। यह पेपर एक पूर्ण वर्कफ़्लो का वर्णन करता है, जो सुसंस्कृत कोशिकाओं से शुरू होता है, सेल सतह बायोटिन लेबलिंग का, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए बाद में नमूना तैयारी (चित्रा 1)। कई प्रतिकृतियों में, यह विधि एक विशेष नमूने के सेल सतह प्रोटिओम का मजबूत कवरेज प्रदान करती है। ट्यूमर और स्वस्थ कोशिकाओं दोनों के सेल सतह प्रोटिओम को चिह्नित करने के लिए इस विधि का उपयोग करने से संभावित इम्यूनोथेराप्यूटिकलक्ष्यों की पहचान करने के लिए नए सेल सतह एंटीजन की खोज की सुविधा मिल सकती है।

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Protocol

नोट: इस सेल सतह प्रोटिओम प्रयोग के लिए एएमओ 1 प्लाज्मासाइटोमा कोशिकाओं का उपयोग किया गया था। इसी प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य सेल प्रकारों के लिए भी किया जा सकता है, जिसमें निलंबन और अनुयायी सेल लाइनों9 की एक विस्तृत श्रृंखला, साथ ही विभिन्न प्रकार के प्राथमिक नमूने10 शामिल हैं। हालांकि, सेल नंबर (प्रयोग के लिए प्रारंभिक सामग्री) को आमतौर पर समकक्ष प्रोटिओम कवरेज के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। सामग्री और उपकरणों से संबंधित विवरण के लिए, सामग्री की तालिका देखें। बफर और अभिकर्मक समाधान और उनकी संरचना से संबंधित विवरण के लिए, तालिका 1 देखें।

1. बायोटिन के साथ सेल सतह लेबलिंग

  1. सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा सुसंस्कृत कोशिकाओं और गोली × लगभग 3.510 7 जीवित कोशिकाओं की गणना करें (500 × ग्राम, 24 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट)।
    नोट: एएमओ 1 प्लाज्मासाइटोमा कोशिकाओं को कटाई से पहले हर 3 दिन में ताजा मीडिया के साथ पारित किया गया था।
  2. सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें और 1 मिलीलीटर ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) डलबेकको के फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (डी-पीबीएस) (कोई कैल्शियम नहीं, कोई मैग्नीशियम नहीं) जोड़कर और धीरे से ऊपर और नीचे पाइप करके गोली को फिर से निलंबित करें।
  3. कोशिकाओं को फिर से पेलेट करें (चरण 1.1 के रूप में) और धोने के चरण (चरण 1.2) को एक बार फिर दोहराएं (कुल मिलाकर दो धोएं)।
  4. दूसरे धोने के बाद, कोशिकाओं को पेलेट करें (चरण 1.1 के रूप में) और उन्हें धीरे से पाइप िंग करके ठंडे डी-पीबीएस के 990 μL में फिर से निलंबित करें।
  5. पहले से 160 एमएम सोडियम मेटापीरियड (एनएआईओ4) का स्टॉक समाधान तैयार करें। 50 μL एलिकोट में विभाजित करें और 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। चरण 1.4 में सेल सस्पेंशन में 160 एमएम सोडियम मेटापीरियड समाधान के 10 μL जोड़ें, अच्छी तरह मिलाएं, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए एंड-टू-एंड रोटर पर इनक्यूबेट करें।
  6. इनक्यूबेशन पूरा होने के बाद, कोशिकाओं को गोली दें (चरण 1.1 के रूप में), सतह पर तैरने वाले को निष्क्रिय करें, और ठंडे डी-पीबीएस के 1 एमएल में पुन: निलंबित करें। इस धोने के चरण को दो बार दोहराएं (कुल मिलाकर तीन धोएं)। तीसरे धोने के बाद, डी-पीबीएस के 989 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  7. पहले से 100 एमएम बायोसाइटिन हाइड्राज़ाइड का स्टॉक समाधान तैयार करें। 50 μL एलिकोट में विभाजित करें, और 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। चरण 1.6 में सेल निलंबन में 1 μL एनिलिन और 100 mM बायोसाइटिन हाइड्राज़ाइड के 10 μL जोड़ें, अच्छी तरह मिलाएं, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए एंड-टू-एंड रोटर पर इनक्यूबेट करें।
  8. इनक्यूबेशन पूरा होने के बाद, कोशिकाओं को गोली दें (चरण 1.1 के रूप में), सतह पर तैरने वाले को निष्क्रिय करें, और ठंडे डी-पीबीएस के 1 एमएल में पुन: निलंबित करें। इस धोने के चरण को दो बार दोहराएं (कुल मिलाकर तीन धोएं)।
  9. तीसरे धोने के बाद, सतह पर तैरनेवाले को एक पाइप के साथ सावधानी से एस्पिरेट करें, और ट्यूब को तरल एन2 में रखकर सेल गोली को स्नैप-फ्रीज करें। जमे हुए गोली को -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें, जब तक कि लाइसिस और पुलडाउन के साथ आगे बढ़ने के लिए तैयार न हो जाएं।

2. सेल लाइसिस और बायोटिन पुलडाउन

  1. बर्फ पर जमे हुए सेल गोली को पिघलाएं।
  2. गोली में 2x लाइसिस बफर के 500 μL जोड़ें, अच्छी तरह से मिलाएं, और 30 सेकंड के लिए भंवर।
    नोट: गोली को पूरी तरह से अलग करने के लिए जोरदार पाइपिंग और भंवर की आवश्यकता हो सकती है। कुछ अघुलनशील मलबे (यानी, डीएनए) स्वीकार्य हैं, क्योंकि इसे बाद के सोनिकेशन चरण में हटा दिया जाता है।
  3. सेल लाइसेट को बर्फ पर रखें (तीन विस्फोट, 20 सेकंड, 60% ड्यूटी चक्र)।
  4. किसी भी शेष मलबे को पेलेट करने के लिए लाइसेट को सेंट्रीफ्यूज करें (17,200 ग्राम पर 10 मिनट × 4 डिग्री सेल्सियस पर)।
  5. जबकि लाइसेट सेंट्रीफ्यूजिंग है, एक निस्पंदन स्तंभ में 100 μL न्यूट्राविडिन एगारोज़ राल मोती जोड़ें। कॉलम को वैक्यूम मैनिफोल्ड में संलग्न करें, एक सौम्य वैक्यूम लागू करें, और उनके ऊपर 3 एमएल वॉश बफर 1 प्रवाहित करके मोतियों को धोएं।
  6. वैक्यूम से निस्पंदन स्तंभ को कई गुना हटा दें, नीचे को कैप करें, और मोतियों के साथ कॉलम में स्पष्ट सेल लाइसेट जोड़ें। स्तंभ के शीर्ष को कैप करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 120 मिनट के लिए एंड-टू-एंड रोटर पर मोतियों के साथ लाइसेट को इनक्यूबेट करें।
    नोट: कॉलम के शीर्ष को कैप करते समय, नीचे की टोपी को मजबूती से पकड़ें, अन्यथा यह हटा दिया जा सकता है और इनक्यूबेशन के दौरान सेल लाइसेट लीक हो सकता है।
  7. वॉश बफर 1, 2, और 3 तैयार करें (प्रति नमूना प्रत्येक वॉश बफर का लगभग 5 एमएल, तालिका 1 देखें), और उन्हें 42 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें।
  8. लाइसेट के इनक्यूबेशन समाप्त होने के बाद, निस्पंदन स्तंभ को वैक्यूम पर वापस रखें, एक सौम्य वैक्यूम लागू करें, और उनके ऊपर 5 मिलीलीटर वॉश बफर 1 बहकर मोतियों को धो लें।
    नोट: धोने के लिए 5 एमएल से अधिक वॉश बफर का उपयोग किया जा सकता है; अतिरिक्त धोने से पृष्ठभूमि कम हो सकती है, मोतियों पर गैर-विशिष्ट बंधन।
  9. वॉश बफर 2 के 5 एमएल के साथ वॉश स्टेप को दोहराएं।
  10. वॉश बफर 3 के 5 एमएल के साथ वॉश स्टेप को दोहराएं।
  11. एक बार जब अंतिम वॉश बफर पूरी तरह से मोतियों के माध्यम से बह जाता है, तो कॉलम को कई गुना से हटा दें। मोतियों में "लाइस" समाधान के 100 μL जोड़ें और उन्हें एक पाइप के साथ 1.7 मिलीलीटर कम-प्रोटीन-बाध्यकारी माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। मोतियों को व्यवस्थित करने के लिए ट्यूब को संक्षेप में स्पिन करें, और बसे हुए मोतियों को परेशान किए बिना घोल के 50 μL को हटा दें।
    नोट: इस चरण में अभिकर्मक और बाद के सभी चरण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटिओमिक्स नमूना तैयारी किट का उपयोग करते हैं। किट एक अनुकूलित, सरलीकृत नमूना तैयारी वर्कफ़्लो प्रदान करता है। हालांकि, इन चरणों को पारंपरिक प्रोटिओमिक्स वर्कफ़्लो का उपयोग करके किट से स्वतंत्र भी किया जा सकता है, जैसा कि वर्मा एट अल.9 में वर्णित है। यदि मोती स्तंभ के किनारे या नीचे चिपके रहते हैं, तो ट्यूब में स्थानांतरित किए गए मोतियों को व्यवस्थित होने की अनुमति दें, और शेष मोतियों को स्थानांतरित करने के लिए ट्यूब में अतिरिक्त "लाइस" समाधान का उपयोग करें।
  12. ट्यूब को 65 डिग्री सेल्सियस पर हीट ब्लॉक / शेकर पर रखें, और 10 मिनट के लिए 1,000 आरपीएम पर हिलाएं।
    नोट: पाचन से पहले सिस्टीन अवशेषों की कमी और क्षारीकरण के लिए यह कदम आवश्यक है।

3. प्रोटीन पाचन

  1. सूखे ट्रिप्सिन (किट में "डाइजेस्ट" ट्यूब, -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) को "रिसुसस्पेंड" समाधान के 210 μL जोड़कर पुन: निलंबित करें। सभी सूखे ट्रिप्सिन को फिर से निलंबित करने के लिए घोल को कई बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  2. इनक्यूबेशन पूरा होने के बाद, मोतियों में पुन: निलंबित ट्रिप्सिन समाधान के 50 μL जोड़ें। प्रोटीन को पचाने के लिए कम से कम 90 मिनट के लिए 500 आरपीएम पर हिलाते हुए, 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
  3. एक बार पाचन पूरा हो जाने के बाद, मोतियों वाले घोल को एक स्पिन कॉलम में स्थानांतरित करें, और कॉलम को 1.7 एमएल कम-प्रोटीन-बाइंडिंग माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें। मोतियों से पचे हुए पेप्टाइड समाधान को अलग करने के लिए ट्यूब (कमरे के तापमान [आरटी] पर 5 मिनट के लिए 500 × ग्राम ) को स्पिन करें।
    नोट: इस स्तर पर, पीएनगेज उपचार मोतियों पर किया जा सकता है जब वे पेप्टाइड समाधान से अलग हो जाते हैं, स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों से बायोटिनीलेटेड पेप्टाइड टुकड़े निकालने के लिए। इस पेप्टाइड नमूने को तब वर्कफ़्लो के शेष भाग के माध्यम से एक अलग, द्वितीयक पेप्टाइड नमूने के रूप में आगे बढ़ाया जा सकता है जिसका विश्लेषण किया जा सकता है और ऑन-बीड ट्रिप्सिनाइजेशन से प्राथमिक नमूने के साथ तुलना की जा सकती है। पीएनगेज दृष्टिकोण एमएस-पता लगाने योग्य साइड चेन संशोधन12 के आधार पर कैप्चर किए गए एन-ग्लाइकोसिलेटेड शतावरी के लिए अतिरिक्त विशिष्टता को देखते हुए, ऑन-बीड ट्रिप्सिनाइजेशन के लिए पूरक डेटा प्रदान करने की संभावना है। हालांकि, इस अनुक्रमिक क्षालन दृष्टिकोण का दोष प्रति नमूना विश्लेषण के द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर उपकरण समय से दोगुना की आवश्यकता है।
  4. पाचन प्रतिक्रिया को रोकने और पेप्टाइड समाधान को अम्लीय करने के लिए "स्टॉप" समाधान के 100 μL जोड़ें।

4. पेप्टाइड डीसाल्टिंग

  1. एक ट्यूब एडाप्टर का उपयोग करके, 1.7 एमएल कम-प्रोटीन-बाइंडिंग माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एक डीसाल्टिंग कॉलम रखें। कॉलम में पूरे अम्लीय पेप्टाइड समाधान जोड़ें। स्तंभ (3 मिनट के लिए 3,800 × ग्राम ) को स्पिन करें ताकि समाधान स्तंभ के माध्यम से प्रवाहित हो। पेप्टाइड्स अब कॉलम से बंधे हैं; प्रवाह को छोड़ दें।
  2. कॉलम में "वॉश 1" समाधान के 200 μL जोड़ें और स्पिन करें (3 मिनट के लिए 3,800 × ग्राम , आरटी)। प्रवाह को छोड़ दें।
  3. कॉलम में "वॉश 2" समाधान के 200 μL जोड़ें और स्पिन करें (3 मिनट के लिए 3,800 × ग्राम , आरटी)। प्रवाह को छोड़ दें।
  4. कॉलम को एक नए में स्थानांतरित करें, जिसे 1.7 एमएल कम-प्रोटीन-बाइंडिंग माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब लेबल किया गया है। कॉलम में "एल्यूट" समाधान के 100 μL जोड़ें और स्पिन करें (3 मिनट के लिए 3,800 × ग्राम , आरटी)। कॉलम में "एल्यूट" समाधान के एक और 100 μL जोड़ें और स्पिन करें (3 मिनट के लिए 3,800 × ग्राम , आरटी)। पेप्टाइड्स को अब ट्यूब में कॉलम से हटा दिया जाता है।
  5. पेप्टाइड समाधान को वैक्यूम सेंट्रीफ्यूज में रखें और इसे रात भर सूखने दें। सूखे हुए पेप्टाइड्स को -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें जब तक कि मात्रा निर्धारित करने के लिए तैयार न हों, और मास स्पेक्ट्रोमीटर पर विश्लेषण करें।

5. पेप्टाइड रिसस्पेंशन और परिमाणीकरण

  1. विलायक ए (0.1% फॉर्मिक एसिड, 2% एसिटोनिट्राइल) के 20 μL में सूखे पेप्टाइड्स को फिर से निलंबित करें।
  2. किसी भी अघुलनशील मलबे को पेलेट करने के लिए पुन: निलंबित पेप्टाइड्स (10 मिनट के लिए 17,200 × ग्राम ) को सेंट्रीफ्यूज करें।
  3. वर्णमिति पेप्टाइड परिमाणीकरण परख के लिए पेप्टाइड मानक तैयार करें।
    1. 96-वेल प्लेट के एक कुएं में 1,000 मिलीग्राम / एमएल पेप्टाइड स्टॉक समाधान के 5 μL रखें।
    2. विआयनीकृत (डीआई) पानी के साथ प्लेट में सात-चरण यी सीरियल तनुकरण करें, निम्नानुसार प्रत्येक मानक के 5 μL प्रति कुएं: 1,000 मिलीग्राम / एमएल, 500 मिलीग्राम / एमएल, 250 मिलीग्राम / एमएल, 125 मिलीग्राम / एमएल, 62.5 मिलीग्राम / एमएल, 31.25 मिलीग्राम / एमएल, और 15.625 मिलीग्राम / एमएल। रिक्त स्थान के लिए आठवें कुएं में 5 μL DI पानी रखें।
  4. 96-वेल प्लेट के तीन अलग-अलग कुओं में 4 μL DI पानी रखें। 5 μL की कुल मात्रा के लिए, प्रत्येक कुएं में पुन: निलंबित पेप्टाइड समाधान का 1 μL जोड़ें।
    नोट: परिमाणीकरण के लिए पेप्टाइड समाधान को पाइप करते समय, किसी भी बसे हुए मलबे को परेशान करने से रोकने के लिए समाधान के शीर्ष से सावधानीपूर्वक पाइप करें।
  5. गणना करें कि कितने काम करने वाले अभिकर्मक की आवश्यकता है (प्रति कुएं 45 μL की आवश्यकता है)। रंगीन परख काम करने वाले अभिकर्मक की आवश्यक मात्रा तैयार करें; घटकों के उचित मिश्रण को सुनिश्चित करने के लिए काम करने वाले अभिकर्मक को भंवर करें।
  6. मानक और नमूना कुओं में से प्रत्येक में काम करने वाले अभिकर्मक के 45 μL जोड़ें।
    नोट: मानकों को डुप्लिकेट में बनाएं, और कुओं में अभिकर्मक जोड़े जाने के समय में न्यूनतम अंतर सुनिश्चित करने के लिए एक मल्टीचैनल पाइप का उपयोग करें।
  7. प्लेट को एल्यूमीनियम पन्नी में कवर करें और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  8. एक स्वचालित प्लेट रीडर पर प्लेट का विश्लेषण करें। एक रैखिक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए मानक नमूने के लिए दर्ज अवशोषण मूल्यों का उपयोग करें। मानक वक्र औरR2 मान का समीकरण ज्ञात कीजिए। यदि आर2 मान उचित है (≥0.95), तो पुन: निलंबित पेप्टाइड्स की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए मानक वक्र का उपयोग करें, जो वर्णमिति परख प्लेट में पांच गुना कमजोर पड़ने के लिए जिम्मेदार है।

6. तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस / एमएस) पचे हुए पेप्टाइड्स का विश्लेषण

  1. विलायक ए जोड़कर पेप्टाइड नमूनों की एकाग्रता को 0.2 μg / μL में समायोजित करें, और 10 μL को 0.6 mL कम-प्रोटीन-बाइंडिंग ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  2. ट्यूब को एलसी ऑटोसैंपलर में रखें।
  3. चित्रा 2 और चित्रा 3 के अनुसार एलसी और एमएस / एमएस पैरामीटर सेट करें।
  4. विश्लेषण के लिए एलसी-एमएस /एमएस सेटअप में पेप्टाइड नमूने के 5 μL (1 μg) इंजेक्ट करें।
    नोट: यहां दिखाए गए एलसी-एमएस / एमएस सेटिंग्स केवल चित्रों के लिए प्रतिनिधि हैं। एलसी और एमएस उपकरण उपलब्धता के आधार पर, उपयोगकर्ता गहरी प्रोटिओम कवरेज प्राप्त करने के लिए एलसी ग्रेडिएंट और एमएस / एमएस पैरामीटर के लिए सेटिंग्स को संशोधित कर सकते हैं। इस पेपर के लिए, एमएस डेटा विश्लेषण मैक्सक्वांट https://www.maxquant.org/ का उपयोग करके किया गया था, द्वितीयक डेटा विश्लेषण पर्सियस https://maxquant.net/perseus/ का उपयोग करके किया गया था, और https://reactome.org/ का उपयोग करके मार्ग विश्लेषण किया गया था।

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Representative Results

इस प्रयोग के लिए, हमने बायोटिन के साथ बरकरार कोशिकाओं के एन-ग्लाइकोसिलेटेड झिल्ली प्रोटीन को लेबल करके एक ट्यूमर सेल लाइन के सेल सतह प्रोटिओम की विशेषता बताई, और पूरे सेल लाइसेट से इन लेबल किए गए प्रोटीन को न्यूट्राविडिन पुलडाउन के साथ समृद्ध किया (चित्रा 1)। इसके अलावा, हमने समृद्ध सेल सतह प्रोटीन को चिह्नित करने के लिए एलसी-एमएस / एमएस का उपयोग करके प्रोटिओम विश्लेषण किया। पूरे सेल प्रोटिओम विश्लेषण के विपरीत, यहां, उद्देश्य केवल सेल सतह प्रोटीन को चिह्नित करना था। इसलिए, हमने 3.5 × 107 एएमओ -1 प्लाज्मासाइटोमा कोशिकाओं के नमूना इनपुट के साथ शुरुआत की। हमने कलरमेट्रिक पेप्टाइड परिमाणीकरण परख के आधार पर ~ 630 एनजी / μL की अंतिम पेप्टाइड एकाग्रता प्राप्त की, और कुल उपज ~ 12.6 μg पेप्टाइड्स (20 μL में) थी (चित्रा 2 ए)। फिर हमने एलसी-एमएस / एमएस सिस्टम में पेप्टाइड नमूने के 1 μg को इंजेक्ट किया, और तकनीकी प्रतिकृति के लिए इंजेक्शन को तीन बार दोहराया। उपयोग किए गए एलसी और एमएस मापदंडों को पूर्व प्रयोगों (चित्रा 2 सी और चित्रा 3 ए) के आधार पर अनुकूलित किया गया था। हमने अधिकतम कवरेज सुनिश्चित करने के लिए 4 घंटे की लंबी एलसी ढाल का उपयोग किया।

एलसी-एमएस / एमएस डेटा का विश्लेषण मैक्सक्वांट का उपयोग करके किया गया था; हम कम से कम एक अद्वितीय पेप्टाइड के साथ 2,221 प्रोटीन और सभी तीन प्रतिकृतियों में कम से कम दो अद्वितीय पेप्टाइड्स के साथ 1,764 प्रोटीन की पहचान करने में सक्षम थे। कुल मिलाकर, 12,307 अद्वितीय पेप्टाइड्स की पहचान की गई थी। हमने एक पायथन स्क्रिप्ट का उपयोग करके नमूने में सेल सतह प्रोटीन संवर्धन निर्धारित किया (हमारे द्वारा उपयोग की जाने वाली सटीक स्क्रिप्ट पूरक चित्रा एस 1 में पाई जा सकती है) जो मैक्सक्वांट से प्राप्त परिणामों की तुलना सेल सतह प्रोटीन के कई स्थापित डेटासेट से करती है। इन डेटासेट में पहले रिपोर्ट किए गए " इन सिलिको सरफेसोम" 3 और यूनिप्रोट13 में झिल्ली-स्थानीयकृत के रूप में एनोटेट किए गए प्रोटीन से स्थापित एक डेटासेट शामिल है (डेटासेट पूरक तालिका एस 1 में उपलब्ध हैं)। इस विश्लेषण ने हमारे नमूने में 601 सतह प्रोटीन प्राप्त किए (पहचाने गए सभी प्रोटीनों का लगभग 27%) (चित्रा 4 ए)। जीन ऑन्कोलॉजी एनोटेशन (http://geneontology.org/) किया गया था, जिसने लगभग 30% प्रोटीन को प्लाज्मा झिल्ली में विहित रूप से स्थानीयकृत होने का संकेत दिया था। रिएक्टोम पाथवे विश्लेषण (https://reactome.org/) ने ट्रांस-मेम्ब्रेन परिवहन और सेल सतह इंटरैक्शन (चित्रा 5 और पूरक तालिका एस 2) में शामिल झिल्ली प्रोटीन के सापेक्ष संवर्धन का भी संकेत दिया।

Figure 1
चित्रा 1: सेल सतह लेबलिंग के लिए वर्कफ़्लो और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए बाद में नमूना तैयारी। सबसे पहले, वांछित सेलुलर नमूने की सतह पर प्रोटीन को बायोटिन के साथ लेबल किया जाता है। इन कोशिकाओं को तब लाइसिस किया जाता है, इसके बाद न्यूट्राविडिन मोतियों के साथ इनक्यूबेशन जाता है जो बायोटिन-लेबल प्रोटीन को बांधते हैं। इंट्रासेल्युलर प्रोटीन और अन्य दूषित पदार्थों को हटाने के लिए मोतियों को बार-बार धोया जाता है। प्रोटीन का नमूना तब ट्रिप्सिन के अलावा एक ऑन-बीड पाचन से गुजरता है। पेप्टाइड टुकड़ों का परिणामी नमूना तब धोने और पाचन चरणों से दूषित पदार्थों को हटाने के लिए डीसाल्टिंग से गुजरता है। अंतिम पेप्टाइड नमूना तब सूख जाता है और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण से गुजरने के लिए तैयार होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: कलरिमेट्रिक पेप्टाइड परिमाणीकरण मानक वक्र और एलसी ढाल। (ए) संसाधित नमूनों में पेप्टाइड एकाग्रता निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले कलरिमेट्रिक पेप्टाइड परिमाणीकरण परख द्वारा उत्पन्न आठ-बिंदु मानक वक्र। (बी) नमूनों को संसाधित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एलसी-एमएस / एमएस प्रणाली का एक चित्रण। (सी) मास स्पेक्ट्रोमीटर पर नमूनों के इंजेक्शन के लिए उपयोग की जाने वाली तरल क्रोमैटोग्राफी ढाल और प्रवाह दर। संक्षेप: एलसी-एमएस / एमएस = तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: मास स्पेक्ट्रोमेट्री पैरामीटर और प्रतिनिधि क्रोमैटोग्राम । (ए) ऑर्बिटरैप मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके इस प्रयोग के लिए उपयोग किए जाने वाले पैरामीटर। (बी) 4 एच ढाल के लिए "सेल सतह कैप्चर" प्रोटोकॉल के बाद मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण द्वारा उत्पन्न प्रतिनिधि क्रोमैटोग्राम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: सेल सतह प्रोटीन संवर्धन विश्लेषण और तकनीकी प्रतिकृति की तुलना। इन डेटासेट में पहले रिपोर्ट किए गए " इन सिलिको सरफेसोम" 3 और यूनिप्रोट13 में झिल्ली-स्थानीयकृत के रूप में एनोटेट किए गए प्रोटीन से स्थापित एक डेटासेट शामिल है। (ए) दूषित पदार्थों, रिवर्स प्रोटीन और क्यू-वैल्यू को हटाने के बाद एक अलग कट-ऑफ के साथ पहचाने जाने वाले प्रोटीन और पेप्टाइड्स की संख्या 0.05 >। (बी) प्लॉट पहचाने गए प्रोटीन और एंड्रोमेडा स्कोर14 के वितरण का प्रतिनिधित्व करता है। (सी) स्कैटर प्लॉट नमूना-से-नमूना सहसंबंध को दर्शाता है। स्पीयरमैन का रैंक सहसंबंध दो रैंक चर के बीच सहयोग की ताकत और दिशा को मापता है। (डी) रन-टू-रन भिन्नता को दर्शाने वाले बॉक्स प्लॉट। (ङ) प्रतिकृतियों की डेटा गुणवत्ता को दर्शाने वाला नमूना-वार वितरण प्लॉट। संक्षिप्त नाम: एलएफक्यू = लेबल-मुक्त मात्रा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: मार्ग विश्लेषण। पाथवे विश्लेषण रिएक्टोम संस्करण 8222 का उपयोग करके किया गया था। संवहनी दीवार पर सेल सतह इंटरैक्शन का एक चित्रण चित्रण, एंडोथेलियम के साथ प्लेटलेट और ल्यूकोसाइट इंटरैक्शन में शामिल प्रमुख इंटरैक्शन के लिए सेल सतह प्रोटिओम के संवर्धन का प्रदर्शन करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अभिकर्मक का नाम संयोजन गोदाम
100 mM बायोसाइटिन हाइड्राज़ाइड पाउडर के रूप में बायोसाइटिन हाइड्राजाइड डीएमएसओ में घुल गया। 50 μL एलिकोट में विभाजित करें और 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
160 mM सोडियम मेटापीरियड (NaIO4) ठोस NaIO4 DI पानी में घुल गया। 50 μL एलिकोट में विभाजित करें और 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
2x RIPA लाइसिस बफर 2x RIPA लाइसिस बफर, 1.25 mM EDTA, एकल उपयोग प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल 10x RIPA लाइसिस बफर का उपयोग करने से पहले हर बार ताजा तैयार करें।
पेप्टाइड कलरिमेट्रिक परख काम करने वाले अभिकर्मक 50% अभिकर्मक A, 48% अभिकर्मक B, 2% अभिकर्मक C उपयोग करने से पहले हर बार ताजा तैयार करें। घटकों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
विलायक ए 0.1% फॉर्मिक एसिड, 2% एसिटोनिट्राइल समय से पहले तैयार कर सकते हैं और कमरे के तापमान पर स्टोर कर सकते हैं
वॉश बफर 1 1x RIPA लाइसिस बफर, 1 mM EDTA पहले से बड़े बैच तैयार कर सकते हैं और कमरे के तापमान पर स्टोर कर सकते हैं
वॉश बफर 2 1x PBS, 1 M NaCl पहले से बड़े बैच तैयार कर सकते हैं और कमरे के तापमान पर स्टोर कर सकते हैं
वॉश बफर 3 2 एम यूरिया, 50 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट हर बार ताजा तैयार करें क्योंकि यूरिया समय के साथ जल्दी से खराब हो जाएगा।

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले बफर और अभिकर्मक समाधान।

पूरक चित्रा एस 1: मैक्सक्वांट से प्राप्त परिणामों की तुलना सेल सतह प्रोटीन के कई स्थापित डेटासेट से करने के लिए पायथन स्क्रिप्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 1: सेल सतह प्रोटीन के डेटासेट। इन डेटासेट में पहले रिपोर्ट किए गए " इन सिलिको सरफेसोम" 3 और यूनिप्रोट13 में झिल्ली-स्थानीयकृत के रूप में एनोटेट किए गए प्रोटीन से स्थापित एक डेटासेट शामिल है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 2: 10 सबसे प्रासंगिक मार्ग ( पी मान द्वारा क्रमबद्ध) यहां प्रस्तुत किए गए हैं। संक्षेप: एफडीआर = झूठी खोज दर; एसएलसी = विलेय वाहक; टीसीआर = टी सेल रिसेप्टर। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटिओमिक्स एक शक्तिशाली उपकरण है जिसने पहले असंभव पैमाने पर हजारों अज्ञात प्रोटीनों के निष्पक्ष लक्षण वर्णन को सक्षम किया है। यह दृष्टिकोण हमें प्रोटीन की पहचान और मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देता है, साथ ही किसी विशेष नमूने में मौजूद प्रोटीन की विविधता को चिह्नित करके कोशिकाओं और ऊतकों की संरचनात्मक और सिग्नलिंग क्षमताओं के लिए अंतर्दृष्टि की एक श्रृंखला प्राप्त करता है। एक नमूने में वैश्विक प्रोटीन प्रोफाइलिंग से आगे बढ़ते हुए, मास स्पेक्ट्रोमेट्री हमें इन प्रोटीनों पर विभिन्न पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएम) को चिह्नित करने की अनुमति देता है, जो डीएनए या आरएनए स्तर1 पर विश्लेषण करते समय उपलब्ध सिग्नलिंग मार्गों और प्रोटीन गतिशीलता के चरणों में और भी गहरी झलक प्रदान करता है। नोवेल कैंसर चिकित्सीय के विकास की ओर, मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटिओमिक्स हमें संभावित दवा योग्य लक्ष्यों की पहचान करने के लिए घातक ट्यूमर कोशिकाओं बनाम स्वस्थ ऊतकों के प्रोटीन प्रोफाइल की तुलना करने की अनुमति देता है।

कैंसर इम्यूनोथेरेपी का तेजी से बढ़ता क्षेत्र ट्यूमर की पहचान करने और चुनिंदा रूप से नष्ट करने के लिए घातक कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त एंटीजन पर निर्भर करता है। चूंकि नोवेल कैंसर इम्यूनोथेरेपी का विकास अद्वितीय कैंसर-विशिष्ट एंटीजन की कमी से सीमित है, जो स्वस्थ ऊतकों में अनुपस्थित हैं, इसलिएट्यूमर कोशिकाओं के लिए विशिष्ट अधिक नए एंटीजन की पहचान करना महत्वपूर्ण है। ट्यूमर विशिष्ट एंटीजन को ट्यूमर सेल के लिए अद्वितीय पूरे प्रोटीन की आवश्यकता नहीं होती है, लेकिन स्वस्थ ऊतकों16,17 में अनुपस्थित विशिष्ट प्रोटीन रचना या पीटीएम भी हो सकते हैं। ट्यूमर और स्वस्थ कोशिकाओं दोनों पर सेल सतह प्रोटीन का प्रोटिओमिक विश्लेषण नए कैंसर-विशिष्ट एंटीजन लक्ष्य प्राप्त कर सकता है। सेल सतह प्रोटिओमिक्स को मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण से पहले पूरे सेल लाइसेट से सतह प्रोटीन के संवर्धन की आवश्यकता होती है, ताकि नमूने की जटिलता को कम किया जा सके और अत्यधिक व्यक्त इंट्रासेल्युलर प्रोटीन द्वारा वांछितझिल्ली प्रोटीन (अक्सर कम बहुतायत) के आयन दमन से बचा जा सके। जबकि यहां नियोजित सेल सतह कैप्चर रणनीति सेल सतह प्रोटिओमिक्स के लिए सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले संवर्धन दृष्टिकोणों में से एक है, सेल सतह प्रोटीन संवर्धन के लिए अन्य तरीके हैं जिन्हें मास स्पेक्ट्रोमेट्री वर्कफ़्लो के साथ एकीकृत किया गया है, जिसमें सेलुलर झिल्ली का चयनात्मक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन, सतह लाइसिन का एनएचएस-बायोटिन लेबलिंग और सेलसतह प्रोटीन का एंजाइम-मध्यस्थता बायोटिनाइलेशन शामिल है। 20. हेड-टू-हेड तुलना से पता चलता है कि सेल सतह कैप्चर दृष्टिकोण इंट्रासेल्युलर प्रोटीन20 की सबसे कम पृष्ठभूमि लेबलिंग के साथ सेल सतह प्रोटीन के उपयोग में आसानी और सफल, अपेक्षाकृत निष्पक्ष संवर्धन का इष्टतम संतुलन प्रदान करता है।

यह पेपर एक अनुकूलित प्रोटिओमिक्स नमूना तैयारी वर्कफ़्लो (चित्रा 1) के साथ सेल सतह लेबलिंग और पुलडाउन प्रक्रिया को एकीकृत करके सेल सतह प्रोटिओमिक्स वर्कफ़्लो के लिए एक प्रभावी और समय कुशल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। सुसंस्कृत कोशिकाओं की कटाई से लेकर मास स्पेक्ट्रोमीटर पर विश्लेषण तक की पूरी प्रक्रिया, 3 दिनों के दौरान हासिल की जा सकती है। सतह प्रोटिओम के सबसे मजबूत कवरेज प्राप्त करने के लिए, कोशिकाओं के प्रारंभिक इनपुट को उपयोग किए जा रहे सेल प्रकार के आधार पर अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है। अधिकतम कवरेज सुनिश्चित करने के लिए कुछ मिलियन कोशिकाओं से लेकर 50 मिलियन कोशिकाओं तक अलग-अलग सेल इनपुट के साथ एक पायलट प्रयोग करने की सिफारिश की जाती है। इसके अतिरिक्त, यदि अत्यधिक व्यक्त इंट्रासेल्युलर प्रोटीन की एक बड़ी मात्रा देखी जाती है, तो लाइसेट के साथ इनक्यूबेशन के बाद न्यूट्राविडिन मोतियों की धुलाई में वृद्धि मोतियों के लिए प्रोटीन के गैर-विशिष्ट बंधन को कम कर सकती है।

हम प्रति स्थिति कम से कम तीन जैविक प्रतिकृति और तीन तकनीकी प्रतिकृति के साथ प्रयोग करने की सलाह देते हैं, ताकि विश्वास बढ़ाया जा सके कि पहचाने गए सेल सतह मार्कर वास्तव में अधिकांश कोशिकाओं पर मौजूद हैं। इसके अतिरिक्त, एक नए नमूना प्रकार के लिए सेल सतह कैप्चर वर्कफ़्लो करते समय, सेल सतह कैप्चर परिणामों के साथ तुलना करने के लिए पारंपरिक शॉटगन प्रोटिओमिक्स दृष्टिकोण21 का उपयोग करके पूरे सेल लाइसेट का विश्लेषण करना सहायक हो सकता है। कच्चे मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा का विश्लेषण विभिन्न डेटाबेस खोज और सॉफ्टवेयर पैकेजों द्वारा किया जा सकता है- यहां, हमने मैक्सक्वांट का उपयोग किया- पहचाने गए प्रोटीन22,23 की एक सूची प्राप्त करने के लिए। इस सूची को एक ही प्रयोग में पहचाने गए सेल सतह प्रोटीन की सूची स्थापित करने के लिए सतह प्रोटीन के विभिन्न ज्ञात डेटाबेस 3,24 के खिलाफ फ़िल्टर किया जा सकता है। एक बार सेल सतह प्रोटीन की एक सूची स्थापित हो जाने के बाद, उन्हें प्रासंगिक जैव रासायनिक मार्ग25 या दवा लक्ष्यउम्मीदवारों 26 में उनकी भूमिका के लिए आगे विश्लेषण किया जा सकता है। इस वर्कफ़्लो को विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों पर लागू किया जा सकता है, जिसमें निलंबन और अनुयायी सेल लाइनें शामिल हैं (अनुयायी कोशिकाओं के लिए, हम नमूना तैयार करने से पहले ट्रिप्सिन के उपयोग के बिना कोशिकाओं को उठाने की सलाह देते हैं, सेल सतह प्रोटीन की दरार से बचने के लिए), साथ ही प्राथमिक नमूने भी।

इस वर्कफ़्लो का उपयोग करके, हम आत्मविश्वास से एक विशेष सेल लाइन के सेल सतह प्रोटिओम को चिह्नित करने में सक्षम थे। स्वस्थ कोशिकाओं के खिलाफ ट्यूमर सेल लाइनों की सतह प्रोटिओम की तुलना करके, और सामान्य ऊतकों के लिए आरएनए अनुक्रमण डेटाबेस के साथ क्रॉस-संदर्भित करके, संभावित इम्यूनोथेराप्यूटिक लक्ष्यों की एकसूची स्थापित की जा सकती है। इस विधि की एक सीमा यह है कि, एक मानक पूरे सेल लाइसेट प्रयोग के खिलाफ सेल सतह प्रोटीन के महत्वपूर्ण संवर्धन के बावजूद, इस वर्कफ़्लो में मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण द्वारा पहचाने गए अधिकांश प्रोटीन अभी भी इंट्रासेल्युलर के रूप में एनोटेट किए गए हैं। उपयोग किए गए सतह प्रोटीन डेटाबेस की स्ट्रिंगेंसी के आधार पर, पहचाने गए प्रोटीन का लगभग 25% -30% सेल सतह से होता है। हम अनुमान लगाते हैं कि गैर-सतह पृष्ठभूमि का एक महत्वपूर्ण हिस्सा संभवतः पृष्ठभूमि प्रोटीन से निकलता है जो विशेष रूप से मोतियों से बंधा नहीं होता है (उदाहरण के लिए, जैसा कि क्रैपोम27 विश्लेषण की विशेषता है), जबकि अन्य एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम, गोल्गी या अन्य इंट्रासेल्युलर डिब्बों में एन-ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए लेबलिंग अभिकर्मक के सेल प्रवेश का प्रतिनिधित्व करते हैं।

जबकि पीएनगेज उपचार जैसे वैकल्पिक पेप्टाइड क्षालन विधियों के परिणामस्वरूप विश्लेषण किए गए कुल पेप्टाइड्स के बीच एन-ग्लाइकोसाइट्स का बहुत अधिक संवर्धन होता है, यह दृष्टिकोण केवल व्यक्तिगत ग्लाइकोसिलेटेड पेप्टाइड्स की पहचान की अनुमति देता है, और खींचे गए प्रोटीन अनुक्रम12 के गैर-ग्लाइकोसिलेटेड शेष से मूल्यवान जानकारी खो देता है। इस अतिरिक्त जानकारी को इस ऑन-बीड ट्रिप्सिनाइजेशन दृष्टिकोण के साथ कैप्चर किया जा सकता है, हालांकि मास स्पेक्ट्रोमीटर में विश्लेषण किए गए एन-ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन के लिए कम विशिष्टता के संभावित व्यापार पर। इसके अलावा, यहां तक कि पीएनगास क्षालन इंट्रासेल्युलर ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन को लेबल करने की चुनौती को दूर नहीं करता है, और एक पीएनगेज क्षालन आमतौर पर प्रति प्रोटीन केवल एक पेप्टाइड की ओर जाता है; यह हमारी प्रयोगशाला के अनुभव के अनुसार प्रोटीन की पहचान में महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता की ओर जाता है, जबकि यहां वर्णित ऑन-बीड पाचन प्रति कैप्चर प्रोटीन में कई पेप्टाइड्स की ओर जाता है। इसलिए, प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर, कोई संभावित रूप से सेल सतह कैप्चर रणनीति को नियोजित करने के लिए विभिन्न रणनीतियों का चयन कर सकता है। इन रणनीतियों में छोटे नमूना इनपुट28 के लिए सेल सतह कैप्चर प्रोटोकॉल का लघुकरण और स्वचालन और आवेदन के आधार पर अलग-अलग बाध्यकारी क्षमता29 के स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों का उपयोग करना शामिल है। यहां चित्रित विधि और वर्कफ़्लो सेल सतह प्रोटीन संवर्धन के लिए एक मजबूत, आसानी से प्रदर्शन करने वाली सामान्य रणनीति के रूप में कार्य करता है।

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Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम एलसी-एमएस/एमएस रन स्थापित करने में मदद के लिए डॉ. कमल मंडल (प्रयोगशाला चिकित्सा विभाग, यूसीएसएफ), डेटा विश्लेषण में मदद के लिए दीपतरूप बिस्वास (बीएसबीई, आईआईटी बॉम्बे) और डेटा विश्लेषण में मदद के लिए डॉ ऑड्रे रीव्स (प्रयोगशाला चिकित्सा विभाग, यूसीएसएफ) को धन्यवाद देते हैं। एपीडब्ल्यू प्रयोगशाला में संबंधित कार्य एनआईएच आर 01 सीए 226851 और चान जुकरबर्ग बायोहब द्वारा समर्थित है। चित्रा 1 और चित्रा 2 बी BioRender.com का उपयोग करके बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kits
96X iST Sample Preparation Kit PreOmics P.O.00027 Proteomics sample preparation kit. Includes reagents for reduction, alkylation, and digestion. Also include desalting columns and reagents. 
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay Thermo 23275 Peptide quantification kit. Includes peptide standards and components of working reagents. 
Reagents
Acetonitrile Fisher A955-1
Ammonium bicarbonate Millipore Sigma 09830-1KG
Biocytin hydrazide Biotium 90060
D-PBS (w/o Calcium and Magnesium Salts) UCSF Cell Culture Facility CCFAL003-225B01
Formic Acid Honeywell 94318
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Single-Use Cocktail Thermo 1861280
High Capacity Neutravidin Agarose Resin Thermo 29204
Phosphate Buffered Saline UCSF Cell Culture Facility CCFAL001-22J01
RIPA Lysis Buffer, 10x Millipore Sigma 20-188
Sodium chloride Fisher BP358-212
Sodium metaperiodate Alfa Aesar 13798
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Invitrogen 15575-038
Urea (Proteomics Grade) VWR M123-1KG
Equipment
TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad 1450102
PrismR Microcentrifuge Labnet International C2500-R-230V
Sonicator VWR Branson Sonifier 240
Vacuum Manifold Promega Promega Vac-Man
Shaking Heatblock Eppendorf Eppendorf Thermomixer C
End-to-End rotator Labnet Revolver Adjustable Rotator
LC Thermo Ultimate 3000 HPLC and UHPLC
Q Exactive Plus Hybrid Quadrapole Orbitrap Mass Spectrometer Thermo IQLAAEGAAPFALGMBDK
Microplate Reader Biotek Biotek Synergy 2 
Vacuum Concentrator Labconco 7810010
Supplies
1.5 mL Protein LoBind Tubes Eppendorf 22431081
1.7 mL Microcentrifuge Tubes
Filtration Columns Bio-Rad 7326008
Spin Columns Thermo 69725

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References

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जैव रसायन अंक 193
सेल सरफेस प्रोटिओम के लेबल-फ्री परिमाणीकरण के लिए "सेल सरफेस कैप्चर" वर्कफ़्लो
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Naik, A., Srivastava, S., Wiita, A.… More

Naik, A., Srivastava, S., Wiita, A. P. "Cell Surface Capture" Workflow for Label-Free Quantification of the Cell Surface Proteome. J. Vis. Exp. (193), e64952, doi:10.3791/64952 (2023).

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