Summary
Aquí, describimos un flujo de trabajo proteómico para la caracterización del proteoma de la superficie celular de varios tipos celulares. Este flujo de trabajo incluye el enriquecimiento de proteínas de la superficie celular, la posterior preparación de muestras, el análisis utilizando una plataforma LC-MS / MS y el procesamiento de datos con software especializado.
Abstract
Durante la última década, la proteómica basada en espectrometría de masas ha permitido una caracterización en profundidad de los sistemas biológicos en una amplia gama de aplicaciones. El proteoma de la superficie celular ("surfaceoma") en la enfermedad humana es de gran interés, ya que las proteínas de la membrana plasmática son el objetivo principal de la mayoría de las terapias clínicamente aprobadas, así como una característica clave para distinguir diagnósticamente las células enfermas de los tejidos sanos. Sin embargo, la caracterización enfocada de las proteínas de membrana y superficie de la célula ha seguido siendo un desafío, principalmente debido a la complejidad de los lisados celulares, que enmascaran proteínas de interés por otras proteínas de alta abundancia. Para superar esta barrera técnica y definir con precisión el proteoma de la superficie celular de varios tipos de células utilizando la proteómica de espectrometría de masas, es necesario enriquecer el lisado celular para las proteínas de la superficie celular antes del análisis en el espectrómetro de masas. Este documento presenta un flujo de trabajo detallado para etiquetar proteínas de la superficie celular de células cancerosas, enriquecer estas proteínas a partir del lisado celular y la posterior preparación de muestras para el análisis de espectrometría de masas.
Introduction
Las proteínas sirven como las unidades fundamentales por las cuales se llevan a cabo la mayoría de las funciones celulares. Caracterizar la estructura y función de las proteínas relevantes es un paso esencial para comprender los procesos biológicos. Durante la última década, los avances en la tecnología de espectrometría de masas, el software de análisis y las bases de datos han permitido la detección y medición precisas de proteínas a escala de todo el proteoma1. La proteómica basada en espectrometría de masas se puede utilizar en una amplia gama de aplicaciones, desde el análisis científico básico de las vías bioquímicas, hasta la identificación de nuevos objetivos farmacológicos en un entorno traslacional, hasta el diagnóstico y monitoreo de enfermedades en la clínica2. Cuando se detectan nuevas dianas farmacológicas, la caracterización del proteoma de la superficie celular es particularmente importante, ya que más del 65% de los fármacos humanos actualmente aprobados se dirigen a las proteínas de la superficie celular3. El campo de la inmunoterapia del cáncer también depende totalmente de antígenos de superficie celular específicos del cáncer para atacar y eliminar específicamente las células tumorales4. Por lo tanto, la proteómica basada en espectrometría de masas puede servir como una herramienta prometedora para identificar nuevas proteínas de la superficie celular hacia intervenciones terapéuticas.
Sin embargo, existen varias limitaciones cuando se utilizan métodos proteómicos convencionales para estudiar las células tumorales en busca de nuevos objetivos de proteínas de la superficie celular. Una preocupación principal es que las proteínas de superficie constituyen una fracción muy pequeña del total de moléculas de proteínas en una célula. Por lo tanto, los fragmentos de estas proteínas son enmascarados por una alta abundancia de proteínas intracelulares cuando se realiza el análisis de espectrometría de masas del lisado de células enteras5. Esta limitación hace que sea difícil caracterizar con precisión el proteoma de la superficie celular con un flujo de trabajo de proteómica tradicional. Para abordar este desafío, es necesario desarrollar formas de enriquecer las proteínas de la superficie celular a partir del lisado de células completas, antes del análisis en el espectrómetro de masas. Uno de estos métodos implica la oxidación y el marcado de biotina de proteínas glicosiladas de la superficie celular en las células intactas, y el posterior enriquecimiento de estas proteínas biotiniladas del lisado con una extracción de neutravidina, un proceso que se ha denominado "captura de la superficie celular"6. Dado que se cree que ~ 85% de las proteínas de la superficie celular de mamíferos son glicosiladas7, esto sirve como un método efectivo para enriquecer el proteoma de la superficie celular a partir del lisado celular completo. Este documento describe un flujo de trabajo completo, comenzando con células cultivadas, del etiquetado de biotina de la superficie celular y la posterior preparación de muestras para el análisis de espectrometría de masas (Figura 1). Sobre varias réplicas, este método proporciona una cobertura robusta del proteoma de la superficie celular de una muestra en particular. La utilización de este método para caracterizar el proteoma de la superficie celular de células tumorales y sanas puede facilitar el descubrimiento de nuevos antígenos de superficie celular para identificar posibles objetivos inmunoterapéuticos8.
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Protocol
NOTA: Se utilizaron células de plasmacitoma AMO1 para este experimento de proteoma de superficie celular. El mismo protocolo podría ser utilizado para otros tipos de células, incluyendo una amplia gama de líneas celulares de suspensión y adherentes9, así como varios tipos de muestras primarias10. Sin embargo, el número de células (material de partida para el experimento) normalmente tiene que ser optimizado para una cobertura de proteoma equivalente. Para obtener detalles relacionados con los materiales y el equipo, consulte la Tabla de materiales. Para obtener detalles relacionados con los tampones y las soluciones de reactivos y su composición, consulte la Tabla 1.
1. Etiquetado de la superficie celular con biotina
- Contar las células cultivadas y granular aproximadamente 3,5 ×10 7 células vivas por centrifugación (5 min a 500 × g, 24 °C).
NOTA: Las células de plasmacitoma AMO1 se pasaron con medios frescos cada 3 días antes de la recolección. - Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet añadiendo 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (D-PBS) fría (4 °C) de Dulbecco (sin calcio, sin magnesio) y pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
- Vuelva a granular las celdas (como en el paso 1.1) y repita el paso de lavado (paso 1.2) una vez más (dos lavados en total).
- Después del segundo lavado, granular las células (como en el paso 1.1) y resuspenderlas en 990 μL de D-PBS frío pipeteando suavemente.
- Preparar previamente una solución madre de metaperiodato de sodio de 160 mM (NaIO4). Dividir en alícuotas de 50 μL y almacenar a -20 °C durante un máximo de 6 meses. Añadir 10 μL de solución de metaperiodato sódico de 160 mM a la suspensión celular en el paso 1.4, mezclar bien e incubar en un rotor de extremo a extremo durante 20 min a 4 °C.
- Una vez completada la incubación, granular las células (como en el paso 1.1), decantar el sobrenadante y volver a suspender en 1 ml de D-PBS frío. Repita este paso de lavado dos veces (tres lavados en total). Después del tercer lavado, resuspender las células en 989 μL de D-PBS.
- Preparar previamente una solución madre de 100 mM de hidrazida de biocita. Dividir en alícuotas de 50 μL y conservar a -20 °C durante un máximo de 6 meses. Añadir 1 μL de anilina y 10 μL de hidrazida de biocitina a 100 mM a la suspensión celular en el paso 1.6, mezclar bien e incubar en un rotor de extremo a extremo durante 60 min a 4 °C.
- Una vez completada la incubación, granular las células (como en el paso 1.1), decantar el sobrenadante y volver a suspender en 1 ml de D-PBS frío. Repita este paso de lavado dos veces (tres lavados en total).
- Después del tercer lavado, aspire el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta y congele el pellet de la celda colocando el tubo en líquido N2. Coloque el pellet congelado a -80 °C, hasta que esté listo para proceder con lisis y pulldown.
2. Lisis celular y extracción de biotina
- Descongele el pellet de celda congelada en hielo.
- Agregue 500 μL de tampón de lisis 2x al pellet, mezcle bien y mezcle durante 30 s.
NOTA: Es posible que se requiera un pipeteo vigoroso y un vórtice para lisar completamente el pellet. Algunos desechos insolubles (es decir, ADN) son aceptables, ya que se eliminan en el paso de sonicación posterior. - Sonicar el lisado celular en hielo (tres ráfagas, 20 s cada una, 60% de ciclo de trabajo).
- Centrifugar el lisado para granular cualquier residuo restante (10 min a 17.200 × g a 4 °C).
- Mientras el lisado se centrifuga, agregue 100 μL de perlas de resina de neutravidina agarosa a una columna de filtración. Fije la columna a un colector de vacío, aplique una aspiradora suave y lave las perlas haciendo fluir 3 ml de tampón de lavado 1 sobre ellas.
- Retire la columna de filtración del colector de vacío, tape la parte inferior y agregue el lisado celular clarificado a la columna con las perlas. Tapar la parte superior de la columna e incubar el lisado con las perlas en un rotor de extremo a extremo durante 120 min a 4 °C.
NOTA: Al tapar la parte superior de la columna, mantenga firmemente la tapa inferior en su lugar, de lo contrario puede desprenderse y el lisado celular puede tener fugas durante la incubación. - Prepare los tampones de lavado 1, 2 y 3 (aproximadamente 5 ml de cada tampón de lavado por muestra, consulte la Tabla 1) y colóquelos en un baño de agua a 42 °C
- Después de que el lisado haya terminado la incubación, coloque la columna de filtración nuevamente en el colector de vacío, aplique un vacío suave y lave las perlas haciendo fluir 5 ml de tampón de lavado 1 sobre ellas.
NOTA: Se pueden usar más de 5 ml de los tampones de lavado para el lavado; El lavado adicional puede reducir el fondo, la unión no específica a las perlas. - Repita el paso de lavado con 5 ml de tampón de lavado 2.
- Repita el paso de lavado con 5 ml de tampón de lavado 3.
- Una vez que el tampón de lavado final haya fluido completamente a través de las perlas, retire la columna del colector. Agregue 100 μL de solución "Lyse" a las perlas y transfiéralas a un tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,7 ml con una pipeta. Gire brevemente el tubo para asentar las perlas y retire 50 μL de la solución sin perturbar las perlas sedimentadas.
NOTA: Los reactivos en este paso y todos los pasos posteriores utilizan un kit de preparación de muestras de proteómica disponible comercialmente. El kit proporciona un flujo de trabajo de preparación de muestras optimizado y simplificado. Sin embargo, estos pasos también se pueden realizar independientemente del kit, utilizando un flujo de trabajo proteómico tradicional como se describe en Verma et al.9. Si las perlas permanecen pegadas al costado o a la parte inferior de la columna, permita que las perlas que se han transferido al tubo se asienten, y use una solución adicional de "Lyse" en el tubo para transferir las perlas restantes. - Coloque el tubo en un bloque/agitador térmico a 65 °C y agite a 1.000 rpm durante 10 min.
NOTA: Este paso es necesario para la reducción y alquilación de residuos de cisteína antes de la digestión.
3. Digestión de proteínas
- Resuspender el tubo de tripsina seca («Digest» del kit, almacenado a -20 °C) añadiendo 210 μL de la solución "Resuspend". Pipet la solución hacia arriba y hacia abajo varias veces para asegurarse de que toda la tripsina seca se resuspenda.
- Una vez completada la incubación, añadir 50 μL de la solución de tripsina resuspendida a las perlas. Incubar el tubo a 37 °C, agitando a 500 rpm durante al menos 90 min para digerir la proteína.
- Una vez que se complete la digestión, transfiera la solución que contiene las perlas a una columna de centrifugado e inserte la columna en un tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,7 ml. Gire el tubo (500 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente [RT]) para separar la solución peptídica digerida de las perlas.
NOTA: En esta etapa, el tratamiento con PNGasa se puede realizar en las perlas una vez que se separan de la solución peptídica, para eluyer fragmentos de péptidos biotinilados de las perlas de estreptavidina. Esta muestra de péptidos se puede llevar adelante a través del resto del flujo de trabajo como una muestra de péptidos secundaria separada que se puede analizar y comparar con la muestra primaria de tripsinización en perla. Es probable que el enfoque PNGasa proporcione datos complementarios a la tripsinización en perla, dada la especificidad adicional para las asparaginas N-glicosiladas capturadas basadas en la modificación de la cadena lateral detectable por EM12. Sin embargo, el inconveniente de este enfoque de elución secuencial es el requisito de duplicar el tiempo del instrumento del espectrómetro de masas por análisis de muestra. - Añadir 100 μL de la solución "Stop" para detener la reacción de digestión y acidificar la solución peptídica.
4. Desalinización de péptidos
- Con un adaptador de tubo, coloque una columna de desalinización en un tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,7 ml. Agregue toda la solución peptídica acidificada a la columna. Gire la columna (3.800 × g durante 3 min) para que la solución fluya a través de la columna. Los péptidos ahora están unidos a la columna; Descarte el flujo continuo.
- Añadir 200 μL de solución "Wash 1" a la columna y girar (3.800 × g durante 3 min, RT). Deseche el flujo continuo.
- Añadir 200 μL de solución "Wash 2" a la columna y girar (3.800 × g durante 3 min, RT). Deseche el flujo continuo.
- Transfiera la columna a un nuevo tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,7 ml marcado. Añadir 100 μL de solución "Elute" a la columna y girar (3.800 × g durante 3 min, RT). Añadir otros 100 μL de solución "Elute" a la columna y girar (3.800 × g durante 3 min, RT). Los péptidos ahora se eluyen de la columna en el tubo.
- Coloque la solución peptídica en una centrífuga al vacío y deje que se seque durante la noche. Coloque los péptidos secos a -80 °C hasta que estén listos para cuantificar y analícelos en el espectrómetro de masas.
5. Resuspensión y cuantificación de péptidos
- Resuspender los péptidos secos en 20 μL de disolvente A (0,1% de ácido fórmico, 2% de acetonitrilo).
- Centrifugar los péptidos resuspendidos (17.200 × g durante 10 min) para granular cualquier residuo insoluble.
- Preparar estándares de péptidos para el ensayo de cuantificación de péptidos colorimétricos.
- Coloque 5 μL de solución madre peptídica de 1,000 mg/ml en un pocillo de una placa de 96 pocillos.
- Realice una dilución seriada de siete pasos en la placa con agua desionizada (DI), de la siguiente manera, con 5 μL de cada patrón por pocillo: 1,000 mg / ml, 500 mg / ml, 250 mg / ml, 125 mg / ml, 62.5 mg / ml, 31.25 mg / ml y 15.625 mg / ml. Coloque 5 μL de agua DI en un octavo pozo para el espacio en blanco.
- Coloque 4 μL de agua DI en tres pocillos separados de la placa de 96 pocillos. Añadir 1 μL de la solución peptídica resuspendida a cada pocillo, para un volumen total de 5 μL.
NOTA: Al pipetear la solución peptídica para la cuantificación, pipetear cuidadosamente desde la parte superior de la solución para evitar perturbar cualquier residuo sedimentado. - Calcule cuánto reactivo de trabajo se necesita (45 μL requeridos por pocillo). Preparar el volumen requerido del reactivo de trabajo del ensayo colorimétrico; Vórtice el reactivo de trabajo para garantizar la mezcla adecuada de los componentes.
- Agregue 45 μL del reactivo de trabajo a cada uno de los pocillos estándar y de muestra.
NOTA: Haga los estándares por duplicado y use una pipeta multicanal para garantizar una diferencia mínima en el momento en que se agrega el reactivo a los pocillos. - Cubrir la placa con papel de aluminio e incubar a 37 °C durante 15 min.
- Analice la placa en un lector de placas automatizado. Utilice los valores de absorbancia registrados para las muestras estándar para generar una curva estándar lineal. Determine la ecuación de la curva estándar y el valor de R2 . Si el valor deR2 es razonable (≥0,95), utilice la curva estándar para determinar la concentración de péptidos resuspendidos, teniendo en cuenta la dilución quíntuple en la placa de ensayo colorimétrico.
6. Análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) de los péptidos digeridos
- Ajustar la concentración de las muestras de péptidos a 0,2 μg/μL añadiendo disolvente A, y transferir 10 μL a un tubo de unión a proteínas bajas en 0,6 ml.
- Coloque el tubo en el muestreador automático LC.
- Establezca los parámetros LC y MS/MS, de acuerdo con la Figura 2 y la Figura 3.
- Inyecte 5 μL (1 μg) de la muestra de péptido en la configuración LC-MS/MS para su análisis.
NOTA: La configuración de LC-MS/MS que se muestra aquí sólo es representativa de las ilustraciones. Dependiendo de la disponibilidad del instrumento LC y MS, los usuarios pueden modificar la configuración del gradiente LC y los parámetros MS/MS para obtener una cobertura profunda del proteoma. Para este trabajo, el análisis de datos de MS se realizó utilizando MaxQuant https://www.maxquant.org/, el análisis de datos secundarios se realizó con Perseus https://maxquant.net/perseus/ y el análisis de vías utilizando https://reactome.org/.
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Representative Results
Para este experimento, caracterizamos el proteoma de la superficie celular de una línea celular tumoral marcando proteínas de membrana N-glicosiladas de células intactas con biotina, y enriqueciendo estas proteínas marcadas del lisado celular completo con un pulldown de neutravidina (Figura 1). Además, realizamos análisis de proteoma utilizando LC-MS / MS para caracterizar proteínas enriquecidas de la superficie celular. A diferencia del análisis del proteoma de células enteras, aquí, el objetivo era caracterizar solo proteínas de la superficie celular. Por lo tanto, comenzamos con una entrada de muestra de 3,5 × 107 células de plasmacitoma AMO-1. Obtuvimos una concentración peptídica final de ~630 ng/μL basada en el ensayo de cuantificación de péptidos colorimétricos, y el rendimiento total fue de ~12.6 μg de péptidos (en 20 μL) (Figura 2A). Luego inyectamos 1 μg de muestra de péptido en el sistema LC-MS / MS, y repetimos la inyección tres veces para réplicas técnicas. Los parámetros LC y MS utilizados se optimizaron en base a experimentos previos (Figura 2C y Figura 3A). Utilizamos un gradiente LC largo de 4 h para garantizar la máxima cobertura.
Los datos de LC-MS/MS se analizaron utilizando MaxQuant; Pudimos identificar 2.221 proteínas con al menos un péptido único y 1.764 proteínas con al menos dos péptidos únicos en las tres réplicas. En total, se identificaron 12.307 péptidos únicos. Determinamos el enriquecimiento de proteínas de la superficie celular en la muestra utilizando un script de Python (el script exacto que usamos se puede encontrar en la Figura Suplementaria S1) que compara los resultados obtenidos de MaxQuant con varios conjuntos de datos establecidos de proteínas de la superficie celular. Estos conjuntos de datos incluyen el " in silico surfaceome" previamente informado"3 y un conjunto de datos establecido a partir de proteínas anotadas como localizadas en membrana en UniProt13 (los conjuntos de datos están disponibles en la Tabla Suplementaria S1). Este análisis arrojó 601 proteínas de superficie en nuestra muestra (aproximadamente el 27% de todas las proteínas identificadas) (Figura 4A). Se realizó una anotación de ontología génica (http://geneontology.org/), que indicó que aproximadamente el 30% de las proteínas se localizaron canónicamente en la membrana plasmática. El análisis de la vía Reactome (https://reactome.org/) también indicó un enriquecimiento relativo de las proteínas de membrana implicadas en el transporte transmembrana y las interacciones de la superficie celular (Figura 5 y Tabla Suplementaria S2).
Figura 1: Flujo de trabajo para el etiquetado de la superficie celular y la posterior preparación de muestras para el análisis de espectrometría de masas. Primero, las proteínas en la superficie de la muestra celular deseada se marcan con biotina. Estas células se lisan, seguidas de la incubación con perlas de neutravidina que se unen a proteínas marcadas con biotina. Luego, las perlas se lavan repetidamente para eliminar las proteínas intracelulares y otros contaminantes. La muestra de proteína luego se somete a una digestión en la perla con la adición de tripsina. La muestra resultante de fragmentos de péptidos se somete a desalinización para eliminar los contaminantes de los pasos de lavado y digestión. La muestra peptídica final se seca y está lista para someterse a un análisis de espectrometría de masas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Curva estándar de cuantificación de péptidos colorimétricos y gradiente de LC. (A) Curva estándar de ocho puntos generada por el ensayo de cuantificación de péptidos colorimétricos utilizado para determinar la concentración de péptidos en muestras procesadas. (B) Una ilustración del sistema LC-MS/MS utilizado para procesar muestras. (C) Gradiente de cromatografía líquida y caudal utilizado para la inyección de muestras en el espectrómetro de masas. Abreviaturas: LC-MS/MS = cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Parámetros de espectrometría de masas y cromatograma representativo . (A) Parámetros utilizados para este experimento utilizando un espectrómetro de masas Orbitrap. (B) Cromatograma representativo generado por análisis de espectrometría de masas siguiendo el protocolo de "captura de superficie celular" para un gradiente de 4 h. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis de enriquecimiento de proteínas en la superficie celular y comparación de réplicas técnicas. Estos conjuntos de datos incluyen el " in silico surfaceome" previamente reportado"3 y un conjunto de datos establecido a partir de proteínas anotadas como localizadas en membrana en UniProt13. (A) El número de proteínas y péptidos identificados con un corte diferente después de eliminar contaminantes, proteínas inversas y un valor q > 0.05. (B) La gráfica representa la distribución de la proteína identificada y la puntuación de Andrómeda14. (C) El diagrama de dispersión ilustra la correlación muestra a muestra. La correlación de rango de Spearman mide la fuerza y la dirección de la asociación entre dos variables clasificadas. (D) Diagramas de caja que representan la variación de carrera a corrida. (E) Diagrama de distribución por muestreo que representa la calidad de los datos de las réplicas. Abreviatura: LFQ = cuantificación sin etiqueta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Análisis de vías. El análisis de la vía se realizó con Reactome versión 8222. Una representación ilustrativa de las interacciones de la superficie celular en la pared vascular, exhibiendo el enriquecimiento del proteoma de la superficie celular para las interacciones clave involucradas en la interacción de plaquetas y leucocitos con el endotelio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre del reactivo | Composición | Almacenamiento | |||||
| 100 mM de hidrazida de biocitina | forma en polvo biocytin hydrazide disuelta en DMSO | Dividir en alícuotas de 50 μL y almacenar a -20 °C durante un máximo de 6 meses. | |||||
| Metaperiodato de sodio de 160 mM (NaIO4) | NaIO4 sólido disuelto en agua DI | Dividir en alícuotas de 50 μL y almacenar a -20 °C durante un máximo de 6 meses. | |||||
| 2x Búfer de lisis RIPA | 2x Tampón de lisis RIPA, 1.25 mM EDTA, cóctel de inhibidor de proteasa de un solo uso | Prepárelo fresco cada vez antes de usar 10x RIPA Lysis Buffer. | |||||
| Ensayo colorimétrico peptídico Reactivo de trabajo | 50% Reactivo A, 48% Reactivo B, 2% Reactivo C | Prepárelo fresco cada vez antes de usar. Conservar los componentes a 4 °C. | |||||
| Disolvente A | 0,1% de ácido fórmico, 2% de acetonitrilo | Puede prepararse con anticipación y almacenar a temperatura ambiente | |||||
| Tampón de lavado 1 | 1x búfer de lisis RIPA, 1 mM EDTA | Puede preparar lotes grandes de antemano y almacenar a temperatura ambiente | |||||
| Tampón de lavado 2 | 1x PBS, 1 M NaCl | Puede preparar lotes grandes de antemano y almacenar a temperatura ambiente | |||||
| Tampón de lavado 3 | 2 M de urea, 50 mM de bicarbonato de amonio | Prepárese fresco cada vez, ya que la urea se degradará rápidamente con el tiempo. | |||||
Tabla 1: Tampones y soluciones de reactivos utilizados en este protocolo.
Figura suplementaria S1: Script de Python para comparar los resultados obtenidos de MaxQuant con varios conjuntos de datos establecidos de proteínas de la superficie celular. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla suplementaria S1: Conjuntos de datos de proteínas de la superficie celular. Estos conjuntos de datos incluyen el " in silico surfaceome" previamente reportado"3 y un conjunto de datos establecido a partir de proteínas anotadas como localizadas en membrana en UniProt13. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla complementaria S2: Aquí se presentan las 10 vías más relevantes (ordenadas por valor de p ). Abreviaturas: FDR = tasa de descubrimiento falso; SLC = portador de soluto; TCR = receptor de células T. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
La proteómica basada en espectrometría de masas es una herramienta poderosa que ha permitido la caracterización imparcial de miles de proteínas desconocidas en una escala previamente imposible. Este enfoque nos permite identificar y cuantificar las proteínas, así como obtener una serie de conocimientos sobre las capacidades estructurales y de señalización de las células y los tejidos, mediante la caracterización de la variedad de proteínas presentes en una muestra en particular. Más allá del perfil global de proteínas en una muestra, la espectrometría de masas nos permite caracterizar varias modificaciones postraduccionales (PTM) en estas proteínas, proporcionando una visión aún más profunda de las etapas de las vías de señalización y la dinámica de proteínas que no están disponibles cuando se analiza en el nivel1 de ADN o ARN. Hacia el desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer, la proteómica basada en espectrometría de masas nos permite comparar el perfil proteico de las células tumorales malignas frente a los tejidos sanos, para identificar posibles objetivos farmacológicos.
El campo de rápido crecimiento de la inmunoterapia contra el cáncer se basa en antígenos expresados en la superficie de las células malignas para identificar y destruir selectivamente los tumores. Dado que el desarrollo de nuevas inmunoterapias contra el cáncer está limitado por la falta de antígenos únicos específicos del cáncer, que están ausentes en los tejidos sanos, es fundamental identificar más antígenos nuevos específicos para las células tumorales15. Los antígenos específicos del tumor no necesitan ser proteínas enteras exclusivas de la célula tumoral, sino que también pueden ser conformaciones proteicas específicas o PTM ausentes en tejidos sanos16,17. El análisis proteómico de las proteínas de la superficie celular tanto en células tumorales como sanas puede producir nuevos objetivos de antígenos específicos del cáncer. La proteómica de la superficie celular requiere el enriquecimiento de proteínas de superficie del lisado de células enteras antes del análisis de espectrometría de masas, para reducir la complejidad de la muestra y evitar la supresión iónica de las proteínas de membrana deseadas (a menudo de baja abundancia) por proteínas intracelulares altamente expresadas18. Si bien la estrategia de captura de la superficie celular empleada aquí es uno de los enfoques de enriquecimiento más utilizados para la proteómica de la superficie celular, existen otros métodos para el enriquecimiento de proteínas de la superficie celular que se han integrado con un flujo de trabajo de espectrometría de masas, incluida la ultracentrifugación selectiva de las membranas celulares, el etiquetado de biotina NHS de las lisinas superficiales y la biotinilación mediada por enzimas de las proteínas de la superficie celular19, 20. Las comparaciones directas sugieren que el enfoque de captura de la superficie celular proporciona el equilibrio óptimo de facilidad de uso y enriquecimiento exitoso y relativamente imparcial de las proteínas de la superficie celular con el etiquetado de fondo más bajo de las proteínas intracelulares20.
Este documento presenta un protocolo eficaz y eficiente en el tiempo para un flujo de trabajo de proteómica de la superficie celular mediante la integración del etiquetado de la superficie celular y el procedimiento de extracción con un flujo de trabajo optimizado de preparación de muestras de proteómica (Figura 1). Todo el procedimiento, desde la recolección de células cultivadas hasta el análisis en el espectrómetro de masas, se pudo lograr en el transcurso de 3 días. Para obtener la cobertura más robusta del proteoma de superficie, puede ser necesario optimizar la entrada inicial de células en función del tipo de célula que se utiliza. Se recomienda realizar un experimento piloto con una entrada de celda variable, que van desde unos pocos millones de células hasta 50 millones de células, para garantizar la máxima cobertura. Además, si se observa una gran cantidad de proteínas intracelulares altamente expresadas, el aumento del lavado de las perlas de neutravidina después de la incubación con el lisado podría minimizar la unión no específica de proteínas a las perlas.
Recomendamos realizar el experimento con al menos tres réplicas biológicas y tres réplicas técnicas por condición, para aumentar la confianza de que los marcadores de superficie celular identificados están realmente presentes en la mayoría de las células. Además, al realizar el flujo de trabajo de captura de superficie celular para un nuevo tipo de muestra, podría ser útil analizar un lisado de células completas utilizando un enfoque convencional de proteómica de escopeta21, para comparar con los resultados de captura de superficie celular. El análisis de los datos brutos de espectrometría de masas se puede realizar mediante varios paquetes de búsqueda de bases de datos y software, aquí utilizamos MaxQuant, para obtener una lista de proteínas identificadas22,23. Esta lista se puede filtrar contravarias bases de datos conocidas 3,24 de proteínas de superficie para establecer una lista de las proteínas de superficie celular identificadas en un solo experimento. Una vez que se ha establecido una lista de proteínas de la superficie celular, pueden analizarse más a fondo por su papel en las vías bioquímicas relevantes25 o en los candidatos a diana de fármacos26. Este flujo de trabajo se puede aplicar a una amplia variedad de tipos de células, incluidas las líneas celulares de suspensión y adherentes (para las células adherentes, recomendamos levantar células sin el uso de tripsina antes de la preparación de la muestra, para evitar la escisión de las proteínas de la superficie celular), así como muestras primarias.
Usando este flujo de trabajo, pudimos caracterizar con confianza el proteoma de la superficie celular de una línea celular en particular. Mediante la comparación del proteoma de superficie de líneas celulares tumorales contra células sanas, y la referencia cruzada con una base de datos de secuenciación de ARN para tejidos normales, se pudo establecer una lista de posibles dianas inmunoterapéuticas 8,13. Una limitación de este método es que, a pesar del enriquecimiento significativo de las proteínas de la superficie celular frente a un experimento estándar de lisado de células enteras, la mayoría de las proteínas identificadas por el análisis de espectrometría de masas en este flujo de trabajo todavía están anotadas como intracelulares. Dependiendo de la rigurosidad de la base de datos de proteínas de superficie utilizada, aproximadamente el 25% -30% de las proteínas identificadas son de la superficie celular. Anticipamos que una parte significativa del fondo no superficial probablemente emana de la proteína de fondo no unida específicamente a las perlas (por ejemplo, como se caracteriza por el análisis CRAPome27), mientras que otras representan la penetración celular del reactivo de marcado para reaccionar con proteínas N-glicosiladas en el retículo endoplásmico, Golgi u otros compartimentos intracelulares.
Mientras que los métodos alternativos de elución peptídica como el tratamiento con PNGasa dan como resultado un enriquecimiento mucho mayor de N-glicositas entre el total de péptidos analizados, este enfoque solo permite la identificación de péptidos gliquiosilados individuales y pierde información valiosa del resto no glicosilado de la secuencia de proteína extraída12. Esta información adicional se puede capturar con este enfoque de tripsinización en perlas, aunque con la posible compensación de una especificidad reducida para las proteínas N-glicosiladas analizadas en el espectrómetro de masas. Además, incluso la elución PNGasa no supera el desafío de etiquetar proteínas glicosiladas intracelulares, y una elución PNGasa conduce típicamente a un solo péptido por proteína; Esto conduce a una variabilidad significativa en la identificación de proteínas, según la experiencia de nuestro laboratorio, mientras que la digestión en cuentas descrita aquí conduce a múltiples péptidos por proteína capturada. Por lo tanto, dependiendo del objetivo del experimento, se podrían elegir diferentes estrategias para emplear la estrategia de captura de la superficie celular. Estas estrategias incluyen la miniaturización y automatización del protocolo de captura de superficie celular para pequeñas entradas de muestras28 y la utilización de perlas de estreptavidina de capacidad de unión variable29 dependiendo de la aplicación. El método y el flujo de trabajo ilustrados aquí sirven como una estrategia general robusta y fácil de realizar para el enriquecimiento de proteínas de la superficie celular.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Kamal Mandal (Departamento de Medicina de Laboratorio, UCSF) por su ayuda con la configuración de la ejecución LC-MS / MS, A Deeptarup Biswas (BSBE, IIT Bombay) por su ayuda con el análisis de datos, y a la Dra. Audrey Reeves (Departamento de Medicina de Laboratorio, UCSF) por su ayuda con el análisis de datos. El trabajo relacionado en el laboratorio de A.P.W. está respaldado por NIH R01 CA226851 y el Biohub Chan Zuckerberg. La Figura 1 y la Figura 2B se realizaron utilizando BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| 96X iST Sample Preparation Kit | PreOmics | P.O.00027 | Proteomics sample preparation kit. Includes reagents for reduction, alkylation, and digestion. Also include desalting columns and reagents. |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo | 23275 | Peptide quantification kit. Includes peptide standards and components of working reagents. |
| Reagents | |||
| Acetonitrile | Fisher | A955-1 | |
| Ammonium bicarbonate | Millipore Sigma | 09830-1KG | |
| Biocytin hydrazide | Biotium | 90060 | |
| D-PBS (w/o Calcium and Magnesium Salts) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003-225B01 | |
| Formic Acid | Honeywell | 94318 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Single-Use Cocktail | Thermo | 1861280 | |
| High Capacity Neutravidin Agarose Resin | Thermo | 29204 | |
| Phosphate Buffered Saline | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001-22J01 | |
| RIPA Lysis Buffer, 10x | Millipore Sigma | 20-188 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Sodium metaperiodate | Alfa Aesar | 13798 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | |
| Urea (Proteomics Grade) | VWR | M123-1KG | |
| Equipment | |||
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | |
| PrismR Microcentrifuge | Labnet International | C2500-R-230V | |
| Sonicator | VWR | Branson Sonifier 240 | |
| Vacuum Manifold | Promega | Promega Vac-Man | |
| Shaking Heatblock | Eppendorf | Eppendorf Thermomixer C | |
| End-to-End rotator | Labnet | Revolver Adjustable Rotator | |
| LC | Thermo | Ultimate 3000 HPLC and UHPLC | |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrapole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| Microplate Reader | Biotek | Biotek Synergy 2 | |
| Vacuum Concentrator | Labconco | 7810010 | |
| Supplies | |||
| 1.5 mL Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | |||
| Filtration Columns | Bio-Rad | 7326008 | |
| Spin Columns | Thermo | 69725 |
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