Summary
Her beskriver vi en proteomisk arbeidsflyt for karakterisering av celleoverflateproteomet av forskjellige celletyper. Denne arbeidsflyten inkluderer proteinberikelse på celleoverflaten, påfølgende prøvepreparering, analyse ved hjelp av en LC-MS/MS-plattform og databehandling med spesialisert programvare.
Abstract
I løpet av det siste tiåret har massespektrometribasert proteomikk muliggjort en grundig karakterisering av biologiske systemer over et bredt spekter av applikasjoner. Celleoverflateproteomet ("overflateom") i menneskelig sykdom er av betydelig interesse, da plasmamembranproteiner er det primære målet for de fleste klinisk godkjente terapier, samt en nøkkelfunksjon for å diagnostisk skille syke celler fra sunt vev. Imidlertid har fokusert karakterisering av membran- og overflateproteiner i cellen vært utfordrende, hovedsakelig på grunn av kompleksiteten til cellulære lysater, som maskerer proteiner av interesse av andre proteiner med høy overflod. For å overvinne denne tekniske barrieren og nøyaktig definere celleoverflateproteomet av forskjellige celletyper ved hjelp av massespektrometriproteomikk, er det nødvendig å berike cellelysatet for celleoverflateproteiner før analyse på massespektrometeret. Dette papiret presenterer en detaljert arbeidsflyt for merking av celleoverflateproteiner fra kreftceller, berikelse av disse proteinene ut av cellelysatet, og påfølgende prøvepreparering for massespektrometrianalyse.
Introduction
Proteiner tjener som de grunnleggende enhetene ved hvilke flertallet av cellulære funksjoner utføres. Karakterisering av strukturen og funksjonen til relevante proteiner er et viktig skritt for å forstå biologiske prosesser. I løpet av det siste tiåret har fremskritt innen massespektrometriteknologi, analyseprogramvare og databaser muliggjort nøyaktig deteksjon og måling av proteiner i proteom-bred skala1. Massespektrometribasert proteomikk kan benyttes i et mangfoldig utvalg av applikasjoner, fra grunnleggende vitenskapelig analyse av biokjemiske veier, til identifisering av nye legemiddelmål i en translasjonell setting, til diagnostisering og overvåking av sykdommer i klinikken2. Ved screening for nye legemiddelmål er karakterisering av celleoverflateproteomet spesielt viktig, med over 65% av dagens godkjente humane legemidler rettet mot celleoverflateproteiner3. Feltet kreftimmunterapi er også helt avhengig av kreftspesifikke celleoverflateantigener for å målrette og spesifikt eliminere tumorceller4. Massespektrometribasert proteomikk kan dermed fungere som et lovende verktøy for å identifisere nye celleoverflateproteiner mot terapeutiske inngrep.
Imidlertid er det flere begrensninger ved bruk av konvensjonelle proteomikkmetoder for å undersøke tumorceller for nye celleoverflateproteinmål. En primær bekymring er at overflateproteiner utgjør en svært liten brøkdel av de totale proteinmolekylene i en celle. Derfor maskeres fragmenter av disse proteinene av en høy overflod av intracellulære proteiner når man utfører massespektrometrianalyse av helcellelysatet5. Denne begrensningen gjør det utfordrende å nøyaktig karakterisere celleoverflateproteomet med en tradisjonell proteomikkarbeidsflyt. For å møte denne utfordringen er det nødvendig å utvikle måter å berike celleoverflateproteiner ut av helcellelysatet, før analyse på massespektrometeret. En slik metode involverer oksidasjon og biotinmerking av glykosylerte celleoverflateproteiner i de intakte cellene, og påfølgende anrikning av disse biotinylerte proteinene fra lysatet med en nøytravidinnedtrekk, en prosess som har blitt kalt "celleoverflatefangst"6. Siden ~ 85% av pattedyrs celleoverflateproteiner antas å være glykosylert7, tjener dette som en effektiv metode for å berike celleoverflateproteomet ut av hele cellelysatet. Dette papiret beskriver en komplett arbeidsflyt, som begynner med dyrkede celler, av biotinmerking av celleoverflate og påfølgende prøvepreparering for massespektrometrianalyse (figur 1). Over flere replikater gir denne metoden robust dekning av celleoverflateproteomet til en bestemt prøve. Bruk av denne metoden for å karakterisere celleoverflateproteomet til både tumor og friske celler kan lette oppdagelsen av nye celleoverflateantigener for å identifisere potensielle immunterapeutiske mål8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: AMO1 plasmacytomceller ble brukt til dette celleoverflateproteomeksperimentet. Den samme protokollen kan også brukes for andre celletyper, inkludert et bredt spekter av suspensjons- og adherente cellelinjer9, samt forskjellige typer primærprøver10. Imidlertid må cellenumre (startmateriale for eksperimentet) vanligvis optimaliseres for ekvivalent proteomdekning. Hvis du vil ha mer informasjon om materialer og utstyr, kan du se materialfortegnelsen. For detaljer knyttet til buffere og reagensløsninger og deres sammensetning, se tabell 1.
1. Merking av celleoverflate med biotin
- Tell dyrkede celler og pellet ca. 3,5 × 107 levende celler ved sentrifugering (5 min ved 500 × g, 24 °C).
MERK: AMO1 plasmacytomcellene ble passert med ferske medier hver 3. dag før høsting. - Aspirer supernatanten og resuspender pelleten ved å tilsette 1 ml kald (4 °C) Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (D-PBS) (uten kalsium, ikke magnesium), og pipettere forsiktig opp og ned.
- Pellet cellene igjen (som i trinn 1.1) og gjenta vasketrinnet (trinn 1.2) en gang til (to vasker totalt).
- Etter den andre vasken, pellet cellene (som i trinn 1.1) og resuspender dem i 990 mikrol kald D-PBS ved forsiktig pipettering.
- Forbered en stamoppløsning på 160 mM natriummetaperiodat (NaIO4) på forhånd. Deles opp i 50 μL alikoter og oppbevares ved -20 °C i opptil 6 måneder. Tilsett 10 μL 160 mM natriummetaperiodatoppløsning til cellesuspensjonen i trinn 1.4, bland godt og inkuber på en ende-til-ende-rotor i 20 minutter ved 4 °C.
- Etter at inkubasjonen er fullført, pellet cellene (som i trinn 1.1), dekanter supernatanten og resuspenderer i 1 ml kald D-PBS. Gjenta dette vasketrinnet to ganger (tre vasker totalt). Etter den tredje vasken, resuspender cellene i 989 μL D-PBS.
- Forbered en stamløsning på 100 mM biocytinhydrazid på forhånd. Deles opp i 50 μL alikoter, og oppbevares ved -20 °C i opptil 6 måneder. Tilsett 1 μL anilin og 10 μL 100 mM biocytinhydrazid til cellesuspensjonen i trinn 1.6, bland godt og inkuber på en ende-til-ende-rotor i 60 minutter ved 4 °C.
- Etter at inkubasjonen er fullført, pellet cellene (som i trinn 1.1), dekanter supernatanten og resuspenderer i 1 ml kald D-PBS. Gjenta dette vasketrinnet to ganger (tre vasker totalt).
- Etter den tredje vasken, aspirer supernatanten forsiktig med en pipette, og knips cellepelleten ved å plassere røret i væske N2. Sett den frosne pelleten på -80 °C, til den er klar til å fortsette med lyse og nedtrekk.
2. Cellelyse og biotin-nedtrekk
- Tine den frosne cellepelleten på is.
- Tilsett 500 μL 2x lysisbuffer til pelleten, bland godt og virvel i 30 s.
MERK: Kraftig pipettering og vortexing kan være nødvendig for å lyse pelleten helt. Noen uoppløselige rusk (dvs. DNA) er akseptabelt, da det fjernes i det etterfølgende sonikeringstrinnet. - Sonikere cellelysatet på is (tre utbrudd, 20 s hver, 60% driftssyklus).
- Sentrifuger lysatet for å pelletere eventuelle gjenværende rusk (10 min ved 17 200 × g ved 4 °C).
- Mens lysatet sentrifugerer, tilsett 100 μL nøytravidin agaroseharpiksperler til en filtreringskolonne. Fest kolonnen til en vakuummanifold, påfør et mildt vakuum og vask perlene ved å strømme 3 ml vaskebuffer 1 over dem.
- Fjern filtreringskolonnen fra vakuummanifolden, kapp bunnen og tilsett det klargjorte cellelysatet til kolonnen med perlene. Sett lokk på toppen av søylen, og rug lysatet med perlene på en ende-til-ende-rotor i 120 minutter ved 4 °C.
MERK: Når du kapper toppen av kolonnen, må du holde bunnhetten på plass, ellers kan den løsne og cellelysatet kan lekke under inkubasjon. - Klargjør vaskebuffer 1, 2 og 3 (ca. 5 ml av hver vaskebuffer per prøve, se tabell 1), og legg dem i et vannbad på 42 °C
- Etter at lysatet er ferdig med inkubasjonen, plasser filtreringskolonnen tilbake på vakuummanifolden, påfør et mildt vakuum og vask perlene ved å strømme 5 ml vaskebuffer 1 over dem.
NOTAT: Mer enn 5 ml av vaskebufferne kan brukes til vask; Ekstra vask kan redusere bakgrunn, uspesifikk binding på perlene. - Gjenta vasketrinnet med 5 ml vaskebuffer 2.
- Gjenta vasketrinnet med 5 ml vaskebuffer 3.
- Når den endelige vaskebufferen har strømmet helt gjennom perlene, fjerner du kolonnen fra manifolden. Tilsett 100 μL "Lyse" -løsning til kulene og overfør dem til et 1,7 ml lavproteinbindende mikrosentrifugerør med pipet. Spinn røret kort for å avgjøre perlene, og fjern 50 μL av løsningen uten å forstyrre de faste perlene.
MERK: Reagensene i dette trinnet og alle påfølgende trinn bruker et kommersielt tilgjengelig prøveprepareringssett for proteomikk. Settet gir en optimalisert, forenklet arbeidsflyt for prøveklargjøring. Disse trinnene kan imidlertid også utføres uavhengig av settet, ved hjelp av en tradisjonell arbeidsflyt for proteomikk som beskrevet i Verma et al.9. Hvis kulene forblir fast på siden eller bunnen av kolonnen, la kulene som er overført til røret sette seg, og bruk ekstra "Lyse" -løsning i røret for å overføre de resterende perlene. - Plasser tuben på en varmeblokk/shaker ved 65 °C, og rist ved 1000 o/min i 10 min.
MERK: Dette trinnet er nødvendig for reduksjon og alkylering av cysteinrester før fordøyelsen.
3. Protein fordøyelse
- Resuspender det tørkede trypsinet ("Digest" -røret i settet, lagret ved -20 ° C) ved å tilsette 210 μL av "Resuspend" -oppløsningen. Pipette oppløsningen opp og ned flere ganger for å sikre at alt tørket trypsin er resuspendert.
- Etter at inkubasjonen er fullført, tilsett 50 μL av den resuspenderte trypsinoppløsningen til perlene. Inkuber røret ved 37 °C, rist ved 500 o / min i minst 90 minutter for å fordøye proteinet.
- Når fordøyelsen er fullført, overfør løsningen som inneholder perlene til en spinnkolonne, og sett kolonnen inn i et 1,7 ml lavproteinbindende mikrosentrifugerør. Sentrifugerer røret (500 × g i 5 minutter ved romtemperatur [RT]) for å skille den fordøyde peptidløsningen fra kulene.
MERK: På dette stadiet kan PNGase-behandling utføres på perlene når de er skilt fra peptidløsningen, for å eluere biotinylerte peptidfragmenter fra streptapavidinperlene. Denne peptidprøven kan deretter videreføres gjennom resten av arbeidsflyten som en separat, sekundær peptidprøve som kan analyseres og sammenlignes med den primære prøven fra trypsinisering på perle. PNGase-tilnærmingen vil sannsynligvis gi komplementære data til trypsinisering på perler, gitt den ekstra spesifisiteten for fangede N-glykosylerte asparaginer basert på MS-detekterbar sidekjedemodifikasjon12. Ulempen med denne sekvensielle elueringsmetoden er imidlertid kravet om to ganger massespektrometerets instrumenttid per prøveanalyse. - Tilsett 100 μL av "Stopp" -løsningen for å stoppe fordøyelsesreaksjonen og surgjøre peptidoppløsningen.
4. Avsalting av peptid
- Bruk en røradapter til å plassere en avsaltingskolonne i et 1,7 ml mikrosentrifugerør med lav proteinbinding. Tilsett hele surgjort peptidoppløsning i kolonnen. Spinn kolonnen (3 800 × g i 3 minutter) slik at løsningen strømmer gjennom kolonnen. Peptidene er nå bundet til kolonnen; Forkast gjennomstrømningen.
- Tilsett 200 μL "Vask 1" -oppløsning i kolonnen og sentrifugerer (3.800 × g i 3 minutter, RT). Forkast gjennomstrømningen.
- Tilsett 200 μL "Vask 2" -oppløsning i kolonnen og spinn (3.800 × g i 3 minutter, RT). Forkast gjennomstrømningen.
- Overfør kolonnen til et nytt, merket 1,7 ml mikrosentrifugerør med lav proteinbinding. Tilsett 100 μL "Elute" -løsning til kolonnen og spinn (3.800 × g i 3 minutter, RT). Legg til en annen 100 μL "Elute" -løsning til kolonnen og spinn (3.800 × g i 3 minutter, RT). Peptidene er nå eluert av kolonnen og inn i røret.
- Plasser peptidløsningen i en vakuumsentrifuge og la den tørke over natten. Plasser de tørkede peptidene ved -80 °C til de er klare til å kvantifiseres, og analyser på massespektrometeret.
5. Peptidresuspensjon og kvantifisering
- Resuspender de tørkede peptidene i 20 μL oppløsningsmiddel A (0,1% maursyre, 2% acetonitril).
- Sentrifuge de resuspenderte peptidene (17 200 × g i 10 minutter) for å pelletere eventuelle uoppløselige rusk.
- Utarbeide peptidstandarder for den kolorimetriske peptidkvantifiseringsanalysen.
- Plasser 5 μL 1000 mg/ml peptidstamløsning i en brønn på en 96-brønnsplate.
- Utfør en syv-trinns seriell fortynning i platen med avionisert (DI) vann, som følger, med 5 μL av hver standard per brønn: 1000 mg / ml, 500 mg / ml, 250 mg / ml, 125 mg / ml, 62,5 mg / ml, 31,25 mg / ml og 15,625 mg / ml. Plasser 5 μL DI-vann i en åttende brønn for blankt.
- Plasser 4 μL DI-vann i tre separate brønner på 96-brønnplaten. Tilsett 1 μL av den resuspenderte peptidløsningen til hver brønn, for et totalt volum på 5 μL.
MERK: Ved pipettering av peptidoppløsningen for kvantifisering, pipetter du forsiktig fra toppen av løsningen for å unngå å forstyrre eventuelle avgjorte rusk. - Beregn hvor mye arbeidsreagens som trengs (45 μL kreves per brønn). Forbered det nødvendige volumet av den kolorimetriske analysens arbeidsreagens; Vortex arbeidsreagenset for å sikre riktig blanding av komponentene.
- Legg til 45 μL av arbeidsreagenset til hver av standard- og prøvebrønnene.
MERK: Lag standardene i duplikat, og bruk en flerkanals pipet for å sikre en minimal forskjell i tidspunktet for når reagenset tilsettes brønnene. - Dekk platen i aluminiumsfolie og inkuber ved 37 °C i 15 minutter.
- Analyser platen på en automatisert plateleser. Bruk absorbansverdiene som er registrert for standardprøvene for å generere en lineær standardkurve. Bestem ligningen for standardkurven og R 2-verdien. HvisR2-verdien er rimelig (≥0,95), bruk standardkurven for å bestemme konsentrasjonen av resuspenderte peptider, og regn med den femfoldige fortynningen i den kolorimetriske analyseplaten.
6. Væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS) analyse av fordøyde peptider
- Juster konsentrasjonen av peptidprøvene til 0,2 μg / μL ved å tilsette løsningsmiddel A, og overfør 10 μL til et 0,6 ml lavproteinbindende rør.
- Plasser røret i LC automatisk prøvetaker.
- Angi LC- og MS/MS-parametrene i henhold til figur 2 og figur 3.
- Injiser 5 μL (1 μg) av peptidprøven i LC-MS/MS-oppsettet for analyse.
MERK: LC-MS/MS-innstillingene som vises her, er bare representative for illustrasjonene. Avhengig av tilgjengeligheten av LC- og MS-instrumentet kan brukerne endre innstillingene for LC-gradient- og MS/MS-parameterne for å oppnå dyp proteomdekning. For dette papiret ble MS-dataanalysen utført ved hjelp av MaxQuant https://www.maxquant.org/, sekundær dataanalyse ble utført ved hjelp av Perseus https://maxquant.net/perseus/ og baneanalyse ved hjelp av https://reactome.org/.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For dette eksperimentet karakteriserte vi celleoverflateproteomet til en tumorcellelinje ved å merke N-glykosylerte membranproteiner av intakte celler med biotin, og berike disse merkede proteinene fra hele cellelysatet med en nøytronavidintrekk (figur 1). Videre utførte vi proteomanalyse ved hjelp av LC-MS / MS for å karakterisere berikede celleoverflateproteiner. I motsetning til helcelleproteomanalyse, var målet her å karakterisere bare celleoverflateproteiner. Derfor startet vi med en prøveinngang på 3,5 × 107 AMO-1 plasmacytomceller. Vi oppnådde en endelig peptidkonsentrasjon på ~630 ng/μL basert på den kolorimetriske peptidkvantifiseringsanalysen, og totalutbyttet var ~12,6 μg peptider (i 20 μL) (figur 2A). Deretter injiserte vi 1 μg peptidprøve i LC-MS/MS-systemet, og gjentok injeksjonen tre ganger for tekniske replikater. LC- og MS-parametrene som ble brukt ble optimalisert basert på tidligere eksperimenter (figur 2C og figur 3A). Vi benyttet en lang LC-gradient på 4 timer for å sikre maksimal dekning.
LC-MS/MS-data ble analysert ved hjelp av MaxQuant; Vi var i stand til å identifisere 2.221 proteiner med minst ett unikt peptid, og 1.764 proteiner med minst to unike peptider over alle de tre replikatene. Totalt ble det identifisert 12 307 unike peptider. Vi bestemte celleoverflateproteinberikelse i prøven ved å bruke et Python-skript (det nøyaktige skriptet vi brukte finnes i tilleggsfigur S1) som sammenligner resultatene oppnådd fra MaxQuant til flere etablerte datasett av celleoverflateproteiner. Disse datasettene inkluderer det tidligere rapporterte "in silico surfaceome"3 og et datasett etablert fra proteiner kommentert som membranlokalisert i UniProt13 (datasett er tilgjengelige i tilleggstabell S1). Denne analysen ga 601 overflateproteiner i vår prøve (ca. 27% av alle identifiserte proteiner) (figur 4A). Genontologisk annotasjon (http://geneontology.org/) ble utført, noe som indikerte at ca. 30 % av proteinene var kanonisk lokalisert til plasmamembranen. Reaktomveisanalyse (https://reactome.org/) indikerte også relativ anrikning av membranproteinene involvert i transmembrantransport og celleoverflateinteraksjoner (figur 5 og tilleggstabell S2).
Figur 1: Arbeidsflyt for merking av celleoverflater og påfølgende prøvepreparering for massespektrometrianalyse. Først merkes proteiner på overflaten av den ønskede celleprøven med biotin. Disse cellene blir deretter lysert, etterfulgt av inkubasjon med nøytraviravidinperler som binder biotinmerkede proteiner. Perlene vaskes deretter gjentatte ganger for å fjerne intracellulære proteiner og andre forurensninger. Proteinprøven gjennomgår deretter en perlefordøyelse med tilsetning av trypsin. Den resulterende prøven av peptidfragmenter gjennomgår deretter avsalting for å fjerne forurensninger fra vaske- og fordøyelsestrinnene. Den endelige peptidprøven tørkes deretter ned og er klar til å gjennomgå massespektrometrianalyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kolorimetrisk peptidkvantifiseringsstandardkurve og LC-gradient. (A) Åttepunkts standardkurve generert av kolorimetrisk peptidkvantifiseringsanalyse brukt til å bestemme peptidkonsentrasjon i behandlede prøver. (B) En illustrasjon av LC-MS/MS-systemet som brukes til å behandle prøver. (C) Væskekromatografigradient og strømningshastighet brukt til injeksjon av prøver på massespektrometeret. Forkortelser: LC-MS/MS = væskekromatografi-tandem massespektrometri. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Massespektrometriparametere og representativt kromatogram . (A) Parametere brukt for dette eksperimentet ved hjelp av et Orbitrap-massespektrometer. (B) Representativt kromatogram generert ved massespektrometrianalyse etter protokoll for "celleoverflatefangst" for en 4-timers gradient. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Analyse av proteinanriking på celleoverflaten og sammenligning av tekniske replikater. Disse datasettene inkluderer det tidligere rapporterte "in silico surfaceome"3 og et datasett etablert fra proteiner kommentert som membranlokalisert i UniProt13. (A) Antall proteiner og peptider identifisert med en annen grenseverdi etter fjerning av forurensninger, reversproteiner og en q-verdi > 0,05. (B) Plottet representerer fordelingen av det identifiserte proteinet og Andromeda score14. (C) Spredningsdiagrammet illustrerer utvalg-til-utvalg-korrelasjonen. Spearmans rangkorrelasjon måler styrken og retningen på assosiasjonen mellom to rangerte variabler. (D) Boksplott som viser kjørevariasjonen. (E) Utvalgsvis distribusjonsplott som representerer datakvaliteten til replikater. Forkortelse: LFQ = etikettfri kvantifisering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Traséanalyse. Pathway analyse ble utført ved hjelp av Reactome versjon 8222. En illustrerende skildring av celleoverflateinteraksjoner ved vaskulærveggen, som viser anrikning av celleoverflateproteom for viktige interaksjoner involvert i blodplate- og leukocyttinteraksjonen med endotelet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Navn på reagens | Komposisjon | Lagring | |||||
| 100 mM biocytinhydrazid | pulverform biocytinhydrazid oppløst i DMSO | Deles opp i 50 μL alikoter og oppbevares ved -20 °C i opptil 6 måneder. | |||||
| 160 ml natriummetaperiodat (NaIO4) | fast NaIO4 oppløst i DI-vann | Deles opp i 50 μL alikoter og oppbevares ved -20 °C i opptil 6 måneder. | |||||
| 2x RIPA lysis buffer | 2x RIPA lysis buffer, 1,25 mM EDTA, engangs proteasehemmere cocktail | Forbered fersk hver gang før du bruker 10x RIPA lysisbuffer. | |||||
| Peptid kolorimetrisk analyse arbeidsreagens | 50 % reagens A, 48 % reagens B, 2 % reagens C | Forbered fersk hver gang før bruk. Oppbevar komponenter ved 4 °C. | |||||
| Løsemiddel A | 0,1% maursyre, 2% acetonitril | Kan forberede seg på forhånd og oppbevare ved romtemperatur | |||||
| Vask Buffer 1 | 1x RIPA lysis buffer, 1 mM EDTA | Kan forberede stort parti på forhånd og lagre ved romtemperatur | |||||
| Vask Buffer 2 | 1x PBS, 1 M NaCl | Kan forberede stort parti på forhånd og lagre ved romtemperatur | |||||
| Vask Buffer 3 | 2 m urea, 50 mM ammoniumbikarbonat | Forbered deg frisk hver gang, da urea vil nedbrytes raskt over tid. | |||||
Tabell 1: Buffere og reagensløsninger brukt i denne protokollen.
Tilleggsfigur S1: Python-skript for å sammenligne resultater oppnådd fra MaxQuant med flere etablerte datasett av celleoverflateproteiner. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell S1: Datasett av celleoverflateproteiner. Disse datasettene inkluderer det tidligere rapporterte "in silico surfaceome"3 og et datasett etablert fra proteiner kommentert som membranlokalisert i UniProt13. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell S2: Her presenteres de 10 mest relevante forløpene (sortert etter p-verdi ). Forkortelser: FDR = falsk oppdagelsesrate; SLC = løsemiddelbærer; TCR = T-celle reseptor. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Massespektrometribasert proteomikk er et kraftig verktøy som har muliggjort objektiv karakterisering av tusenvis av ukjente proteiner på en tidligere umulig skala. Denne tilnærmingen tillater oss å identifisere og kvantifisere proteinene, samt samle en rekke innsikt for strukturelle og signaleringskapasiteter av celler og vev, ved å karakterisere mangfoldet av proteiner som er tilstede i en bestemt prøve. Ved å bevege seg utover global proteinprofilering i en prøve, tillater massespektrometri oss å karakterisere forskjellige posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM) på disse proteinene, noe som gir et enda dypere innblikk i stadiene av signalveier og proteindynamikk som ikke er tilgjengelige når man analyserer på DNA- eller RNA-nivå1. Mot utviklingen av nye kreftbehandlinger gir massespektrometribasert proteomikk oss mulighet til å sammenligne proteinprofilen til ondartede tumorceller mot sunt vev for å identifisere potensielle medisinerbare mål.
Det raskt voksende feltet av kreftimmunterapi er avhengig av antigener uttrykt på overflaten av ondartede celler for å identifisere og selektivt ødelegge svulster. Siden utviklingen av nye kreftimmunterapier er begrenset av mangelen på unike kreftspesifikke antigener, som er fraværende i sunt vev, er det avgjørende å identifisere flere nye antigener som er spesifikke for tumorceller15. Tumorspesifikke antigener trenger ikke være hele proteiner som er unike for tumorcellen, men kan også være spesifikke proteinkonformasjoner eller PTM fraværende i sunt vev16,17. Proteomisk analyse av celleoverflateproteiner på både tumor og friske celler kan gi nye kreftspesifikke antigenmål. Celleoverflateproteomikk krever anrikning av overflateproteiner fra helcellelysatet før massespektrometrianalyse, for å redusere prøvens kompleksitet og unngå ioneundertrykkelse av de ønskede membranproteiner (ofte lav overflod) av høyt uttrykte intracellulære proteiner18. Mens celleoverflatefangststrategien som brukes her, er en av de mest brukte anrikningsmetodene for celleoverflateproteomikk, finnes det andre metoder for celleoverflateproteinberikelse som er integrert med en massespektrometriarbeidsflyt, inkludert selektiv ultrasentrifugering av cellulære membraner, NHS-biotinmerking av overflatelysiner og enzymmediert biotinylering av celleoverflateproteiner19, 20. Head-to-head sammenligninger tyder på at celleoverflatefangstmetoden gir den optimale balansen mellom brukervennlighet og vellykket, relativt objektiv anrikning av celleoverflateproteiner med den laveste bakgrunnsmerkingen av intracellulære proteiner20.
Dette papiret presenterer en effektiv og tidseffektiv protokoll for en arbeidsflyt for celleoverflateproteomikk ved å integrere merking og nedtrekksprosedyre for celleoverflate med en optimalisert arbeidsflyt for prøvepreparering av proteomikk (figur 1). Hele prosedyren, fra høsting av dyrkede celler til analyse på massespektrometeret, kunne oppnås i løpet av 3 dager. For å oppnå mest mulig robust dekning av overflateproteomet, kan det hende at den første inngangen til celler må optimaliseres basert på celletypen som brukes. Å utføre et piloteksperiment med varierende celleinngang, alt fra noen få millioner celler opp til 50 millioner celler, anbefales for å sikre maksimal dekning. I tillegg, hvis en stor mengde høyt uttrykkende intracellulære proteiner observeres, kan økt vasking av nøytravidinkulene etter inkubasjon med lysatet minimere ikke-spesifikk binding av proteiner til perlene.
Vi anbefaler å utføre eksperimentet med minst tre biologiske replikater og tre tekniske replikater per tilstand, for å øke tilliten til at de identifiserte celleoverflatemarkørene faktisk er tilstede på de fleste celler. I tillegg, når du utfører arbeidsflyten for fangst av celleoverflate for en ny prøvetype, kan det være nyttig å analysere et helcellelysat ved hjelp av en konvensjonell hagleproteomikktilnærming21, for å sammenligne med resultatene av celleoverflaten. Analyse av råmassespektrometridataene kan utføres av ulike databasesøk og programvarepakker - her brukte vi MaxQuant - for å gi en liste over identifiserte proteiner22,23. Denne listen kan filtreres mot ulike kjente databaser 3,24 av overflateproteiner for å etablere en liste over celleoverflateproteiner identifisert i et enkelt eksperiment. Når en liste over celleoverflateproteiner er etablert, kan de analyseres videre for deres rolle i relevante biokjemiske veier25 eller legemiddelmålkandidater26. Denne arbeidsflyten kan brukes på et bredt spekter av celletyper, inkludert suspensjon og adherente cellelinjer (for adherente celler anbefaler vi å løfte celler uten bruk av trypsin før prøvepreparering, for å unngå spaltning av celleoverflateproteinene), samt primærprøver.
Ved hjelp av denne arbeidsflyten kunne vi trygt karakterisere celleoverflateproteomet til en bestemt cellelinje. Ved å sammenligne overflateproteomet til tumorcellelinjer mot friske celler, og kryssreferere med en RNA-sekvenseringsdatabase for normalt vev, kunne en liste over potensielle immunterapeutiske mål etableres 8,13. En begrensning av denne metoden er at, til tross for den betydelige anrikningen av celleoverflateproteiner versus et standard helcellelysateksperiment, er flertallet av proteinene identifisert ved massespektrometrianalyse i denne arbeidsflyten fortsatt kommentert som intracellulære. Avhengig av strengheten til overflateproteindatabasen som brukes, er omtrent 25% -30% av de identifiserte proteinene fra celleoverflaten. Vi forventer at en betydelig del av bakgrunnen utenfor overflaten sannsynligvis kommer fra bakgrunnsprotein som ikke er spesifikt bundet til perler (for eksempel som karakterisert ved CRAPome27-analyse), mens andre representerer cellepenetrasjon av merkingsreagenset for å reagere med N-glykosylerte proteiner i endoplasmatisk retikulum, Golgi eller andre intracellulære rom.
Mens alternative peptidelueringsmetoder som PNGase-behandling resulterer i mye større anrikning av N-glykositter blant de totale peptidene som analyseres, tillater denne tilnærmingen bare identifisering av individuelle glycyosylerte peptider, og mister verdifull informasjon fra den ikke-glykosylerte resten av den nedtrukne proteinsekvensen12. Denne ekstra informasjonen kan fanges opp med denne trypsiniseringsmetoden på perler, men ved den potensielle kompromisset av redusert spesifisitet for N-glykosylerte proteiner analysert i massespektrometeret. I tillegg overvinner selv PNGase-eluering ikke utfordringen med å merke intracellulære glykosylerte proteiner, og en PNGase-eluering fører vanligvis bare til et enkelt peptid per protein; Dette fører til betydelig variasjon i proteinidentifikasjon, per laboratoriets erfaring, mens fordøyelsen på perlen beskrevet her fører til flere peptider per fanget protein. Derfor, avhengig av målet med forsøket, kan man potensielt velge forskjellige strategier for å bruke celleoverflatefangststrategien. Disse strategiene inkluderer miniatyrisering og automatisering av celleoverflatefangstprotokollen for små prøveinnganger28 og bruk av streptavidinperler med varierende bindingskapasitet29, avhengig av applikasjonen. Metoden og arbeidsflyten som er illustrert her, fungerer som en robust, lett å utføre generell strategi for berikelse av celleoverflateproteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Kamal Mandal (Dept of Laboratory Medicine, UCSF) for hjelp med å sette opp LC-MS / MS kjøre, Deeptarup Biswas (BSBE, IIT Bombay) for hjelp med dataanalyse, og Dr. Audrey Reeves (Dept of Laboratory Medicine, UCSF) for hjelp med dataanalyse. Relatert arbeid i APW-laboratoriet støttes av NIH R01 CA226851 og Chan Zuckerberg Biohub. Figur 1 og figur 2B ble laget med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| 96X iST Sample Preparation Kit | PreOmics | P.O.00027 | Proteomics sample preparation kit. Includes reagents for reduction, alkylation, and digestion. Also include desalting columns and reagents. |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo | 23275 | Peptide quantification kit. Includes peptide standards and components of working reagents. |
| Reagents | |||
| Acetonitrile | Fisher | A955-1 | |
| Ammonium bicarbonate | Millipore Sigma | 09830-1KG | |
| Biocytin hydrazide | Biotium | 90060 | |
| D-PBS (w/o Calcium and Magnesium Salts) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003-225B01 | |
| Formic Acid | Honeywell | 94318 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Single-Use Cocktail | Thermo | 1861280 | |
| High Capacity Neutravidin Agarose Resin | Thermo | 29204 | |
| Phosphate Buffered Saline | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001-22J01 | |
| RIPA Lysis Buffer, 10x | Millipore Sigma | 20-188 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Sodium metaperiodate | Alfa Aesar | 13798 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | |
| Urea (Proteomics Grade) | VWR | M123-1KG | |
| Equipment | |||
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | |
| PrismR Microcentrifuge | Labnet International | C2500-R-230V | |
| Sonicator | VWR | Branson Sonifier 240 | |
| Vacuum Manifold | Promega | Promega Vac-Man | |
| Shaking Heatblock | Eppendorf | Eppendorf Thermomixer C | |
| End-to-End rotator | Labnet | Revolver Adjustable Rotator | |
| LC | Thermo | Ultimate 3000 HPLC and UHPLC | |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrapole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| Microplate Reader | Biotek | Biotek Synergy 2 | |
| Vacuum Concentrator | Labconco | 7810010 | |
| Supplies | |||
| 1.5 mL Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | |||
| Filtration Columns | Bio-Rad | 7326008 | |
| Spin Columns | Thermo | 69725 |
References
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
- Aslam, B., Basit, M. B., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. Proteomics: technologies and their applications. Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).
- Bausch-Fluck, D., et al.
- Takahashi, Y., et al. Research advance in tumor specific antigens: A narrative review. AME Medical Journal. 6, 35 (2021).
- Li, Y., Qin, H., Ye, M. An overview on enrichment methods for cell surface proteome profiling. Journal of Separation Science. 43 (1), 292-312 (2020).
- Wollscheid, B., et al. Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins. Nature Biotechnology. 27 (4), 378-386 (2009).
- Chandler, K. B., Costello, C. C. Glycomics and glycoproteomics of membrane proteins and cell-surface receptors: present trends and future opportunities. Electrophoresis. 37 (11), 1407-1419 (2016).
- Ferguson, I. D., et al. The surfaceome of multiple myeloma cells suggests potential immunotherapeutic strategies and protein markers of drug resistance. Nature Communications. 13 (1), 4121 (2022).
- Karcini, A., Lazar, I. M. The SKBR3 cell-membrane proteome reveals telltales of aberrant cancer cell proliferation and targets for precision medicine applications. Scientific Reports. 12 (1), 10847 (2022).
- Köhnke, T., et al. Integrated multiomic approach for identification of novel immunotherapeutic targets in AML. Biomarker Research. 10 (1), 43 (2022).
- Verma, A., Kumar, V., Ghantasala, S., Mukherjee, S., Srivastava, S. Comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples. Journal of Visualized Experiments. (177), e61786 (2021).
- Leung, K. K., et al. Broad and thematic remodeling of the surfaceome and glycoproteome on isogenic cells transformed with driving proliferative oncogenes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (14), 7764-7775 (2020).
- Nix, M. A., et al. Surface proteomics reveals CD72 as a target for in vitro-evolved nanobody-based CAR-T cells in KMT2A/MLL1-rearranged B-ALL. Cancer Discovery. 11 (8), 2032-2049 (2021).
- Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
- Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
- Hosen, N., et al. The activated conformation of integrin β7 is a novel multiple myeloma-specific target for CAR T cell therapy. Nature Medicine. 23 (12), 1436-1443 (2017).
- Costa, A. F., Campos, D., Reis, C. A., Gomes, C. Targeting glycosylation: A new road for cancer drug discovery. Trends in Cancer. 6 (9), 757-766 (2020).
- Gundry, R. L., Boheler, K. R., Van Eyk, J. E., Wollscheid, B. A novel role for proteomics in the discovery of cell-surface markers on stem cells: Scratching the surface. Proteomics. Clinical Applications. 2 (6), 892-903 (2008).
- Itzhak, D. N., et al. A mass spectrometry-based approach for mapping protein subcellular localization reveals the spatial proteome of mouse primary neurons. Cell Reports. 20 (11), 2706-2718 (2017).
- Kirkemo, L. L., et al. Cell-surface tethered promiscuous biotinylators enable comparative small-scale surface proteomic analysis of human extracellular vesicles and cells. eLife. 11, 73982 (2022).
- Wojtkiewicz, M., Berg Luecke, L., Kelly, M. I., Gundry, R. L. Facile preparation of peptides for mass spectrometry analysis in bottom-up proteomics workflows. Current Protocols. 1 (3), 85 (2021).
- Välikangas, T., Suomi, T., Elo, L. L. A comprehensive evaluation of popular proteomics software workflows for label-free proteome quantification and imputation. Briefings in Bioinformatics. 19 (6), 1344-1355 (2018).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Bausch-Fluck, D., et al. A mass spectrometric-derived cell surface protein atlas. PLoS One. 10 (3), 0121314 (2015).
- Griss, J., et al. ReactomeGSA-efficient multi-omics comparative pathway analysis. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (12), 2115-2125 (2020).
- Waas, M., et al. SurfaceGenie: a web-based application for prioritizing cell-type-specific marker candidates. Bioinformatics. 36 (11), 3447-3456 (2020).
- Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).
- van Oostrum, M., et al. Classification of mouse B cell types using surfaceome proteotype maps. Nature Communications. 10 (1), 5734 (2019).
- Berg Luecke, L., Gundry, R. L. Assessment of streptavidin bead binding capacity to improve quality of streptavidin-based enrichment studies. Journal of Proteome Research. 20 (2), 1153-1164 (2021).
