Summary
Här beskriver vi ett proteomikarbetsflöde för karakterisering av cellyteproteomet hos olika celltyper. Detta arbetsflöde inkluderar proteinanrikning på cellytan, efterföljande provberedning, analys med hjälp av en LC-MS / MS-plattform och databehandling med specialiserad programvara.
Abstract
Under det senaste decenniet har masspektrometribaserad proteomik möjliggjort en djupgående karakterisering av biologiska system inom ett brett spektrum av applikationer. Cellyteproteomet ("surfaceome") i mänsklig sjukdom är av betydande intresse, eftersom plasmamembranproteiner är det primära målet för de flesta kliniskt godkända terapier, liksom en nyckelfunktion för att diagnostiskt skilja sjuka celler från friska vävnader. Fokuserad karakterisering av membran- och ytproteiner i cellen har dock förblivit utmanande, främst på grund av komplexiteten hos cellulära lysater, som maskerar proteiner av intresse av andra proteiner med hög överflöd. För att övervinna denna tekniska barriär och noggrant definiera cellyteproteomet för olika celltyper med hjälp av masspektrometriproteomik är det nödvändigt att anrika celllysatet för cellytproteiner före analys på masspektrometern. Detta dokument presenterar ett detaljerat arbetsflöde för märkning av cellyteproteiner från cancerceller, anrikning av dessa proteiner ur celllysatet och efterföljande provberedning för masspektrometrianalys.
Introduction
Proteiner fungerar som de grundläggande enheterna genom vilka majoriteten av cellulära funktioner utförs. Att karakterisera strukturen och funktionen hos relevanta proteiner är ett viktigt steg för att förstå biologiska processer. Under det senaste decenniet har framsteg inom masspektrometriteknik, analysprogramvara och databaser möjliggjort noggrann detektion och mätning av proteiner i en proteomomfattande skala1. Masspektrometribaserad proteomik kan användas i ett brett spektrum av applikationer, från grundläggande vetenskaplig analys av biokemiska vägar, till identifiering av nya läkemedelsmål i en translationell miljö, till diagnos och övervakning av sjukdomar i kliniken2. Vid screening för nya läkemedelsmål är karakterisering av cellyteproteomet särskilt viktigt, med över 65% av för närvarande godkända humana läkemedel riktade mot cellytproteiner3. Området cancerimmunterapi är också helt beroende av cancerspecifika cellytantigener för att rikta in sig på och specifikt eliminera tumörceller4. Masspektrometribaserad proteomik kan därmed fungera som ett lovande verktyg för att identifiera nya cellyteproteiner mot terapeutiska ingrepp.
Det finns dock flera begränsningar när man använder konventionella proteomikmetoder för att kartlägga tumörceller för nya cellyteproteinmål. Ett primärt problem är att ytproteiner utgör en mycket liten del av de totala proteinmolekylerna i en cell. Därför maskeras fragment av dessa proteiner av ett högt överflöd av intracellulära proteiner när man utför masspektrometrianalys av helcellslysatet5. Denna begränsning gör det svårt att exakt karakterisera cellyteproteomet med ett traditionellt proteomikarbetsflöde. För att ta itu med denna utmaning är det nödvändigt att utveckla sätt att anrika cellyteproteiner ur helcellslysatet, före analys på masspektrometern. En sådan metod innefattar oxidation och biotinmärkning av glykosylerade cellyteproteiner i de intakta cellerna och efterföljande anrikning av dessa biotinylerade proteiner från lysatet med en neutravidinneddragning, en process som har kallats "cell surface capture"6. Eftersom ~ 85% av däggdjurscellytproteinerna tros vara glykosylerade7, fungerar detta som en effektiv metod för att berika cellyteproteomet ur hela celllysatet. Detta dokument beskriver ett komplett arbetsflöde, som börjar med odlade celler, av cellyta biotin märkning och efterföljande provberedning för masspektrometrianalys (figur 1). Över flera replikat ger denna metod robust täckning av cellyteproteomet för ett visst prov. Att använda denna metod för att karakterisera cellyteproteomet hos både tumörceller och friska celler kan underlätta upptäckten av nya cellytantigener för att identifiera potentiella immunterapeutiska mål8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: AMO1 plasmacytomceller användes för detta cellyteproteomexperiment. Samma protokoll kan också användas för andra celltyper, inklusive ett brett spektrum av suspensions- och vidhäftande cellinjer9, liksom olika typer av primära prover10. Cellnummer (utgångsmaterial för experimentet) måste dock vanligtvis optimeras för motsvarande proteomtäckning. För detaljer relaterade till material och utrustning, se materialförteckningen. För närmare uppgifter om buffertar och reagenslösningar och deras sammansättning, se tabell 1.
1. Cellytmärkning med biotin
- Räkna odlade celler och pellet ca 3,5 × 107 levande celler genom centrifugering (5 min vid 500 × g, 24 °C).
OBS: AMO1-plasmacytomcellerna passerades med färskt media var 3: e dag före skörden. - Aspirera supernatanten och suspendera pelleten igen genom att tillsätta 1 ml kall (4 °C) Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (D-PBS) (inget kalcium, inget magnesium) och försiktigt pipettera upp och ner.
- Pellet cellerna igen (som i steg 1.1) och upprepa tvättsteget (steg 1.2) en gång till (totalt två tvättar).
- Efter den andra tvättningen, pellet cellerna (som i steg 1.1) och återsuspendera dem i 990 μL kall D-PBS genom försiktigt pipettering.
- Bered en stamlösning av 160 mM natriummetaperiodat (NaIO4) i förväg. Dela upp i 50 μl alikvoter och förvara vid -20 °C i upp till 6 månader. Tillsätt 10 μl 160 mM natriummetaperiodatlösning till cellsuspensionen i steg 1.4, blanda noggrant och inkubera på en rotor från ände till ände i 20 minuter vid 4 °C.
- När inkubationen är klar, pelletera cellerna (som i steg 1.1), dekantera supernatanten och återsuspendera i 1 ml kall D-PBS. Upprepa detta tvättsteg två gånger (totalt tre tvättar). Efter den tredje tvätten, suspendera cellerna igen i 989 μL D-PBS.
- Bered en stamlösning av 100 mM biocytinhydrazid i förväg. Dela upp i 50 μl alikvoter och förvara vid -20 °C i upp till 6 månader. Tillsätt 1 μl anilin och 10 μl 100 mM biocytinhydrazid till cellsuspensionen i steg 1.6, blanda noggrant och inkubera på en rotor från ände till ände i 60 minuter vid 4 °C.
- När inkubationen är klar, pelletera cellerna (som i steg 1.1), dekantera supernatanten och återsuspendera i 1 ml kall D-PBS. Upprepa detta tvättsteg två gånger (totalt tre tvättar).
- Efter den tredje tvätten, aspirera supernatanten försiktigt med en pipett och snäppfrys cellpelleten genom att placera röret i vätska N2. Placera den frusna pelleten vid -80 °C tills den är klar att fortsätta med lys och neddragning.
2. Celllys och neddragning av biotin
- Tina den frusna cellpelleten på is.
- Tillsätt 500 μL 2x lysbuffert till pelleten, blanda noggrant och virvel i 30 sekunder.
OBS: Kraftig pipettering och virvling kan krävas för att lysera pelleten helt. Vissa olösliga skräp (dvs DNA) är acceptabelt, eftersom det avlägsnas i det efterföljande ultraljudsbehandlingssteget. - Sonicate celllysatet på is (tre skurar, 20 s vardera, 60% arbetscykel).
- Centrifugera lysatet för att pellera eventuellt kvarvarande skräp (10 min vid 17 200 × g vid 4 °C).
- Medan lysatet centrifugerar, tillsätt 100 μL neutravidin agaroshartspärlor till en filtreringskolonn. Fäst kolonnen på ett vakuumgrenrör, applicera ett försiktigt vakuum och tvätta pärlorna genom att flyta 3 ml tvättbuffert 1 över dem.
- Ta bort filtreringskolonnen från vakuumgrenröret, täck botten och tillsätt det klarade celllysatet till kolonnen med pärlorna. Häll kolonnens ovansida och inkubera lysatet med pärlorna på en rotor från ände till ände i 120 minuter vid 4 °C.
OBS: När du täcker toppen av kolonnen, håll fast bottenlocket på plats, annars kan det lossna och celllysatet kan läcka under inkubation. - Förbered tvättbuffertarna 1, 2 och 3 (cirka 5 ml av varje tvättbuffert per prov, se tabell 1) och placera dem i ett vattenbad på 42 °C
- När lysatet har avslutat inkubationen, placera filtreringskolonnen tillbaka på vakuumgrenröret, applicera ett försiktigt vakuum och tvätta pärlorna genom att flöda 5 ml tvättbuffert 1 över dem.
OBS: Mer än 5 ml av tvättbuffertarna kan användas för tvätt; Extra tvätt kan minska bakgrunden, ospecifik bindning på pärlorna. - Upprepa tvättsteget med 5 ml tvättbuffert 2.
- Upprepa tvättsteget med 5 ml tvättbuffert 3.
- När den slutliga tvättbufferten har flödat helt genom pärlorna, ta bort kolonnen från grenröret. Tillsätt 100 μL "Lyse" -lösning till pärlorna och överför dem till ett 1,7 ml lågproteinbindande mikrocentrifugrör med en pipet. Snurra röret kort för att sedimentera pärlorna och ta bort 50 μL av lösningen utan att störa de sedimenterade pärlorna.
OBS: Reagenserna i detta steg och alla efterföljande steg använder en kommersiellt tillgänglig proteomikprovberedningssats. Satsen ger ett optimerat, förenklat arbetsflöde för provberedning. Dessa steg kan dock också utföras oberoende av satsen, med hjälp av ett traditionellt proteomikarbetsflöde som beskrivs i Verma et al.9. Om pärlorna förblir fast på sidan eller botten av kolonnen, låt pärlorna som har överförts till röret sätta sig och använd extra "Lyse" -lösning i röret för att överföra de återstående pärlorna. - Placera röret på ett värmeblock/en skakapparat vid 65 °C och skaka vid 1 000 varv/min i 10 minuter.
OBS: Detta steg krävs för reduktion och alkylering av cysteinrester före matsmältningen.
3. Protein digestion
- Återsuspendera det torkade trypsinet ("Digest"-röret i satsen, förvarat vid -20 °C) genom att tillsätta 210 μL av "Resuspend"-lösningen. Pipettera lösningen upp och ner flera gånger för att säkerställa att allt torkat trypsin är resuspenderat.
- När inkubationen är klar tillsätts 50 μL av den återsuspenderade trypsinlösningen till pärlorna. Inkubera röret vid 37 °C och skaka vid 500 rpm i minst 90 minuter för att smälta proteinet.
- När uppslutningen är klar, överför lösningen som innehåller pärlorna till en spinnkolonn och sätt in kolonnen i ett 1,7 ml lågproteinbindande mikrocentrifugrör. Snurra röret (500 × g i 5 minuter vid rumstemperatur [RT]) för att separera den smälta peptidlösningen från pärlorna.
OBS: I detta skede kan PNGase-behandling utföras på pärlorna när de separeras från peptidlösningen, för att eluera biotinylerade peptidfragment från streptavidinpärlorna. Detta peptidprov kan sedan föras vidare genom resten av arbetsflödet som ett separat, sekundärt peptidprov som kan analyseras och jämföras med det primära provet från trypsinisering på pärlan. PNGase-metoden kommer sannolikt att ge kompletterande data till trypsinisering på strängar, med tanke på den ytterligare specificiteten för fångade N-glykosylerade asparaginer baserat på MS-detekterbar sidokedjemodifiering12. Nackdelen med denna sekventiella elueringsmetod är emellertid kravet på två gånger masspektrometerinstrumenttiden per provanalys. - Tillsätt 100 μL av "Stop" -lösningen för att stoppa matsmältningsreaktionen och surgöra peptidlösningen.
4. Avsaltning av peptider
- Använd en röradapter och placera en avsaltningskolonn i ett 1,7 ml lågproteinbindande mikrocentrifugrör. Tillsätt hela den surgjorda peptidlösningen till kolonnen. Snurra kolonnen (3 800 × g i 3 minuter) så att lösningen rinner genom kolonnen. Peptiderna är nu bundna till kolonnen; Kassera genomflödet.
- Tillsätt 200 μl "Wash 1"-lösning till kolonnen och snurra (3 800 × g i 3 min, RT). Ignorera genomflödet.
- Tillsätt 200 μl "Wash 2"-lösning till kolonnen och snurra (3 800 × g i 3 min, RT). Ignorera genomflödet.
- Överför kolonnen till ett nytt, märkt 1,7 ml lågproteinbindande mikrocentrifugrör. Tillsätt 100 μl "Eluerad" lösning till kolonnen och snurra (3 800 × g i 3 min, RT). Tillsätt ytterligare 100 μL "Eluerad"-lösning till kolonnen och snurra (3 800 × g i 3 min, RT). Peptiderna elueras nu från kolonnen in i röret.
- Placera peptidlösningen i en vakuumcentrifug och låt den torka över natten. Placera de torkade peptiderna vid -80 °C tills de är klara att kvantifieras och analysera på masspektrometern.
5. Resuspension och kvantifiering av peptider
- Återsuspendera de torkade peptiderna i 20 μL lösningsmedel A (0,1% myrsyra, 2% acetonitril).
- Centrifugera de återsuspenderade peptiderna (17 200 × g i 10 minuter) för att pellet eventuellt olösligt skräp.
- Förbered peptidstandarder för kolorimetrisk peptidkvantifieringsanalys.
- Placera 5 μl 1 000 mg/ml peptidstamlösning i en brunn på en platta med 96 brunnar.
- Utför en sjustegs serieutspädning i plattan med avjoniserat (DI) vatten, enligt följande, med 5 μL av varje standard per brunn: 1 000 mg / ml, 500 mg / ml, 250 mg / ml, 125 mg / ml, 62,5 mg / ml, 31,25 mg / ml och 15,625 mg / ml. Placera 5 μL DI-vatten i en åttonde brunn för ämnet.
- Placera 4 μL DI-vatten i tre separata brunnar på 96-brunnsplattan. Tillsätt 1 μL av den resuspenderade peptidlösningen till varje brunn för en total volym på 5 μl.
OBS: Vid pipettering av peptidlösningen för kvantifiering, pipettera försiktigt från toppen av lösningen för att förhindra att eventuella sedimenterade skräp störs. - Beräkna hur mycket arbetsreagens som behövs (45 μL krävs per brunn). Bered den erforderliga volymen av det kolorimetriska analysarbetsreagenset; virvel arbetsreagenset för att säkerställa korrekt blandning av komponenterna.
- Tillsätt 45 μl arbetsreagens till var och en av standard- och provbrunnarna.
OBS: Gör standarderna i två exemplar och använd en flerkanalig pipet för att säkerställa en minimal skillnad i tidpunkten för när reagenset tillsätts till brunnarna. - Täck plattan med aluminiumfolie och inkubera vid 37 °C i 15 minuter.
- Analysera plattan på en automatiserad plattläsare. Använd absorbansvärdena som registrerats för standardproverna för att generera en linjär standardkurva. Bestäm ekvationen för standardkurvan och R2-värdet . OmR2-värdet är rimligt (≥0,95), använd standardkurvan för att bestämma koncentrationen av återsuspenderade peptider, med hänsyn tagen till den femfaldiga utspädningen i den kolorimetriska analysplattan.
6. Vätskekromatografi-tandemmasspektrometri (LC-MS/MS) analys av de smälta peptiderna
- Justera koncentrationen av peptidproverna till 0,2 μg/μl genom tillsats av lösningsmedel A och överför 10 μl till ett 0,6 ml lågproteinbindande rör.
- Placera röret i LC-autosamplern.
- Ställ in LC- och MS/MS-parametrarna enligt figur 2 och figur 3.
- Injicera 5 μL (1 μg) av peptidprovet i LC-MS/MS-inställningen för analys.
LC-MS/MS-inställningarna som visas här är endast representativa för illustrationerna. Beroende på LC- och MS-instrumentens tillgänglighet kan användare ändra inställningarna för LC-gradienten och MS/MS-parametrarna för att få djup proteomtäckning. För detta dokument utfördes MS-dataanalysen med MaxQuant https://www.maxquant.org/, sekundär dataanalys utfördes med Perseus https://maxquant.net/perseus/ och väganalys med https://reactome.org/.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För detta experiment karakteriserade vi cellyteproteomet i en tumörcellinje genom att märka N-glykosylerade membranproteiner av intakta celler med biotin och berika dessa märkta proteiner från hela celllysatet med en neutravidinneddragning (Figur 1). Vidare utförde vi proteomanalys med LC-MS/MS för att karakterisera anrikade cellyteproteiner. Till skillnad från helcellsproteomanalys var målet här att karakterisera endast cellyteproteiner. Därför började vi med en provinmatning av 3,5 × 107 AMO-1 plasmacytomceller. Vi erhöll en slutlig peptidkoncentration på ~ 630 ng / μL baserat på kolorimetrisk peptidkvantifieringsanalys och det totala utbytet var ~ 12,6 μg peptider (i 20 μL) (figur 2A). Vi injicerade sedan 1 μg peptidprov i LC-MS/MS-systemet och upprepade injektionen tre gånger för tekniska replikat. De LC- och MS-parametrar som användes optimerades baserat på tidigare experiment (figur 2C och figur 3A). Vi använde en lång LC-gradient på 4 timmar för att säkerställa maximal täckning.
LC-MS/MS-data analyserades med MaxQuant; Vi kunde identifiera 2 221 proteiner med minst en unik peptid och 1 764 proteiner med minst två unika peptider över alla tre replikaten. Totalt identifierades 12 307 unika peptider. Vi bestämde proteinanrikning på cellytan i provet genom att använda ett Python-skript (det exakta skriptet vi använde finns i kompletterande figur S1) som jämför resultaten erhållna från MaxQuant med flera etablerade dataset av cellytproteiner. Dessa dataset inkluderar det tidigare rapporterade "in silico surfaceome"3 och ett dataset etablerat från proteiner annoterade som membranlokaliserade i UniProt13 (dataset finns tillgängliga i kompletterande tabell S1). Denna analys gav 601 ytproteiner i vårt prov (cirka 27% av alla identifierade proteiner) (figur 4A). Genontologiannotering (http://geneontology.org/) utfördes, vilket indikerade att cirka 30% av proteinerna var kanoniskt lokaliserade till plasmamembranet. Reaktomvägsanalys (https://reactome.org/) indikerade också relativ anrikning av membranproteinerna involverade i transmembrantransport och cellyteinteraktioner (figur 5 och kompletterande tabell S2).
Figur 1: Arbetsflöde för märkning av cellytan och efterföljande provberedning för masspektrometrianalys. Först märks proteiner vid ytan av det önskade cellulära provet med biotin. Dessa celler lyseras sedan, följt av inkubation med neutravidinpärlor som binder biotinmärkta proteiner. Pärlorna tvättas sedan upprepade gånger för att avlägsna intracellulära proteiner och andra föroreningar. Proteinprovet genomgår sedan en matsmältning på pärlan med tillsats av trypsin. Det resulterande provet av peptidfragment genomgår sedan avsaltning för att avlägsna föroreningar från tvätt- och matsmältningsstegen. Det slutliga peptidprovet torkas sedan ner och är redo att genomgå masspektrometrianalys. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Kolorimetrisk peptidkvantifiering standardkurva och LC-gradient. a) Åttapunkts standardkurva genererad genom kolorimetrisk peptidkvantifieringsanalys som används för att bestämma peptidkoncentrationen i bearbetade prover. b) En illustration av det LC-MS/MS-system som används för att bearbeta prover. c) Vätskekromatografigradient och flödeshastighet som används för injektion av prover på masspektrometern. Förkortningar: LC-MS/MS = vätskekromatografi-tandemmasspektrometri. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Masspektrometriparametrar och representativt kromatogram . (A) Parametrar som används för detta experiment med en Orbitrap-masspektrometer. b) Representativt kromatogram genererat genom masspektrometrianalys enligt protokollet för infångning av cellytan för en gradient på 4 timmar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Analys av proteinanrikning på cellytan och jämförelse av tekniska replikat. Dessa dataset inkluderar det tidigare rapporterade "in silico surfaceome"3 och ett dataset etablerat från proteiner annoterade som membranlokaliserade i UniProt13. (A) Antalet proteiner och peptider som identifierats med en annan cut-off efter avlägsnande av föroreningar, omvända proteiner och ett q-värde > 0,05. (B) Diagrammet representerar fördelningen av det identifierade proteinet och Andromeda-poäng14. (C) Spridningsdiagrammet illustrerar korrelationen mellan prov och prov. Spearmans rangkorrelation mäter styrkan och associationsriktningen mellan två rankade variabler. (D) Boxdiagram som visar run-to-run-variationen. E) Fördelningsdiagram på ett urval som representerar replikatens datakvalitet. Förkortning: LFQ = etikettfri kvantifiering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Analys av spridningsvägar. Pathway analys utfördes med hjälp av Reactome version 8222. En illustrativ bild av cellyteinteraktioner vid kärlväggen, som uppvisar anrikning av cellyteproteom för viktiga interaktioner involverade i trombocyt- och leukocytinteraktionen med endotelet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Reagensens namn | Sammansättning | Lagring | |||||
| 100 mM biocytinhydrazid | pulverform biocytinhydrazid upplöst i DMSO | Dela upp i 50 μl alikvoter och förvara vid -20 °C i upp till 6 månader. | |||||
| 160 mM natriummetaperiodat (NaIO4) | fast NaIO4 upplöst i DI-vatten | Dela upp i 50 μl alikvoter och förvara vid -20 °C i upp till 6 månader. | |||||
| 2x RIPA lysbuffert | 2x RIPA lysis buffert, 1,25 mM EDTA, engångs proteashämmare cocktail | Förbered färskt varje gång innan du använder 10x RIPA lysis buffert. | |||||
| Peptidkolorimetrisk analys som arbetar reagens | 50% Reagens A, 48% Reagens B, 2% Reagens C | Förbered färskt varje gång före användning. Förvara komponenter vid 4 °C. | |||||
| Lösningsmedel A | 0,1% myrsyra, 2% acetonitril | Kan förbereda i förväg och förvara vid rumstemperatur | |||||
| Tvätta buffert 1 | 1x RIPA lysbuffert, 1 mM EDTA | Kan förbereda stor sats i förväg och förvara i rumstemperatur | |||||
| Tvätta buffert 2 | 1x PBS, 1 M NaCl | Kan förbereda stor sats i förväg och förvara i rumstemperatur | |||||
| Tvätta buffert 3 | 2 M urea, 50 mM ammoniumbikarbonat | Förbered färskt varje gång eftersom urea kommer att brytas ned snabbt över tiden. | |||||
Tabell 1: Buffertar och reagenslösningar som används i detta protokoll.
Kompletterande figur S1: Python-skript för att jämföra resultat erhållna från MaxQuant med flera etablerade dataset av cellyteproteiner. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande tabell S1: Dataset för cellyteproteiner. Dessa dataset inkluderar det tidigare rapporterade "in silico surfaceome"3 och ett dataset etablerat från proteiner annoterade som membranlokaliserade i UniProt13. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande tabell S2: De 10 mest relevanta vägarna (sorterade efter p-värde ) presenteras här. Förkortningar: FDR = falsk upptäcktsfrekvens; SLC = löst bärare; TCR = T-cellreceptor. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Masspektrometribaserad proteomik är ett kraftfullt verktyg som har möjliggjort opartisk karakterisering av tusentals okända proteiner i en tidigare omöjlig skala. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt för oss att identifiera och kvantifiera proteinerna, samt få en rad insikter för cellernas och vävnadernas strukturella och signaleringskapacitet genom att karakterisera de olika proteiner som finns i ett visst prov. Masspektrometri går bortom global proteinprofilering i ett prov och tillåter oss att karakterisera olika posttranslationella modifieringar (PTM) på dessa proteiner, vilket ger en ännu djupare inblick i stadierna av signalvägar och proteindynamik som inte är tillgängliga vid analys på DNA- eller RNA-nivå1. Mot utvecklingen av nya cancerterapier tillåter masspektrometribaserad proteomik oss att jämföra proteinprofilen hos maligna tumörceller kontra friska vävnader för att identifiera potentiella läkemedelsmål.
Det snabbt växande området cancerimmunterapi bygger på antigener som uttrycks på ytan av maligna celler för att identifiera och selektivt förstöra tumörer. Eftersom utvecklingen av nya cancerimmunterapier begränsas av bristen på unika cancerspecifika antigener, som saknas i friska vävnader, är det viktigt att identifiera fler nya antigener som är specifika för tumörceller15. Tumörspecifika antigener behöver inte vara hela proteiner som är unika för tumörcellen, utan kan också vara specifika proteinkonformationer eller PTM som saknas i friska vävnader16,17. Proteomisk analys av cellyteproteiner på både tumörceller och friska celler kan ge nya cancerspecifika antigenmål. Cellyteproteomik kräver anrikning av ytproteiner från helcellslysatet före masspektrometrianalys, för att minska provets komplexitet och undvika jonundertryckning av de önskade membranproteinerna (ofta låg förekomst) av starkt uttryckta intracellulära proteiner18. Medan strategin för fångst av cellytan som används här är en av de vanligaste anrikningsmetoderna för cellyteproteomik, finns det andra metoder för proteinanrikning på cellytan som har integrerats med ett masspektrometriarbetsflöde, inklusive selektiv ultracentrifugering av cellmembran, NHS-biotinmärkning av ytlysiner och enzymmedierad biotinylering av cellytproteiner19, 20. Head-to-head-jämförelser tyder på att cellytefångstmetoden ger den optimala balansen mellan användarvänlighet och framgångsrik, relativt opartisk anrikning av cellytproteiner med den lägsta bakgrundsmärkningen av intracellulära proteiner20.
Detta dokument presenterar ett effektivt och tidseffektivt protokoll för ett arbetsflöde för cellyteproteomik genom att integrera cellytans märkning och nedrullningsprocedur med ett optimerat arbetsflöde för beredning av proteomikprov (figur 1). Hela proceduren, från skörd av odlade celler till analys på masspektrometern, kunde uppnås under 3 dagar. För att få så robust täckning som möjligt av ytproteomet kan den initiala inmatningen av celler behöva optimeras baserat på vilken celltyp som används. Att utföra ett pilotexperiment med varierande cellinmatning, allt från några miljoner celler upp till 50 miljoner celler, rekommenderas för att säkerställa maximal täckning. Dessutom, om en stor mängd höguttryckande intracellulära proteiner observeras, kan ökad tvättning av neutravidinpärlorna efter inkubation med lysatet minimera icke-specifik bindning av proteiner till pärlorna.
Vi rekommenderar att du utför experimentet med minst tre biologiska replikat och tre tekniska replikat per tillstånd, för att öka förtroendet för att de identifierade cellytmarkörerna verkligen finns på majoriteten av cellerna. När du utför arbetsflödet för cellytefångst för en ny provtyp kan det dessutom vara till hjälp att analysera ett helcellslysat med en konventionell hagelgevärsproteomikmetod21 för att jämföra med resultaten för cellytan. Analys av råmasspektrometridata kan utföras av olika databassöknings- och programvarupaket - här använde vi MaxQuant - för att ge en lista över identifierade proteiner22,23. Denna lista kan filtreras mot olika kända databaser 3,24 av ytproteiner för att upprätta en lista över de cellytproteiner som identifierats i ett enda experiment. När en lista över cellyteproteiner har upprättats kan de analyseras ytterligare för deras roll i relevanta biokemiska vägar25 eller läkemedelsmålkandidater26. Detta arbetsflöde kan tillämpas på en mängd olika celltyper, inklusive suspension och vidhäftande cellinjer (för vidhäftande celler rekommenderar vi att du lyfter celler utan användning av trypsin före provberedning, för att undvika klyvning av cellyteproteinerna), såväl som primära prover.
Med hjälp av detta arbetsflöde kunde vi med säkerhet karakterisera cellyteproteomet för en viss cellinje. Genom att jämföra ytproteomet i tumörcellinjer med friska celler och korsreferera med en RNA-sekvenseringsdatabas för normala vävnader kunde en lista över potentiella immunterapeutiska mål upprättas 8,13. En begränsning med denna metod är att, trots den signifikanta anrikningen av cellyteproteiner jämfört med ett standardhelcellslysatexperiment, är majoriteten av proteinerna som identifierats genom masspektrometrianalys i detta arbetsflöde fortfarande annoterade som intracellulära. Beroende på stringensen i ytproteindatabasen som används kommer cirka 25% -30% av de identifierade proteinerna från cellytan. Vi förväntar oss att en betydande del av den icke-ytliga bakgrunden sannolikt härrör från bakgrundsprotein som inte är specifikt bundet till pärlor (till exempel som kännetecknas av CRAPome27-analys), medan andra representerar cellpenetration av märkningsreagenset för att reagera med N-glykosylerade proteiner i endoplasmatisk retikulum, Golgi eller andra intracellulära fack.
Medan alternativa peptidelueringsmetoder såsom PNGase-behandling resulterar i mycket större anrikning av N-glykositer bland de totala peptiderna som analyseras, tillåter detta tillvägagångssätt endast identifiering av enskilda glycyosylerade peptider och förlorar värdefull information från den icke-glykosylerade återstoden av den neddragna proteinsekvensen12. Denna extra information kan fångas med denna on-bead trypsiniseringsmetod, men vid den potentiella avvägningen av minskad specificitet för N-glykosylerade proteiner analyserade i masspektrometern. Dessutom övervinner inte ens PNGaseluering utmaningen att märka intracellulära glykosylerade proteiner, och en PNGas-eluering leder vanligtvis endast en enda peptid per protein; Detta leder till betydande variationer i proteinidentifiering, enligt vårt laboratoriums erfarenhet, medan matsmältningen på pärlan som beskrivs här leder till flera peptider per fångat protein. Beroende på experimentets mål kan man därför potentiellt välja olika strategier för att använda strategin för cellytan. Dessa strategier inkluderar miniatyrisering och automatisering av cellytefångstprotokollet för små provingångar28 och användning av streptavidinpärlor med varierande bindningskapacitet29 beroende på applikationen. Metoden och arbetsflödet som illustreras här fungerar som en robust, lätt att utföra allmän strategi för proteinanrikning på cellytan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inte några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Kamal Mandal (Institutionen för laboratoriemedicin, UCSF) för hjälp med att ställa in LC-MS / MS-körningen, Deeptarup Biswas (BSBE, IIT Bombay) för hjälp med dataanalys och Dr. Audrey Reeves (Institutionen för laboratoriemedicin, UCSF) för hjälp med dataanalys. Relaterat arbete i APW-labbet stöds av NIH R01 CA226851 och Chan Zuckerberg Biohub. Figur 1 och figur 2B gjordes med hjälp av BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| 96X iST Sample Preparation Kit | PreOmics | P.O.00027 | Proteomics sample preparation kit. Includes reagents for reduction, alkylation, and digestion. Also include desalting columns and reagents. |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo | 23275 | Peptide quantification kit. Includes peptide standards and components of working reagents. |
| Reagents | |||
| Acetonitrile | Fisher | A955-1 | |
| Ammonium bicarbonate | Millipore Sigma | 09830-1KG | |
| Biocytin hydrazide | Biotium | 90060 | |
| D-PBS (w/o Calcium and Magnesium Salts) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003-225B01 | |
| Formic Acid | Honeywell | 94318 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Single-Use Cocktail | Thermo | 1861280 | |
| High Capacity Neutravidin Agarose Resin | Thermo | 29204 | |
| Phosphate Buffered Saline | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001-22J01 | |
| RIPA Lysis Buffer, 10x | Millipore Sigma | 20-188 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Sodium metaperiodate | Alfa Aesar | 13798 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | |
| Urea (Proteomics Grade) | VWR | M123-1KG | |
| Equipment | |||
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | |
| PrismR Microcentrifuge | Labnet International | C2500-R-230V | |
| Sonicator | VWR | Branson Sonifier 240 | |
| Vacuum Manifold | Promega | Promega Vac-Man | |
| Shaking Heatblock | Eppendorf | Eppendorf Thermomixer C | |
| End-to-End rotator | Labnet | Revolver Adjustable Rotator | |
| LC | Thermo | Ultimate 3000 HPLC and UHPLC | |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrapole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| Microplate Reader | Biotek | Biotek Synergy 2 | |
| Vacuum Concentrator | Labconco | 7810010 | |
| Supplies | |||
| 1.5 mL Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | |||
| Filtration Columns | Bio-Rad | 7326008 | |
| Spin Columns | Thermo | 69725 |
References
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
- Aslam, B., Basit, M. B., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. Proteomics: technologies and their applications. Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).
- Bausch-Fluck, D., et al.
- Takahashi, Y., et al. Research advance in tumor specific antigens: A narrative review. AME Medical Journal. 6, 35 (2021).
- Li, Y., Qin, H., Ye, M. An overview on enrichment methods for cell surface proteome profiling. Journal of Separation Science. 43 (1), 292-312 (2020).
- Wollscheid, B., et al. Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins. Nature Biotechnology. 27 (4), 378-386 (2009).
- Chandler, K. B., Costello, C. C. Glycomics and glycoproteomics of membrane proteins and cell-surface receptors: present trends and future opportunities. Electrophoresis. 37 (11), 1407-1419 (2016).
- Ferguson, I. D., et al. The surfaceome of multiple myeloma cells suggests potential immunotherapeutic strategies and protein markers of drug resistance. Nature Communications. 13 (1), 4121 (2022).
- Karcini, A., Lazar, I. M. The SKBR3 cell-membrane proteome reveals telltales of aberrant cancer cell proliferation and targets for precision medicine applications. Scientific Reports. 12 (1), 10847 (2022).
- Köhnke, T., et al. Integrated multiomic approach for identification of novel immunotherapeutic targets in AML. Biomarker Research. 10 (1), 43 (2022).
- Verma, A., Kumar, V., Ghantasala, S., Mukherjee, S., Srivastava, S. Comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples. Journal of Visualized Experiments. (177), e61786 (2021).
- Leung, K. K., et al. Broad and thematic remodeling of the surfaceome and glycoproteome on isogenic cells transformed with driving proliferative oncogenes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (14), 7764-7775 (2020).
- Nix, M. A., et al. Surface proteomics reveals CD72 as a target for in vitro-evolved nanobody-based CAR-T cells in KMT2A/MLL1-rearranged B-ALL. Cancer Discovery. 11 (8), 2032-2049 (2021).
- Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
- Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
- Hosen, N., et al. The activated conformation of integrin β7 is a novel multiple myeloma-specific target for CAR T cell therapy. Nature Medicine. 23 (12), 1436-1443 (2017).
- Costa, A. F., Campos, D., Reis, C. A., Gomes, C. Targeting glycosylation: A new road for cancer drug discovery. Trends in Cancer. 6 (9), 757-766 (2020).
- Gundry, R. L., Boheler, K. R., Van Eyk, J. E., Wollscheid, B. A novel role for proteomics in the discovery of cell-surface markers on stem cells: Scratching the surface. Proteomics. Clinical Applications. 2 (6), 892-903 (2008).
- Itzhak, D. N., et al. A mass spectrometry-based approach for mapping protein subcellular localization reveals the spatial proteome of mouse primary neurons. Cell Reports. 20 (11), 2706-2718 (2017).
- Kirkemo, L. L., et al. Cell-surface tethered promiscuous biotinylators enable comparative small-scale surface proteomic analysis of human extracellular vesicles and cells. eLife. 11, 73982 (2022).
- Wojtkiewicz, M., Berg Luecke, L., Kelly, M. I., Gundry, R. L. Facile preparation of peptides for mass spectrometry analysis in bottom-up proteomics workflows. Current Protocols. 1 (3), 85 (2021).
- Välikangas, T., Suomi, T., Elo, L. L. A comprehensive evaluation of popular proteomics software workflows for label-free proteome quantification and imputation. Briefings in Bioinformatics. 19 (6), 1344-1355 (2018).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Bausch-Fluck, D., et al. A mass spectrometric-derived cell surface protein atlas. PLoS One. 10 (3), 0121314 (2015).
- Griss, J., et al. ReactomeGSA-efficient multi-omics comparative pathway analysis. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (12), 2115-2125 (2020).
- Waas, M., et al. SurfaceGenie: a web-based application for prioritizing cell-type-specific marker candidates. Bioinformatics. 36 (11), 3447-3456 (2020).
- Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).
- van Oostrum, M., et al. Classification of mouse B cell types using surfaceome proteotype maps. Nature Communications. 10 (1), 5734 (2019).
- Berg Luecke, L., Gundry, R. L. Assessment of streptavidin bead binding capacity to improve quality of streptavidin-based enrichment studies. Journal of Proteome Research. 20 (2), 1153-1164 (2021).
