Summary
Burada, çeşitli hücre tiplerinin hücre yüzeyi proteomunun karakterizasyonu için bir proteomik iş akışını açıklıyoruz. Bu iş akışı, hücre yüzeyi protein zenginleştirme, müteakip numune hazırlama, LC-MS/MS platformu kullanarak analiz ve özel yazılımla veri işlemeyi içerir.
Abstract
Son on yılda, kütle spektrometrisine dayalı proteomikler, çok çeşitli uygulamalarda biyolojik sistemlerin derinlemesine karakterize edilmesini sağlamıştır. İnsan hastalığında hücre yüzeyi proteomu ("surfaceome") önemli bir ilgi çekicidir, çünkü plazma zarı proteinleri klinik olarak onaylanmış terapötiklerin çoğunun birincil hedefidir ve hastalıklı hücreleri sağlıklı dokulardan tanısal olarak ayırt etmenin temel bir özelliğidir. Bununla birlikte, hücrenin membran ve yüzey proteinlerinin odaklanmış karakterizasyonu, esas olarak, diğer yüksek bolluktaki proteinler tarafından ilgilenilen proteinleri maskeleyen hücresel lizatların karmaşıklığı nedeniyle zor olmaya devam etmiştir. Bu teknik engelin üstesinden gelmek ve kütle spektrometrisi proteomiklerini kullanarak çeşitli hücre tiplerinin hücre yüzey proteomunu doğru bir şekilde tanımlamak için, kütle spektrometresinde analizden önce hücre yüzey proteinleri için hücre lizatını zenginleştirmek gerekir. Bu makale, kanser hücrelerinden hücre yüzey proteinlerini etiketlemek, bu proteinleri hücre lizatından zenginleştirmek ve ardından kütle spektrometrisi analizi için numune hazırlamak için ayrıntılı bir iş akışı sunmaktadır.
Introduction
Proteinler, hücresel fonksiyonların çoğunun gerçekleştirildiği temel birimler olarak işlev görür. İlgili proteinlerin yapısını ve işlevini karakterize etmek, biyolojik süreçleri anlamak için önemli bir adımdır. Son on yılda, kütle spektrometresi teknolojisi, analiz yazılımı ve veritabanlarındaki ilerlemeler, proteinlerin proteom çapında bir ölçekte doğru bir şekilde tespit edilmesini ve ölçülmesini sağlamıştır1. Kütle spektrometrisine dayalı proteomikler, biyokimyasal yolakların temel bilim analizinden, translasyonel bir ortamda yeni ilaç hedeflerinin belirlenmesine, klinik2'deki hastalıkların tanı ve izlenmesine kadar çeşitli uygulamalarda kullanılabilir. Yeni ilaç hedefleri için tarama yaparken, hücre yüzeyi proteomunun karakterizasyonu özellikle önemlidir, şu anda onaylanmış insan ilaçlarının% 65'inden fazlası hücre yüzey proteinlerini hedeflemektedir3. Kanser immünoterapisi alanı ayrıca tümör hücrelerini hedeflemek ve spesifik olarak ortadan kaldırmak için tamamen kansere özgü hücre yüzey antijenlerine dayanır4. Kütle spektrometrisine dayalı proteomikler, terapötik müdahalelere yönelik yeni hücre yüzey proteinlerini tanımlamak için umut verici bir araç olarak hizmet edebilir.
Bununla birlikte, yeni hücre yüzey protein hedefleri için tümör hücrelerini araştırmak için geleneksel proteomik yöntemleri kullanırken birkaç sınırlama vardır. Birincil endişe, yüzey proteinlerinin bir hücredeki toplam protein moleküllerinin çok küçük bir kısmını oluşturmasıdır. Bu nedenle, bu proteinlerin parçaları, tüm hücre lizatı5'in kütle spektrometrisi analizi yapılırken yüksek miktarda hücre içi protein ile maskelenir. Bu sınırlama, hücre yüzeyi proteomunu geleneksel bir proteomik iş akışıyla doğru bir şekilde karakterize etmeyi zorlaştırır. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, kütle spektrometresi üzerinde analiz yapmadan önce, hücre yüzey proteinlerini tüm hücre lizatından zenginleştirmenin yollarını geliştirmek gerekir. Böyle bir yöntem, bozulmamış hücrelerdeki glikozile hücre yüzey proteinlerinin oksidasyonunu ve biyotin etiketlemesini ve daha sonra bu biyotinile proteinlerin lizattan bir nötravidin çekilmesi ile zenginleştirilmesini içerir, bu işlem "hücre yüzeyi yakalama"6 olarak adlandırılır. Memeli hücre yüzey proteinlerinin ~% 85'inin glikozile olduğu düşünüldüğünden7, bu, hücre yüzey proteomunu tüm hücre lizatından zenginleştirmek için etkili bir yöntem olarak hizmet eder. Bu yazıda, kültürlü hücrelerden başlayarak, hücre yüzeyi biyotin etiketlemesi ve ardından kütle spektrometrisi analizi için numune hazırlama ile ilgili eksiksiz bir iş akışı açıklanmaktadır (Şekil 1). Birkaç replika üzerinden, bu yöntem belirli bir numunenin hücre yüzeyi proteomunun sağlam bir şekilde kaplanmasını sağlar. Hem tümör hem de sağlıklı hücrelerin hücre yüzeyi proteomunu karakterize etmek için bu yöntemin kullanılması, potansiyel immünoterapötik hedefleri tanımlamak için yeni hücre yüzey antijenlerinin keşfedilmesini kolaylaştırabilir8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu hücre yüzeyi proteom deneyi için AMO1 plazmasitom hücreleri kullanıldı. Aynı protokol, çok çeşitli süspansiyon ve yapışkan hücre hatları9'un yanı sıra çeşitli birincil numune tipleri10 dahil olmak üzere diğer hücre tipleri için de kullanılabilir. Bununla birlikte, hücre sayıları (deney için başlangıç materyali) tipik olarak eşdeğer proteom kapsamı için optimize edilmelidir. Malzeme ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar için Malzemeler Tablosu'na bakın. Tamponlar ve reaktif çözeltileri ve bunların bileşimi ile ilgili ayrıntılar için Tablo 1'e bakınız.
1. Biotin ile hücre yüzeyi etiketleme
- Kültürlenmiş hücreleri ve peletleri santrifüjleme ile yaklaşık 3,5 × 107 canlı hücre sayın (500 × g, 24 ° C'de 5 dakika).
NOT: AMO1 plazmasitom hücreleri, hasattan her 3 günde bir taze ortam ile geçirildi. - Süpernatantı aspire edin ve 1 mL soğuk (4 °C) Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (D-PBS) (kalsiyum yok, magnezyum yok) ekleyerek ve yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek peleti yeniden askıya alın.
- Hücreleri tekrar pelet edin (adım 1.1'de olduğu gibi) ve yıkama adımını (adım 1.2) bir kez daha tekrarlayın (toplamda iki yıkama).
- İkinci yıkamadan sonra, hücreleri pelet haline getirin (adım 1.1'de olduğu gibi) ve hafifçe pipetleyerek 990 μL soğuk D-PBS'de yeniden askıya alın.
- Önceden 160 mM sodyum metaperiodat (NaIO4) stok çözeltisi hazırlayın. 50 μL alikotlara bölünür ve -20 °C'de 6 aya kadar saklanır. Adım 1.4'te hücre süspansiyonuna 10 μL 160 mM sodyum metaperiodat çözeltisi ekleyin, iyice karıştırın ve 4 ° C'de 20 dakika boyunca uçtan uca bir rotorda inkübe edin.
- İnkübasyon tamamlandıktan sonra, hücreleri pelet haline getirin (adım 1.1'de olduğu gibi), süpernatanı boşaltın ve 1 mL soğuk D-PBS'de yeniden askıya alın. Bu yıkama adımını iki kez tekrarlayın (toplamda üç yıkama). Üçüncü yıkamadan sonra, hücreleri 989 μL D-PBS'de yeniden askıya alın.
- Önceden 100 mM biyositin hidrazit stok çözeltisi hazırlayın. 50 μL alikotlara bölünür ve -20 ° C'de 6 aya kadar saklayın. Adım 1.6'da hücre süspansiyonuna 1 μL anilin ve 10 μL 100 mM biyositin hidrazit ekleyin, iyice karıştırın ve 4 ° C'de 60 dakika boyunca uçtan uca bir rotorda inkübe edin.
- İnkübasyon tamamlandıktan sonra, hücreleri pelet haline getirin (adım 1.1'de olduğu gibi), süpernatanı boşaltın ve 1 mL soğuk D-PBS'de yeniden askıya alın. Bu yıkama adımını iki kez tekrarlayın (toplamda üç yıkama).
- Üçüncü yıkamadan sonra, süpernatantı bir pipetle dikkatlice aspire edin ve tüpü sıvıN2'ye yerleştirerek hücre peletini dondurun. Dondurulmuş peleti -80 ° C'ye, lizis ve aşağı çekme işlemine devam etmeye hazır olana kadar yerleştirin.
2. Hücre lizisi ve biyotin pulldown
- Dondurulmuş hücre peletini buz üzerinde çözün.
- Peletin üzerine 500 μL 2x lizis tamponu ekleyin, iyice karıştırın ve 30 s boyunca vorteks yapın.
NOT: Peletin tamamen lize edilmesi için kuvvetli pipetleme ve vorteks gerekebilir. Bazı çözünmeyen döküntüler (yani, DNA), sonraki sonikasyon adımında çıkarıldığı için kabul edilebilir. - Hücre lizatını buz üzerinde sonikleştirin (üç patlama, her biri 20 sn,% 60 görev döngüsü).
- Kalan kalıntıları peletlemek için lizatı santrifüj edin (17.200'de 10 dakika × 4 ° C'de g ).
- Lizat santrifüj yaparken, bir filtrasyon sütununa 100 μL nötravidin agaroz reçine boncukları ekleyin. Kolonu bir vakum manifolduna takın, nazik bir vakum uygulayın ve üzerlerine 3 mL yıkama tamponu 1 akıtarak boncukları yıkayın.
- Filtreleme sütununu vakum manifoldundan çıkarın, tabanı kapatın ve arıtılmış hücre lizatını boncuklarla kolona ekleyin. Kolonun üst kısmını kapatın ve lizatı 4 ° C'de 120 dakika boyunca uçtan uca bir rotorda boncuklarla inkübe edin.
NOT: Kolonun üst kısmını kapatırken, alt kapağı sıkıca yerinde tutun, aksi takdirde yerinden çıkabilir ve inkübasyon sırasında hücre lizatı sızabilir. - 1, 2 ve 3 yıkama tamponlarını hazırlayın (numune başına her yıkama tamponunun yaklaşık 5 mL'si, Tablo 1'e bakın) ve bunları 42 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin
- Lizat inkübasyonu bitirdikten sonra, filtrasyon kolonunu tekrar vakum manifolduna yerleştirin, nazik bir vakum uygulayın ve boncukları üzerlerine 5 mL yıkama tamponu 1 akıtarak yıkayın.
NOT: Yıkama tamponlarının 5 mL'den fazlası yıkama için kullanılabilir; Ekstra yıkama, arka planda, boncuklara spesifik olmayan bağlanmayı azaltabilir. - Yıkama adımını 5 mL yıkama tamponu 2 ile tekrarlayın.
- Yıkama adımını 5 mL yıkama tamponu 3 ile tekrarlayın.
- Son yıkama tamponu boncuklardan tamamen aktıktan sonra, sütunu manifolddan çıkarın. Boncuklara 100 μL "Liz" çözeltisi ekleyin ve bunları bir pipet ile 1.7 mL düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Boncukları yerleştirmek için tüpü kısaca döndürün ve yerleşmiş boncukları rahatsız etmeden çözeltinin 50 μL'sini çıkarın.
NOT: Bu adımdaki ve sonraki tüm adımlardaki reaktifler, piyasada bulunan bir proteomik numune hazırlama kiti kullanır. Kit, optimize edilmiş, basitleştirilmiş bir numune hazırlama iş akışı sağlar. Bununla birlikte, bu adımlar, Verma ve ark.9'da açıklandığı gibi geleneksel bir proteomik iş akışı kullanılarak kitten bağımsız olarak da gerçekleştirilebilir. Boncuklar kolonun yanına veya altına yapışmış kalırsa, tüpe aktarılan boncukların yerleşmesine izin verin ve kalan boncukları aktarmak için tüpte ekstra "Liz" çözeltisi kullanın. - Tüpü 65 ° C'de bir ısı bloğu / çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve 10 dakika boyunca 1.000 rpm'de çalkalayın.
NOT: Bu adım, sindirimden önce sistein kalıntılarının azaltılması ve alkilasyonu için gereklidir.
3. Protein sindirimi
- Kurutulmuş tripsini ("Resuspend" çözeltisinden 210 μL ekleyerek kitteki "Sindirim" tüpü, -20 ° C'de saklanır) tekrar askıya alın. Tüm kurutulmuş tripsinin yeniden askıya alındığından emin olmak için çözeltiyi birkaç kez yukarı ve aşağı borulayın.
- Kuluçka tamamlandıktan sonra, boncuklara 50 μL yeniden askıya alınmış tripsin çözeltisi ekleyin. Tüpü 37 ° C'de inkübe edin, proteini sindirmek için en az 90 dakika boyunca 500 rpm'de çalkalayın.
- Sindirim tamamlandıktan sonra, boncukları içeren çözeltiyi bir spin sütununa aktarın ve sütunu 1.7 mL düşük proteinli bağlayıcı bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Sindirilmiş peptid çözeltisini boncuklardan ayırmak için tüpü (oda sıcaklığında [RT] 5 dakika boyunca 500 × g ) döndürün.
NOT: Bu aşamada, streptavidin boncuklarından biyotinile peptid fragmanlarını çıkarmak için peptid çözeltisinden ayrıldıktan sonra boncuklar üzerinde PNGaz tedavisi uygulanabilir. Bu peptid numunesi daha sonra iş akışının geri kalanı boyunca, boncuk üzerinde tripsinizasyondan analiz edilebilen ve birincil numune ile karşılaştırılabilen ayrı, ikincil bir peptid numunesi olarak ileriye taşınabilir. PNGaz yaklaşımının, MS-saptanabilir yan zincir modifikasyonu12'ye dayanan yakalanan N-glikozile asparajinler için ek özgüllük göz önüne alındığında, boncuk üzerinde tripsinizasyona tamamlayıcı veriler sağlaması muhtemeldir. Bununla birlikte, bu sıralı elüsyon yaklaşımının dezavantajı, numune analizi başına kütle spektrometresi cihaz süresinin iki katı gerekliliğidir. - Sindirim reaksiyonunu durdurmak ve peptit çözeltisini asitleştirmek için 100 μL "Stop" çözeltisi ekleyin.
4. Peptit tuzdan arındırma
- Bir tüp adaptörü kullanarak, 1,7 mL'lik düşük proteinli bağlayıcı bir mikrosantrifüj tüpüne bir tuzdan arındırma sütunu yerleştirin. Tüm asitlenmiş peptit çözeltisini sütuna ekleyin. Kolonu (3 dakika boyunca 3.800 × g ) döndürün, böylece çözelti sütundan akar. Peptitler şimdi sütuna bağlanır; akışı atın.
- Kolona 200 μL "Wash 1" çözeltisi ekleyin ve döndürün (3 dakika boyunca 3.800 × g , RT). Akışı atın.
- Kolona 200 μL "Wash 2" çözeltisi ekleyin ve döndürün (3 dakika boyunca 3.800 × g , RT). Akışı atın.
- Kolonu yeni, etiketli 1,7 mL düşük proteinli mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Kolona 100 μL "Elute" çözeltisi ekleyin ve döndürün (3 dakika boyunca 3.800 × g , RT). Kolona başka bir 100 μL "Elute" çözeltisi ekleyin ve döndürün (3 dakika boyunca 3.800 × g , RT). Peptitler şimdi kolondan tüpe salınır.
- Peptit çözeltisini bir vakum santrifüjüne yerleştirin ve gece boyunca kurumasını bekleyin. Kurutulmuş peptitleri -80 ° C'de nicelleştirmeye hazır olana kadar yerleştirin ve kütle spektrometresinde analiz edin.
5. Peptit yeniden süspansiyonu ve miktarının belirlenmesi
- Kurumuş peptitleri 20 μL çözücü A (% 0.1 formik asit,% 2 asetonitril) içinde yeniden askıya alın.
- Çözünmeyen kalıntıları pelletmek için yeniden askıya alınmış peptitleri (10 dakika boyunca 17.200 × g ) santrifüjleyin.
- Kolorimetrik peptid nicelleştirme testi için peptid standartlarını hazırlayın.
- 5 μL 1.000 mg/mL peptid stok çözeltisini 96 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin.
- Deiyonize (DI) su ile plakada yedi adımlı bir seri seyreltme gerçekleştirin, kuyu başına her bir standardın 5 μL'si ile: 1.000 mg / mL, 500 mg / mL, 250 mg / mL, 125 mg / mL, 62.5 mg / mL, 31.25 mg / mL ve 15.625 mg / mL. Boşluk için sekizinci bir kuyucuğa 5 μL DI su yerleştirin.
- 4 μL DI suyunu 96 delikli plakanın üç ayrı kuyusuna yerleştirin. Toplam 5 μL hacim için her bir kuyucuğa 1 μL yeniden askıya alınmış peptid çözeltisi ekleyin.
NOT: Peptit çözeltisini miktar ölçümü için pipetlerken, yerleşmiş kalıntıların rahatsız edilmesini önlemek için çözeltinin üstünden dikkatlice pipetin. - Ne kadar çalışma reaktifine ihtiyaç duyulduğunu hesaplayın (kuyu başına 45 μL gereklidir). Kolorimetrik tahlil çalışma reaktifinin gerekli hacmini hazırlayın; Bileşenlerin uygun şekilde karıştırılmasını sağlamak için çalışan reaktifi vorteks.
- Standart ve numune kuyucuklarının her birine 45 μL çalışma reaktifi ekleyin.
NOT: Standartları iki katına çıkarın ve reaktifin kuyucuklara ne zaman eklendiği zamanlamasında minimum fark sağlamak için çok kanallı bir pipet kullanın. - Plakayı alüminyum folyo ile örtün ve 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Plakayı otomatik bir plaka okuyucuda analiz edin. Doğrusal bir standart eğri oluşturmak için standart numuneler için kaydedilen absorbans değerlerini kullanın. Standart eğrinin veR2 değerinin denklemini belirleyin. R2 değeri makul ise (≥0.95), kolorimetrik tahlil plakasındaki beş kat seyreltmeyi hesaba katan askıya alınmış peptitlerin konsantrasyonunu belirlemek için standart eğriyi kullanın.
6. Sindirilmiş peptitlerin sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) analizi
- Çözücü A ekleyerek peptit numunelerinin konsantrasyonunu 0,2 μg / μL'ye ayarlayın ve 10 μL'yi 0,6 mL'lik düşük proteinli bağlayıcı bir tüpe aktarın.
- Tüpü LC otomatik numune alma cihazına yerleştirin.
- LC ve MS/MS parametrelerini Şekil 2 ve Şekil 3'e göre ayarlayın.
- Peptit numunesinin 5 μL'sini (1 μg) analiz için LC-MS/MS kurulumuna enjekte edin.
NOT: Burada gösterilen LC-MS/MS ayarları yalnızca çizimleri temsil eder. LC ve MS cihazının kullanılabilirliğine bağlı olarak, kullanıcılar derin proteom kapsamı elde etmek için LC gradyanı ve MS / MS parametrelerinin ayarlarını değiştirebilirler. Bu çalışmada MaxQuant https://www.maxquant.org/ kullanılarak MS veri analizi, Perseus https://maxquant.net/perseus/ kullanılarak ikincil veri analizi ve https://reactome.org/ kullanılarak yol analizi yapılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu deney için, bir tümör hücre hattının hücre yüzey proteomunu, bozulmamış hücrelerin N-glikozile membran proteinlerini biyotin ile etiketleyerek ve bu etiketli proteinleri tüm hücre lizatından bir nötravidin pulldown ile zenginleştirerek karakterize ettik (Şekil 1). Ayrıca, zenginleştirilmiş hücre yüzey proteinlerini karakterize etmek için LC-MS / MS kullanarak proteom analizi yaptık. Tüm hücre proteom analizinden farklı olarak, burada amaç sadece hücre yüzey proteinlerini karakterize etmekti. Bu nedenle, 3.5 × 107 AMO-1 plazmasitom hücresinden oluşan bir örnek girdisi ile başladık. Kolorimetrik peptid nicelleştirme testine dayanarak ~ 630 ng / μL'lik nihai bir peptid konsantrasyonu elde ettik ve toplam verim ~ 12.6 μg peptid (20 μL'de) idi (Şekil 2A). Daha sonra LC-MS / MS sistemine 1 μg peptid numunesi enjekte ettik ve enjeksiyonu teknik replikalar için üç kez tekrarladık. Kullanılan LC ve MS parametreleri önceki deneylere dayanarak optimize edilmiştir (Şekil 2C ve Şekil 3A). Maksimum kapsama alanı sağlamak için 4 saatlik uzun bir LC gradyanı kullandık.
LC-MS/MS verileri MaxQuant kullanılarak analiz edildi; En az bir benzersiz peptit içeren 2.221 proteini ve her üç replikada da en az iki benzersiz peptit içeren 1.764 proteini tanımlayabildik. Toplamda, tanımlanmış 12.307 benzersiz peptit vardı. Örneklemdeki hücre yüzeyi protein zenginleştirmesini, MaxQuant'tan elde edilen sonuçları hücre yüzey proteinlerinin birkaç yerleşik veri kümesiyle karşılaştıran bir Python betiği (kullandığımız tam komut dosyası Ek Şekil S1'de bulunabilir) kullanarak belirledik. Bu veri kümeleri, daha önce bildirilen "in silico surfaceome"3 ve UniProt13'te membran lokalize olarak ek açıklamalı proteinlerden oluşturulan bir veri kümesini içerir (veri kümeleri Ek Tablo S1'de mevcuttur). Bu analiz, örneğimizde 601 yüzey proteini verdi (tanımlanan tüm proteinlerin yaklaşık% 27'si) (Şekil 4A). Gen ontolojisi ek açıklaması (http://geneontology.org/) yapıldı, bu da proteinlerin yaklaşık% 30'unun plazma zarına kanonik olarak lokalize olduğunu gösterdi. Reaktom yolu analizi (https://reactome.org/) ayrıca trans-membran taşınması ve hücre yüzeyi etkileşimlerinde rol oynayan membran proteinlerinin göreceli zenginleşmesini de göstermiştir (Şekil 5 ve Ek Tablo S2).
Şekil 1: Hücre yüzeyi etiketlemesi ve ardından kütle spektrometrisi analizi için numune hazırlama iş akışı. İlk olarak, istenen hücresel numunenin yüzeyindeki proteinler biotin ile etiketlenir. Bu hücreler daha sonra lize edilir, ardından biyotin etiketli proteinleri bağlayan nötravidin boncukları ile inkübasyon yapılır. Boncuklar daha sonra hücre içi proteinleri ve diğer kirleticileri uzaklaştırmak için tekrar tekrar yıkanır. Protein örneği daha sonra tripsin ilavesiyle boncuk üzerinde bir sindirime tabi tutulur. Elde edilen peptit parçaları örneği daha sonra kirleticileri yıkama ve sindirim adımlarından çıkarmak için tuzdan arındırmaya tabi tutulur. Son peptid numunesi daha sonra kurutulur ve kütle spektrometrisi analizine tabi tutulur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kolorimetrik peptid nicelleştirme standart eğrisi ve LC gradyanı. (A) İşlenmiş numunelerde peptid konsantrasyonunu belirlemek için kullanılan kolorimetrik peptid niceleme testi ile oluşturulan sekiz noktalı standart eğri. (B) Numuneleri işlemek için kullanılan LC-MS/MS sisteminin bir çizimi. (C) Numunelerin kütle spektrometresine enjeksiyonu için kullanılan sıvı kromatografisi gradyanı ve akış hızı. Kısaltmalar: LC-MS/MS = sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometrisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 3: Kütle spektrometresi parametreleri ve temsili kromatogram . (A) Bir Orbitrap kütle spektrometresi kullanılarak bu deney için kullanılan parametreler. (B) 4 saatlik bir gradyan için "hücre yüzeyi yakalama" protokolünü takiben kütle spektrometrisi analizi ile oluşturulan temsili kromatogram. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Hücre yüzeyi protein zenginleştirme analizi ve teknik replikaların karşılaştırılması. Bu veri kümeleri, daha önce bildirilen "in silico surfaceome"3 ve UniProt13'te membran lokalize olarak ek açıklamalı proteinlerden oluşturulan bir veri kümesini içerir. (A) Kirleticiler, ters proteinler ve q-değeri 0.05 > uzaklaştırıldıktan sonra farklı bir kesimle tanımlanan protein ve peptit sayısı. (B) Grafik, tanımlanan proteinin dağılımını ve Andromeda skoru14'ü temsil eder. (C) Dağılım grafiği, örneklem-örneklem korelasyonunu gösterir. Spearman'ın rütbe korelasyonu, iki dereceli değişken arasındaki ilişkinin gücünü ve yönünü ölçer. (D) Koş-kaç varyasyonunu gösteren kutu grafikleri. (E) Replikaların veri kalitesini temsil eden örnek bazında dağılım grafiği. Kısaltma: LFQ = etiketsiz niceliklendirme. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Yol analizi. Yol analizi Reactome versiyon 8222 kullanılarak yapıldı. Vasküler duvardaki hücre yüzey etkileşimlerinin açıklayıcı bir tasviri, trombosit ve lökosit etkileşiminde endotel ile ilgili anahtar etkileşimler için hücre yüzey proteomunun zenginleştirilmesini sergilemektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Reaktif Adı | Kompozisyon | Depolama | |||||
| 100 mM biyositin hidrazit | DMSO'da çözünmüş toz formu biyositin hidrazit | 50 μL alikotlara bölünür ve -20 °C'de 6 aya kadar saklanır. | |||||
| 160 mM sodyum metaperiodat (NaIO4) | DI suyunda çözünmüş katı NaIO4 | 50 μL alikotlara bölünür ve -20 °C'de 6 aya kadar saklanır. | |||||
| 2x RIPA Lizis Tamponu | 2x RIPA Lizis Tamponu, 1.25 mM EDTA, Tek Kullanımlık Proteaz İnhibitörü Kokteyli | 10x RIPA Lizis Tamponu kullanmadan önce her seferinde taze hazırlayın. | |||||
| Peptit Kolorimetrik Tahlil Çalışma Reaktifi | %50 Reaktif A, %48 Reaktif B, %2 Reaktif C | Kullanmadan önce her seferinde taze hazırlayın. Bileşenleri 4 °C'de saklayın. | |||||
| Solvent A | % 0.1 Formik Asit,% 2 Asetonitril | Önceden hazırlanabilir ve oda sıcaklığında saklayabilir | |||||
| Yıkama Tamponu 1 | 1x RIPA Lizis Tamponu, 1 mM EDTA | Önceden büyük parti hazırlayabilir ve oda sıcaklığında saklayabilir | |||||
| Yıkama Tamponu 2 | 1x PBS, 1 M NaCl | Önceden büyük parti hazırlayabilir ve oda sıcaklığında saklayabilir | |||||
| Yıkama Tamponu 3 | 2 M Üre, 50 mM Amonyum bikarbonat | Üre zamanla hızla bozulacağı için her seferinde taze hazırlayın. | |||||
Tablo 1: Bu protokolde kullanılan tamponlar ve reaktif çözeltileri.
Ek Şekil S1: MaxQuant'tan elde edilen sonuçları hücre yüzey proteinlerinin birkaç yerleşik veri kümesiyle karşılaştırmak için Python komut dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo S1: Hücre yüzey proteinlerinin veri kümeleri. Bu veri kümeleri, daha önce bildirilen "in silico surfaceome"3 ve UniProt13'te membran lokalize olarak ek açıklamalı proteinlerden oluşturulan bir veri kümesini içerir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo S2: En alakalı 10 yol ( p değerine göre sıralanmış) burada sunulmuştur. Kısaltmalar: FDR = yanlış keşif oranı; SLC = çözünen taşıyıcı; TCR = T hücre reseptörü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kütle spektrometrisine dayalı proteomik, binlerce bilinmeyen proteinin daha önce imkansız bir ölçekte tarafsız karakterizasyonunu sağlayan güçlü bir araçtır. Bu yaklaşım, proteinleri tanımlamamıza ve ölçmemize ve ayrıca belirli bir numunede bulunan protein çeşitliliğini karakterize ederek hücrelerin ve dokuların yapısal ve sinyal kapasiteleri için bir dizi içgörü toplamamıza olanak tanır. Bir numunede küresel protein profillemesinin ötesine geçen kütle spektrometresi, bu proteinler üzerindeki çeşitli post-translasyonel modifikasyonları (PTM'ler) karakterize etmemize izin vererek, DNA veya RNA seviye1'de analiz ederken mevcut olmayan sinyal yollarının ve protein dinamiklerinin aşamalarına daha derin bir bakış sağlar. Yeni kanser terapötiklerinin geliştirilmesine doğru, kütle spektrometrisine dayalı proteomikler, potansiyel uyuşturulabilir hedefleri tanımlamak için malign tümör hücrelerinin protein profilini sağlıklı dokulara karşı karşılaştırmamızı sağlar.
Hızla büyüyen kanser immünoterapi alanı, tümörleri tanımlamak ve seçici olarak yok etmek için malign hücrelerin yüzeyinde eksprese edilen antijenlere dayanır. Yeni kanser immünoterapilerinin gelişimi, sağlıklı dokularda bulunmayan benzersiz kansere özgü antijenlerin eksikliği ile sınırlı olduğundan, tümör hücrelerine özgü daha yeni antijenlerin tanımlanması kritik öneme sahiptir15. Tümör spesifik antijenlerin tümör hücresine özgü bütün proteinler olması gerekmez, aynı zamanda sağlıklı dokularda bulunmayan spesifik protein konformasyonları veya PTM'ler de olabilir16,17. Hem tümör hem de sağlıklı hücrelerdeki hücre yüzey proteinlerinin proteomik analizi, kansere özgü yeni antijen hedefleri verebilir. Hücre yüzeyi proteomikleri, numunenin karmaşıklığını azaltmak ve istenen membran proteinlerinin (genellikle düşük bollukta) yüksek oranda eksprese edilen hücre içi proteinler tarafından iyon baskılanmasını önlemek için kütle spektrometrisi analizinden önce yüzey proteinlerinin tüm hücre lizatından zenginleştirilmesini gerektirir18. Burada kullanılan hücre yüzeyi yakalama stratejisi, hücre yüzeyi proteomikleri için en yaygın kullanılan zenginleştirme yaklaşımlarından biri olsa da, hücre yüzeyi protein zenginleştirmesi için, hücresel membranların seçici ultrasantrifüjlenmesi, yüzey lizinlerinin NHS-biyotin etiketlemesi ve hücre yüzey proteinlerinin enzim aracılı biyotinilasyonu dahil olmak üzere bir kütle spektrometrisi iş akışıyla entegre edilmiş başka yöntemler de vardır19, 20. Kafa kafaya karşılaştırmalar, hücre yüzeyi yakalama yaklaşımının, hücre içi proteinlerin en düşük arka plan etiketlemesi ile hücre yüzey proteinlerinin kullanım kolaylığı ve başarılı, nispeten tarafsız zenginleştirilmesinin optimum dengesini sağladığını göstermektedir20.
Bu makale, hücre yüzeyi etiketleme ve aşağı çekme prosedürünü optimize edilmiş bir proteomik numune hazırlama iş akışıyla bütünleştirerek hücre yüzeyi proteomik iş akışı için etkili ve zaman açısından verimli bir protokol sunmaktadır (Şekil 1). Kültürlenmiş hücrelerin toplanmasından kütle spektrometresinde analize kadar tüm prosedür 3 gün boyunca elde edilebilir. Yüzey proteomunun en sağlam kapsamını elde etmek için, hücrelerin ilk girişinin, kullanılan hücre tipine bağlı olarak optimize edilmesi gerekebilir. Maksimum kapsama alanı sağlamak için birkaç milyon hücreden 50 milyon hücreye kadar değişen hücre girdileriyle pilot bir deney yapılması önerilir. Ek olarak, çok miktarda yüksek oranda eksprese edici hücre içi proteinler gözlenirse, lizat ile inkübasyondan sonra nötravidin boncuklarının daha fazla yıkanması, proteinlerin boncuklara spesifik olmayan bağlanmasını en aza indirebilir.
Tanımlanan hücre yüzey belirteçlerinin hücrelerin çoğunda gerçekten mevcut olduğuna dair güveni artırmak için deneyi koşul başına en az üç biyolojik replika ve üç teknik replika ile gerçekleştirmenizi öneririz. Ek olarak, yeni bir numune türü için hücre yüzeyi yakalama iş akışını gerçekleştirirken, hücre yüzeyi yakalama sonuçlarıyla karşılaştırmak için geleneksel bir av tüfeği proteomik yaklaşımı21 kullanarak tüm hücre lizatını analiz etmek yararlı olabilir. Ham kütle spektrometresi verilerinin analizi, çeşitli veritabanı arama ve yazılım paketleri tarafından gerçekleştirilebilir - burada, MaxQuant'ı kullandık - tanımlanmış proteinlerin bir listesini çıkarmak için22,23. Bu liste, tek bir deneyde tanımlanan hücre yüzey proteinlerinin bir listesini oluşturmak için yüzey proteinlerinin 3,24 bilinen veritabanlarına karşı filtrelenebilir. Hücre yüzey proteinlerinin bir listesi oluşturulduktan sonra, ilgili biyokimyasal yollar25 veya ilaç hedef adayları26'daki rolleri için daha fazla analiz edilebilirler. Bu iş akışı, birincil numunelerin yanı sıra süspansiyon ve yapışkan hücre hatları (yapışkan hücreler için, hücre yüzey proteinlerinin bölünmesini önlemek için numune hazırlamadan önce tripsin kullanmadan hücrelerin kaldırılmasını öneririz) dahil olmak üzere çok çeşitli hücre tiplerine uygulanabilir.
Bu iş akışını kullanarak, belirli bir hücre hattının hücre yüzeyi proteomunu güvenle karakterize edebildik. Tümör hücre hatlarının yüzey proteomunu sağlıklı hücrelerle karşılaştırarak ve normal dokular için bir RNA dizileme veritabanı ile çapraz referanslama yaparak, potansiyel immünoterapötik hedeflerin bir listesi oluşturulabilir 8,13. Bu yöntemin bir sınırlaması, standart bir tam hücre lizat deneyine karşı hücre yüzey proteinlerinin önemli ölçüde zenginleşmesine rağmen, bu iş akışında kütle spektrometrisi analizi ile tanımlanan proteinlerin çoğunun hala hücre içi olarak açıklanmasıdır. Kullanılan yüzey protein veritabanının sıkılığına bağlı olarak, tanımlanan proteinlerin yaklaşık% 25-30'u hücre yüzeyindendir. Yüzey dışı arka planın önemli bir kısmının muhtemelen boncuklara spesifik olarak bağlı olmayan arka plan proteininden (örneğin, CRAPome27 analizi ile karakterize edildiği gibi) yayıldığını, diğerlerinin ise endoplazmik retikulum, Golgi veya diğer hücre içi bölmelerdeki N-glikozile proteinlerle reaksiyona girmek için etiketleme reaktifinin hücre penetrasyonunu temsil ettiğini tahmin ediyoruz.
PNGaz tedavisi gibi alternatif peptid elüsyon yöntemleri, analiz edilen toplam peptitler arasında N-glikozitlerin çok daha fazla zenginleşmesine neden olurken, bu yaklaşım sadece bireysel glisiyosillenmiş peptitlerin tanımlanmasına izin verir ve aşağı çekilmiş protein dizisi12'nin glikozile edilmemiş kalanından değerli bilgileri kaybeder. Bu ekstra bilgi, bu boncuk üzerinde tripsinizasyon yaklaşımı ile yakalanabilir, ancak kütle spektrometresinde analiz edilen N-glikozile proteinler için azaltılmış özgüllüğün potansiyel ödünleşiminde. Ek olarak, PNGaz elüsyonu bile hücre içi glikozile proteinleri etiketleme zorluğunun üstesinden gelmez ve bir PNGaz elüsyonu tipik olarak protein başına sadece tek bir peptite yol açar; Bu, laboratuvarımızın deneyimine göre protein tanımlamasında önemli değişkenliğe yol açarken, burada açıklanan boncuk üstü sindirim, yakalanan protein başına birden fazla peptitlere yol açar. Bu nedenle, deneyin amacına bağlı olarak, hücre yüzeyi yakalama stratejisini kullanmak için potansiyel olarak farklı stratejiler seçilebilir. Bu stratejiler, küçük numune girişleri28 için hücre yüzeyi yakalama protokolünün minyatürleştirilmesini ve otomasyonunu ve uygulamaya bağlı olarak değişen bağlama kapasitesi29'a sahip streptavidin boncuklarının kullanılmasını içerir. Burada gösterilen yöntem ve iş akışı, hücre yüzeyi protein zenginleştirmesi için sağlam, gerçekleştirilmesi kolay bir genel strateji olarak hizmet vermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
LC-MS/MS çalışmasının kurulmasına yardımcı olduğu için Dr. Kamal Mandal'a (Laboratuvar Tıbbı Bölümü, UCSF), veri analizi konusunda yardım için Deeptarup Biswas'a (BSBE, IIT Bombay) ve veri analizi konusunda yardım için Dr. Audrey Reeves'e (Laboratuvar Tıbbı Bölümü, UCSF) teşekkür ederiz. A.P.W. laboratuvarındaki ilgili çalışmalar NIH R01 CA226851 ve Chan Zuckerberg Biohub tarafından desteklenmektedir. Şekil 1 ve Şekil 2B BioRender.com kullanılarak yapılmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| 96X iST Sample Preparation Kit | PreOmics | P.O.00027 | Proteomics sample preparation kit. Includes reagents for reduction, alkylation, and digestion. Also include desalting columns and reagents. |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo | 23275 | Peptide quantification kit. Includes peptide standards and components of working reagents. |
| Reagents | |||
| Acetonitrile | Fisher | A955-1 | |
| Ammonium bicarbonate | Millipore Sigma | 09830-1KG | |
| Biocytin hydrazide | Biotium | 90060 | |
| D-PBS (w/o Calcium and Magnesium Salts) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003-225B01 | |
| Formic Acid | Honeywell | 94318 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Single-Use Cocktail | Thermo | 1861280 | |
| High Capacity Neutravidin Agarose Resin | Thermo | 29204 | |
| Phosphate Buffered Saline | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001-22J01 | |
| RIPA Lysis Buffer, 10x | Millipore Sigma | 20-188 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Sodium metaperiodate | Alfa Aesar | 13798 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | |
| Urea (Proteomics Grade) | VWR | M123-1KG | |
| Equipment | |||
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | |
| PrismR Microcentrifuge | Labnet International | C2500-R-230V | |
| Sonicator | VWR | Branson Sonifier 240 | |
| Vacuum Manifold | Promega | Promega Vac-Man | |
| Shaking Heatblock | Eppendorf | Eppendorf Thermomixer C | |
| End-to-End rotator | Labnet | Revolver Adjustable Rotator | |
| LC | Thermo | Ultimate 3000 HPLC and UHPLC | |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrapole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| Microplate Reader | Biotek | Biotek Synergy 2 | |
| Vacuum Concentrator | Labconco | 7810010 | |
| Supplies | |||
| 1.5 mL Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | |||
| Filtration Columns | Bio-Rad | 7326008 | |
| Spin Columns | Thermo | 69725 |
References
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
- Aslam, B., Basit, M. B., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. Proteomics: technologies and their applications. Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).
- Bausch-Fluck, D., et al.
- Takahashi, Y., et al. Research advance in tumor specific antigens: A narrative review. AME Medical Journal. 6, 35 (2021).
- Li, Y., Qin, H., Ye, M. An overview on enrichment methods for cell surface proteome profiling. Journal of Separation Science. 43 (1), 292-312 (2020).
- Wollscheid, B., et al. Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins. Nature Biotechnology. 27 (4), 378-386 (2009).
- Chandler, K. B., Costello, C. C. Glycomics and glycoproteomics of membrane proteins and cell-surface receptors: present trends and future opportunities. Electrophoresis. 37 (11), 1407-1419 (2016).
- Ferguson, I. D., et al. The surfaceome of multiple myeloma cells suggests potential immunotherapeutic strategies and protein markers of drug resistance. Nature Communications. 13 (1), 4121 (2022).
- Karcini, A., Lazar, I. M. The SKBR3 cell-membrane proteome reveals telltales of aberrant cancer cell proliferation and targets for precision medicine applications. Scientific Reports. 12 (1), 10847 (2022).
- Köhnke, T., et al. Integrated multiomic approach for identification of novel immunotherapeutic targets in AML. Biomarker Research. 10 (1), 43 (2022).
- Verma, A., Kumar, V., Ghantasala, S., Mukherjee, S., Srivastava, S. Comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples. Journal of Visualized Experiments. (177), e61786 (2021).
- Leung, K. K., et al. Broad and thematic remodeling of the surfaceome and glycoproteome on isogenic cells transformed with driving proliferative oncogenes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (14), 7764-7775 (2020).
- Nix, M. A., et al. Surface proteomics reveals CD72 as a target for in vitro-evolved nanobody-based CAR-T cells in KMT2A/MLL1-rearranged B-ALL. Cancer Discovery. 11 (8), 2032-2049 (2021).
- Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
- Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
- Hosen, N., et al. The activated conformation of integrin β7 is a novel multiple myeloma-specific target for CAR T cell therapy. Nature Medicine. 23 (12), 1436-1443 (2017).
- Costa, A. F., Campos, D., Reis, C. A., Gomes, C. Targeting glycosylation: A new road for cancer drug discovery. Trends in Cancer. 6 (9), 757-766 (2020).
- Gundry, R. L., Boheler, K. R., Van Eyk, J. E., Wollscheid, B. A novel role for proteomics in the discovery of cell-surface markers on stem cells: Scratching the surface. Proteomics. Clinical Applications. 2 (6), 892-903 (2008).
- Itzhak, D. N., et al. A mass spectrometry-based approach for mapping protein subcellular localization reveals the spatial proteome of mouse primary neurons. Cell Reports. 20 (11), 2706-2718 (2017).
- Kirkemo, L. L., et al. Cell-surface tethered promiscuous biotinylators enable comparative small-scale surface proteomic analysis of human extracellular vesicles and cells. eLife. 11, 73982 (2022).
- Wojtkiewicz, M., Berg Luecke, L., Kelly, M. I., Gundry, R. L. Facile preparation of peptides for mass spectrometry analysis in bottom-up proteomics workflows. Current Protocols. 1 (3), 85 (2021).
- Välikangas, T., Suomi, T., Elo, L. L. A comprehensive evaluation of popular proteomics software workflows for label-free proteome quantification and imputation. Briefings in Bioinformatics. 19 (6), 1344-1355 (2018).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Bausch-Fluck, D., et al. A mass spectrometric-derived cell surface protein atlas. PLoS One. 10 (3), 0121314 (2015).
- Griss, J., et al. ReactomeGSA-efficient multi-omics comparative pathway analysis. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (12), 2115-2125 (2020).
- Waas, M., et al. SurfaceGenie: a web-based application for prioritizing cell-type-specific marker candidates. Bioinformatics. 36 (11), 3447-3456 (2020).
- Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).
- van Oostrum, M., et al. Classification of mouse B cell types using surfaceome proteotype maps. Nature Communications. 10 (1), 5734 (2019).
- Berg Luecke, L., Gundry, R. L. Assessment of streptavidin bead binding capacity to improve quality of streptavidin-based enrichment studies. Journal of Proteome Research. 20 (2), 1153-1164 (2021).
