תא אל תא Macromolecular התחבורה Assay ב Planta ניצול ההפגזה Biolistic

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לנתח את היקף התנועה של תא לתא של חלבון מתויג פלואורסצנטי באפידרמיס הצמח. זה מושג על ידי השגת חלקיקי זהב מצופים DNA כדי לבטא את חלבון ההיתוך המעניין באופן חולף באפידרמיס הצמח. כשלב שני, ה-DNA מועבר לאפידרמיס הצמח, המאפשר ביטוי ותנועה של חלבון ההיתוך שנבדק.

לאחר מכן, חלבון ההיתוך המתבטא נצפה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי על מנת לנטר את הביטוי והלוקליזציה של חלבונים שנבדקו מתויגים פלואורסצנטית. מתקבלות תוצאות המראות את היקף הובלת התא לתא של החלבון המתויג פלואורסצנטי על סמך ניתוח התפלגות האות הפלואורסצנטי על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. היי, אני בן מאיירס מהמעבדה של KY במחלקה לביוכימיה וביולוגיה של התא באוניברסיטת מדינת ניו יורק בסטוני ברוק.

היום נראה לכם נוהל לניתוח היקף התנועה של תא לתא או חלבון מתויג פלואורסצנטי באפידרמיס הצמח. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור הובלה של תא לתא של חלבוני תנועה נגיפית של צמחים ברקעים צמחיים שונים ולהשוות את התא לניידות התא של סוגים שונים של חלבונים. אז בואו נתחיל.

כדי להתחיל בפרוטוקול זה, גדל צמח ארבידופסיס אחד ב-Promix bx. בעציץ בגודל מתאים, השתמש בתא מבוקר סביבתי עם זמן צילום קצר ולחות יחסית של 40 עד 65% עבור צמחי טבק ניקוטיאנה, המנה וניקוטיאנה מגדלים כל צמח ב- Promix BX בעציץ גדול יותר. שוב, ספק תא מבוקר סביבה עם תקופת צילום ארוכה ולחות יחסית של 40 עד 65%.

דשן את הצמח מדי פעם במוצרים זמינים מסחרית כפי שתואר קודם לכן. לאחר גידול צמח האופסיס במשך שישה עד שמונה שבועות, בחרו לניסוי עלים שגודלם עולה על 15 מילימטר על 35 מילימטר, כאשר מדידת האורך כוללת את הצמחים עבור n benanna וצמחי NAC מגדלים את הצמחים במשך שבעה עד 10 שבועות. לאחר מכן בחר עלים גדולים מ-50 מילימטר על 70 מילימטר עבור בננה קצה ו-100 מילימטר על 125 מילימטר עבור נאק.

במקרים אלה, מדידות האורך אינן כוללות את הפול. לפני אספקת ה-BIC של מיקרו-חלקיקים מצופים DNA ניתן להתחיל להכין את מחסנית אקדח הגנים עם מיקרו-חלקיקי זהב מצופים DNA כפי שתואר קודם לכן בפירוט. לאחר מכן הסר את העלים מאותו שלב התפתחותי בעזרת סכין גילוח חד, והניח אותם מיד כשדפנות ה- AAL פונות כלפי מעלה על משטח קלקר שטוח.

צד ה-ABA של העלה מייצג מצע טוב יותר להפצצה בשל צפיפות הבית הנמוכה יותר והקוטיקולה הדקה יותר. ניתן לשתק עלים קטנים כגון אופסיס מהיר על ידי כיסוי בחתיכת רשת מסך חלון וקיבוע הרשת עם סיכות דחיפה למשטח הקלקר. שמור על העלים שטוחים כדי להגביר את יעילות העברת החלקיקים וכדי למזער את הנזק לרקמה במהלך הפצצה זעירה.

לאחר מכן הכנס את המחסנית עם מיקרו-חלקיקים מצופים DNA לתוך האקדח. לאופסיס של ארנב. בצע את הצילום בלחצים של 140 עד 160 PSI עבור מיקרו-חלקיקים של 0.6 מיקרון.

הפציצו את הדגימה באמצעות מחסנית אחת לכל עלה כדי לפזר את המיקרו-חלקיקים על פני שטח פנים של 10 עד 12 מילימטרים בקוטר. לסוף בננה וסוף באום. בצע את הצילום בלחצים של 160 עד 180 PSI עבור מיקרו-חלקיקים של 0.6 מיקרון עם עלי טבק גדולים יותר.

הפצצות מרובות של אותו עלה אפשריות, עם זאת, הן חייבות להיעשות במיקומים סימטריים בכל צד של הצלע האמצעית כדי למקד את אזורי העלים באותו שלב התפתחותי. האות הפלואורסצנטי של החלבונים המתויגים המתבטאים באופן חולף מתואר על ידי קונפוקל. יש לנקוט בזהירות במיקרוסקופיה כדי למצוא הגדרות מיקרוסקופיה אופטימליות לזיהוי כל חלבון שנבדק.

השתמש בעדשה אובייקטיבית של פי 40 כדי לצפות בחלבונים המראים הצטברות תוך-תאית מוגבלת עם עוצמות אות חלשות, כגון לוקליזציה של התפלת פלזמה של נגיף פסיפס הטבק, חלבון תנועה או T-M-V-M-P. זה מאפשר רזולוציה גבוהה יותר ורגישות משופרת. עם זאת, ניתן להשתמש בעדשת אובייקטיבית פי 10 עם פונקציית זום קונפוקלית להדמיה מהירה יותר של חלבונים המראים התפלגות ציטופלזמית עם עוצמות אות חזקות כגון חלבון פלואורסצנטי צהוב חופשי או YFP הובלה פשטנית מוסקת מהמראה של אשכולות מרובי תאים המכילים את האות הפלואורסצנטי.

מספר האשכולות הללו ומספר התאים בכל אשכול מעידים על היקף ההובלה של תא לתא. כדי להשיג נתונים מהימנים, רשום לפחות 100 ביטויים. אשכולות לכל מערכת ניסויית, דאגו לבצע ניסויים בו זמנית.

מתי יבוצעו השוואות. כאן, זוהתה הובלה פשטנית של חלבונים מתויגים פלואורסצנטיים. מוצגות תמונות קונפוקליות אופייניות המתקבלות בעקבות הפצצה מיקרו של עלה המאנה קצה עם מבנה ביטוי TMV mp YFP.

תנועה פשטנית של TMV MP YFP נצפית על סמך הופעתם של אשכולות מרובי תאים של אות YFP. עם זאת, לא כל ה-TMV MP YFP המתבטא באופן חולף מסוגל לנוע כפי שמעיד אות תא בודד. בכמה מיקרו הפצצות.

סטטיסטית בפחות מ-40% מאשכולות האותות שנספרו, TMV MP YFP אינו מסוגל לנוע בין תאים. ואילו ביותר מ-60% מהאשכולות, החלבון נע בין שניים לחמישה תאים. כאשר התפשטות שני התאים היא השכיחה ביותר, החלבונים בעלי גודל מולקולרי קטן יחסית ללא פעילות תנועה מולדת יכולים להתפזר דרך SMA פלזמה כדי להעביר תא לתא.

לדוגמה, YFP חופשי או XYFP אחד מתפשט בין מספר תאים ויותר מ-30% מהאשכולות שנספרו. לעומת זאת, דיפוזיה לא ספציפית זו אינה מתרחשת עבור דימר YFP תרגומי או שני XYFP, הדומה בגודלו לחלבון היתוך TMV MP YFP והוא אוטונומי לחלוטין בתאים. זה עתה הראינו לכם כיצד לנתח תנועה של תא לתא של חלבונים המתויגים פלואורסצנטית באמצעות ביטוי חולף על ידי מערכת אקדח גנים באפידרמיס הצמח.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להכין צמחים בריאים וחזקים, חלקיק זהב מצופה DNA באיכות גבוהה למסירת DNA ולנתח מספיק אשכולות ביטוי כדי לקבל תוצאות אמינות סטטיסטית. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.