Name: Video-oculografia in Mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Scopri la video-oculografia nei topi per studiare le prestazioni motorie oculari e l'apprendimento motorio. Questa tecnica quantitativa permette di analizzare i movimenti oculari e investigare la fisiologia dei comportamenti motori.

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Si ringraziano l&#39;Organizzazione olandese per la ricerca sulla salute e lo sviluppo (MDJ, CDZ), l&#39;Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (CDZ), NeuroBasic (CDZ), Prinses Beatrix Fonds (CDZ), The SENSOPAC (CDZ), C7 (CDZ) e l&#39;(CDZ) CEREBNET programma della Comunità europea per il loro sostegno finanziario.

1. Preparazione I seguenti esperimenti sono stati condotti in accordo con il Comitato Etico Duch degli esperimenti su animali. <ol><li> Preparazione topi per video-oculografia. Per misurare i movimenti oculari di un topo, la testa del mouse deve essere immobilizzato. Pertanto, una costruzione piedistallo viene effettuata sul cranio del topo (Figura 1). <ol><li> Anestetizzare il mouse da una miscela di isoflurano (isofluran 1-1,5%, Rhodia Organique fine Ltd, Francia) e l&#39;ossigeno in una camera a gas. Il gas in eccesso viene scavenging. Mantenere l&#39;anestesia tramite cono di naso. Confermare la profondità dell&#39;anestesia tramite un pizzico punta. </li><li> Mantenere la temperatura corporea a 37 ° C con l&#39;uso di un sensore termico anale ed un rilievo di riscaldamento (FHC, Bowdoinham, ME). </li><li> Proteggere gli occhi coprendoli con un unguento oculare (duratears, Alcon, Belgio). Accorciare il pelo dorsale del cranio, e pulire l&#39;area chirurgica, con una rotazione di macchia e betadinE o soluzione di clorexidina. </li><li> Eseguire un&#39;incisione linea di mezzo per esporre la superficie dorsale craniale del cranio. Rendere la superficie pulita e asciutta. </li><li> Applicare una goccia di acido fosforico (acido fosforico gel mordenzante 37,5%; Kerr, CA) sulla superficie dorsale craniale del cranio dal bregma al lambda. Rimuovere il mordenzante dopo 15 secondi e rendere la superficie cranica pulire con soluzione fisiologica e di nuovo asciutto. </li><li> Applicare in cima a questa superficie incisa cranica una goccia di OptiBond prime (Kerr, CA) e asciugare all&#39;aria per 30 secondi. </li><li> Mettere una goccia di OptiBond adesivo (Kerr, CA) in cima al primo OptiBond e la cura con la luce per 1 minuto (Maxima 480 fotopolimerizzatore a luce visibile, Henry Schein, USA). </li><li> Coprire lo strato adesivo con uno strato sottile di Charisma composito (Heraeus Kulzer, Germania). Incorpora due dadi collegati (diametro: 3 mm) in materiale composito. Curare il composito poi con la luce. Se necessario, applicare ulteriori strati di composito e curarli con la luce. </li><li> Annuncioministro buprenorfina (0,015 mg / kg, sc) per analgesia post-operatoria. L&#39;animale dovrebbe essere di nuovo in piedi nel giro di circa 5 min. Lasciare il mouse per recuperare in gabbia a casa a temperatura ambiente per almeno 3 giorni dopo l&#39;intervento. </li></ol></li><li> Video-oculografia setup per topi (Figura 2). <ol><li> Posizionare il mouse il limitatore e fissare la testa per il limitatore da due viti (Figura 1). Il mouse non ha bisogno di essere anestetizzati per questa procedura. Tempo di ritenuta non deve superare 1 ora / giorno. </li><li> Montare la testa e il corpo restrainer mouse su una piattaforma XY, che a sua volta è montato sulla tavola rotante (diametro: 60 cm). Utilizzando la piattaforma XY la testa mouse può essere posizionato sopra il centro del piatto girevole. Il mouse può essere spostato nel corso degli assi beccheggio, imbardata e rollio. La testa del mouse viene posizionato nella corretta beccheggio, imbardata e l&#39;angolo di rollio allineando l&#39;occhio utilizzando l&#39;immagine visiva dell&#39;occhio generato dal syste iSCANm. In alternativa, la costruzione piedistallo può essere posizionato sulla testa di topo in un telaio stereotassico 11. </li><li> L&#39;unità di rotazione è collegata ad un servo-motore controllato da AC (Harmonic Drive, Paesi Bassi) e la posizione del piatto girevole è controllata da un potenziometro (Bourns inc., CA) fissato all&#39;asse rotante. </li><li> Uno schermo cilindrico circostante (diametro: 63 cm, altezza 35 cm) con un modello casuale tratteggiata (ciascun elemento 2 °) copre la piattaforma girevole; questo tamburo è inoltre dotato di un servo-motore controllato da AC (Harmonic Drive, Paesi Bassi) . La posizione dello schermo cilindrico è controllata da un potenziometro (Bourns inc., CA) attaccato al suo asse e lo schermo può essere illuminato da una lampada alogena (20 Watt). Sia lo schermo circostante e la piattaforma girevole sono azionati in modo indipendente. </li><li> Il movimento della tavola rotante e schermo circostante è controllato da un computer che è collegato ad un interfaccia I / O (CED limitata, Cambridge, Regno Unito). Tabili e dintorni segnali di posizione dello schermo vengono filtrati (cut-off frequenza: 20 Hz), digitalizzati dal interfaccia I / O e memorizzati su questo computer. </li><li> L&#39;occhio del mouse è illuminato da tre emettitori a infrarossi (600 mW, angolo di dispersione: 7 °, picco di lunghezza d&#39;onda: 880 nm, RS Components, Paesi Bassi). Due emettitori sono fissati alla piattaforma girevole e il terzo emettitore è collegato alla telecamera. Questo terzo emettitore produce una riflessione corneale di riferimento (CR), che viene utilizzata durante la procedura di taratura e durante le registrazioni movimento dell&#39;occhio. </li><li> Una termocamera ad infrarossi CCD dotata di un obiettivo zoom (Zoom 6000, Navitar inc., NY) è attaccato al giradischi e si concentra sulla testa mouse al centro del piatto girevole. La telecamera può essere sbloccato e può essere straorzate attorno all&#39;asse giradischi oltre esattamente 20 ° durante la procedura di calibrazione. </li><li> Il segnale video viene elaborato da un sistema di tracciamento dell&#39;occhio (ETL-200, iSCAN, Burlington, MA). Il sistema utilizza un algoritmo iSCANRithm per monitorare i centri della pupilla e la CR di riferimento. Il sistema può monitorare la pupilla e di riferimento CR in direzione orizzontale e verticale ad una frequenza di campionamento di 120 Hz. </li><li> CR riferimento di posizione, la posizione della pupilla e segnali di dimensioni della pupilla vengono digitalizzati da interfaccia I / O e sono memorizzati nel file stesso tavolo e dintorni segnali di posizione dello schermo. L&#39;allievo-tracking sistema video induce un ritardo di segnali movimento dell&#39;occhio di circa 27 ms. </li></ol></li></ol> 2. Calibrare e misurare i movimenti oculari utilizzando Video Alunno-tracking Il sistema di tracciamento dell&#39;occhio cattura il movimento della pupilla come traslazione. La traslazione della pupilla monitorati contiene un componente di traslazione assiale dovuto alla differenza tra il centro di rotazione dell&#39;occhio e il centro anatomico dell&#39;occhio (cioè centro di curvatura corneale), e una componente rotazionale dovuta alla rotazione angolare del bulbo oculare. Per sottrarreIng il riferimento CR dal movimento pupilla / posizione, la componente indesiderata traslazionale viene eliminata dal segnale, con conseguente traslazione che è solo a causa della rotazione del bulbo oculare. Anche se sono spesso molto piccola, questa sottrazione elimina anche le traduzioni tra la testa e la telecamera. Il residuo movimento traslatorio isolato viene convertito in rotazione angolare del bulbo oculare con il metodo di calibrazione seguente 8,12. Questa taratura è stata eseguita prima di ogni esperimento movimento dell&#39;occhio. <ol><li> Regolare la posizione della testa del mouse per la telecamera in modo tale che l&#39;immagine video della pupilla è situata al centro del monitor e che la rappresentazione del CR riferimento si trova sulla linea mediana verticale dell&#39;occhio preferibilmente diretto sopra la pupilla. Minimizzare i movimenti del CR riferimento per rotazioni angolari telecamera, che può essere ottenuto posizionando il centro della curvatura corneale sulla telecamera / tabella asse. &lt;/ Li&gt; <li> Ruotare la telecamera più volte da + / - 10 ° (ossia 20 gradi picco-picco) attorno all&#39;asse verticale della giostra. Utilizzare la posizione della pupilla cingolato (P) e il riferimento CR registrato nelle posizioni estreme della rotazione della telecamera per calcolare il raggio di rotazione della pupilla (Rp; Rp = Δ / sin (20 °), dove Δ = (CR -P), vedi figura 3A). </li><li> Dato che il valore Rp dipende dalla dimensione della pupilla, una correzione dimensione della pupilla deve essere attuata 12 (Figura 3B). Ripetere il passaggio 2,2 volte in diverse condizioni di illuminazione (cioè manipolare la dimensione della pupilla, figura 3C) per determinare la dimensione della pupilla - rapporto Rp e comporre una curva di correzione Rp (Figura 3D). Il valore Rp dipende anche dalla posizione dell&#39;occhio verticale. Quando l&#39;esperimento farà sì che i movimenti oculari verticali, quindi una correzione della calibrazione per le posizioni oculari verticali è altamente raccomandabile13. </li><li> Determinare la posizione angolare dell&#39;occhio (E) misurando la posizione di riferimento CR, la posizione P e il diametro pupillare. La posizione di riferimento CR viene sottratto dalla posizione della pupilla generando una posizione traslazionale pupilla libero. Misurando il diametro pupillare il valore Rp può essere estratto dalla curva di correzione Rp e E può essere calcolato utilizzando la seguente formula E = arcsin {(Δ1) / Rp} (Figura 4A; cui Δ1 = (P 2-P 1) e P 1 e P 2 sono corrette mediante sottrazione del CR riferimento). </li><li> Un vasto repertorio di giradischi e / o rotazioni dello schermo circostanti possono ora essere utilizzati per stimolare il sistema oculomotore. Per svolgere oculografia video nel buio, l&#39;occhio mouse deve essere pretrattato con un farmaco miotico per limitare la dilatazione della pupilla e consentire il monitoraggio pupilla in queste circostanze. Nei nostri esperimenti, usiamo pilocarpina (4%, Laboratori Chauvin, Francia) per limitare la dilatazione degli alunni inal buio. </li></ol> 3. Analisi dei dati <ol><li> Posizioni degli occhi, le posizioni della tabella e le posizioni dello schermo circostanti sono tutti convertiti in posizioni angolari (si veda la Figura 4B e la formula in 2.4). Segnali oculari sono corretti per il loro ritardo di 27 ms indotta dalla elaborazione delle immagini della pupilla-sistema di tracciamento. </li><li> Posizioni angolari dell&#39;occhio, e la tavola schermo circostante sono differenziate e filtrati con un filtro passa-basso Butterworth utilizzando una frequenza di taglio di 20 Hz. </li><li> Saccadi vengono rimossi dal segnale di velocità occhio con una soglia di rilevamento di 40 ° / s. I dati vengono rimossi a partire da 20 ms prima e fino a 80 ms dopo aver attraversato la soglia di rilevamento. </li><li> Tabella, schermo circostante e segnali di velocità oculari sono mediati utilizzando ogni singolo ciclo del percorso (Figura 4C). </li><li> Segnali mediati sono dotati di una funzione appropriata. In generale, una stimolazione velocità sinusoidale viene utilizzato e la mediatocicli sono dotati di seno o funzione coseno (Figura 4C). Quindi, il guadagno può essere calcolata come il rapporto di velocità occhio velocità stimolo, mentre la fase può essere calcolato come la differenza (in gradi) fra la velocità occhio e velocità stimolo. </li></ol> 4. Risultati rappresentativi Video-oculografia può essere utilizzato per indagare varie forme di spettacoli oculomotori (cioè reflex optocinetico: okr; riflesso vestibolo-oculare: VOR; visivamente migliore riflesso vestibolo-oculare: VVOR), nonché di apprendimento motorio (adattamento VOR; adattamento okr). Il okr compensa i disturbi a bassa frequenza con feedback visivo. Il okr può essere indotta dalla rotazione ben illuminato schermo circostante (Film 1). Ruotando lo schermo circostante su una gamma di frequenza di 0,2 -1,0 Hz con un&#39;ampiezza di 1,6 ° mostra come il sistema optocinetico è un più efficiente meccanismo di compensazione nell&#39;intervallo a bassa frequenza THAn nella gamma alta frequenza (Figura 5A). Il VOR compensa alta frequenza movimenti della testa utilizzando segnali dagli organi vestibolari. Il VOR può essere indotta ruotando l&#39;animale (cioè giradischi) al buio (Film 2). Ruotando il piatto su una gamma di frequenza di 0,2 -1,0 Hz con un&#39;ampiezza di 1,6 ° dimostra come il vestibolo-oculare sistema più efficiente per generare movimenti oculari di compensazione nella gamma alta frequenza rispetto alla gamma di bassa frequenza (figura 5A) . Quando la legge sul sistema optocinetico e vestibolo-oculare in concerto, le immagini possono essere stabilizzate sulla retina su una vasta gamma di movimenti della testa. Ruotando il piatto su una gamma di frequenza di 0,2 -1,0 Hz con un&#39;ampiezza di 1,6 °, mentre lo schermo circostante è ben illuminato (Film 3) mostra come l&#39;occhio genera &quot;alto guadagno&quot; movimenti di compensazione sulla intera gamma di frequenze (figura 5A ). Tutti questi guadagno e phasi valori sono tipici per i topi, anche se le differenze di genere 14 e ceppo 15,16,17 sono stati segnalati. Il controllo indipendente sopra il giradischi e lo schermo circonda ci permette di affrontare i topi con una mancata corrispondenza tra le informazioni visive e vestibolari. Dopo esposizione a lungo termine e uniforme delle corrispondenti informazioni visive e vestibolare, il VOR del mouse cambierà per compensare l&#39;ingresso alterato visivo (adattamento VOR; Movie 4). La rotazione del piatto di fase (cioè 180 °) con lo schermo circostante (1 Hz, 1,6 °) aumenta il guadagno VOR (Figura 5B). La variazione del guadagno massimo in VOR, quando si utilizza un paradigma di apprendimento di prova, viene spesso raggiunto dopo 30 minuti. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3971/3971fig1.jpg" /> Figura 1. Schema del limitatore del mouse testa-corpo. Il corpo del mouse viene trattenuto medianteun tubo di plastica cilindrico con un diametro di 35 mm. Il capo del mouse è immobilizzato collegando il piedistallo del mouse per la barra di ferro con due viti. La sbarra di ferro forma un angolo di 30 gradi al fine di posizionare la testa del mouse in campo durante la normale deambulazione. *, Vista dall&#39;alto del piedistallo contenente due dadi. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3971/3971fig2.jpg" /> Figura 2. Schema della configurazione del mouse video-oculografia. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3971/3971fig3.jpg" /> Figura 3. La calibrazione del sistema di video-allievo tracking. A) La telecamera è ruotato diverse volte da + / - 10 ° (cioè 20 gradi picco-picco) attorno all&#39;asse verticale della giostra. La pupilla cingolato (P) e la riflessione corneale di riferimento (CR) registrata nel posizioni estreme della rotazione della telecamera vengono utilizzati per calcolare il raggio di rotazione della pupilla(Rp). B) Il raggio del diametro pupillare dipende dalla dimensione della pupilla. C) Esempio illustra l&#39;effetto della dimensione della pupilla sulla posizione della pupilla durante la procedura di calibrazione (misurato sia in pixel (px)). D) Rapporto tra Rp e il diametro della pupilla misurata in un mouse. I diametri pupillari tredici differenti state realizzate modificando l&#39;intensità della luce circostante. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3971/3971fig4.jpg" /> Figura 4. Misurazione e analisi dei movimenti oculari che utilizzano il video allievo-tracking. A) La posizione della pupilla angolare viene calcolata dal raggio della pupilla (Rp) e la posizione della pupilla (P; posizione corretta per CR). B) Esempio di movimento degli occhi compensativo indotto stimolando il sistema vestibolare e visivo (visivo maggiore VOR). La tavola rotante è stata ruotata sinusoidale a 0,6 Hz con un&#39;ampiezza di 1,6 °, mentre lo schermo circostante era ben illuminato. C) Analisi della registrazionemostrato in B). Il grafico mostra la traccia velocità media del giradischi (blu) e allievo (rosso). Queste tracce mediati sono stati dotati di una funzione sinusoidale (nero). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3971/3971fig5.jpg" /> Figura 5. Prestazioni e l&#39;apprendimento del sistema oculomotore misurato in una C57Bl6 mouse. Movimenti A) occhi sono generati da rotazioni dello schermo circostante (optocinetico riflessi: okr, pannelli superiori), ruotando il mouse al buio (riflesso vestibolo-oculare: VOR, pannelli centrali) e ruotando il mouse nella luce (visivamente -enhanced riflesso vestibolo-oculare: VVOR, pannello inferiore) con frequenze da 0,2 a 1,0 Hz ad un&#39;ampiezza di 1,6 °. Il guadagno del riflesso è stata calcolata come il rapporto di velocità occhio velocità stimolo (pannelli di sinistra) e la fase del riflesso è stata calcolata dalla differenza di fase tra la velocità occhio e velocità stimolo (pannelli di destra). B) L&#39;apprendimento motorio è stato realizzato da<html> adattivo aumentando la VOR utilizza un paradigma di fase di addestramento. Il topo è stato oggetto di un paradigma formazione visuovestibular in cui la rotazione del topo era fuori fase (180 °) con la rotazione dello schermo circostante (sia rotante a 1,0 Hz, 1,6 °) per quaranta minuti. Ogni 10 minuti il ​​VOR è stata provata (1.0 Hz, 1.6 °). In questo mouse la fase di formazione è aumentato il guadagno VOR. Movie 1. L&#39;animazione mostra il paradigma che induce nei topi okr <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3971/3971movie1.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere il film</a> . Movie 2. L&#39;animazione mostra il paradigma che induce VOR nei topi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3971/3971movie2.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere il film</a> . Movie 3. L&#39;animazione mostra il paradigma che induce VVOR nei topi..com/files/ftp_upload/3971/3971movie3.mov &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere il film. Movie 4. L&#39;animazione mostra la visuovestibular fuori del paradigma fase di formazione che induce l&#39;adattamento VOR (aumento) nei topi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3971/3971movie4.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere il film</a> .

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Al fine di ottenere video di alta qualità movimenti oculari registrazioni in topi diversi requisiti sono necessari. La procedura di taratura deve essere eseguita in materia suddetto standardizzato. Per esempio fuori centro calibrazione, quando la pupilla non è posizionato sulla linea mediana verticale con il riferimento CR durante la procedura di calibrazione, si tradurrà in una sottostima della RP e di conseguenza una sovrastima del movimento dell&#39;occhio. Inoltre, si consiglia di integrare la dimensione pupilla metodo di correzione nella procedura di calibrazione 12, in quanto gli studi che mostrano un diametro pupillare molto stabile sono molto rari. Anche un piccolo fattore di stress durante il processo può già modificare il diametro della pupilla in modo sostanziale. Quando si progetta un esperimento movimento degli occhi, i seguenti fattori devono essere presi in considerazione o controllati per quanto sono noti per influenzare la risposta movimento degli occhi: 13,18 età, sesso 14 e ceppo 15,16, 19. Inoltre, l&#39;animale sperimentale dovrebbe avere iridi pigmentate in quanto il rilevamento e il monitoraggio degli alunni è impossibile quando il contrasto tra pupilla e iride è troppo bassa, come nel topo BALB / c. Animali estremamente nervoso o ansioso bisogno di essere formati, prima dell&#39;esperimento, per abituarsi al set up sperimentale e la condizione contenuta. Questo animale procedura di gestione dei risultati in meno di chiusura o semi-chiusura degli occhi e impedisce la generazione di fluidi oculari durante l&#39;esperimento, e di conseguenza un monitoraggio allievo migliore è compiuto. Infine, l&#39;acquisizione e l&#39;analisi dei dati richiede due o tre ore per animale. Pertanto, le registrazioni dei movimenti oculari probabilmente rimarrà una procedura specifica applicata ai topi selezionati e non è adatto come test di screening ad alta produttività.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> Rhodia Organique fine LTD </td><td></td></tr><tr><td> Riscaldamento pad </td><td> FHC </td><td> 40-90-8 </td></tr><tr><td> Duratears </td><td> Alcon </td><td></td></tr><tr><td> Gel di acido fosforico </td><td> Kerr </td><td> 31297 </td></tr><tr><td> OptiBond prime </td><td> Kerr </td><td> 35369 </td></tr><tr><td> OptiBond adesivo </td><td> Kerr </td><td> 35369 </td></tr><tr><td> Charisma composito </td><td> Heraeus Kulzer </td><td></td></tr><tr><td> Maxima 480 Unità luce di polimerizzazione </td><td> Henry Schein </td><td></td></tr><tr><td> AC servo motore controllato da </td><td> Harmonic Drive AG </td><td></td></tr><tr><td> Cylschermo indric </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Luce alogena (20 W) </td><td> RS Components </td><td></td></tr><tr><td> Potenziometri (precisione) </td><td> Bourns inc. </td><td> 6574 </td></tr><tr><td> Potenza 1401 (interfaccia I / O) </td><td> CED limitata </td><td></td></tr><tr><td> Computer </td><td> Conca </td><td></td></tr><tr><td> Emmitters infrarossi </td><td> RS Components </td><td> 195-451 </td></tr><tr><td> ETL-200 </td><td> ISCAN </td><td></td></tr><tr><td> Zoom (zoom 6000) </td><td> Navitar inc. </td><td></td></tr><tr><td> Pilocarpinenitrate (minime) </td><td> Laboratoire Chauvin </td><td></td></tr></tbody></table>

video-oculografia in mouse

Video-oculography in Mice

I movimenti oculari sono molto importanti al fine di tracciare un oggetto o per stabilizzare l&#39;immagine sulla retina durante il movimento. Gli animali senza fovea, come il mouse, hanno una limitata capacità di bloccare i loro occhi su un bersaglio. In contrasto con questi movimenti oculari destinatari diretti, compensativi movimenti oculari oculari possono essere facilmente raggiunta in animali afoveate 1,2,3,4. Movimenti oculari compensative sono generati dal trattamento delle informazioni vestibolari e optocinetico in un segnale di comando che guiderà i muscoli oculari. Il trattamento delle informazioni vestibolare e optocinetico possono essere analizzate separatamente e insieme, permettendo la definizione di un deficit del sistema oculomotore. Il sistema oculomotore può essere verificata attraverso l&#39;evocazione di uno optocinetico reflex (okr), riflesso vestibolo-oculare (VOR) o visivamente-enhanced riflesso vestibolo-oculare (VVOR). Il okr è un movimento riflesso che compensa il &quot;pieno campo&quot; i movimenti delle immagini sulla retina, mentre la VOR è una m occhio reflexovement che compensa i movimenti della testa. Il VVOR è un movimento degli occhi riflesso che utilizza sia vestibolare così come le informazioni optocinetico per rendere il risarcimento adeguato. Il cervelletto controlla ed è in grado di regolare i movimenti oculari di compensazione. Pertanto, oculografia è uno strumento molto potente per studiare il comportamento del cervello in rapporto normale, così come in condizioni patologiche (fe di vestibolare, oculare e / o origine cerebellare). Test del sistema oculomotore, come un paradigma comportamentale, è interessante per diversi motivi. In primo luogo, il sistema oculomotore è un sistema ben compreso neurale 5. In secondo luogo, il sistema è relativamente semplice oculomotore 6, la quantità di movimento dell&#39;occhio possibile è limitata dalla sua sfera-in-presa architettura (&quot;singolo giunto&quot;) e le tre coppie di muscoli extraoculari 7. In terzo luogo, l&#39;output comportamentale e l&#39;input sensoriale può essere facilmente misurata, che rende questo un sistema altamente accessibile quantitativaanalisi 8. Molti test comportamentali manca questo elevato livello di potenza quantitativa. Infine, sia le prestazioni nonché plasticità del sistema oculomotoria può essere testato, consentendo ricerca sui processi di apprendimento e memoria 9. Topi geneticamente modificati sono ormai ampiamente disponibili e formano una fonte importante per l&#39;esplorazione delle funzioni cerebrali a vari livelli 10. Inoltre, possono essere utilizzati come modelli per mimare malattie umane. Applicando oculografia su Normal, trattati farmacologicamente o topi geneticamente modificati è un potente strumento di ricerca per esplorare la fisiologia di base dei comportamenti del motore in condizioni normali e patologiche. Qui, descriviamo come misurare la video-oculografia nei topi 8.

Video-oculografia è un metodo molto quantitativa per indagare le prestazioni del motore oculare così come apprendimento motorio. Qui, descriviamo come misurare la video-oculografia nei topi. Applicando questa tecnica su normali, trattati farmacologicamente o topi geneticamente modificati è un potente strumento di ricerca per esplorare la fisiologia di base dei comportamenti del motore.

Video-oculografia in Mouse

I movimenti oculari sono di fondamentale importanza per tracciare un oggetto o per stabilizzare un'immagine sulla retina durante il movimento. Gli animali privi di fovea, come i...

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire la video-oculografia nei topi. Questo viene realizzato innanzitutto equipaggiando il topo con una struttura a perno sul cranio, che permette l'immobilizzazione della testa in un apposito contenitore per testa e corpo. Il secondo passaggio consiste nel posizionare il topo nell'apparato per la video-oculografia e nel calibrare il sistema di tracciamento video della pupilla.Successivamente, i movimenti oculari vengono registrati mentre il sistema oculomotore viene attivato mediante un ampio repertorio di stimoli vestibolari e optocinetici. L'ultimo passaggio consiste nell'analizzare questi movimenti oculari. Infine, l'iconografia video su topi normali, trattati farmacologicamente o modificati geneticamente può essere utilizzata per esplorare la fisiologia dei comportamenti motori.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul sistema oculomotore, può anche essere applicato per studiare malattie di origine cerebellare, vestibolare o oculare utilizzando mutanti murini che imitano patologie umane. Per iniziare questa procedura, anestetizzare il topo in una camera a gas con una miscela di isof, fluoro e ossigeno. Successivamente, mantenere l'anestesia somministrando il gas attraverso una maschera.Successivamente, utilizzare un tappetino riscaldante e un sensore termico anale per mantenere la temperatura corporea del topo a 37 gradi Celsius. In seguito, applicare un unguento oculare per proteggere gli occhi dall'essiccamento, rasare il pelo cranico dorsale e pulire l'area chirurgica. Dopodiché, praticare un'incisione mediana per esporre la superficie cranica dorsale del cranio, quindi pulire e asciugare la superficie.Quindi applicare una goccia di acido fosforico da bgma a Lambda. Dopo 15 secondi, rimuovere il mordente, quindi pulire la superficie cranica con soluzione fisiologica e asciugarla nuovamente. Applicare una goccia di opti bond prime sulla parte superiore della superficie cranica mordenzata e aerare.Asciugarlo per 30 secondi. Successivamente, aggiungere una goccia di adesivo opti bond sopra il primer opti bond. Polimerizzarlo con luce UV per un minuto.In seguito, ricoprire lo strato adesivo con uno strato sottile di composito charisma. Il connettore con foro per vite magnetica e i siti di attacco sono incorporati nel composito. Quindi polimerizzare il composito con luce UV.Se necessario, applicare ulteriori strati di composito e polimerizzarli con la luce. Lasciare che il topo si riprenda per almeno tre giorni dopo l'intervento chirurgico. Il passo successivo consiste nel posizionare il topo nel contenitore e fissare la sua testa al contenitore stesso mediante un magnete e un supporto a vite; montare il contenitore per la testa e il corpo del topo su una piattaforma XY.Utilizzando la piattaforma XY, posizionare la testa del mouse al centro del tavolo rotante in modo che il mouse possa essere spostato sopra gli assi di beccheggio Ya e di imbardata. Successivamente, posizionare la testa all'angolo corretto di beccheggio ya e di imbardata allineando l'occhio mediante l'immagine visiva dell'occhio generata dal sistema di scansione oculare. Ora il tavolo rotante è collegato a un motore controllato da servocomando CA.La posizione del piatto girevole viene monitorata mediante un potenziometro collegato all'asse del piatto girevole. Il piatto girevole è ricoperto da una schermatura cilindrica con un motivo a punti casuali, dotata anche di un motore controllato da servomotore in corrente alternata. La posizione dello schermo cilindrico viene monitorata da un potenziometro collegato al suo asse.Lo schermo può essere illuminato da una luce alogena. Il movimento del piatto girevole e dello schermo circostante è controllato da un computer collegato a un'interfaccia di ingresso e uscita. I segnali di posizione del piatto girevole e dello schermo circostante vengono filtrati da una frequenza di taglio di 20 hertz, digitalizzati dall'interfaccia di ingresso e uscita e memorizzati su questo computer.L'occhio del mouse è illuminato da tre emettitori a infrarossi. Due sono fissati al piatto girevole, mentre il terzo è collegato alla telecamera. Questo terzo emettitore produce una riflessione corneale di riferimento, utilizzata durante la procedura di calibrazione e durante le registrazioni dei movimenti oculari.Una telecamera CCD a infrarossi dotata di obiettivo zoom è collegata al tavolo girevole ed è focalizzata sulla testa del topo. Al centro del tavolo girevole. La telecamera può essere sbloccata e spostata attorno all'asse del tavolo girevole esattamente di 20 gradi.Durante la procedura di calibrazione, il segnale video viene elaborato da un sistema di eye tracking, in grado di tracciare la pupilla e la riflessione corneale di riferimento nelle direzioni orizzontale e verticale con una frequenza di campionamento di 120 hertz. Successivamente, la posizione di riferimento corneale, la posizione della pupilla e i segnali relativi alle dimensioni della pupilla vengono digitalizzati tramite l'interfaccia di ingresso-uscita e memorizzati nello stesso file insieme ai segnali della posizione del tavolo e dello schermo circostante, al fine di calibrare i movimenti oculari. Regolare la posizione della testa del mouse rispetto alla telecamera in modo che l'immagine video della pupilla sia centrata sul monitor e la rappresentazione del riferimento corneale sia posizionata sulla linea mediana verticale dell'occhio, direttamente al di sopra della pupilla.Successivamente, spostare la telecamera più volte di 20 gradi al picco. Effettuare il picco attorno all'asse verticale del tavolo girevole. Utilizzare le posizioni della pupilla tracciata e del riferimento corneale registrato nelle posizioni estreme della telecamera per calcolare il raggio della rotazione della pupilla.Ripetere questi passaggi più volte in diverse condizioni di illuminazione al fine di determinare la relazione tra la dimensione della pupilla e la rotazione pupillare. Quindi, comporre una curva di correzione della rotazione pupillare. Ora calcolare la posizione angolare dell'occhio misurando la posizione di riferimento corneale, la posizione della pupilla e la dimensione della pupilla.Il valore della rotazione della pupilla può essere estratto dalla curva di correzione della rotazione della pupilla e la posizione angolare dell'occhio può essere calcolata utilizzando la seguente formula. Viene qui illustrato l'esperimento sul movimento oculare VVOR. Ora, convertire le posizioni dell'occhio, le posizioni del tavolo e le posizioni dello schermo circostante in posizioni angolari.Successivamente, differenzia e filtra le posizioni angolari del tavolo oculare e dello schermo circostante mediante un filtro passa-basso di Butterworth. Utilizzando una frequenza di taglio di 20 hertz sub, rimuovi il secondo dal segnale di velocità oculare mediante una soglia di rilevamento di 40 gradi al secondo. Quindi, calcola la media dei segnali di velocità del tavolo e dell'occhio utilizzando ogni singolo ciclo della prova e adatta i segnali mediati con una funzione appropriata.In generale, si utilizza una stimolazione sinusoidale della velocità e i cicli medi vengono adattati con una funzione seno o coseno. Questo filmato mostra come i movimenti oculari siano generati dalla rotazione dello schermo circostante, provocando un riflesso optocinetico mediante la rotazione dello schermo circostante in un intervallo di frequenza compreso tra 0,2 e 1 hertz con un'ampiezza di 1,6 gradi. Si osserva che il sistema optocinetico del topo è più efficiente nell'intervallo di bassa frequenza rispetto a quello di alta frequenza.Ecco un altro filmato per mostrare come vengono generati i movimenti oculari. Ruotando il mouse al buio si induce il riflesso oculovestibolare, facendo ruotare il piatto girevole in un intervallo di frequenza compreso tra 0,2 e 1 hertz con un'ampiezza di 1,6 gradi. Si osserva che il sistema oculovestibolare del mouse è più efficiente nell'intervallo di frequenza alta rispetto a quello di frequenza bassa.Di seguito è mostrato un altro filmato che illustra come i movimenti oculari siano generati ruotando il mouse alla luce per indurre un riflesso vestibolo-oculare potenziato dal punto di vista visivo, ruotando il piatto girevole in un intervallo di frequenza compreso tra 0,2 e 1 hertz con un'ampiezza di 1,6 gradi, mentre lo schermo circostante è ben illuminato; in queste condizioni, si osserva che il mouse genera movimenti oculari compensatori efficienti su tutto l'intervallo di frequenza. Questo filmato mostra inoltre come l'apprendimento motorio sia stato ottenuto aumentando in modo adattativo il riflesso vestibolo-oculare. Utilizzando un paradigma di addestramento in opposizione di fase, la rotazione del piatto girevole in opposizione di fase rispetto allo schermo circostante incrementa il guadagno del riflesso vestibolo-oculare in questo mouse.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un'oculografia video nei topi.

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Neuroscienze

Questo video dimostra la coltura ex vivo e l'imaging di fette oculomotorie da embrioni di topo transgenico. Gli embrioni vengono isolati e immersi nell'agarosio. Utilizzando un vibratomo si ottengono fette contenenti i nuclei oculomotori e gli occhi. Le fette vengono mantenute in coltura e visualizzate utilizzando un microscopio a fluorescenza.

Coltura ex vivo e imaging di fette oculomotorie da embrioni di topo transgenico

Fonte: Wang, Z., et al. Imaging transpupillare in vivo a due fotoni della retina del topo. J. Vis. Exp. (2021).Questo video mostra una tecnica per l'imaging retinico in vivo utilizzando la microscopia a due fotoni. I topi anestetizzati vengono preparati per l'imaging fissando le loro teste, applicando lubrificante per gli occhi e posizionando un vetrino coprioggetti sull'occhio. Le cellule gangliari retiniche (RGC) che esprimono proteine fluorescenti vengono prima visualizzate utilizzando...

Imaging in vivo a due fotoni della retina del topo

Source: Bosco, A., et al. Dinamiche in vivo dell'attivazione microgliale retinica durante la neurodegenerazione: imaging oftalmoscopico confocale e morfometria cellulare nel glaucoma di topo. J. Vis. Exp. (2015) Questo video dimostra l'imaging in vivo della microglia retinica in un modello murino di glaucoma. Un topo transgenico con microglia retinica fluorescente che esprime proteine è posizionato sotto un oftalmoscopio. L'illuminazione a infrarossi viene utilizzata per localizzare la testa...

Imaging in vivo della microglia retinica in un modello murino di glaucoma

Fonte: Jagodzinska, J., et. al., Tomografia a coerenza ottica: imaging delle cellule gangliari retiniche del topo In Vivo. J. Vis. Exp. (2017) &lt;br /&gt; In questo video, dimostriamo l'uso della tomografia a coerenza ottica del dominio spettrale (SD-OCT) per visualizzare gli strati retinici e valutare i cambiamenti strutturali in un modello murino geneticamente modificato con neuropatia ottica.

Imaging in vivo della retina di topo mediante tomografia a coerenza ottica

La microscopia intravitale può essere utilizzata negli animali per visualizzare e misurare i diametri vascolari della retina, la velocità del flusso sanguigno e il flusso sanguigno retinico totale.

Microscopio video intravitale misurazioni della retina flusso sanguigno nei topi

Attivazione microglia e microgliosis sono risposte chiave per neurodegenerazione cronica. Qui vi presentiamo i metodi per in vivo, la visualizzazione a lungo termine della retina CX3CR1-GFP + cellule microgliali di oftalmoscopia confocale, e per la soglia e le analisi morfometrica per identificare e quantificare la loro attivazione. Monitoriamo modifiche microgliali durante fasi iniziali di glaucoma all'età.

In Vivo Dynamics of Retinal microglia attivazione durante neurodegenerazione: confocale oftalmoscopico Imaging e Morfometria cellulare in mouse Glaucoma

Questo manoscritto descrive un protocollo per l'imaging in vivo della retina di topo con tomografia a coerenza ottica ad alta risoluzione spettrale dominio (SD-OCT). Si concentra sulle cellule retiniche del ganglio (RGC) nella regione peripapillare, con diverse analisi e quantificazione approcci descritti.

Tomografia a coerenza ottica: Imaging Mouse ganglionari cellule In Vivo

Questo protocollo descrive come ad alta definizione tecniche di imaging come la tomografia ottica di coerenza di dominio spettrale e scansione laser oftalmoscopia può essere utilizzata in piccoli roditori, utilizzando un sistema di piattaforma di imaging oftalmico, per ottenere informazioni su lo spessore retinico e microglial cellula distribuzione, rispettivamente.

In Vivo Imaging dei topi Reporter Cx3cr1gfp/gfp con tomografia a coerenza ottica Spectral-domain e scansione Laser oftalmoscopia

Il protocollo presentato produce un persistente conflitto sensoriale per esperimenti volti a studiare l'apprendimento a lungo termine. Da indossare permanentemente un dispositivo fisso sulle loro teste, topi sono continuamente esposti a una mancata corrispondenza sensoriale tra gli input visivi e vestibolari mentre si muove liberamente in casa gabbie.

A lungo termine conflitto sensoriale a comportarsi liberamente topi

Il presente protocollo delinea i passaggi per l'allineamento in vivo delle immagini in fibra di tomografia a coerenza ottica a luce visibile (vis-OCTF) con le immagini confocali ex vivo della stessa retina murina allo scopo di verificare la morfologia osservata del fascio assonale delle cellule gangliari retiniche nelle immagini in vivo .

Allineamento di fibrogrammi per tomografia a coerenza ottica a luce visibile con immagini confocali della stessa retina murina

Qui descriviamo un protocollo standard per quantificare il riflesso optocinetico. Combina la stimolazione virtuale del tamburo e la video-oculografia, e consente quindi una valutazione precisa della selettività delle caratteristiche del comportamento e della sua plasticità adattativa.

Quantificazione della selettività delle caratteristiche visive del riflesso optocinetico nei topi

Scopri la video-oculografia nei topi per studiare le prestazioni motorie oculari e l'apprendimento motorio. Questa tecnica quantitativa permette di analizzare i movimenti oculari e investigare la fisiologia dei comportamenti motori.

Video-oculografia in Mouse

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