Video-oculografia in Mouse
19 luglio 2012
Video-oculografia è un metodo molto quantitativa per indagare le prestazioni del motore oculare così come apprendimento motorio. Qui, descriviamo come misurare la video-oculografia nei topi. Applicando questa tecnica su normali, trattati farmacologicamente o topi geneticamente modificati è un potente strumento di ricerca per esplorare la fisiologia di base dei comportamenti del motore.
L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire la video-oculografia nei topi. Questo viene realizzato innanzitutto equipaggiando il topo con una struttura a perno sul cranio, che permette l'immobilizzazione della testa in un apposito contenitore per testa e corpo. Il secondo passaggio consiste nel posizionare il topo nell'apparato per la video-oculografia e nel calibrare il sistema di tracciamento video della pupilla.
Successivamente, i movimenti oculari vengono registrati mentre il sistema oculomotore viene attivato mediante un ampio repertorio di stimoli vestibolari e optocinetici. L'ultimo passaggio consiste nell'analizzare questi movimenti oculari. Infine, l'iconografia video su topi normali, trattati farmacologicamente o modificati geneticamente può essere utilizzata per esplorare la fisiologia dei comportamenti motori.
Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul sistema oculomotore, può anche essere applicato per studiare malattie di origine cerebellare, vestibolare o oculare utilizzando mutanti murini che imitano patologie umane. Per iniziare questa procedura, anestetizzare il topo in una camera a gas con una miscela di isof, fluoro e ossigeno. Successivamente, mantenere l'anestesia somministrando il gas attraverso una maschera.
Successivamente, utilizzare un tappetino riscaldante e un sensore termico anale per mantenere la temperatura corporea del topo a 37 gradi Celsius. In seguito, applicare un unguento oculare per proteggere gli occhi dall'essiccamento, rasare il pelo cranico dorsale e pulire l'area chirurgica. Dopodiché, praticare un'incisione mediana per esporre la superficie cranica dorsale del cranio, quindi pulire e asciugare la superficie.
Quindi applicare una goccia di acido fosforico da bgma a Lambda. Dopo 15 secondi, rimuovere il mordente, quindi pulire la superficie cranica con soluzione fisiologica e asciugarla nuovamente. Applicare una goccia di opti bond prime sulla parte superiore della superficie cranica mordenzata e aerare.
Asciugarlo per 30 secondi. Successivamente, aggiungere una goccia di adesivo opti bond sopra il primer opti bond. Polimerizzarlo con luce UV per un minuto.
In seguito, ricoprire lo strato adesivo con uno strato sottile di composito charisma. Il connettore con foro per vite magnetica e i siti di attacco sono incorporati nel composito. Quindi polimerizzare il composito con luce UV.
Se necessario, applicare ulteriori strati di composito e polimerizzarli con la luce. Lasciare che il topo si riprenda per almeno tre giorni dopo l'intervento chirurgico. Il passo successivo consiste nel posizionare il topo nel contenitore e fissare la sua testa al contenitore stesso mediante un magnete e un supporto a vite; montare il contenitore per la testa e il corpo del topo su una piattaforma XY.
Utilizzando la piattaforma XY, posizionare la testa del mouse al centro del tavolo rotante in modo che il mouse possa essere spostato sopra gli assi di beccheggio Ya e di imbardata. Successivamente, posizionare la testa all'angolo corretto di beccheggio ya e di imbardata allineando l'occhio mediante l'immagine visiva dell'occhio generata dal sistema di scansione oculare. Ora il tavolo rotante è collegato a un motore controllato da servocomando CA.
La posizione del piatto girevole viene monitorata mediante un potenziometro collegato all'asse del piatto girevole. Il piatto girevole è ricoperto da una schermatura cilindrica con un motivo a punti casuali, dotata anche di un motore controllato da servomotore in corrente alternata. La posizione dello schermo cilindrico viene monitorata da un potenziometro collegato al suo asse.
Lo schermo può essere illuminato da una luce alogena. Il movimento del piatto girevole e dello schermo circostante è controllato da un computer collegato a un'interfaccia di ingresso e uscita. I segnali di posizione del piatto girevole e dello schermo circostante vengono filtrati da una frequenza di taglio di 20 hertz, digitalizzati dall'interfaccia di ingresso e uscita e memorizzati su questo computer.
L'occhio del mouse è illuminato da tre emettitori a infrarossi. Due sono fissati al piatto girevole, mentre il terzo è collegato alla telecamera. Questo terzo emettitore produce una riflessione corneale di riferimento, utilizzata durante la procedura di calibrazione e durante le registrazioni dei movimenti oculari.
Una telecamera CCD a infrarossi dotata di obiettivo zoom è collegata al tavolo girevole ed è focalizzata sulla testa del topo. Al centro del tavolo girevole. La telecamera può essere sbloccata e spostata attorno all'asse del tavolo girevole esattamente di 20 gradi.
Durante la procedura di calibrazione, il segnale video viene elaborato da un sistema di eye tracking, in grado di tracciare la pupilla e la riflessione corneale di riferimento nelle direzioni orizzontale e verticale con una frequenza di campionamento di 120 hertz. Successivamente, la posizione di riferimento corneale, la posizione della pupilla e i segnali relativi alle dimensioni della pupilla vengono digitalizzati tramite l'interfaccia di ingresso-uscita e memorizzati nello stesso file insieme ai segnali della posizione del tavolo e dello schermo circostante, al fine di calibrare i movimenti oculari. Regolare la posizione della testa del mouse rispetto alla telecamera in modo che l'immagine video della pupilla sia centrata sul monitor e la rappresentazione del riferimento corneale sia posizionata sulla linea mediana verticale dell'occhio, direttamente al di sopra della pupilla.
Successivamente, spostare la telecamera più volte di 20 gradi al picco. Effettuare il picco attorno all'asse verticale del tavolo girevole. Utilizzare le posizioni della pupilla tracciata e del riferimento corneale registrato nelle posizioni estreme della telecamera per calcolare il raggio della rotazione della pupilla.
Ripetere questi passaggi più volte in diverse condizioni di illuminazione al fine di determinare la relazione tra la dimensione della pupilla e la rotazione pupillare. Quindi, comporre una curva di correzione della rotazione pupillare. Ora calcolare la posizione angolare dell'occhio misurando la posizione di riferimento corneale, la posizione della pupilla e la dimensione della pupilla.
Il valore della rotazione della pupilla può essere estratto dalla curva di correzione della rotazione della pupilla e la posizione angolare dell'occhio può essere calcolata utilizzando la seguente formula. Viene qui illustrato l'esperimento sul movimento oculare VVOR. Ora, convertire le posizioni dell'occhio, le posizioni del tavolo e le posizioni dello schermo circostante in posizioni angolari.
Successivamente, differenzia e filtra le posizioni angolari del tavolo oculare e dello schermo circostante mediante un filtro passa-basso di Butterworth. Utilizzando una frequenza di taglio di 20 hertz sub, rimuovi il secondo dal segnale di velocità oculare mediante una soglia di rilevamento di 40 gradi al secondo. Quindi, calcola la media dei segnali di velocità del tavolo e dell'occhio utilizzando ogni singolo ciclo della prova e adatta i segnali mediati con una funzione appropriata.
In generale, si utilizza una stimolazione sinusoidale della velocità e i cicli medi vengono adattati con una funzione seno o coseno. Questo filmato mostra come i movimenti oculari siano generati dalla rotazione dello schermo circostante, provocando un riflesso optocinetico mediante la rotazione dello schermo circostante in un intervallo di frequenza compreso tra 0,2 e 1 hertz con un'ampiezza di 1,6 gradi. Si osserva che il sistema optocinetico del topo è più efficiente nell'intervallo di bassa frequenza rispetto a quello di alta frequenza.
Ecco un altro filmato per mostrare come vengono generati i movimenti oculari. Ruotando il mouse al buio si induce il riflesso oculovestibolare, facendo ruotare il piatto girevole in un intervallo di frequenza compreso tra 0,2 e 1 hertz con un'ampiezza di 1,6 gradi. Si osserva che il sistema oculovestibolare del mouse è più efficiente nell'intervallo di frequenza alta rispetto a quello di frequenza bassa.
Di seguito è mostrato un altro filmato che illustra come i movimenti oculari siano generati ruotando il mouse alla luce per indurre un riflesso vestibolo-oculare potenziato dal punto di vista visivo, ruotando il piatto girevole in un intervallo di frequenza compreso tra 0,2 e 1 hertz con un'ampiezza di 1,6 gradi, mentre lo schermo circostante è ben illuminato; in queste condizioni, si osserva che il mouse genera movimenti oculari compensatori efficienti su tutto l'intervallo di frequenza. Questo filmato mostra inoltre come l'apprendimento motorio sia stato ottenuto aumentando in modo adattativo il riflesso vestibolo-oculare. Utilizzando un paradigma di addestramento in opposizione di fase, la rotazione del piatto girevole in opposizione di fase rispetto allo schermo circostante incrementa il guadagno del riflesso vestibolo-oculare in questo mouse.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un'oculografia video nei topi.
Panoramica
In questo articolo viene descritta la procedura per eseguire la video-oculografia nei topi, un metodo quantitativo per studiare le prestazioni motorie oculari e l'apprendimento motorio. La tecnica può essere applicata a topi normali, trattati farmacologicamente o modificati geneticamente per esplorare la fisiologia dei comportamenti motori.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Prestazione del movimento oculare
- Apprendimento motorio
Sfondo
- La video-oculografia è un metodo utilizzato per lo studio dei movimenti oculari.
- Questa tecnica fornisce informazioni sul sistema oculomotore.
- Può inoltre essere utilizzata per studiare malattie di origine cerebellare o vestibolare.
- I modelli murini possono riprodurre patologie umane ai fini della ricerca.
Scopo dello studio
- Misurare e analizzare i movimenti oculari nei topi.
- Studiare la fisiologia alla base dei comportamenti motori.
- Applicare il metodo a diversi modelli murini per studi sulle malattie.
Metodi Utilizzati
- Equipaggiare il topo con un basamento per l'immobilizzazione della testa.
- Calibrare il sistema video per il tracciamento della pupilla.
- Registrare i movimenti oculari utilizzando stimoli vestibolari e ottici.
- Analizzare i movimenti oculari registrati per ottenere informazioni fisiologiche.
Risultati principali
- Calibrazione corretta del sistema di eye tracking.
- Registrazione dei movimenti oculari in diverse condizioni di stimolo.
- Analisi dei dati che rivela informazioni sulla fisiologia del comportamento motorio.
- Applicazione del metodo per lo studio delle malattie del sistema motorio oculare.
Conclusioni
- La video-oculografia è uno strumento potente per lo studio dei movimenti oculari.
- Questo metodo può migliorare la comprensione dell'apprendimento motorio e della prestazione.
- Presenta potenzialità per l'indagine di malattie che interessano il sistema oculomotore.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La video-oculografia nei topi fornisce un indice comportamentale quantitativo per valutare la funzione oculomotoria, consentendo una riduzione del rischio meccanicistica dei bersagli coinvolti nelle vie vestibolari, cerebellari e oculari motorie. Il metodo supporta la validazione dei bersagli collegando manipolazioni genetiche o farmacologiche a modifiche misurabili nei movimenti oculari riflessi, offrendo una previsione affidabile nelle fasi iniziali della scoperta. La sua applicabilità a modelli rilevanti per le malattie migliora la continuità traslazionale nei percorsi per disturbi neuropsichiatrici e neurodegenerativi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche rivolte ai sistemi vestibolare, cerebellare e oculomotorio attraverso fenotipi comportamentali quantificabili.
- Valore operativo: Fornisce un saggio riproducibile e compatibile con l'alta produttività per lo screening di modificatori genetici e farmacologici del comportamento motorio.
- Valore scientifico: Supporta la riduzione del rischio biologico isolando la funzione del circuito oculomotorio da variabili motorie o motivazionali interferenti.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera misurazioni quantitative di variabili dipendenti (velocità oculare, guadagno, fase) che consentono correlazioni dose-risposta e genotipo-fenotipo.
- Valore operativo: Protocolli standardizzati di calibrazione e tracciamento garantiscono riproducibilità tra laboratori e prontezza del saggio per la valutazione di composti.
- Valore scientifico: I risultati supportano la riduzione del rischio meccanicistico distinguendo i contributi del VOR vestibolare, optocinetico e visivamente potenziato al controllo motorio.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Sistema rilevante per le malattie: modelli murini che riproducono patologie vestibolari, cerebellari o oculari umane consentono un allineamento diretto dei biomarcatori di tipo traslazionale.
- Valore operativo: Permette il monitoraggio longitudinale dell'apprendimento motorio e della plasticità adattativa, supportando la validazione preclinica di terapie cognitive e motorie.
- Valore scientifico: Facilita decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio, quantificando il recupero funzionale o la progressione del deficit in modelli genetici.
Pipeline e integrazione del flusso di lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta come strumento di screening fenotipico per la validazione degli obiettivi, i cui risultati informano le decisioni relative all'identificazione dei composti promettenti e al passaggio alle fasi precliniche in base all'integrità del sistema oculomotore.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi isolando i contributi vestibolari e optocinetici al controllo del movimento oculare.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio mediante fissazione standardizzata della testa, calibrazione e somministrazione di stimoli, consentendo una valutazione affidabile di composti o genotipi.
- Analisi: Fornisce parametri quantitativi (posizione angolare dell'occhio, velocità, guadagno) filtrati e adattati a stimoli sinusoidali per analisi comparative tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica attraverso l'applicabilità nei modelli di malattia, permettendo la valutazione dell'impatto terapeutico sui fenotipi del comportamento motorio.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per team interfunzionali che studiano l'apprendimento motorio, i disturbi dell'equilibrio e le indicazioni neuropsichiatriche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Previsione affidabile dell'interazione con il bersaglio attraverso modifiche misurabili del guadagno e della fase del riflesso vestibolo-oculare (VOR), del riflesso optocinetico (OKR) e del VVOR.
- Valore operativo: La preparazione chirurgica standardizzata, l'immobilizzazione della testa e il tracciamento in infrarosso garantiscono la riproducibilità tra laboratori e punti temporali.
- Valore strategico: Riduce il rischio biologico in fase avanzata consentendo la rilevazione precoce di disfunzioni nei circuiti motori in modelli genetici o farmacologici.
- Impatto sul portafoglio: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo quantificando la performance oculomotoria come biomarcatore dell'integrità dei circuiti neurali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in chirurgia murina, impianto di piastre craniche e sistemi di tracciamento oculomotorio a infrarossi.
- È dipendente da attrezzature specializzate, tra cui piattaforme XY, girelli controllati da servomeccanismi, emettitori a infrarossi e telecamere CCD ad alta velocità.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo ai protocolli chirurgici, alle procedure di calibrazione e ai parametri degli stimoli, al fine di ottenere risultati riproducibili.
- Le considerazioni relative all'adattamento includono aggiustamenti specifici per ceppo murino, peso e pigmentazione oculare, fattori che possono influenzare l'accuratezza del tracciamento a infrarossi.
- I limiti pratici comprendono il tempo di recupero post-chirurgico e potenziali fattori confondenti derivanti dall'anestesia o dall'infiammazione, che possono alterare la funzione oculomotoria di base.
