Usando elettroforesi capillare per quantificare Acidi organici da tessuti vegetali: un banco di prova d'esame Coffea arabica Semi

Questo articolo presenta un metodo per l'individuazione e la quantificazione di acidi organici provenienti da materiale vegetale che utilizzano gratuitamente zonale elettroforesi capillare. Un esempio del potenziale applicazione di questo metodo, determinare gli effetti di una fermentazione secondaria sui livelli di acidi organici in semi di caffè, è fornito.

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare i livelli di acidi organici presenti nei tessuti vegetali. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande di biochimica e fisiologia vegetale, come l'impatto degli stimoli ambientali sulla crescita delle radici, sullo sviluppo delle colture e sulla qualità degli alimenti o delle bevande. I principali vantaggi di questo metodo sono che la preparazione del campione è minima, il metodo è ad alta produttività e l'elettroforesi capillare è più conveniente della spettrometria di massa.

Sebbene questo metodo venga utilizzato per chiarire le risposte fisiologiche delle piante, può essere applicato anche alla scienza e alla qualità degli alimenti, dove gli acidi organici hanno un impatto critico sul sapore, sulla sicurezza e sulla stabilità. Per iniziare, assemblare i campioni per l'estrazione dell'acido carbossilico a catena corta, o SCCA. Preparare un grammo di semi di caffè alla volta per assicurarsi che rimanga abbastanza campione dopo la lavorazione.

Per ottenere una granulometria uniforme per la massima efficienza di estrazione SCCA, prima pre-raffreddare un mortaio e un pestello con azoto liquido. Aggiungere il campione a un piccolo volume di azoto liquido nella malta. Utilizzando un mestolo, aggiungere una quantità sufficiente di azoto liquido alla malta per immergere completamente il campione.

Aggiungi campioni difficili da macinare, come i semi di caffè crudi, all'azoto liquido. Lasciarli congelare per 10-30 secondi prima di macinarli. Rompere il tessuto in frammenti più piccoli usando un movimento di frantumazione verticale.

Quindi, completare la macinazione dei tessuti utilizzando un movimento di macinazione circolare. Ripetere le fasi di congelamento e macinazione altre due volte in modo che i campioni vengano macinati per un totale di tre volte. In genere, tre cicli consecutivi di macinazione ridurranno i campioni in polvere con una consistenza simile alla farina.

Trasferire la polvere in fiale di vetro o in provette da microcentrifuga da 1,5 ml. Avviare l'elaborazione a valle immediatamente dopo la macinazione o conservare i campioni a 80 gradi Celsius fino a quando i campioni non sono pronti per l'estrazione. Assemblare standard autentici per gli SCCA di interesse per creare soluzioni standard esterne e interne da utilizzare nella determinazione delle concentrazioni di SCCA.

Per i campioni di caffè, includere l'acido citrico, malico, acetico e lattico come acidi di interesse e l'acido adipico come standard interno. Creare una soluzione madre da 10 milligrammi per millilitro aggiungendo 100 milligrammi di standard a un matraccio tarato da 10 millilitri. Riempire il matraccio tarato fino alla linea da 10 millilitri con acqua ultra pura per sciogliere l'acido.

Trasferire ogni soluzione madre in una provetta di vetro pulita da 15 millilitri, con un tappo rivestito in politetrafluoroetilene, e sigillare con un film di paraffina di plastica. Le soluzioni madre possono essere conservate in provette sigillate a quattro gradi Celsius per una settimana. Preparare 50 millilitri della soluzione di estrazione SCCA diluendo la soluzione madre standard interna a 0,05 milligrammi per millilitro in acqua ultra pura.

A tale scopo, aggiungere 250 microlitri della soluzione madre standard interna a 49,75 millilitri di acqua. Successivamente, preparare campioni di curve standard per gli SCCA di interesse. Utilizzare un minimo di almeno cinque punti con concentrazioni nell'intervallo di risposta lineare che comprendano le concentrazioni di SCCA previste nei campioni.

Diluire ogni SCCA alla concentrazione determinata in nuove provette per microcentrifuga utilizzando acqua ultra pura fino a un volume di un millilitro. Assicurarsi che ogni punto di concentrazione contenga tutti e quattro gli standard di acidità e lo standard interno alla concentrazione corretta. Prelevare i campioni da estrarre dal deposito e posizionarli sul ghiaccio.

Pesare 100 milligrammi di campione per l'estrazione SCCA. Misurare una quantità di campione il più vicino possibile alla massa target, per ridurre la variabilità. Dopo aver pesato ciascun campione, trasferire il tessuto in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 millilitri.

Tieni traccia della massa di ciascun campione misurato, poiché le quantità di SCCA rilevate verranno normalizzate utilizzando la massa del campione. Dopo aver pesato tutti i campioni, aggiungere un millilitro di soluzione di exaction a ciascuna delle provette del campione. Mantenere lo stesso rapporto tra soluzione di estrazione e massa tissutale in tutte le estrazioni.

Mescolate bene agitando per 10 secondi. Lasciare riposare i campioni a temperatura ambiente per un'ora. Durante quest'ora, mescolare ogni tubo ogni 15 minuti agitando per 10 secondi.

Dopo un'ora di estrazione, mescolare i campioni un'ultima volta e trasferire le provette in una microcentrifuga. Centrifugare i campioni a quattro gradi Celsius, 10.000 volte G per 10 minuti, per far precipitare il materiale solido. Per filtrare i campioni, preparare filtri a disco montati sulla siringa, assicurandosi che ogni filtro sia collegato correttamente alla siringa.

Preparare una siringa dotata di filtro a disco per ogni campione da analizzare, compresi i campioni con curva standard. Filtrare i surnatanti direttamente in una provetta da microcentrifuga pulita. Dopo il filtraggio, chiudere il tubo contenente il filtrato e gettare l'apparecchio filtrante della siringa.

Trasferire un millilitro di campione in ciascuna fiala di elettroforesi capillare, o fiala CE, facendo attenzione a evitare schizzi di campione nel collo della fiala. Dopo aver trasferito il campione, posizionare un tappo CE su ciascuna fiala. Impostare l'esecuzione del rilevamento SCCA come descritto nel protocollo di testo.

Caricare le fiale contenenti i punti di curva standard e le fiale contenenti i campioni da analizzare nel vassoio di ingresso, come descritto nelle istruzioni del produttore. Annotare la posizione di ciascuna fiala per la programmazione dell'autocampionatore. Dopo il condizionamento come descritto nel protocollo di testo, avviare la separazione del campione aprendo il menu Controllo nel software e selezionando Esegui sequenza.

Monitorare l'array di fotodiodi, o vassoi PDA, per garantire una separazione corretta. Osservare la prima traccia e assicurarsi che abbia una linea di base piatta e risolvere in modo pulito i singoli picchi acidi. Per integrare i picchi di campionamento, aprire il primo file e impostare i passaggi di integrazione automatica in modo da escludere i primi tre minuti della corsa.

Nello stesso menu, impostare i criteri di selezione dei picchi su un'ampiezza minima del picco di 50 unità e un'area del picco di 100 unità, per fornire un livello di selettività moderatamente elevato, separando i picchi acidi dal rumore di fondo nella traccia. Eseguire l'analisi dei dati come descritto nel protocollo di testo. Di seguito è riportato un confronto tra le tracce del PDA che evidenziano un campione sovraccarico.

Con l'aumentare della concentrazione dell'analita, la geometria dei singoli picchi può iniziare a diventare asimmetrica. A 0,05 milligrammi per millilitro, l'acido acetico presenta un picco bilateralmente simmetrico ben definito. Quando la concentrazione di acido acetico aumenta a 0,07 o 0,10 milligrammi per millilitro, il picco diventa asimmetrico e si forma una coda di picco.

Questo code di picco è una buona indicazione che il campione è sovraccarico. Qui sono mostrate tracce di PDA di esempio che mostrano acidi organici in campioni di caffè verde. I campioni di caffè verde sono stati diluiti 1:10 prima di essere caricati in fiale CE.

Gli acidi di interesse includono l'acido acetico, l'acido citrico, l'acido lattico, l'acido malico e lo standard interno, l'acido adipico. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di macinare i campioni fino a ottenere una consistenza uniforme e di pipettare i campioni con cura, per massimizzare la riproducibilità e ridurre al minimo l'errore sperimentale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare gli acidi organici da campioni di piante utilizzando l'elettroforesi capillare, o CE. Dovresti essere in grado di macinare campioni di piante, estrarre acidi organici e preparare estratti vegetali per l'analisi CE a valle.