Usando elettroforesi capillare per quantificare Acidi organici da tessuti vegetali: un banco di prova d'esame

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare i livelli di acidi organici presenti nei tessuti vegetali. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande in ambito di biochimica e fisiologia vegetale, come l'impatto di stimoli ambientali sulla crescita radicale, lo sviluppo delle colture e la qualità di alimenti e bevande. I principali vantaggi di questo metodo sono la preparazione minima del campione, l'elevata capacità di analisi e il fatto che l'elettroforesi capillare è più economica della spettrometria di massa.

Sebbene questo metodo venga utilizzato per chiarire le risposte fisiologiche delle piante, può essere applicato anche alla scienza e alla qualità degli alimenti, dove gli acidi organici influenzano in modo critico sapore, sicurezza e stabilità. Per iniziare, preparare i campioni per l'estrazione di acidi carbossilici a catena corta, o SCCA. Preparare un grammo di seme di caffè alla volta per assicurare che rimanga una quantità sufficiente di campione dopo l'elaborazione.

Per ottenere una dimensione uniforme delle particelle e massimizzare l'efficienza di estrazione di SCCA, raffreddare preliminarmente un mortaio e un pestello con azoto liquido. Aggiungere il campione a un piccolo volume di azoto liquido nel mortaio. Utilizzando una paletta, aggiungere azoto liquido sufficiente nel mortaio per immergere completamente il campione.

Aggiungere campioni difficili da macinare, come semi di caffè crudi, all'azoto liquido. Lasciarli congelare per 10-30 secondi prima della macinazione. Spezzare il tessuto in frammenti più piccoli utilizzando un movimento verticale di schiacciamento.

Quindi, completare la macinazione del tessuto utilizzando un movimento circolare. Ripetere i passaggi di congelamento e macinazione altre due volte, in modo che i campioni vengano macinati un totale di tre volte. In genere, tre cicli successivi di macinazione ridurranno i campioni a una polvere con una consistenza simile a quella della farina.

Trasferire la polvere in vial di vetro o in provette microcentrifuga da 1,5 ml. Avviare immediatamente la lavorazione successiva alla macinazione oppure conservare i campioni a 80 gradi Celsius fino al momento dell'estrazione. Assemblare standard autentici per gli SCCA di interesse al fine di creare soluzioni di standard esterno e interno da utilizzare per la determinazione delle concentrazioni di SCCA.

Per i campioni di caffè, includere acido citrico, malico, acetico e lattico come acidi di interesse, e acido adipico come standard interno. Preparare una soluzione madre di 10 milligrammi per millilitro aggiungendo 100 milligrammi di standard a un matraccio tarato da 10 millilitri. Riempire il matraccio tarato fino alla linea dei 10 millilitri con acqua ultrapura per sciogliere l'acido.

Trasferire ogni soluzione madre in un tubo di vetro pulito da 15 millilitri, con tappo rivestito in politetrafluoroetilene, e sigillare con pellicola di paraffina plastica. Le soluzioni madri possono essere conservate in tubi sigillati a quattro gradi Celsius per una settimana. Preparare 50 millilitri della soluzione di estrazione SCCA diluendo la soluzione madre dello standard interno a 0,05 milligrammi per millilitro in acqua ultrapura.

Eseguire questa operazione aggiungendo 250 microlitri della soluzione madre dello standard interno a 49,75 millilitri di acqua. Successivamente, preparare i campioni per la curva standard per gli SCCA di interesse. Utilizzare un minimo di almeno cinque punti con concentrazioni comprese nell'intervallo di risposta lineare che coprano le concentrazioni attese di SCCA nei campioni.

Diluire ogni SCCA alla concentrazione determinata in nuovi tubi da microcentrifuga utilizzando acqua ultrapura fino a un volume di un millilitro. Assicurarsi che ogni punto di concentrazione contenga tutti e quattro gli standard acidi e lo standard interno alla concentrazione corretta. Rimuovere i campioni da estrarre dallo stoccaggio e posizionarli sul ghiaccio.

Pesare 100 milligrammi di campione per l'estrazione SCCA. Misurare una quantità di campione il più vicina possibile alla massa target, per ridurre la variabilità. Dopo aver pesato ciascun campione, trasferire il tessuto in una provetta microcentrifuga pulita da 1,5 millilitri.

Tenere traccia della massa di ciascun campione misurato, poiché le quantità di SCCA rilevate verranno normalizzate utilizzando la massa del campione. Dopo aver pesato tutti i campioni, aggiungere un millilitro di soluzione di estrazione a ciascun tubo campione. Mantenere costante il rapporto tra la soluzione di estrazione e la massa del tessuto in tutte le estrazioni.

Mescolare accuratamente mediante vortex per 10 secondi. Lasciare i campioni a temperatura ambiente per un'ora. Durante quest'ora, mescolare ogni provetta ogni 15 minuti mediante vortex per 10 secondi.

Dopo un'ora di estrazione, mescolare i campioni un'ultima volta e trasferire le provette in una microcentrifuga. Centrifugare i campioni a quattro gradi Celsius, 10.000 ×g per 10 minuti, per far precipitare il materiale solido. Per filtrare i campioni, preparare filtri a disco montati su siringa, assicurandosi che ciascun filtro sia correttamente fissato alla siringa.

Preparare una siringa dotata di un filtro a disco per ogni campione da analizzare, inclusi i campioni della curva standard. Filtrare i soprannatanti direttamente in una provetta microcentrifuga pulita. Dopo il filtraggio, chiudere la provetta contenente il filtrato e scartare il dispositivo di filtraggio con siringa e filtro.

Trasferire un millilitro di campione in ciascun vial per elettroforesi capillare, o CE, avendo cura di evitare che il campione schizzi nel collo del vial. Dopo il trasferimento del campione, posizionare un tappo CE su ciascun vial. Impostare la corsa di rilevamento SCCA come descritto nel protocollo testuale.

Caricare le provette contenenti i punti della curva standard e le provette contenenti i campioni da analizzare nel vassoio del campionatore in ingresso, come descritto nelle istruzioni del produttore. Annotare la posizione di ogni provetta per la programmazione dell'auto-campionatore. Dopo il condizionamento descritto nel protocollo testuale, avviare la separazione dei campioni aprendo il menu Controllo nel software e selezionando Esegui Sequenza.

Monitorare l'array di fotodiodi, o i vassoi PDA, per garantire una corretta separazione. Osservare il primo tracciato e assicurarsi che presenti una linea di base piatta e che risolva chiaramente i singoli picchi degli acidi. Per integrare i picchi del campione, aprire il primo file e impostare i passaggi di integrazione automatica in modo da escludere i primi tre minuti della corsa.

Nello stesso menu, impostare i criteri di selezione dei picchi su una larghezza minima del picco di 50 unità e un'area del picco di 100 unità, al fine di ottenere un livello moderatamente elevato di selettività, separando i picchi acidi dal rumore di fondo nel tracciato. Eseguire l'analisi dei dati come descritto nel protocollo testuale. Qui mostrato, vi è un confronto tra tracciati PDA che evidenziano un campione sovraccarico.

All'aumentare della concentrazione dell'analita, la geometria dei singoli picchi può iniziare a diventare asimmetrica. A 0,05 milligrammi per millilitro, l'acido acetico presenta un picco ben definito e bilateralmente simmetrico. All'aumentare della concentrazione di acido acetico a 0,07 o 0,10 milligrammi per millilitro, il picco diventa asimmetrico e si forma una coda del picco.

Questo allargamento della coda del picco è un buon indicatore del sovraccarico del campione. Qui vengono mostrati esempi di tracce PDA che evidenziano acidi organici in campioni di caffè verde. I campioni di caffè verde sono stati diluiti 1:10 prima di essere caricati nei vial per CE.

Gli acidi di interesse includono l'acido acetico, l'acido citrico, l'acido lattico, l'acido malico e il campione interno, l'acido adipico. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di macinare i campioni fino a ottenere una consistenza uniforme e di pipettare con attenzione i campioni, al fine di massimizzare la riproducibilità e ridurre al minimo l'errore sperimentale. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come quantificare gli acidi organici da campioni vegetali utilizzando l'elettroforesi capillare, o CE. Si dovrebbe essere in grado di macinare campioni vegetali, estrarre acidi organici e preparare estratti vegetali per analisi successive mediante CE.