Modellazione di morte neuronale e degenerazione in neuroni cerebellari del granello primario del Mouse

Questo protocollo descrive un metodo semplice per isolare e neuroni di granulo cerebrale primario del mouse (CGNs) da cuccioli di 6-7 giorno vecchio, trasduzione efficiente di CGNs per la perdita e guadagno di funzione studia, la coltura e la modellazione eccitotossicità neuronale indotta da NMDA, basso-potassio-indotta delle cellule morte, danni al DNA e stress ossidativo utilizzando lo stesso modello di cultura.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre popolazioni pure sane di neuroni granulari cerebellari e di manipolarli geneticamente e modellare diversi meccanismi di danno neuronale nella coltura primaria in vitro. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle lesioni neuronali. Utilizziamo questo protocollo per studiare i meccanismi molecolari sottostanti alle lesioni neurali a seguito di danni cerebrali acuti e malattie neurogenerative.

Il vantaggio principale di questo protocollo è che possiamo modellare diversi meccanismi di morte cellulare come l'eccitotossicità, lo stress ossidativo, il danno al DNA e l'evento di sviluppo utilizzando il sistema di coltura. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul danno neuronale, può anche essere utilizzato con i neuroni cerebellari del ratto per studiare l'attività neuronale e la morfogenesi in risposta a fattori di crescita ed eventi collaterali. Per estrarre il cervello di un topo di sei o sette giorni, usa un paio di pinze per afferrare una testa e, con le forbici per micro-dissezione, taglia la pelle anteriormente verso la testa.

Spingi indietro la pelle per rivelare il teschio. Successivamente, penetra nel cranio con la punta delle forbici e taglia anteriormente e lateralmente. Facendo attenzione a non danneggiare il cervelletto e facilitare l'identificazione e la rimozione delle meningi, utilizzare una pinza per staccare il cranio esponendo il cervello.

Con un paio di pinze o spatola, estrai delicatamente il cervello in una soluzione di dissezione fredda. Per isolare il cervelletto, posizionare il cervello nella soluzione di dissezione integrata con solfato di magnesio e mantenere la soluzione e il cervello in ghiaccio. Sotto il microscopio di dissezione, rimuovere le meningi utilizzando una pinza fine, quindi sezionare il cervelletto dal cervello in una soluzione di dissezione integrata con solfato di magnesio.

Questo aiuta a staccare le meningi rimanenti e permette di andare tra gli strati per pulire le pieghe cerebellari. La presenza di meningi è che la coltura neuronale provoca cellule malsane e l'eventuale morte cellulare. Pertanto, è importante garantire la completa rimozione delle meningi prima di procedere con la coltura.

Successivamente, gira il cervelletto sul lato ventrale e assicurati la rimozione del plesso coroideo. Quindi, tirare il cervelletto in un piatto da 35 millimetri contenente un millilitro di soluzione di dissezione integrata con solfato di magnesio. Tagliare i tessuti in piccoli pezzi e trasferirli in una provetta da 50 millilitri contenente 30 millilitri di soluzione di dissezione tamponata con solfato di magnesio.

In questa fase, centrifugare la provetta da 15 millilitri contenente il tessuto cerebrale tritato per cinque minuti a 644 volte g e quattro gradi Celsius. Successivamente, rimuovere il surnatante e aggiungere 10 millilitri di soluzione di dissezione di tripsina. Quindi agitare il tavolo ad alta velocità per 15 minuti a 37 gradi Celsius.

Aggiungere due millilitri di soluzione di inibitore della tripsina uno al tubo e agitare delicatamente per due minuti. Successivamente, centrifugare la provetta per cinque minuti a 644 volte g e quattro gradi Celsius. Dopo cinque minuti, rimuovere il surnatante e aggiungere due millilitri di soluzione di inibitori della tripsina prima di trasferirla in una provetta da 15 millilitri.

Quindi triturare il tessuto nella provetta da 15 millilitri fino a quando la soluzione diventa torbida. Lasciate riposare per cinque minuti. Quindi rimuovere il surnatante limpido e trasferirlo in una nuova provetta contenente un millilitro di soluzione di dissezione integrata con cloruro di calcio.

Aggiungere altri due millilitri di soluzione di inibitore della tripsina due sul fondo del tubo contenente il pellet. Trituratela nuovamente e lasciatela riposare per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e aggiungerlo al tubo contenente il surnatante del passaggio precedente.

Ripetere questo processo fino a quando la maggior parte del tessuto non è dissociata meccanicamente. Aggiungere 0,3 millilitri di soluzione di dissezione integrata con cloruro di calcio alla raccolta del surnatante per ogni millilitro di surnatante. Mescolare il contenuto della provetta e poi centrifugare per cinque minuti a 644 volte G a temperatura ambiente.

Successivamente, rimuovere il surnatante. Aggiungere 10 millilitri di terreno fresco al pellet e mescolare. Quindi contare le cellule vive e diluirle a una concentrazione di 1,5 volte 10 per sei cellule per millilitro.

Placcare le celle sulle piastre di poli-D-lisina precedentemente preparate. Per piastre a quattro pozzetti, piastra 0,5 millimetri del campione fornendo 7,5 volte 10 alla quinta cella per pozzetto. Per piastre da 35 millimetri, impiattare quattro millilitri di campione, somministrando sei volte 10 alla sesta cellula per piastra.

Per i vetrini di copertura, piastra da 0,5 millilitri somministrando 7,5 volte 10 alla quinta cella per pozzetto. Dopo 24 ore, aggiungere AraC alle piastre per ridurre la contaminazione gliale. Se le cellule devono essere mantenute per sette-otto giorni, ripetere questo trattamento il terzo giorno e mantenere le colture in un incubatore al 5% di CO2 a 37 gradi Celsius.

Per le colture mantenute più di cinque giorni, alimentare la coltura con glucosio ogni due giorni a partire dal quinto giorno. Per indurre eccitotossicità neuronale con NMDA, dopo sette giorni in vitro, trattare i neuroni dei granuli cerebellari con 100 NMDA micromolare e 10 glicina micromolare per un'ora. Quindi, sostituire il terreno con un terreno condizionato proveniente dalle colture parallele senza trattamento.

Questa concentrazione provoca il 50% di morte cellulare a 24 ore dal trattamento. Per la morte cellulare indotta dai ROS, trattare i neuroni con perossido di idrogeno a 75-100 micromolari per cinque minuti. Dopo cinque minuti, passare ai supporti condizionati da impostazioni cultura parallele.

A causa dell'instabilità del perossido di idrogeno, la concentrazione deve essere ottimizzata a un livello che induca tra il 50 e il 70% di morte cellulare dopo 24 ore. Questa concentrazione è solitamente compresa tra 75 e 100 micromolari. Per indurre la morte cellulare per danno al DNA, trattare i neuroni dei granuli cerebellari con 10 micromolari di camptotecina per indurre oltre il 50% di morte cellulare entro 24 ore.

Per l'apoptosi neuronale indotta da basso potassio nei neuroni dei granuli cerebellari, cambiare il terreno contenente 25 millimolari di potassio in un mezzo a basso contenuto di potassio con cinque millimolari di potassio dopo sette giorni in vitro. I neuroni sono stati trasdotti con lentivirus per RFP a MOI di tre al momento della placcatura. Fissato e colorato a sette giorni in vitro.

La co-localizzazione del segnale RFP MAP2 e di Hoechst ha dimostrato che i neuroni sani sono completamente trasdotti dai lentivirus. Le immagini mostrate qui rappresentano analisi di test vivi-morti di neuroni infettati con diversi MOI di adenovirus per misurare la tossicità. I neuroni dei granuli cerebellari infettati con adenovirus che esprimono LacZ con un MOI compreso tra 25 e 50 consentono la massima efficienza mantenendo una tossicità minima.

Quando si infetta a questo MOI, si osserva una differenza inferiore all'1% nella sopravvivenza cellulare rispetto al controllo. Queste figure mostrano la colorazione di Hoechst dei neuroni dei granuli cerebellari di controllo e dei neuroni dei granuli cerebellari trattati con NMDA per indurre la morte cellulare. Si noti la formazione di nuclei picnotici con trattamento NMDA.

Questo è un segno di morte cellulare e può essere osservato in circa il 50% della coltura 24 ore dopo il trattamento con 100 NMDA micromolari e 10 glicina micromolare. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore e mezza con sei schiocchi del mouse, se eseguita correttamente. Quando si esegue questa tecnica, è importante utilizzare la tecnica asettica e gli strumenti chirurgici concatenati secondo necessità per ridurre al minimo il rischio di contaminazione della coltura.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per studiare lo sviluppo neuronale e il danno neuronale nei neuroni primari di topo. Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di coltivare neuroni granulari cerebellari, manipolarli geneticamente usando virus e indurre vari meccanismi di danno neurale. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'immunofluorescenza o i saggi di vitalità cellulare per rispondere a domande come se un gene di interesse migliora la sopravvivenza cellulare in risposta all'eccitotossicità, allo stress ossidativo o al danno al DNA.