Modellazione di morte neuronale e degenerazione in neuroni cerebellari del granello primario del Mouse

L'obiettivo generale di questo procedimento è produrre popolazioni pure e sane di neuroni granulari cerebellari, manipolarli geneticamente e modellare diversi meccanismi di danno neuronale nella coltura primaria in vitro. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del danno neuronale. Utilizziamo questo protocollo per indagare i meccanismi molecolari alla base delle lesioni neurali conseguenti a danni cerebrali acuti e a malattie neurodegenerative.

Il principale vantaggio di questo protocollo è che possiamo modellare diversi meccanismi di morte cellulare, come l'eccitotossicità, lo stress ossidativo, i danni al DNA e gli eventi di sviluppo, utilizzando il sistema di coltura. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui danni neuronali, può essere utilizzato anche con neuroni cerebellari di ratto per studiare l'attività neuronale e la morfogenesi in risposta a fattori di crescita ed eventi collaterali. Per estrarre il cervello di un topo di sei o sette giorni di età, utilizzare una pinzetta per afferrare la testa e, con forbici da microdissezione, tagliare la pelle anteriormente verso la testa.

Ripiegare la pelle per esporre il cranio. Successivamente, penetrare il cranio con la punta delle forbici e tagliare in direzione anteriore e laterale. Facendo attenzione a non danneggiare il cervelletto e per facilitare l'identificazione e la rimozione delle meningi, utilizzare la pinzetta per sollevare il cranio ed esporre il cervello.

Con una pinzetta o una spatola, estrarre delicatamente il cervello nella soluzione di dissezione fredda. Per isolare il cervelletto, posizionare il cervello nella soluzione di dissezione supplementata con solfato di magnesio e mantenere la soluzione e il cervello sul ghiaccio. Sotto il microscopio di dissezione, rimuovere le meningi utilizzando pinzette fini, quindi dissezionare il cervelletto dal cervello in soluzione di dissezione arricchita con solfato di magnesio.

Questo facilita lo staccamento delle meningi residue e consente di intervenire tra i vari strati per pulire le pieghe del cervelletto. La presenza di meningi nelle colture neuronali provoca cellule non vitali e, alla fine, morte cellulare. Per tale motivo, è fondamentale assicurarsi della completa rimozione delle meningi prima di procedere con la coltura.

Successivamente, ruotare il cervelletto sul lato ventrale ed assicurarsi della rimozione del plesso coroideo. Poi, trasferire i cervelletti in una piastra da 35 millimetri contenente un millilitro di soluzione di dissezione integrata con solfato di magnesio. Triturare i tessuti in piccoli pezzi e trasferirli in un tubo da 50 millilitri contenente 30 millilitri di soluzione di dissezione tampone con solfato di magnesio.

In questo passaggio, centrifugare il tubo da 15 millilitri contenente il tessuto cerebrale tritato per cinque minuti a 644 ×g e a quattro gradi Celsius. Successivamente, rimuovere il soprannatante e aggiungere 10 millilitri di soluzione di dissezione con tripsina. Quindi, agitare il tavolo a velocità elevata per 15 minuti a 37 gradi Celsius.

Aggiungere due millilitri di soluzione di inibitore della tripsina uno al tubo e agitare delicatamente per due minuti. Successivamente, centrifugare il tubo per cinque minuti a 644 ×g e a quattro gradi Celsius. Dopo cinque minuti, rimuovere il soprannatante e aggiungere due millilitri di soluzione di inibitori della tripsina due prima di trasferirlo in un tubo da 15 millilitri.

Quindi tritare il tessuto nel tubo da 15 millilitri fino a quando la soluzione diventa torbida. Lasciare sedimentare per cinque minuti. Successivamente, rimuovere il soprannatante limpido e trasferirlo in un nuovo tubo contenente un millilitro di soluzione di dissezione supplementata con cloruro di calcio.

Aggiungere altri due millilitri di soluzione di inibitore della tripsina 2 alla base del tubo contenente il pellet. Eseguire nuovamente la trituration e lasciare sedimentare per cinque minuti. Rimuovere il soprannatante e aggiungerlo al tubo contenente il soprannatante del passaggio precedente.

Ripetere questo processo fino a quando la maggior parte del tessuto è stata dissociata meccanicamente. Aggiungere 0,3 millilitri di soluzione di dissezione supplementata con cloruro di calcio per ogni millilitro di sopranatante raccolto. Mescolare il contenuto del tubo e quindi centrifugare per cinque minuti a 644 ×g a temperatura ambiente.

In seguito, rimuovere il soprannatante. Aggiungere 10 millilitri di mezzo fresco al pellet e mescolare. Quindi contare le cellule vitali e diluirle fino a una concentrazione di 1,5 × 10⁶ cellule per millilitro.

Piastrare le cellule su piastre in poli-D-lisina precedentemente preparate. Per piastre a quattro pozzetti, piastrare 0,5 millilitri del campione, ottenendo 7,5 × 10⁵ cellule per pozzetto. Per piatti da 35 millimetri, piastrare 4 millilitri del campione, ottenendo 6 × 10⁶ cellule per piastra.

Per le coprioggetti, piastrare 0,5 millilitri contenenti 7,5 × 10⁵ cellule per pozzetto. Dopo 24 ore, aggiungere AraC alle piastre per ridurre la contaminazione da cellule gliali. Se le cellule devono essere mantenute per sette-otto giorni, ripetere questo trattamento al terzo giorno e mantenere le colture in un incubatore con 5% CO₂ a 37 gradi Celsius.

Per le colture mantenute per più di cinque giorni, aggiungere glucosio alla coltura ogni due giorni a partire dal giorno cinque. Per indurre l'eccitotossicità neuronale con NMDA, dopo sette giorni in vitro, trattare i neuroni granulari cerebellari con 100 micromolar di NMDA e 10 micromolar di glicina per un'ora. Successivamente, sostituire il mezzo con mezzo condizionato proveniente da colture parallele non trattate.

Questa concentrazione provoca la morte del 50% delle cellule a 24 ore dal trattamento. Per indurre la morte cellulare mediante specie reattive dell'ossigeno (ROS), trattare i neuroni con perossido di idrogeno a una concentrazione compresa tra 75 e 100 micromolari per cinque minuti. Trascorsi cinque minuti, sostituire con il mezzo condizionato proveniente da colture parallele.

A causa dell'instabilità del perossido di idrogeno, la concentrazione deve essere ottimizzata a un livello che induca una morte cellulare compresa tra il 50 e il 70% dopo 24 ore. Questa concentrazione è solitamente compresa tra 75 e 100 micromolari. Per indurre la morte cellulare mediante danni al DNA, trattare i neuroni granulari cerebellari con 10 micromolari di camptotecina per indurre oltre il 50% di morte cellulare entro 24 ore.

Per indurre l'apoptosi neuronale mediata da bassa concentrazione di potassio nei neuroni granulari del cervelletto, dopo sette giorni in coltura, sostituire il mezzo contenente 25 millimoli di potassio con un mezzo a basso contenuto di potassio (5 millimoli). I neuroni sono stati trasdotti con lentivirus per RFP a un MOI di tre al momento della semina. Fissati e colorati dopo sette giorni in coltura.

La co-localizzazione del segnale RFP con MAP2 e Hoechst è mostrata per dimostrare neuroni sani completamente trasdotti da lentivirus. Le immagini qui presentate rappresentano analisi dell'assay vitale/morto di neuroni infettati con diversi MOI di adenovirus per misurare la tossicità. Neuroni granulari del cervelletto infettati con adenovirus che esprimono LacZ a un MOI compreso tra 25 e 50 consentono un'efficienza massima mantenendo una tossicità minima.

Viene osservata una differenza inferiore all'1% nella sopravvivenza cellulare rispetto al controllo quando l'infezione avviene a questo MOI. Queste immagini mostrano la colorazione con Hoechst di neuroni granulari del cervelletto di controllo e di neuroni granulari del cervelletto trattati con NMDA per indurre la morte cellulare. Si noti la formazione di nuclei piroptotici dopo il trattamento con NMDA.

Questo è un indicatore della morte cellulare e può essere osservato in circa il 50% della coltura a 24 ore dal trattamento con 100 micromolari di NMDA e 10 micromolari di glicina. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in due ore e mezza con sei topi, se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione di questa tecnica, è importante utilizzare una tecnica asettica e strumenti chirurgici in catena, come richiesto, al fine di minimizzare il rischio di contaminazione della coltura.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per studiare lo sviluppo neuronale e il danno neuronale nei neuroni primari di topo. Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di coltivare neuroni granulari del cervelletto, manipolarli geneticamente utilizzando virus e indurre diversi meccanismi di danno neuronale. A seguito di questa procedura, altri metodi come l'immunofluorescenza o saggi di vitalità cellulare possono essere eseguiti per rispondere a domande come se un gene di interesse migliori la sopravvivenza cellulare in risposta a eccitotossicità, stress ossidativo o danno al DNA.