利用小鼠脑肿瘤球的原发染色质沉淀

该程序的总体目标是鉴定特定基因组位置中组蛋白标记物的富集。这种方法可以帮助回答表观遗传学领域的关键问题，例如改变组蛋白修饰的表观遗传调节因子突变如何影响肿瘤细胞转录组。这种技术的主要优点是细胞没有交联，因此它们处于更自然的状态，这有助于抗体特异性。

首先在 10 厘米培养皿中解剖小鼠大脑中实验诱导的肿瘤。如果肿瘤表达荧光蛋白，则通过设置为 0.3 倍放大倍率的适当荧光通道的荧光解剖显微镜观察肿瘤。使用手术刀和镊子将肿瘤组织与正常大脑分离，并在培养皿中将肿瘤切成小块。

将解剖的肿瘤转移到装有 300 μL NSC 培养基的 1.5 mL管中，并使用一次性注射器轻轻匀浆肿瘤。然后，加入 1 mL 细胞分离培养基，并在 37 摄氏度下孵育样品 5 分钟。孵育后，将细胞悬液通过 70 微米细胞过滤器放入 50 毫升离心管中。

然后，用 25 ml NSC 培养基洗涤过滤器，并在室温下以 300 倍 G 离心悬浮液 5 分钟。倾析上清液后，将沉淀重悬于 6 mL NSC 培养基中，并将肿瘤细胞悬液转移到 T25 培养瓶中。在 37 摄氏度下在 95% 空气和 5% 二氧化碳气氛的组织培养箱中培养细胞，直到形成神经球。

收获神经球后，以 300 倍 G 离心离心 10 次，以每次氨基沉淀向 6 个神经球细胞离心 5 分钟。离心后，倒出上清液，并将神经球沉淀重悬于一毫升平衡盐溶液中。将悬浮液转移到低蛋白结合的 1.5 ml 微量离心管中，然后像以前一样离心。

接下来，倒出上清液，将细胞沉淀重悬于 95 μL 消化缓冲液中，每 1 次 10 个 6 个细胞中补充 1 至 100 个蛋白酶抑制剂混合物。立即上下移液细胞，以防止结块并避免产生任何气泡。然后，将 5 μL 0.1X 微球菌核酸酶与 145 μL 消化缓冲液混合，并向 6 个细胞中每 1 乘以 10 加入 5 μL 稀释的微球菌核酸酶。

轻弹试管混合，然后将试管放入 37 摄氏度的加热块中整整 12 分钟。微球菌核酸酶消化成染色质片段是最关键的步骤。适当的染色质片段化对于实现 ChIP 的高分辨率非常重要。

为确保步骤成功，请一次孵育多个样品，以确保不会发生过度消化。12 分钟后，向 6 个细胞中加入 10 μL 10X 微球菌酶终止缓冲液，每 1 次 10 次。从此时起，样品必须保存在冰上。

微球菌核酸酶消化样品的生物分析仪分析表明，大部分 DNA 已片段化为单核小体、双核小体和三核小体。接下来，向 6 个细胞中加入 110 μL 2X ripa 缓冲液，并添加 1 至 100 份蛋白酶抑制剂混合物。轻弹试管混合，然后在 4 摄氏度下以 1700 倍 G 离心 15 分钟，将含有染色质的上清液转移到普通的 1.5 毫升微量离心管中，并置于冰上。

使用补充有 1 至 1000 蛋白酶抑制剂的 ripa 缓冲液稀释染色质，使每个 IP 的体积为 100 至 200 微升。然后，取出相当于 ChIP 体积 10% 的等分试样作为输入样品。通过添加 100 微升补充有蛋白酶 K 的 TE 缓冲液来制备输入，并在 55 摄氏度下孵育 1 小时。

用 PCR 纯化试剂盒纯化输入后，使用微量分光光度计测量输入的浓度。将结果记录在笔记本中。每个 IP 添加 10 微升洗涤的蛋白 A 和 G 磁珠，将对每个样品进行，并在 4 摄氏度下孵育 1 小时，并以 20 RPM 的速度旋转。

将样品放在磁性支架上，让磁珠分离，然后将所需体积转移到新的 1.5 mL 试管中。将所需的抗体添加到每个试管中，然后用塑料石蜡膜包裹瓶盖以避免蒸发。将样品在 4 摄氏度下孵育过夜，并像以前一样旋转。

第二天，将试管以 2000 倍 G 离心 10 秒，然后向每个 IP 中加入 10 微升珠子，并在 4 摄氏度下孵育 3 小时，并以 20 RPM 的速度旋转。然后，将样品放在磁力架上，让磁珠分离。使用移液管去除上清液，然后向每个 IP 中加入 150 μL 含蛋白酶抑制剂的 ripa 缓冲液，并在 4 摄氏度下以 20 RPM 孵育 5 分钟。

孵育期后，将样品放在磁力架上，让磁珠分离。使用移液管去除上清液，然后向每个 IP 中加入 150 微升补充有低浓度蛋白酶抑制剂的氯化锂缓冲液，并在 4 摄氏度下孵育，以 20 RPM 旋转 5 分钟。孵育期后，将样品放在磁力架上，让磁珠分离，然后用移液管去除上清液。

然后，向微珠中加入 150 μL 不含蛋白酶抑制剂的冷 TE，并在 4 摄氏度下以 20 RPM 旋转孵育 5 分钟。在最后的洗涤步骤后，将样品重悬于 100 μL TE 缓冲液中，补充有 0.5 毫克/毫升的终浓度蛋白酶 K，并在 55 摄氏度下孵育 1 小时。最后，使用 PCR 纯化试剂盒纯化氨基沉淀的 DNA。

然后，为了检查 IP 是否成功，使用靶向阳性和阴性对照区域的引物进行 qPCR。使用 IGG ChIP DNA、组蛋白-3-赖烯-4-三甲基化 ChIP DNA 和组蛋白-3-赖烯-27-苏甲基化 ChIP DNA，使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶引物进行 qPCR。代表性结果表明，Gapdh 是一种看家基因，仅富含与活性转录相关的 H3K4me3 修饰，而不富含与抑制染色质相关的 H3K27me3 修饰。

按照此程序，可以执行其他方法，如 ChIP-C，以识别全基因组组蛋白标记的变化。看完这个视频后，您应该对如何在神经球中进行天然 ChIP 以识别特定基因位点的组蛋白标记有很好的了解。