Allevamento di massa e studi molecolari negli insetti parassiti Tortricidae

Il presente protocollo descrive il metodo di allevamento degli insetti nocivi tortricidi nei laboratori. Le procedure per distinguere il sesso degli insetti ed estrarre gli acidi nucleici per il sequenziamento ad alto rendimento sono stabilite utilizzando due parassiti tortricidi.

Presentiamo masse fondamentali, ma molto richieste per l'allevamento di massa, osservazioni e studi molecolari utilizzando masse Tortrix gravi, per studiare la loro biologia. Finora, la struttura delle uova di insetto ha impedito ulteriori analisi. In particolare, abbiamo permesso lo studio di uova sottili, morbide e fragili coperte da secrezione materna.

Ci sono tecniche semplici che dovrebbero essere applicabili per ulteriori ricerche su tortrix, provando altri insetti e altri taxa. Inizia mettendo una femmina e due maschi in un bicchiere di plastica da 120 millilitri con un pezzo di carta di paraffina per stabilire una linea Matra. Affettare circa 60 grammi di diete artificiali usando una grattugia per l'allevamento di massa.

Metti la massa d'uovo piena di embrioni maturi sulla dieta artificiale affettata in un contenitore di plastica. Metti le carte di paraffina sulla massa d'uovo con le diete a fette. Metti 15 maschi e 10 femmine in una scatola di plastica per l'accoppiamento a 25 gradi Celsius.

Raccogli le uova ogni cinque-sette giorni e ripeti le fasi di allevamento di massa per ogni generazione. Immergere la massa d'uovo in 1000 microlitri di soluzione acquosa di ipoclorito di sodio all'1,2% per 10 minuti o in 1000 microlitri di cinque soluzione acquosa di idrossido di potassio molare per 30 minuti per separare le uova. Lavare le uova separate in 1000 microlitri di PBSt.

Immergere le uova in una miscela peso per volume di 500 microlitri di 100% eptano e 500 microlitri di soluzione PBSt di paraformaldeide al 4%. Mescolare per 10 minuti a 1500 rotazioni al minuto utilizzando un miscelatore a vortice. Immergere le uova in una miscela di 500 microlitri di 100% eptano e 500 microlitri di metanolo al 100%.

Mescolare per 10 minuti a 1500 rotazioni al minuto. Lavare le uova due volte con 1000 microlitri di metanolo al 100% e conservarle a quattro gradi Celsius in metanolo al 100%. Immergere le uova in sequenza in etanolo al 99% 70% e al 50% e PBSt per cinque minuti ciascuno per l'idrofilizzazione.

Lavare le uova con PBSt. Immergere le uova in una soluzione DAPI di microgrammi per millilitro per cinque minuti, quindi lavare le uova con PBS due volte. Immergere le uova in 20 microlitri di soluzione lattica, acetica o CN all'1,25%, per visualizzare l'eterocromatina fino a quando i nuclei non mostrano un colore rosso brillante.

Trasferire le uova colorate usando una pipetta su un vetrino, quindi racchiuderle con un reagente anti-dissolvenza e un vetro di copertura. Estrarre le larve di Ferrate, Amonamagnetama e Adoxophyes honmai dalle masse uovo usando una pinza. Seziona le larve sul vetrino.

Fissare i tessuti con una miscela di uno o tre acido ascetico al 99,7% in metanolo al 100% per cinque minuti. Macchiare quelli con 1,25% di peso in soluzione lattica, ascetica o CN fino a quando i nuclei non sono macchiati. Determinare il sesso di ciascun campione osservando la presenza di eterocromatina per le femmine o l'assenza per i maschi al microscopio.

Per estrarre DNA e RNA da larve di Ferrate determinate per sesso, raggruppare 12 larve di ferrate maschili o femminili determinate per sesso e aggiungere tampone di lisi cellulare o reagenti di estrazione dell'RNA in un tubo da 1,5 millilitri. Le fasi di fissazione, permeabilizzazione e colorazione consentono la visualizzazione dei nuclei con la soluzione DAPI. La colorazione lattica, ascetica o CN usando le larve di Ferrate sezionate ha rivelato che le femmine mostrano eterocromatina come un punto, ma i maschi mancano dell'eterocromatina.

I protocolli modificati che utilizzano una colonna di spin hanno migliorato la qualità dell'RNA producendo da 900 a 1500 nanogrammi di prodotto con un rapporto da 260 a 200 da 1,9 a 2,1 e un rapporto da 260 a 280 da 1,9 a 2,3. Il rapporto di concentrazione dell'RNA per il protocollo modificato era inferiore a 1,2, soddisfacendo i requisiti di qualità per il sequenziamento di prossima generazione. L'integrità dell'RNA estratto dalle larve di Ferrate determinate dal sesso utilizzando il protocollo modificato è stata confermata utilizzando l'elettroforesi a microchip.

Le librerie preparate sono state confermate per produrre letture con punteggio Q 30 elevato. Il nostro messaggio contribuisce agli studi fondamentali sugli insetti e agli strumenti per i parassiti. Inoltre, i nostri protocolli hanno il potenziale per essere utilizzati per valutare l'efficacia dei pesticidi chimici o dei microbi intercellulari durante l'embriogenesi.