Name: Allevamento di massa e studi molecolari negli insetti parassiti Tortricidae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Impara l'allevamento di massa di insetti Tortricidae parassiti per studi molecolari. Questo metodo include la differenziazione del sesso e l'estrazione di acidi nucleici per il sequenziamento ad alto rendimento.

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Gli autori desiderano riconoscere il sostegno della Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Research Fellowships for Young Scientists [Numero di sovvenzione 19J13123 e 21J00895].

1. Raccolta e allevamento di massa degli insetti
<ol><li>Raccogli gli insetti tortricidi dai campi seguendo i riferimenti 8,12 precedentemente pubblicati. NOTA: le larve di H. magnanima e A. honmai sono raccolte da foglie di tè danneggiate (Figura 1A); gli adulti sono attratti utilizzando la luce UV portatile da 4 W (lunghezza d'onda di 365 nm, vedi Tabella dei materiali, Figura 1B).</li>
	<li>Allevare le larve raccolte (Figura 1C, D) individualmente su un pezzo di dieta artificiale in una tazza da 1/2 oz per 2-3 settimane fino all'eclosione adulta (Figura 1E, F). Confermare il sesso delle pupe e degli adulti per tratti morfologici (Figura 1G,I).</li>
	<li>Accoppiare i maschi e le femmine in una scatola di plastica (30 cm x 20 cm x 5 cm) alle masse di uova di ovoposito su una carta di paraffina (Figura 1J-L). Metti una femmina e due maschi in un bicchiere di plastica da 120 ml con un pezzo di carta di paraffina per stabilire una matrilina. NOTA: È importante fare pieghe sulla carta di paraffina. Per H. magnanima, la carta di paraffina deve essere sul fondo del caso. Nel frattempo, per A. honmai, metti un foglio sul soffitto della cassa per raccogliere le uova (Figura 1L) poiché H. magnanima oviposit massa di uova sul lato superiore delle foglie di tè, ma A. honmai depone le uova sul lato inferiore delle foglie8. Le procedure sono state verificate anche in altre specie tortricidi, ed è meglio posizionare documenti su entrambi i lati se l'ecologia e il comportamento delle specie bersaglio non sono chiariti.</li>
	<li>Ritagliare le masse di uova (circa 100-200 uova per massa d'uovo12, Figura 1M) sulla carta di paraffina con le forbici. Metti le uova in una tazza da 1/2 oz con carta scaricata per 5-7 giorni. NOTA: L'embrione maturo presenta una capsula di punti neri (Figura 1N). I periodi di embriogenesi sono attribuiti in modo diverso alle specie totricidi, ma generalmente 5 giorni dopo l'ovodeposizione (dpo) per H. magnanima e 4 dpo per A. honmai a 25 °C con il 60% di umidità relativa, 16 ore di luce / 8 ore di cicli scuri7.</li>
	<li>Conservare le masse di uova che mostrano capsule di testa nera a 4-8 °C per 7 giorni.</li>
	<li>Affettare ~ 60 g di diete artificiali usando una grattugia per l'allevamento di massa. Metti la massa d'uovo piena di embrioni maturi sulla dieta artificiale affettata in un contenitore di plastica (23 cm x 16 cm x 8 cm). Posizionare le carte di paraffina sulla massa d'uovo con le diete a fette (Figura 10). NOTA: al di sotto del 30% l'umidità relativa è considerata troppo secca, mentre oltre il 70% è troppo umida. Creare fori sul coperchio del contenitore di plastica è meglio per consentire una migliore ventilazione. Riempire i fori con il cotone per evitare le fughe di piccole larve.</li>
	<li>Per eliminare i contaminanti superficiali dalle uova, immergere la massa dell'uovo in una soluzione di cloruro di benzalconio al 3% e allo 0,2% per 5 minuti, rispettivamente12. Per sradicare i batteri intestinali o intracellulari, utilizzare una dieta artificiale integrata con 0,05% (p / p) tetraciclina cloridrato o 0,06% (p / p) rifampicina invece di una normale dieta artificiale (vedi Tabella dei materiali). NOTA: questo passaggio è facoltativo. È importante impastare Silk Mate 2S e 0,05% (p / p) tetraciclina cloridrato o 0,06% (p / p) rifampicina equamente per coerenza.</li>
	<li>Raccogliere le pupe dal contenitore di plastica e distinguere il sesso in base alle12 caratteristiche morfologiche (Figura 1G-I). NOTA: Generalmente, i tortricidi presentano 5-6 stelle fino alla pupa12. Le larve di H. magnanima e A. honmai impiegano rispettivamente 3 settimane e 2 settimane dopo la schiusa fino alla pupa.</li>
	<li>Metti 15 maschi e 10 femmine in una scatola di plastica (30 cm x 20 cm x 5 cm, Figura 1K) per l'accoppiamento con 25 °C, 16 L/8 D. Raccogli le uova per 5-7 giorni e ripeti i passaggi 1,4-1,9. per ogni generazione. NOTA: se è necessaria la raccolta di masse di uova appena ovopositate per un'analisi successiva, impostare l'inizio e la fine del periodo buio, ad esempio dalle 9:00 alle 17:00. In questa condizione, H. magnanima e A. honami di solito ovoposito uova dopo 5 h (2 PM).</li>
</ol>2. Separazione delle uova e delle larve di farato dalle masse delle uova per la fissazione, la permeabilizzazione e la colorazione
<ol><li>Immergere la massa dell'uovo in 1.000 μL di soluzione acquosa di ipoclorito di sodio all'1,2% per 10 minuti o in 1.000 μL di soluzione acquosa di idrossido di potassio 5 M per 30 minuti per separare le uova.</li>
	<li>Lavare le uova separate in 1.000 μL di PBSt (137 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 0,05% di poliossietilene (20) sorbitano monolaurato [Tween-20] pH 7,4, vedere Tabella dei materiali) seguendo il rapportoprecedentemente pubblicato 7.</li>
	<li>Immergere le uova in una miscela di 500 μL di eptano al 100% e 500 μL di soluzione di paraformaldeide-PBSt al 4% (p/v). Mescolare per 10 minuti a 1.500 giri / min utilizzando un miscelatore a vortice.</li>
	<li>Immergere le uova in una miscela di 500 μL di 100% eptano e 500 μL di metanolo al 100%. Miscelare per 10 min a 1.500 giri/min.</li>
	<li>Lavare le uova due volte con 1.000 μL di metanolo al 100% e conservare a 4 °C in metanolo al 100% fino a ulteriori esperimenti (Figura 2A). NOTA: Le uova possono essere conservate per almeno 1 anno a 4 °C.</li>
	<li>Immergere le uova in sequenza in etanolo al 99%, 70%, 50% e PBSt per 5 minuti ciascuno per l'idrofilizzazione seguendo il rapporto7 precedentemente pubblicato.</li>
	<li>Lavare le uova con PBSt, immergere le uova in 1 μg/mL di soluzione DAPI per 5 minuti, quindi lavare le uova con 1x PBS due volte. Immergere le uova in 20 μL di soluzione di orceina lattico-acetica all'1,25% (p/p) (vedi Tabella dei materiali)11 per visualizzare l'eterocromatina fino a quando i nuclei non presentano un colore rosso brillante (questo varia da 5-60 min) (Figura 2B,C). NOTA: I periodi di colorazione della orceina lattico-acetica dipendono dalla temperatura e dall'umidità. È meglio verificare la corretta colorazione usando un microscopio con ingrandimento 4x-10x.</li>
	<li>Trasferire le uova colorate usando una pipetta su un vetrino. Racchiudere le uova colorate con un reagente antideflagrante (vedi Tabella dei materiali) e un vetro di copertura7.</li>
	<li>Estrarre le larve di pharate H. magnanima e A. honmai (4-5 giorni dopo l'ovodeposizione (dpo)) dalle masse uovo usando una pinza (Figura 2D). Larve tagliate in due su un vetrino (Figura 2E).</li>
	<li>Fissare eventuali tessuti (ad esempio, ganglio subesofageo, gangli toracici, tubulo malpighiano, ecc.) con una miscela di 1:3 (v/v) 99,7% acido acetico/100% metanolo per 5 minuti. Macchiare quelli con 1,25% (p/p) di soluzione di orceina lattico-acetica11 fino a quando i nuclei non sono macchiati (questo può richiedere 5-60 minuti, a seconda della temperatura e dell'umidità).</li>
	<li>Determinare il sesso di ciascun campione osservando la presenza (femmina) o l'assenza (maschio) di eterocromatina (il cromosoma W, Figura 2F,G) al microscopio. NOTA: Il sesso è determinato visualizzando la cromatina sessuale. Ogni cellula rappresenta la cromatina sessuale come un punto nelle femmine11,12, mentre la restante porzione di tessuti larvali di farato (non fissa) deve essere immediatamente immersa nel tampone di lisi cellulare12 (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA e 1% SDS, pH 8,0) o reagenti di estrazione dell'RNA contenenti fenolo per l'estrazione di DNA o RNA. Prima delle dissezioni, erogare in anticipo 20 μL dei reagenti in tubi PCR da 0,2 mL (Figura 3A). Immergere e conservare i campioni a -80 °C fino a un'ulteriore estrazione. I campioni possono essere conservati per almeno 3 mesi, ma è meglio procedere con gli esperimenti a valle per prevenire la degradazione degli acidi nucleici.</li>
</ol>3. Estrazioni di DNA e RNA da larve di farato determinate per sesso
<ol><li>Raggruppare 12 larve di farato maschili o femminili determinate per sesso (embrione da 5 dpo) e aggiungere tampone di lisi cellulare o reagenti di estrazione dell'RNA (vedere il passaggio 2.11 e la tabella dei materiali) in un tubo da 1,5 ml. NOTA: seguire i passaggi 3.2-3.7 per l'estrazione del DNA e i passaggi 3.8-3.11 per l'estrazione dell'RNA.</li>
	<li>Omogeneizzare i tessuti in 600 μL del tampone di lisi cellulare (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA e 1% SDS, pH 8,0) e centrifugare i campioni a 10.000 x g per 5 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Raccogliere il surnatante (500 μL) usando una pipetta e incubare a 50 °C con 1,5 μL di proteinasi K (20 mg/mL, vedere Tabella dei materiali) per 5 ore su un blocco termico.</li>
	<li>Trattare i campioni con 1,0 μL di 10 mg/mL di soluzione di RNasi (vedere Tabella dei materiali) a 37 °C per 30 min.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di soluzione di precipitazione proteica (vedere Tabella dei materiali) ai tubi7, quindi una centrifuga a 17.000 x g per 10 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Mescolare il surnatante (500 μL) con 500 μL di isopropanolo al 100% e quindi centrifugare a 20.400 x g per 10 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Lavare il DNA pellettato due volte con 1.000 μL di etanolo al 70%. Quindi, asciugare all'aria (5-10 minuti a temperatura ambiente), sciogliere il DNA in 30 μL di tampone Tris-Cl da 10 mM (pH 8,5).</li>
	<li>Omogeneizzare i tessuti in 600 μL di reagenti per l'estrazione dell'RNA e aggiungere 240 μL di acqua distillata ultrapura al tubo. Centrifugare i tubi a 12.000 x g per 15 min a 4 °C.</li>
	<li>Mescolare il surnatante (600 μL) con 600 μL di isopropanolo al 100% e trasferire la miscela in una colonna di spin di silice (vedere Tabella dei materiali). Centrifugare i tubi a 17.900 x g per 1 min a 4 °C.</li>
	<li>Lavare la colonna con 750 μL di etanolo al 70% e centrifugare la colonna due volte a 17.900 x g per 1 minuto ciascuno a 4 °C.</li>
	<li>Caricare 15 μL di acqua distillata ultrapura sulla colonna. Centrifugare i tubi a 17.900 x g per 1 min a 4 °C per eluire l'RNA.</li>
	<li>Calcola e verifica la qualità e la quantità di DNA e RNA utilizzando uno spettrofotometro basato su UV. Valutare la purezza degli acidi nucleici utilizzando i rapporti A260/A280 (Acidi nucleici/proteine) e A260/A230 (Acidi nucleici/sali e altri contaminanti)13. NOTA: Per l'estrazione dell'RNA, è stata seguita la procedura12 precedentemente pubblicata, che ha provocato la contaminazione da fenoli (Tabella 1). Il DNA e l'RNA estratti da un singolo embrione o larve di farato producono campioni di bassa quantità e di bassa qualità. Tipicamente, l'estrazione del DNA da 12 larve di farato produce 100-600 ng, mentre l'estrazione dell'RNA utilizzando il metodo corrente genera 900-1.500 ng, come mostrato nella Tabella 1. NOTA: i passaggi 3.13-3.15 sono facoltativi per ulteriori saggi di sequenziamenti ad alto rendimento.</li>
	<li>Calcola le quantità di DNA e RNA utilizzando uno spettrofotometro basato sulla fluorescenza. NOTA: Il rapporto tra le quantità di RNA (concentrazione basata su UV (ng/μL)/concentrazione basata sulla fluorescenza (ng/μL)) è stato calcolato per valutare la qualità per ulteriori applicazioni sperimentali. Ad esempio, quando le concentrazioni basate su UV e fluorescenza sono rispettivamente 80 ng / uL e 60 ng / uL, il rapporto sarà 1,5 (80/60). Di solito, rapporti inferiori a 1,5 indicano una purezza sufficiente per le applicazioni a valle che utilizzano il sequenziamento ad alta produttività13.</li>
	<li>Analizzare la qualità dell'RNA utilizzando l'elettroforesi a microchip14.</li>
	<li>Utilizzare gli RNA qualificati per preparare la libreria di RNA utilizzando un kit di preparazione della libreria di RNA (vedere Tabella dei materiali). Sequenziare le librerie utilizzando una piattaforma adatta alle librerie preparate.</li>
</ol>

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<li>Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eggshell+of+Drosophila+melanogaster.+I.+Fine+structure+of+the+layers+and+regions+of+the+wild-type+eggshell%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell.</a> Journal of Cell Science. 43 (1), 1-35 (1980).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Tortricid comprende diversi parassiti agricoli e forestali; il presente studio ha presentato metodi per allevare tortrix nel corso delle generazioni, osservare l'embriogenesi e il sesso degli insetti e condurre analisi molecolari utilizzando embrioni maturi.
Uno degli ostacoli per lo studio degli insetti nocivi è quello di stabilire metodi di allevamento. Soprattutto, la consanguineità a volte influisce negativamente sulla forma fisica della specie. La riduzione della forma fisica da parte deg...

Gli insetti lepidotteri rappresentano oltre il 10% di tutte le specie viventi descritte1 e alcune specie di taxa causano gravi danni alle piante e gravi perdite agricole 2,3. Sebbene siano stati sviluppati studi molecolari e genetici utilizzando insetti modello come il baco da seta Bombyx mori 4,5, gli insetti parassiti rimangono non indagati, in parte a causa delle difficoltà di allevamento e manipolazione 6,7. Pertanto, sono necessari studi e tecniche fondamentali per comprendere la biologia di tali insetti parassiti non modello.
I Tortricidae (Lepidoptera), comunemente noti come tortrix o falene leafroller, comprendono molti parassiti agricoli e forestali8. Dei taxa degli insetti, il tortrix orientale del tè Homona magnanima Diakonoff e il tortrix di frutta estiva Adoxophyes honmai Yasuda sono gravi parassiti polifagi noti per danneggiare gli alberi del tè in Asia orientale7. Le due specie depongono grappoli di uova piatte e ovali simili a squame (o masse d'uovo) costituiti da uova sottili, morbide e fragili coperte da secrezioni materne. Sebbene le fasi di embriogenesi siano cruciali per lo sviluppo degli insetti e le determinazioni del sesso9, le strutture delle uova impediscono a ulteriori analisi di comprendere la biologia degli insetti. È importante superare le difficoltà per ulteriori studi sui parassiti che ovopongono una massa di uova così complessa.
Qui, per comprendere la biologia dei tortricidi, sono stati sviluppati metodi per l'allevamento di massa, osservazioni e studi molecolari utilizzando A. honmai e H. magnanima. In primo luogo, i metodi di allevamento di massa mantengono entrambi i tortricidi per oltre 100 generazioni da inbred. La separazione delle uova dalla massa uovo concatenata simile a una scala ha facilitato l'osservazione dell'embriogenesi dei tortricidi utilizzando solventi alcalini e organici precedentemente sviluppati da tecniche utilizzate nelle mosche10. Inoltre, il presente studio ha stabilito la discriminazione sessuale di piccoli embrioni sviluppando metodi di colorazione della cromatina sessuale di femmine di lepidotteri utilizzando orceina lattico-acetica11. Combinando questi metodi, gli acidi nucleici di alta qualità e quantità sono stati estratti da embrioni determinati dal sesso, che era altrimenti difficile da stabilire6. L'RNA estratto è stato utilizzato per il sequenziamento di prossima generazione. Collettivamente, i metodi qui presentati si applicano ad altri insetti lepidotteri e altri taxa di insetti.

<table><tbody><tr><td>1/2 oncia tazza</td><td>FP CHUPA</td><td>CP070009</td><td>l'allevamento di insetti; https://www.askul.co.jp/p/6010417/</td></tr> <tr><td>1/2 oncia coperchio tazza</td><td>FP CHUPA</td><td>CP070011</td><td>l'allevamento di insetti; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether</td></tr><tr><td>acido acetico al 99,7%</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Giappone</td><td>36289</td><td>fissazione; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>non mostrato</td><td>Quantificazione degli acidi nucleici; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument</td></tr><tr><td>Agilent RNA6000 nano kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td>Quantificazione degli acidi nucleici; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG .pdf</td></tr><tr><td>soluzione di cloruro di benzalconio</td><td>Nihon Pharmaceutical Co., Ltd</td><td>No.4987123116046</td><td>Sterilizzazione; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html</td></tr><tr><td>Cotton</td><td>AOUME</td><td>8-1611-02</td><td>allevamento di insetti;</td></tr><tr><td>https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1 soluzione DAPI</td><td>Dojindo, Tokyo, Giappone</td><td>340-07971</td><td>macchie; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/</td></tr> <tr><td>Idrogenofosfato disodico</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html</td></tr><tr><td>dsDNA HS kit di quantificazione</td><td>Invitrogen</td><td>Q33231</td><td>Quantificazione degli acidi nucleici; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230</td></tr><tr><td>Econospin RNA II colonna</td><td>Epoch Life Science Inc.</td><td>EP-11201</td><td>Estrazione dell'RNA; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Giappone</td><td>4.98748E+12</td><td>fissazione; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html</td></tr><tr><td>Etilendiammina-N,N,N',N'-tetraacetico Acido tetrasodico Tetraidrato (4NA)</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Tampone per lisi cellulare (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html</td></tr><tr><td>Carta pernisoliera</td><td>HEIKO</td><td>2100010</td><td>l'allevamento di insetti; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla&amp; utm_medium=cpc& utm_source= Blocco termico Adw</td></tr><tr><td>WSC-2620 PowerBLOCK</td><td>ATTO, Tokyo, Giappone</td><td>4002620</td><td>incubazione; https://www.attoeng.site/</td></tr> <tr><td>eptano</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Giappone</td><td>4.98748E+12</td><td>fissazione; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html</td></tr><tr><td>INSECTA LF</td><td>Nosan Co., Ltd</td><td>non mostrato</td><td>Dieta artificiale; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm</td></tr><tr><td>ISOGENII</td><td>Nippon Gene</td><td>311-07361</td><td>Estrazione dell'RNA; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html</td></tr><tr><td>isopropanolo</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>estrazione di acidi nucleici; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html</td></tr><tr><td>acido lattico</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Coloranti;</td></tr><tr><td>metanolo</td> https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html <td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Giappone</td><td>4.98748E+12</td><td>fissaggio; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html</td></tr><tr><td>MSV-3500 vortex</td><td>Biosan</td><td>BS-010210-TAK</td><td>Miscelatore Voltex; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/</td></tr><tr><td>Nano fotometro NP 80</td><td>Implen</td><td>non mostrato</td><td>Quantificazione degli acidi nucleici; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/</td></tr> <tr><td>Confezione naturale ampia</td><td>Inomata chimica</td><td>1859</td><td>allevamento di insetti; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3% 82%A4%E3%83%89</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Kit di preparazione della libreria di RNA per Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td>E7770S</td><td>Preparazione della libreria; https://www.nebj.jp/products/detail/2039</td></tr><tr><td>orceina</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Coloranti; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>160-16061</td><td>fissaggio; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html</td></tr><tr><td>Poliossietilene(20) Monolaurato di sorbitano</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html</td></tr><tr><td>Luce nera UV portatile (4W, lunghezza d'onda 365nm)</td><td>Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Giappone</td><td>non mostrato</td><td>Collezione di insetti; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html</td></tr><tr><td>Diidrogeno fosfato di potassio</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Invitrogen, MA, USA</td><td>P36965</td><td>antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965</td></tr><tr><td>Soluzione di proteinasi K</td><td>Merck</td><td>71049-4CN</td><td>Estrazione del DNA; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049</td></tr><tr><td>soluzione di precipitazione delle proteine</td><td>Qiagen</td><td>158912</td><td>estrazione del DNA; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC</td></tr><tr><td>Qubit V4</td><td>Invitrogen</td><td>Q33238</td><td>Quantificazione degli acidi nucleici; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238</td></tr><tr><td>rifampicina</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Giappone</td><td>4.98748E+12</td><td>Sterilizzazione;</td></tr><tr><td>https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html Kit di quantificazione dell'RNA HS</td><td>Invitrogen</td><td>Q32855</td><td>Quantificazione degli acidi nucleici; soluzione di</td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852 RNasi</td><td>Nippon Gene</td><td>313-01461</td><td>Estrazione dell'RNA; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html</td></tr><tr><td>Silk Mate 2S</td><td>Nosan Co., Ltd</td><td>non mostrato</td><td>Dieta artificiale; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html</td></tr><tr><td>Sodio Dodecil Solfato</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Tampone di lisi cellulare (SDS);</td></tr><tr><td>https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html soluzione acquosa di ipoclorito di sodio</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Giappone</td><td>4.98748E+12</td><td>separazione di uova; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html</td></tr><tr><td>Tetraciclina cloridrato</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Giappone</td><td>4.98748E+12</td><td>Sterilizzazione; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Tampone per lisi cellulare; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html</td></tr><tr><td>acqua distillata ultrapura</td><td>Invitrogen</td><td>10977023</td><td>estrazione di RNA; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015</td></tr></tbody></table>

allevamento di massa e studi molecolari negli insetti parassiti tortricidae

Mass-Rearing and Molecular Studies in Tortricidae Pest Insects

Tortricidae (Lepidoptera), comunemente noti come tortrix o falene leafroller, comprende molti parassiti agricoli e forestali, che causano gravi perdite agricole. Per comprendere la biologia di tali falene nocive, le tecniche fondamentali sono state molto richieste. Qui, i metodi per l'allevamento di massa, le osservazioni e gli studi molecolari sono sviluppati utilizzando due tortrix del tè, Homona magnanima e Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). Gli insetti sono stati allevati in massa con una dieta artificiale affettata e mantenuti dalla consanguineità per oltre 100 generazioni considerando le loro caratteristiche biologiche. Gli insetti hanno vari dimorfismi sessuali; quindi è difficile distinguere il sesso durante le fasi di sviluppo, che hanno impedito i test successivi. Il presente lavoro ha evidenziato che il sesso delle larve di tortricidi potrebbe essere determinato osservando testicoli o colorazione di orceina lattico-acetica per visualizzare il cromosoma W specifico della femmina. Inoltre, utilizzando i metodi di determinazione del sesso, il presente studio ha permesso l'estrazione di acido nucleico da embrioni determinati dal sesso e l'applicazione verso il sequenziamento ad alto rendimento. Questi suggerimenti sono applicabili ad altri insetti parassiti e faciliteranno ulteriori studi morfologici e genetici.

Creazione di linee host e loro manutenzione La vitalità delle larve raccolte sul campo è attribuita in modo diverso alla posizione del campo, alle stagioni e alle condizioni di allevamento (ad esempio, il 90% della vitalità a Taiwan, Taoyuan, come mostrato in Arai et al.12). Circa il 30%-50% delle coppie genererà la prossima generazione come al solito. Per H. magnanima e A. honmai, le matriline sono state mantenute dalla consanguineità per oltre 100 generazion...

Il presente protocollo descrive il metodo di allevamento degli insetti nocivi tortricidi nei laboratori. Le procedure per distinguere il sesso degli insetti ed estrarre gli acidi nucleici per il sequenziamento ad alto rendimento sono stabilite utilizzando due parassiti tortricidi.

Allevamento di massa e studi molecolari negli insetti parassiti Tortricidae

Tortricidae (Lepidoptera), commonly known as tortrix or leafroller moths, comprises many agricultural and forestry pests, which cause serious agricultural ...

Presentiamo masse fondamentali, ma molto richieste per l'allevamento di massa, osservazioni e studi molecolari utilizzando masse Tortrix gravi, per studiare la loro biologia. Finora, la struttura delle uova di insetto ha impedito ulteriori analisi. In particolare, abbiamo permesso lo studio di uova sottili, morbide e fragili coperte da secrezione materna.Ci sono tecniche semplici che dovrebbero essere applicabili per ulteriori ricerche su tortrix, provando altri insetti e altri taxa. Inizia mettendo una femmina e due maschi in un bicchiere di plastica da 120 millilitri con un pezzo di carta di paraffina per stabilire una linea Matra. Affettare circa 60 grammi di diete artificiali usando una grattugia per l'allevamento di massa.Metti la massa d'uovo piena di embrioni maturi sulla dieta artificiale affettata in un contenitore di plastica. Metti le carte di paraffina sulla massa d'uovo con le diete a fette. Metti 15 maschi e 10 femmine in una scatola di plastica per l'accoppiamento a 25 gradi Celsius.Raccogli le uova ogni cinque-sette giorni e ripeti le fasi di allevamento di massa per ogni generazione. Immergere la massa d'uovo in 1000 microlitri di soluzione acquosa di ipoclorito di

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Ambiente

Per ottenere la soppressione della popolazione di Aedes aegypti utilizzando il sistema RIDL® (Rilascio di insetti che trasportano un letale dominante), è necessario rilasciare un gran numero di zanzare maschili. Ciò richiede l'uso di tecniche e tecnologie di allevamento di massa per fornire sistemi affidabili per ottenere il massimo numero di zanzare maschili di alta qualità.

Produzione di massa di Aedes aegypti geneticamente modificati per rilasci sul campo in Brasile

Protocolli per la preparazione efficiente di campioni omogenei di acari, infestazione di piante sperimentali, e la valutazione del danno dell'impianto, come richiesto per gli studi di interazione pianta-parassita sono stati sviluppati.

Applicazione di due-macchiato Spider Mite<em&gt; Tetranychus urticae</em&gt; Per gli Studi Plant-parassita di interazione

Qui, vi presentiamo i protocolli per l'allevamento di un coleottero intermedio di germi, Dermestes maculatus (D. maculatus) in laboratorio. Condividiamo anche protocolli per embrionale e genitori RNAi e metodi per l'analisi dei fenotipi embrionali per studiare la funzione dei geni in questa specie.

Allevamento e RNA a doppio filamento mediata silenziamento genico nel Hide Beetle, Dermestes maculatus

Imaging della morfogenesi di embrioni insetto con luce microscopio a fluorescenza foglio basata è diventato stato dell'arte. Questo protocollo descrive e confronta tre tecniche di montaggio appropriate per gli embrioni Tribolium castaneum, presenta due linee transgeniche misura romanzo ben adatto per l'imaging in tempo reale, discute controlli di qualità essenziali e indichi limitazioni dell'esperimento corrente.

Luce Scheda a base di microscopia a fluorescenza di vita o fissate e colorate<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; embrioni

Tabelle di vita consentono la quantificazione delle fonti e dei tassi di mortalità in popolazioni di insetti e contribuiscano alla comprensione, la predizione e la manipolazione dinamica di popolazione negli agroecosistemi. Metodi per lo svolgimento e l'analisi di tabelle di vita basate su coorte nel campo per un insetto con stadi immaturi sessili sono presentati.

Metodologia per lo sviluppo di tavole di sopravvivenza per insetti Sessile nel campo utilizzando la Whitefly, Bemisia tabaci, in cotone come un modello di sistema

Forniamo un protocollo dettagliato per l'allevamento, la microiniezione delle uova e per l'accoppiamento efficiente del firebrat Thermobia domestica per generare e mantenere ceppi mutanti dopo l'editing del genoma.

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Qui è presentato un protocollo di microiniezione embrionale Helicoverpa armigera (Hübner) e identificazione di mutanti knockout creati dall'editing del genoma CRISPR / Cas9. Gli insetti mutanti consentono ulteriori ricerche sulla funzione genica e sull'interazione tra diversi geni in vivo.

Microiniezione embrionale e identificazione di mutanti knockout di Helicoverpa Armigera (Hübner) modificata dal genoma CRISPR/Cas9

Questo documento delinea i metodi di base per standardizzare fattori importanti come la densità, la disponibilità di mangime, la fonte di idratazione e i controlli ambientali per l'allevamento a lungo termine di colture di laboratorio del grillo commestibile, Gryllus bimaculatus.

Mantenimento di colture di laboratorio di Gryllus bimaculatus, un modello ortottero versatile per l'agricoltura degli insetti e la fisiologia degli invertebrati

Il protocollo dimostra un metodo di dissezione semplice e facile, adatto per gli insetti femmina migratori di tipo selvatico catturati con trappole a proiettori. Questa tecnica può chiarire in modo significativo la stessa specie confrontando entrambi i tessuti riproduttivi, vale a dire il sacco di accoppiamento e lo sviluppo ovarico degli insetti femmina wild-type.

Dissezione e classificazione dello sviluppo ovarico in insetti femmina wild-type

Qui presentiamo un protocollo per ottenere funghi entomopatogeni da una piralide forestale e un modo sostitutivo per valutare le loro attività entomopatogene utilizzando un insetto modello di Coleotteri. Questo metodo è efficiente e conveniente per esplorare le risorse fungine entomopatogene da insetti nocivi che perforano il legno nelle foreste naturali.

Isolamento, identificazione comportamentale e valutazione della patogenicità di funghi entomopatogeni da una piralide forestale

Impara l'allevamento di massa di insetti Tortricidae parassiti per studi molecolari. Questo metodo include la differenziazione del sesso e l'estrazione di acidi nucleici per il sequenziamento ad alto rendimento.

Allevamento di massa e studi molecolari negli insetti parassiti Tortricidae

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