iCLIP - トランスクリプトーム全体の個々のヌクレオチド分解能タンパク質- RNA相互作用のマッピング

次の実験の全体的な目標は、個々のヌクレオチド分解能でRNA結合タンパク質の結合部位のトランスクリプトームワイドマップを取得することです。これは、第2のステップとして、生体内でタンパク質とRNAを共有結合的に架橋するために、生細胞にUV照射を行うことによって達成されます。RNA結合タンパク質は、架橋されたRNAフラグメントを回収するために、ストリンジェント条件下で免疫精製されます。

次に、逆転写は、付着したペプチドでしばしば切断されるCDNAを生成し、RNA内の架橋位置に関する情報を保持するcDNAライブラリのハイスループットシーケンシングに基づいてトランスクリプトーム内のすべての結合部位を示す結果が得られる。この方法は、さまざまなRNAオンタンパク質の相互作用がRNAプロセッシングをどのように制御するかなど、RNA生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、タンパク質RNA相互作用のトランスクリプトームワイドマップの性能および分解能の両方を向上させることであり、UV架橋組織培養細胞の手順を開始することである。

ヒーラー細胞の10センチメートルプレートから培地を取り出します。6ミリリットルの氷冷PBSを追加し、プレートを氷の上に置きます。1枚のプレートで3回の実験に十分対応できます。

フタを外し、細胞に照射します。150ミリジュール/センチメートルの正方形で254ナノメートルになったら、セルリフターでプレートから細胞をこすり落とし、細胞を回収し、細胞懸濁液を3つのマイクロチューブのそれぞれに移して細胞をペレット化します。最高速度で4°Cで10秒間回転させます。

次に、スーピネートスナップを取り外し、細胞ペレットをドライアイスで凍結し、使用するまで摂氏マイナス80度まで保管します。100マイクロリットルのタンパク質、実験ごとにダイナビーズを新鮮なマイクロチューブに加えます。マウスまたはヤギの抗体を使用する場合は、プロテインGダイナビーズを使用してください。

ビーズを溶解緩衝液で2回洗浄します。溶解バッファーは、添付の書面によるプロトコルに記載されています。ビーズを100マイクロリットルの溶解バッファーに2〜10マイクログラムの抗体とともに再懸濁します。チューブを室温で30〜60分間回転させます。

次に、ビーズを900マイクロリットルの溶解バッファーで3回洗浄し、続行する準備ができるまで最後の洗浄にそのままにしておきます。氷上のトール細胞宮殿を免疫沈降させます。Resusを1ミリリットルの溶解緩衝液に懸濁し、1.5ミリリットルのマイクロチューブに移します。

1〜500希釈のRNAを1個調製します。次に、10マイクロリットルと2マイクロリットルのターボDNAを細胞に加えます。ライセート。サンプルを摂氏37度で正確に3分間インキュベートし、毎分1, 100回転で振とうし、直ちに氷に移します。

次に、摂氏4度と重力22,000倍でサンプルを20分間回転させて、ライセートをクリアし、SUPナタントを慎重に収集し、約50マイクロリットルのライセートをペレットと一緒に残してビーズを免疫沈殿させます。洗浄バッファーを取り出し、調製した細胞溶解物を添加します。サンプルを摂氏4度で2時間回転させます。

SUP剤を廃棄し、付属の書面によるプロトコルに記載されている900マイクロリットルの高塩緩衝液でビーズを2回洗浄します。最後に、ビーズを900マイクロリットルの洗浄バッファーで2回洗浄します。次に、脱リン酸化を進め、RNAの3つの主要な末端にリンカーを追加します。

プレキシガラスシールドの後ろで働いているRNAの5つのプライムエンドを標識します。リンカーライゲーション反応の最後の洗浄からスピネートを取り出し、ビーズを8マイクロリットルのホットPNKミックスに再懸濁します。摂氏37度で5分間インキュベートします。

ホットPNKミックスを取り出して再燃させます。ビーズを1倍の新しいページローディングバッファーの20マイクロリットルに吊り下げます。次に、サンプルをサーモミキサーで摂氏70度で10分間インキュベー

すぐにサンプルを磁石に置き、空のビーズを沈殿させます。サンプルを4〜12%の新しいページにロードします。ビスゲルは製造元の指示に従ってください。

また、染色済みタンパク質サイズマーカーを5マイクロリットルロードします。ゲルを180ボルトで50分間泳がせます。製造元の指示に従って、NOVA湿式転写装置を使用して、タンパク質RNA複合体をゲルからニトロセルロースメンブレンに移します。

転写後、PBSバッファーでメンブレンをすすぎます。その後、サランラップで包み、マイナス80°Cのフィルムに露光します。30分、1時間、一晩中露光します。

次に、低分子RNAからタンパク質RNA複合体に従って膜領域を単離します。自動X線写真をマスクとして使用して実験します。プロテイナーゼK消化とフェノールクロロホルム抽出により、メンブレンからRNAを回収します。

AYPプライマーの1つを使用してRNAを逆転写し、CDNAをゲル化します。6マイクロリットルのCDNAサンプルと2倍のTBE尿素ローディングバッファーの6マイクロリットルを混合します。サンプルをゲルにロードする直前。

サンプルを摂氏80度に3分間加熱します。次に、サンプルをプレキャスト6%TBE尿素ゲルにロードし、低分子量マーカーを添加します。メーカーの説明に従って、ゲルを180ボルトで40分間流し、上部の染料とプラスチックゲルサポートのマークを使用して切除をガイドします。

120〜200ヌクレオチド、85〜120ヌクレオチド、70〜85ヌクレオチドの3つのバンドをカットします。アークリッププライマーとL 3配列を合わせると、クリップ配列の52ヌクレオチドを占めることに注意してください。400マイクロリットルのteを加え、ゲルスライスを細かく砕きます。

1ミリリットルのシリンジプランジャーを使用して、摂氏37度で2時間、毎分1,100回転で振とうしながらゲル片をインキュベートします。1cmガラス製プレフィルター2枚をCoStarスピンクスカラムに入れます。サンプルの液体部分をカラムスピンに1分間、毎分13, 000回転で1.5ミリリットルのチューブに移します。

0.5マイクロリットルのグリコブルーと40マイクロリットルの酢酸ナトリウムpH5.5を追加します。次に、サンプルを混合します。100%エタノールを1ミリリットル加えます。

再度混合し、サンプルを摂氏マイナス20度で一晩沈殿させます。最後に、CD NA分子を環状化して、アダプター領域を5つのプライムエンドに付着させます。次に、アイクリップライブラリのシーケンシングに先立って、添付の書面によるプロトコルに従って再線形化およびPCR増幅を行い、実験の成功を2つのステップで監視することができます。

膜転写後のタンパク質RNA複合体の自己無線グラフと、低RNAサンプルの自己X線写真におけるPCR産物のゲル画像、拡散放射能は、高RNAサンプルのタンパク質の分子量より上に見られるはずです。この放射能は、タンパク質の分子量により近いところに集まっています。免疫沈降に抗体を使用しない場合、シグナルは検出されません。

免疫沈降の特異性に関するさらに重要な制御は、UVE照射を放出するか、または目的のタンパク質を発現しない細胞を使用する。PCR産物のゲル画像は、CD NA画分に対応するサイズ範囲を示す必要があります。PCRプライマーであるP three CelexaおよびP five Celexaは、CD NAのサイズに追加で76ヌクレオチドを導入することに留意されたい。免疫沈降中に抗体を使用しない場合、対応するPCR産物は検出されません。

この手順を試行する際には、64のステップのそれぞれが重要であり、100%の精度で実行する必要があることを覚えておくことが重要です。ICLデータは、トランスクリプト全体の機能アッセイと計算的に統合できます。これにより、例えば、RNAプロセッシングの位置依存性制御に関する洞察を得ることができます。

計算データ解析については、Nicholas KA European Bioinformatics Instituteおよびリアナ大学のbla zupanと共同で発表した最近の論文を参照したいと思います。そして今、あなた自身が実験を始める時が来ました。楽しんでください。