Name: iCLIP - トランスクリプトーム全体の個々のヌクレオチド分解能タンパク質- RNA相互作用のマッピング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 学ぶiCLIP法によるトランスクリプトーム全体のRNA結合タンパク質結合部位の個々のヌクレオチド分解能マッピング。UV架橋と免疫沈降、ハイスループットシーケンスを用いて、転写後制御メカニズムの理解を深める。

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著者は、議論や実験的な援助のためにウレ、ラスコームとジュパン研究所のすべてのメンバーに感謝。我々は、ハイスループットシーケンシングのためにジェームズハドフィールドとニックマシューズに感謝。我々はiCLIPメソッドがここにロバートダーネルの研究室でカークジェンセンとJUによって開発された株式は、オリジナルのクリップのプロトコルでいくつかの手順を、説明することを指摘したいと思います。この作品は、欧州研究評議会の助成金JUとJKに長期ヒューマンフロンティアサイエンスプログラムのフェローシップへ206726 - CLIPによってサポートされていました

<ol><li>Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+regulons%3A+coordination+of+post-transcriptional+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA regulons: coordination of post-transcriptional events.</a> Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).</li>
<li>Wang, Z., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+regulation%3A+from+a+parts+list+of+regulatory+elements+to+an+integrated+splicing+code%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code.</a> RNA. 14, 802-813 (2008).</li>
<li>Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+the+right+RNA%3A+identification+of+cellular+mRNA+substrates+for+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins.</a> RNA. 5, 1071-1082 (1999).</li>
<li>Brooks, S. A., Rigby, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+mRNA+ligands+bound+by+the+RNA+binding+protein+hnRNP+A2+utilizing+a+novel+in+vivo+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of the mRNA ligands bound by the RNA binding protein hnRNP A2 utilizing a novel in vivo technique.</a> Nucleic Acids Res. 28, E49-E49 (2000).</li>
<li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proc Natl Acad Sci. 97, 14085-14090 (2000).</li>
<li>Mili, S., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+reassociation+of+RNA-binding+proteins+after+cell+lysis%3A+implications+for+the+interpretation+of+immunoprecipitation+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses.</a> RNA. 10, 1692-1694 (2004).</li>
<li>Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302, 1212-1215 (2003).</li>
<li>Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIP%3A+A+method+for+identifying+protein-RNA+interaction+sites+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">CLIP: A method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells.</a> Methods. 37, 376-386 (2005).</li>
<li>Licatalosi, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456, 464-469 (2008).</li>
<li>Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA+code+for+the+FOX2+splicing+regulator+revealed+by+mapping+RNA-protein+interactions+in+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An RNA code for the FOX2 splicing regulator revealed by mapping RNA-protein interactions in stem cells.</a> Nat Struct Mol Biol. 16, 130-137 (2009).</li>
<li>Urlaub, H., Hartmuth, K., Lührmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-tracked+approach+to+analyze+RNA-protein+crosslinking+sites+in+native%2C+nonlabeled+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A two-tracked approach to analyze RNA-protein crosslinking sites in native, nonlabeled small nuclear ribonucleoprotein particles.</a> Methods. 26, 170-181 (2002).</li>
<li>König, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP+reveals+the+function+of+hnRNP+particles+in+splicing+at+individual+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution.</a> Nat Struct Mol Biol. 17, 909-915 (2010).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

iCLIPプロトコルは、酵素反応と精製段階の多様な範囲を含んでいるので、それは実験が失敗する問題を識別するために、必ずしも容易ではない。同定されたRNAの相互リンクサイトの特異性をコントロールするために、一つ以上のネガティブコントロールは、完全な実験とその後の計算論throughout維持されるべきである。これらのコントロールは、非抗体サンプル、非架橋の細胞、またはノックアウト細胞や組織から免疫沈降することができます。理想的には、これらの対照実験では、任意のタンパク質- RNA複合体を浄化してはならないため、SDS - PAGEゲル上に信号を与えないこと、およびPCR増幅後には検出可能な製品があります。これらの制御ライブラリのハイスループットシーケンシングは非常にいくつかのユニークな配列を返す必要があります。結果のシーケンスはまだ少量でノックダウン細胞から精製されているのと同じタンパク質の架橋部位に対応するので、ノックダウン細胞は、シーケンシング制御としては推奨されません。 注意事項は、以前の実験からのPCR産物の混入を避けるために注意する必要があります。この問題を最小限にする最良の方法は、事前事後のPCRステップを空間的に分離することです。理想的には、PCR産物とすべての後続のステップの分析は別の部屋で実行する必要があります。また、研究室の各メンバーは、バッファや他の試薬の独自のセットを使用する必要があります。この方法では、汚染の源は簡単に識別することができます。

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/details.php?id=2638">iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution</a>. There was an error in part 2 of step 3. One of the characters had the incorrect symbol and was corrected to: "...as well as 2 &#x03BC;l Turbo DNase..." instead of: "...as well as 2 ml Turbo DNase..."

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Erratum: iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

ゲル電気泳動およびメンブレントランスファーのために我々は彼がX細胞SureLockの使用トン勧め®プロトコルを通じて指定されている異なるプレキャストミニゲルの使用と互換性のあるミニセルとX細胞II™ブロットモジュールキットCEマーク（Invitrogen社、EI0002）、 。使用されるすべての材料のブランドとオーダー番号は、プロトコル中に記載されています。プロトコルで使用されている酵素の一覧を下表に示します。 <table border="1"><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ＃ </td><td> コメント </td></tr><tr><td>タンパク質のDynabeadsを</td><td>インビトロジェン</td><td> 10001D </td><td>マウスまたはヤギ抗体のプロテインGを使って</td></tr><tr><td>リボヌクレアーゼI </td><td>アンビオン</td><td> AM2295 </td><td>活動は、バッチ毎に変更することができます。 </td></tr><tr><td> T4 RNAリガーゼI </td><td> NEB </td><td> M0204S </td><td> </td></tr><tr><td> PNK </td><td> NEB </td><td> M0201S </td><td> </td></tr><tr><td>プロテイナーゼK </td><td>ロッシュ</td><td> 03115828001 </td><td> </td></tr><tr><td>上付き文字III逆転写酵素</td><td>インビトロジェン</td><td> 18080044 </td><td> </td></tr><tr><td> Circligase II </td><td> EPICENTRE </td><td> CL9021K </td><td> </td></tr><tr><td> FastDigest ®をBamHI </td><td> Fermentas </td><td> FD0054 </td><td> </td></tr><tr><td> AccuPrime™スーパーミックスI </td><td>インビトロジェン</td><td> 12342010 </td><td>このPCRミックスは、私たちの手で最高の結果が得られます</td></tr></table>

iclip - トランスクリプトーム全体の個々のヌクレオチド分解能タンパク質- rna相互作用のマッピング

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

転写でRNA結合タンパク質（RBPs）のユニークな組成と空間配置は、転写後調節1の多様な側面をガイド。したがって、分子レベルでの転写調節を理解することに向けた重要なステップはRBPs 2の結合部位の位置情報を得ることです。 タンパク質- RNA相互作用は、生化学的手法を用いて検討することができますが、これらのアプローチは、そのネイティブ細胞状況でのRNA結合に対処していない。ディファレンシャルディスプレイやマイクロアレイ分析（RIP -チップ）3-5と組み合わせてアフィニティー精製や免疫沈降法を採用し、携帯環境でのタンパク質- RNA複合体を研究する初期の試み。これらのアプローチは、間接的または非生理的な相互作用6を識別する傾向があった。特異性と位置分解能を向上させるためには、CLIP（UV架橋及び免疫沈降）と呼ばれる戦略は7,8を導入されました。 CLIPは、UV架橋変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を含む厳密な精製スキームとタンパク質とRNA分子のを兼ね備えています。ハイスループットシーケンシング技術と組み合わせることで、CLIPはゲノムワイドスケールでのタンパク質- RNA相互作用（HITS - CLIPまたはCLIP - seqと呼ばれる）9,10を研究する強力なツールとして証明されています。最近では、PAR - CLIPは、11,12の架橋のために光反応性リボヌクレオシド類似体を使用することを導入されました。 得られたデータの高い特異性にもかかわらず、CLIPの実験は、しばしば限られたシーケンスの複雑さのcDNAライブラリーを生成します。これは部分的に共精製されたRNAの制限された量とライブラリの準備に必要な2つの非効率的なRNAのライゲーション反応によるものです。さらに、プライマー伸長アッセイは、多くのcDNAが架橋ヌクレオチド13で途中で切り捨てることが示された。そのような切り詰められたcDNAは、標準のクリップライブラリの準備のプロトコル中に失われます。我々は最近、より効率的な分子内cDNAを環状化（図1）14で非効率的な分子間のRNAライゲーションのステップのいずれかに置き換えることによって切り捨てられたcDNAをキャプチャiCLIP（個々のヌクレオチドの解像度のCLIP）を、開発しました。重要なことは、切り捨てられたcDNAを配列決定する塩基の解像度でクロスリンク部位の位置への洞察を提供します。私たちは正常にゲノムワイドな規模でのhnRNP C粒子の組織を研究し、スプライシングの調節14にその役割を評価するiCLIPを適用する。

転写でRNA結合蛋白質の空間配置は、転写後調節の重要な決定要因である。したがって、我々は、RNA結合タンパク質の結合部位の正確なゲノムワイドなマッピングを可能にする個々のヌクレオチドの解像度のUV架橋及び免疫沈降（iCLIP）を開発。

iCLIP - トランスクリプトーム全体の個々のヌクレオチド分解能タンパク質- RNA相互作用のマッピング

転写産物上のRNA結合タンパク質（RBP）の独自の組成と空間的配置が、転写後調節の多様な側面を導いています。

本実験の全体的な目的は、単一ヌクレオチド解像度で、RNA結合タンパク質の結合部位のトランスクリプトームワイドなマップを取得することです。これは、第2ステップとして、生細胞にUV照射を行い、in vivoでタンパク質とRNAを共有結合的にクロスリンクさせることで達成されます。その後、クロスリンクされたRNA断片を回収するために、厳格な条件下でRNA結合タンパク質を免疫精製します。次に、逆転写によってcDNAを合成します。これらのcDNAは、付着したペプチド部分でしばしば切断されるため、RNA内のクロスリンク位置に関する情報が保持されます。cDNAライブラリーの高スループットシーケンシングに基づき、トランスクリプトーム内のすべての結合部位を示す結果が得られます。この手法は、異なるRNA結合タンパク質の相互作用がどのようにRNAプロセシングを制御しているかなど、RNA生物学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、タンパク質とRNAの相互作用に関するトランスクリプトームワイドなマップの性能と解像度の両方を向上させられることです。それでは、培養細胞のUVクロスリンクの手順を開始します。10 cmプレートで培養したhealer細胞から培地を除去します。氷冷したPBSを6 mL加え、プレートを氷上に置きます。1枚のプレートで3回の実験が可能です。蓋を取り外し、細胞を照射します。254 nanometers、150 millijoules per centimeter squaredで一度照射した後、セルリフターを用いてプレートから細胞を掻き取り、回収します。細胞懸濁液を2 mLずつ3本のマイクロチューブに分注し、細胞をペレット化します。4 °Cで最高速度にて10秒間遠心分離します。次に、上清を抜き、細胞ペレットをドライアイスで凍結させ、使用時まで−80°Cで保存します。新しいマイクロチューブに、実験あたり100 µLのプロテインA Dynabeadsを加えます。マウスまたはヤギ抗体を使用する場合は、プロテインG Dynabeadsを使用してください。ビーズをライシスバッファー（詳細は付属の書面プロトコルを参照）で2回洗浄します。2〜10 µgの抗体を含む100 µLのライシスバッファーにビーズを再懸濁します。チューブを室温で30〜60分間回転させます。その後、ビーズを900 µLの溶解バッファーで3回洗浄し、次の工程に進むまで最後の洗浄液の中に保持します。免疫沈降用に、氷上のThor細胞ペレットを1 mLの溶解バッファーで再懸濁し、1.5 mLマイクロチューブに移します。RNase Aを1:500に希釈して調製します。次に、この希釈液10 µLとTurbo DNase 2 µLを細胞溶解液に加えます。サンプルを37 °Cで正確に3分間、1,100 rpmで振盪しながらインキュベートし、直ちに氷上に移します。次に、4 °C、22,000 ×gで20分間遠心分離してライセートを清澄化し、ペレットとともに約50 µLのライセートを残して上清を慎重に回収します。洗浄バッファーを除去し、調製した細胞ライセートを加えます。サンプルを4 °Cで2時間回転混和します。SUP剤を廃棄し、付属の書面プロトコルに記載されている高塩濃度バッファー 900 µLでビーズを2回洗浄します。最後に、洗浄バッファー 900 µLでビーズを2回洗浄してください。その後、RNAの3'末端を脱リン酸化し、リンカーを付加します。プレキシガラスのシールド内で、RNAの5'末端を標識します。リンカーライゲーション反応の最後の洗浄後の上清を除去し、ビーズを8 µLのホットPNKミックスに再懸濁します。37 °Cで5分間インキュベートします。加熱したPNKミックスを除去し、再利用します。ビーズを1×サンプルローディングバッファー 20 µLに懸濁させます。その後、サーモミキサーを用いてサンプルを70 °Cで10分間インキュベートします。直ちにサンプルをマグネットに載せ、空のビーズを沈殿させます。メーカーの指示に従い、4～12%の新規ページ。Bissゲルにサンプルをロードします。また、プレステイン済みタンパク質サイズマーカーを5 µLロードします。ゲルを180 Vで50分間泳動します。製造元の指示に従い、NOVA wet transfer apparatusを用いて、ゲルからニトロセルロース膜へタンパク質RNA複合体を転写します。転写後、メンブレンをPBSバッファーで洗浄します。次に、サランラップで包み、-80 °Cでフィルムに露光させます。露光時間は30分、1時間、および一晩として行います。次に、低分子RNAからのタンパク質RNA複合体に基づき、メンブレン領域を切り出します。オートラジオグラムをマスクとして使用し、実験を行ってください。プロテアーゼK消化およびフェノール・クロロホルム抽出により、メンブレンからRNAを回収します。AYPプライマーのいずれかを用いてRNAを逆転写し、cDNAをゲル精製します。6 µLのcDNAサンプルを、6 µLの2倍TBE尿素ローディングバッファーと混合します。これは、サンプルをゲルにロードする直前に行ってください。サンプルを80 °Cで3分間加熱します。次に、低分子量マーカーとともに、サンプルをプリキャスト6% TBE ureaゲルにロードします。メーカーの指示に従い、180 Vで40分間電気泳動を行い、上部の色素およびプラスチック製ゲルサポートの目印を目安にして切り出しを行います。120～200ヌクレオチド、85～120ヌクレオチド、および70～85ヌクレオチドの3つのバンドを切り出します。arc lipプライマーとL3配列を合わせて、clip配列の52ヌクレオチド分となることに注意してください。400 µLのTE bufferを加え、ゲルのスライスを小さく砕きます。1 mLシリンジのプランジャーを用いて、ゲル片を1,100 rpmで2時間、37 °Cで振盪インキュベートします。2枚の1 cmガラスプレフィルターをCoStar spinxカラムにセットします。サンプルの液相部分をカラムに移し、13,000 rpmで1分間遠心分離し、1.5 mLチューブに回収します。0.5 µLのglyco blueと40 µLの酢酸ナトリウム（pH 5.5）を添加します。その後、サンプルを混合します。1 mLの100%エタノールを添加します。再度混合し、−20 °Cで一晩静置してサンプルを沈殿させます。最後に、CD NA分子を環状化し、5'末端にアダプター領域を結合させます。次に、アイクリップライブラリーのシーケンシングに先立ち、付属の書面プロトコルに従って再線状化およびPCR増幅を行います。実験の成否は2つのステップで確認できます。メンブレン転写後のタンパク質-RNA複合体のオートラジオグラフおよびPCR産物のゲル画像において、RNA含有量の少ない試料では、タンパク質の分子量よりも高い位置に拡散した放射能が観察されるはずです。RNA含有量の多い試料では、この放射能はタンパク質の分子量により近い位置に集中します。免疫沈降に抗体を用いない場合、シグナルは検出されないはずです。免疫沈降の特異性を確認するためのさらなる重要なコントロールとして、UV照射を省略するか、あるいは目的のタンパク質を発現していない細胞を使用します。PCR産物のゲル画像では、CD NA画分に相当するサイズ範囲が示されるはずです。なお、PCRプライマーのP three CelexaおよびP five Celexaにより、CD NAのサイズに76ヌクレオチドが追加されることに注意してください。免疫沈降時に抗体を使用しなかった場合、対応するPCR産物は検出されないはずです。この手順を行う際は、64のステップのすべてが重要であり、100%の正確さで実施されなければならないことに留意してください。ICLデータは、トランスクリプトーム全体の機能解析と計算的に統合することが可能です。これにより、例えば、RNAプロセシングの位置依存的な制御に関する知見を得ることができます。計算データ解析については、欧州バイオインフォマティクス研究所のNicholas KA氏およびリアナ大学のbla zupan氏との共同研究による最近の出版物を参照してください。それでは、あなた自身の実験を始めてください。お楽しみください。

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Research

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Biology

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iCLIP - トランスクリプトーム全体の個々のヌクレオチド分解能タンパク質- RNA相互作用のマッピング

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