Name: 全体の開発、 ショウジョウバエの脳のex vivoで培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 学ぶDrosophila脳のex vivo培養法。幼虫と蛹の脳を25度で培養し、固定・染色・イメージングすることで、キノコ体のin vivo発生を模倣し、高解像度で発生動態を解析できます。

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私たちは、原稿上でのアドバイス、有用な議論やコメントのために我々の研究室のメンバー全員に感謝したい。我々はまた、特に我々が改造実験で培養するための脳を解剖する前に、APF 1.5時間まで待つという優れた提案のためにマルタコッホとBassemハッサンに感謝します。我々はまた、共焦点顕微鏡を使用するためのNHGRIのイメージング機能を感謝します。この作品は、NINDS学内研究プログラムは、NIH（Z01 NS003106）の基本的な神経科学プログラムによってサポートされていました。

メディアのA.の準備<ol><li>フィルター滅菌シュナイダーのショウジョウバエのメディアは、10％ウシ胎児血清および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補ったことで、完全なメディアを準備します。 </li><li>メディアは毎回新鮮な準備する必要があります。また、事前に凍結メディアの新鮮なアリコートを各使用前に解凍することができます。 </li><li>培養に先立って、メディアに10μg/ mlのインスリンおよび2μg/ mlのエクジソンを追加します。薬が濃縮された株式のように調製し、小アリコートで凍結した。融解したアリコートを再凍結はありませんでした。 </li><li>すべての作業のソリューションは、25℃で維持されるべきである</li></ol>幼虫の脳の培養 1。幼虫の脳の選択と解剖<ol><li> 12ミリメートルMillicellセルカルチャーインサートにメディアの500μlを添加します。解剖脳は簡単に免疫染色を容易にするために、これらのインサートに配置されます。 </li><li>解剖の時計ガラスに準備されたメディアの少量を追加します。 </li><li> U、小さなへらを歌う放浪3齢幼虫をピックアップし、時計皿に置きます。 （我々は、ex vivoでの培養方法は、第一または第二齢幼虫にも同様に適用されるだろうが、我々はこれをテストしていないことを想定しています。） </li><li>鉗子のペアと幼虫の後端持って慎重＃5鉗子の第二のペアで前端を開きます。 </li><li>すぐに腹神経索を保持したまま、脳を解剖する。 </li></ol>ディテールに秘められた幼虫の脳の2 のEx vivoでの培養<ol><li>プリウェットピペットチップを使用して、メディアが事前に満たされ、細胞培養インサートに慎重に脳を転送します。 </li><li> 25℃インキュベーターへのメディアの転送の脳は、°希望の時間点までのCに達しています。このメソッドは、文化の中で最大48時間のために効率的に動作します。 </li><li> 8時間でメディアを交換してください。その向こうには、メディア毎に5-6時間の半分を交換してください。 </li></ol> 3。の薬理学的操作幼虫ブレインズ ex vivoでの培養は、このメソッドは、薬理学的に以前に私たちの研究室1に示す遺伝子の相互作用を裏付けるために使用できます。 <ol><li>準備されたメディアに、100μMのロスコビチンと100μMのオロモウシンを追加します。 </li><li>このメディアに解剖し、脳を転送します。 </li><li> 25文化の脳℃で24時間。 </li><li> 8時間でメディアを交換してください。それを超えて、メディアの半分（薬物を含む）ごとに5-6時間を交換してください。 </li></ol>蛹の脳の培養 1。解離に対する蛹の選択<ol><li>ボトル/バイアル白い蛹をマークします。 </li><li>唯一の完全に白です蛹を選択します。発色の任意の並べ替えと蛹が含まれるべきではありません。 </li><li>この段階では、0時間蛹殻の形成（APF）の後です。 </li><li>これらの蛹は、1.5時間マーキングした後に解剖の準備ができます。このステップでは、その発達のプルーニングがエクスビボで発生したことを確認することが重要です</eM&gt;文化。 </li></ol> 2。蛹の解剖<ol><li> 12ミリメートルMillicellセルカルチャーインサートにメディアの500μlを添加します。 （解剖脳は簡単に免疫染色を容易にするために、これらのインサートに配置されます。） </li><li>希望の時間ポイントに達した後、解剖時計ガラスに準備されたメディアの少量を追加します。 </li><li>小さい、ぬれたへらを使用して、以前に解剖用にマークされた蛹をピックアップし、時計皿に置きます。 </li><li>鉗子のペアと蛹の後端持って慎重＃5鉗子の第二のペアで蛹ケースの前端を開きます。 </li><li>すぐに腹神経索がそのまま接続されたまま、脳を解剖する。 </li></ol>ディテールに秘められた蛹の脳の3 のEx vivoでの培養<ol><li>メディアが事前に満たされた、細胞培養インサートに慎重に脳を転送します。 </li><li>希望の時間-Pまで25℃インキュベーター℃〜メディアの転送の脳、ointに達しています。我々は示した実験のために文化の中で10時間にこのメソッドを使用しますが、必要に応じてそれは、観察と治療の長い期間に延長することができます。 </li><li> 8時間のAPFよりも時間ポイントより長い場合は、メディア毎に5-6時間を交換してください。 </li></ol>このステップから、プロトコルは、幼虫と蛹の両方で変わりません。 ディテールに秘められた脳を修復するB. <ol><li>希望の時間ポイントに達すると、メディアを取り出し、30分間0.5％1X PBS中4％ホルムアルデヒドトリトンX-100（PBST）500μLを加え、15分後に新鮮なホルムアルデヒドと置き換えます。 </li><li>固定でメディアを交換しながら、脳を乾燥させないようにしてください。 </li><li> 0.5パーセントトリトンX-100（PBST）での1X PBSを4つの10分間の洗浄でホルムアルデヒドを洗い流してください。 </li></ol> C.固定ブレインズの染色<ol><li>ホルムアルデヒドは、通常1％の1X PBSをブロッキング溶液で1時間の頭脳をブロックし、洗い流された後ヤギ血清および1％ウシ血清アルブミン。 </li><li>ブロッキング溶液で構成される一次抗体を追加します。 </li><li> 4℃一晩インキュベートし、脳℃、 </li><li>翌朝、PBSTの4つの10分間の洗浄を一次抗体を洗い流してください。 </li><li>ブロッキング溶液で構成される二次抗体を追加します。 </li><li>室温で4時間のままにします。 </li><li> PBSTの4つの10分間の洗浄を二次抗体を洗い流してください。 </li></ol> D.は、顕微鏡用固定および染色した頭脳をマウントする<ol><li> 1時間Vectashieldマウンティングメディアの頭脳を平衡化します。 </li><li> Vectashieldマウンティングメディアを使用してスライドガラス上に頭脳をマウントします。 </li><li>カバースリップをマウントする前に脳の両側にガラスチップを置きます。共焦点顕微鏡ですべてのフォーカルプレーンをスキャンするのに十分な試料が薄い維持しながら、これは、押しつぶされたことから脳を防ぐことができます。脳は、興味のある機能を表示して容易にするために、取り付け時におおよそ配向されていた。必要な場合には、脳画像は、ドキュメント、および測定のための最適なビューを提供するためにImarisソフトウェアを回転させた。 </li><li>透明なマニキュアでスリップをカバーシール。 </li><li>ストアでは、光から離れてスライドします。 </li></ol> E.代表的な結果 図1（A）野生型のハエの3齢幼虫の脳のパネルを示し、（B）Cdk5のドミナントネガティブ誘導体（Cdk5DN）（コネル·クロウリーら 、2000）を発現するハエ。 MBのγニューロンの両方急行アクチン-GFP（緑）。前述のように（Trunova ら 、2011）、したがって、 &quot;クリアゾーン&quot;（A、ブラケット）として示すと、アクチン-GFPを蓄積して失敗した野生型γニューロンの近位軸索内の領域があるfasciclin 2蛋白質（赤）までしか、このゾーンの腹側の境界線（白い水平線）への軸索に蓄積されます。 図1（A）の3番目のパネルの点線は、行為を強調し、MBの位置を示す&quot;クリアゾーン&quot;とその腹側の境界インチCdk5DNを発現しているハエでは、アクチンクリアゾーンは存在しません（B）とFasciclin 2（FasII）免疫反応性は、その領域を介して背広が​​っています。 （MB間の水平FasII陽性軸索プロジェクトの変数番号があることに注意してください。これらは表現型には関係ありません）。スケールバーは20μmを表す。 ex vivoでの培養の手法を用いて、我々は、ロスコビチンとオロモウシン、Cdk5を活動の薬理学的阻害剤の組み合わせで、野生型のハエを処理した。 図2は、制御の3齢幼虫の脳（A）のパネルと、（B薬剤処理を示しています。 ）は、野生型のハエ。ドミナントネガティブCdk5を構造、24時間Cdk5を阻害剤で処理し、脳を発現しているハエと同様に、アクチンクリアゾーンとFasII境界（角括弧）内のシフトの特性の損失を示しています。白い線は、野生型FasII境界の位置を示します。スケールバーは20μmを表す。 ふぃぎゅ再3 mCD8-GFP（緑）、膜標的で標識された0から10時間以内APFからショウジョウバエのキノコ体の代表的なシリーズを示しています。ブラケットは、萼、つまりMBの樹状突起を示す。変態前に、一つは太いバンドルと同様に、緻密な樹アーバー（ブラケット）に起因する蛍光シグナルの &quot;かすみ&quot;で背腹走ることMBの軸索を見ることができます。時解剖パネル示す脳が示された。地域における樹状突起のプルーニングが（軸索の信号が影響を受けないですが）6-8時間でAPF、樹状信号のヘイズが消えたように、括弧で示された注意してください。パネルBの脳は、内部エクジソンスパイク（トルーマンとRiddiford、2002）、示されているように培養されたex vivoでの前に、0時間APFで解剖した。これらは、樹状突起のない発達プルーニングを示していないのではなく樹状信号は10時間APFで保持されます。これを回避するためには、蛹には0時間APFでマークされたが、APFと培養1.5時間後に解剖されています。ペインL Cは0から10時間、APFからこれらのショウジョウバエのキノコ体の代表的なシリーズを示しています。非培養サンプルのように、樹状信号は、8時間APFによって検出不可能である。スケールバーは20μmを表す。

<ol><li>Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdk5+regulates+the+size+of+an+axon+initial+segment-like+compartment+in+mushroom+body+neurons+of+the+Drosophila+central+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain.</a> J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).</li>
<li>Nakada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+anchored+proteins+forms+membrane+diffusion+barriers+during+neuronal+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization.</a> Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).</li>
<li>Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+the+p53+tumor+suppressor+protein+family+and+Cdk5%3A+novel+therapeutic+approaches+for+the+treatment+of+neurodegenerative+disease+using+selective+Cdk+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors.</a> Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).</li>
<li>Kahsai, L., Zars, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+and+memory+in+Drosophila%3A+behavior%2C+genetics%2C+and+neural+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system.</a> Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).</li>
<li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies%3A+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126, 4065-4076 (1999).</li>
<li>Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+pruning+during+Drosophila+metamorphosis%3A+evidence+for+local+degeneration+and+requirement+of+the+ubiquitin-proteasome+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system.</a> Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).</li>
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<li>Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cyclin-dependent+kinase+Cdk5+controls+multiple+aspects+of+axon+patterning+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo.</a> Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).</li>
<li>Truman, J. W., Riddiford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+insights+into+the+evolution+of+metamorphosis+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects.</a> Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).</li>
<li>Noguchi, T., Miller, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+actin+dynamics+in+individualization+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Development. 130, 1805-1816 (2003).</li>
<li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1%2Fdynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).</li>
<li>Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+time-lapse+imaging+and+dominant+negative+receptors+to+dissect+the+steroid+receptor+control+of+neuronal+remodeling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila.</a> Development. 133, 275-288 (2006).</li>
<li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Developing+and+Adult+Drosophila+Brains+and+Retinae+for+Live+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (37), e1936(2010).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

<html>突然変異と導入遺伝子の発現を含む組織の構造と機能の慢性的な遺伝子操作は、通常、分離するのは非常に困難である即効性と後期間接的な結果の組み合わせを生成します。薬理学と遺伝学的手法を補完する表現型の背後にある時間経過の取り調べを容易にすることができます。たとえば、これはショウジョウバエの 10の精子形成時に異なる細胞骨格成分の寄与を解剖するための強力なアプローチされています。現在の例では、私たちはショウジョウバエのAISの構造を維持するために、Cdk5をするための永続的な要件があることを示すことができました。他の実験では、我々はまた、そのターゲットのタンパク質キナーゼ（イマチニブ）、アクチン重合（カラシン、latrunculinとjasplakinolide）と微小管（ビンブラスチンおよびタキソール）を含む他の細胞成分を、薬物を使用して成功を収めている。 &quot;&gt; ex vivoでの培養方法はまた、発達過程のダイナミクスの高分解能分析を可能にします。これまでの研究のような、中央の脳11、または神経系の他の部分の長...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td>シュナイダーのショウジョウバエメディア</td><td>インビトロジェン</td><td> 21720-024 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（熱不活化） </td><td>インビトロジェン</td><td> 10082-1​​47 </td><td> 10パーセント</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15140-122 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>インスリン</td><td>インビトロジェン</td><td> 12585-014 </td><td> 10μg/mlの</td></tr><tr><td>エクジソン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> H5142 </td><td> 2μg/ml </td></tr><tr><td>ロスコビチン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> R7772 </td><td> 100μM </td></tr><tr><td>オロモウシン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> O0886 </td><td> 100μM </td></tr><tr><td>正常ヤギ血清</td><td>インビトロジェン</td><td> 50062Z </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> M9501 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> D4551 </td><td> 4パーセント</td></tr><tr><td>トリトンX-100 </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP151 </td><td> 0.5パーセント</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>インビトロジェン</td><td> 70011-044 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td> H1000 </TD&gt; <td></td></tr><tr><td> Millicellセルカルチャーインサート</td><td>ミリポア</td><td> PI8P01250 </td><td></td></tr><tr><td> Multidish、ウェル4 </td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td>デュモン＃5鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11251から20 </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 12-544-7 </td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 12から548-5M </td><td></td></tr></tbody></table>

全体の開発、 ショウジョウバエの脳のex vivoで培養

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

我々は全体のショウジョウバエの脳のex vivoで培養する方法を説明します。これは急性の薬理学的介入と細胞プロセスのライブイメージングを可能にすることにより、細胞生物学と中央脳構造の開発を調査するための慢性的な遺伝子操作に対位法として使用することができます。技術の一例として、我々の研究室1から前の仕事は、以前に認識されていない細胞内コンパートメントは、 ショウジョウバエ中枢脳の軸索の軸索と細胞体のコンパートメントの間にあることが示されている。軸索起始部（AIS）2と呼ばれるこの区画の開発は、ニューロン特異的サイクリン依存性キナーゼ、Cdk5を依存するように遺伝的に示された。私たちは、Cdk5を特異的薬理学的阻害剤ロスコビチンとオロモウシン3野生型のショウジョウバエの幼虫の脳のex vivoでの治療はアクチン組織の急性変化を引き起こすこと、およびここに示す遺伝的にCdk5を活性を欠く変異体では見られた変化を模倣する細胞表面タンパク質Fasciclin 2の局在インチ ex vivoでの培養技術の第二の例は、幼生から成体への変態期胚のキノコ体（MB）γニューロンの接続の改造のために提供されています。キノコ体は嗅覚学習とフライ4のメモリの中心であり、これらのγニューロンは成体の神経支配パターン5を確立するために後でタイムポイントでの再拡張に分岐して蛹開発中に、その軸索と樹状突起の枝を剪定します。 MBのこれらのニューロンのプルーニングは、エクジソン受容体B1 7で演技、エクジソン、ステロイドホルモンによって引き起こされるメカニズムによって、神経突起の分岐6のローカル変性を介して起こることが示され、それがの活性に依存しているされていますユビキチン-プロテアソームシステム6。 ex vivoでの培養の我々の方法は、bができますeはさらに発達リモデリングのメカニズムを調べるために使用されます。我々は、ex vivoで培養設定では、MBのγニューロンは in vivoと同様の時間経過とともに発達剪定の過程をrecapitulatedことがわかった。それは変態と不可逆的にコミットするために細胞ために組織をexplanting前蛹殻形成後1.5時間まで待つことが、不可欠であった。pupariation開始時の動物の解剖は、培養中のほとんど、あるいはまったく変態につながった。したがって、適切な修正を加えて、ex vivoで培養アプローチは中心的な脳の生物学の定常状態の側面だけでなく、動的な学習に適用することができます。

この資料では、1つは、模倣することができるようにする方法について説明します。<emin vivoでの&gt;</emの&gt;開発<em&gt;ショウジョウバエ</emで&gt;キノコ体<em&gt; ex vivoで</em&gt;培養系。

ショウジョウバエの脳全体をex vivoで培養する方法について記述します。本手法は、...に対する慢性的な遺伝学的操作の対照として利用可能です。

本手順の全体的な目的は、発達段階にあるショウジョウバエの成虫、幼虫、および蛹の脳をex vivoで培養することです。まず、適切な段階のショウジョウバエ、幼虫、および蛹を選別し、次いで速やかに脳を摘出することでこれを達成します。その後、脳を25°Cで必要な期間培養します。最後に、培養した脳を固定、染色、封入し、撮影します。最終的に、ex vivo培養法によって、キノコ体のin vivoでの発達を模倣することが可能であることが示されました。本手法の既存手法に対する主な利点は、ex vivoの培養条件下でショウジョウバエのキノコ体にin vivoの表現型を模倣でき、発生プロセスのダイナミクスを高解像度で解析することが可能になった点です。幼虫の脳を培養するには、まずインスリンとAct-Dを添加した新鮮な完全培地を準備し、薬剤処理用のインサート付き12 mm細胞培養ディッシュに500 µL分注します。次に、100 µMずつのRoc-battinおよびoli-moinを含む完全培地を準備します。少量の培地を解剖用時計皿に加えます。小型のスパチュラを用いて、徘徊している3齢幼虫を回収し、時計皿に入れます。次に、ピンセットで幼虫の後端を保持します。次に、5番のピンセットを用いて前端を慎重に開き、腹側神経索を損なわなように注意しながら脳を迅速に摘出します。あらかじめ濡らしておいたピペットチップを使用し、摘出した脳をあらかじめ準備した細胞培養ディッシュに慎重に移します。次に、ウェットチャンバーを作成し、その中にディッシュを設置します。瞳孔脳を培養するため、脳を25 °Cで最大48時間インキュベートします。まず、バイアルに白い点（puy）を付けてマークします。この段階をER形成後0時間、またはPFを1.5時間として記録します。インサート付きの12mm細胞培養ディッシュに、完全培地を500 microliters加えます。あらかじめ準備した培地を少 amount、解剖用ウォッチグラスに加えます。次に、濡らした小型スパチュラを用いて、解剖用に印をつけられたPPEを回収し、ウォッチグラスに入れます。左側の白い蛹が0時間の時点であり、右側はPF後1.5時間の時点を示しています。次に、ピンセットで蛹の後端を固定しながら、5番ピンセットを使用して蛹のケースの前端を慎重に開きます。その後、腹側神経索を無傷で付着させたまま、脳を迅速に摘出します。20 µLプラスチックチップの先端を切り落とした後、ピペットチップを湿らせ、それを用いて蛹の脳を培地入りのディッシュに慎重に転送します。25 °Cで目的の時間だけインキュベートします。幼虫または蛹の脳を目的の時間インキュベートした後、培地を除去し、PBST緩衝液で調製した4%ホルムアルデヒドを500 µL加えます。15分間インキュベートした後、新しい緩衝

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神経科学

このビデオでは、後期ショウジョウバエ蛹の脳からの初代神経培養の準備を示しています。ライブ文化の景色は、フラ-2を使用してカルシウム濃度の神経突起伸長とイメージングを示す。...

後期ステージショウジョウバエ蛹の脳からの初代神経培養

このビデオでは、標準のセル全体の技術を使用して単一ニューロンから記録するための準備のために成人のショウジョウバエから全脳を単離するための手順を示しています。それは、記録中に表示したGFP標識された細胞と神経細胞のイメージが含まれます。...

アダルトショウジョウバエの脳から全細胞レコーディング

このプロトコルは、次の3つについて説明します...

開発と大人の準備ショウジョウバエ</emライブイメージングのための>脳と網膜

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このビデオは、ショウジョウバエの脳神経幹細胞の静止状態からの再活性化を開始する外因性因子を特定するためのプロトコルを示しています。孵化したばかりの幼虫を解剖して脳を分離し、その後、試験ホルモンの有無にかかわらず培地で培養して、神経幹細胞の再活性化と増殖を誘導するホルモンの可能性を評価します。...

培養ショウジョウバエ脳外植片における神経幹細胞の再活性化の解析

出典: Ishimoto, H. et.al., Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain responses to Endocrine Signaling in Drosophila. J. Vis. Exp. (2018)...

神経ペプチドに対するショウジョウバエの脳応答を研究するための Ex vivo カルシウムイメージング

このプロトコルは、無傷の幼虫の脳のコンテキストで生細胞イメージングを行うために使用合理化された方法を説明します。ライブセルイメージングのアプローチは、一貫して、以前に見落とされたメカニズムを暴く、非対称神経幹細胞分裂の研究だけでなく、他の神経と発達過程のための非常に貴重である。...

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経芽細胞

大人ショウジョウバエの脳は神経回路、高次脳機能、および複雑な疾患を研究するための貴重なシステムです。小さなハエの頭から全脳組織を分析するための効率的な方法は、脳ベースの研究を促進します。ここでは、よく保存された形態を有する成人の脳の簡単な、ワンステップ解剖プロトコルを記述します。...

大人のホールマウントの準備のためのシンプルなワンステップ解剖プロトコル<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ブレインズ

このプロトコルの目標は、前のヴィヴォ ショウジョウバエ幼虫の脳文化が長期的な蛍光タイムラプス...

単一セルの解像度蛍光は住む幼虫脳文化のショウジョウバエ概日時計のイメージング

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Ex Vivoショウジョウバエにおける内分泌シグナル伝達する脳の反応を可視化するためのカルシウム イメージング

培養ショウ ジョウバエ 脳外植体において静止期神経幹細胞を再活性化する方法が確立されている。この方法を用いて、神経幹細胞の静止、入口および退出の調節において、全身性シグナルの役割を組織内因性シグナルから切り離すことができる。...

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全体の開発、 ショウジョウバエの脳のex vivoで培養

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