全体の開発、 ショウジョウバエの脳のex vivoで培養

この手順の全体的な目標は、発育中のショウジョウバエ、幼虫、瞳孔の脳全体を生体外で培養することです。これは、最初に適切な段階のショウジョウバエ、幼虫、および蛹を特定することによって達成されます。次に、脳をすばやく解剖します。

その後、脳を摂氏25度で必要な時間培養します。最後に、培養された脳を固定し、染色し、マウントし、画像化します。最終的に、結果は、ex vivo培養技術を通じてophキノコ本体のin vivo開発を模倣することが可能であることを示しています。

この手法が既存の方法よりも優れている点は、ex vivo培養環境でショウジョウバエの体内のin vivo表現型をエミュレートできるようになったことであり、幼虫の脳を培養する発達過程のダイナミクスを高解像度で分析できるようになったことです。インスリンを含む新鮮で完全な培地を調製した後、薬物治療用のインサート付き12mm細胞培養皿に500マイクロリットルでダイソンを作用させます。Rosco battinとoli moinをそれぞれ100マイクロモルで完全な培地を調製します。

解剖液に少量の培地を加えます。小さなヘラを使用して時計ガラスを使用し、さまよう3番目の幼虫を拾い上げて時計のガラスに入れます。次に、鉗子を使用して幼虫の後端を保持します。

次に、5番の鉗子で、前端を慎重に開き、腹側神経索を無傷に保ちながら脳をすばやく解剖します。事前に濡れたピペットチップを使用して、事前に準備した細胞培養皿に脳を慎重に移します。次に、濡れたチャンバーを作り、チャンバー内に皿を置きます。

脳を摂氏25度で最大48時間インキュベートして、瞳孔の脳を培養します。バイアルに白いピュイをマークすることから始めます。このステージは、ER形成の0時間後、または1.5時間後のPFとして記録します。

A PF インサート付きの12mm細胞培養皿に500マイクロリットルの完全培地を加えます。少量の準備した培地を解剖時計のグラスに加えます。次に、小さな濡れたヘラを使用して、以前に解剖用にマークされたPPEをピックアップし、ウォッチグラスに入れます。

左側の白い蛹がゼロ点、右側が1.5時間のA PFを示しています。次に、ピュイの後端を一対の鉗子で保持しながら、5番の鉗子を使用して、蛹ケースの前端を慎重に開きます。次に、腹側神経コードを無傷で取り付けたまま、脳をすばやく取り除きます。20マイクロリットルのプラスチックチップの上部を切り取った後、ピペットチップを濡らし、それを使用して瞳孔の脳を中型の皿に慎重に移します。

それらを摂氏25度で所望の時間インキュベートします。幼虫または瞳孔の脳を所望の時間インキュベートした後、培地を取り出し、PBSTバッファーに500マイクロリットルの4%ホルムアルデヒドを加えます。15分間インキュベートした後、新たに緩衝した4%ホルムアルデヒドと交換し、さらに15分間インキュベー

0.5%Triton X 100のXPBSを1つ使用して、脳を10分間ずつ4回洗浄します。最後の洗浄後、サンプルを1時間インキュベートします。ブロッキングソリューションで。

ブロッキング溶液に一次抗体を添加し、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌朝、サンプルをPBSTで4回、それぞれ10分間洗浄します。その後、二次抗体を室温で4時間インキュベートします。

洗浄手順を繰り返して、顕微鏡検査用の脳を取り付けます。まず、平衡化して培地を1時間封入し、サンプルが押しつぶされないようにスライドガラスに封入します。ガラスチップを両側に置きます。

次に、カバースリップをマニキュアで密封した後、カバースリップを塗布します。スライドは暗闇に保管してください。この図は、野生型のハエおよびCDKファイブまたはCDKファイブdnの支配的な負の誘導体を発現するハエからの第3インスター幼虫の脳のパネルを示しており、両者は前述のようにキノコ体またはMBガンマニューロンでアクチンGFPを発現し、野生型ガンマニューロンの近位軸索にはアクチンGFPを蓄積できない領域があり、 したがって、明確なゾーンとして現れ、筋膜的には2つのタンパク質がこのゾーンの腹側境界までのみ軸索に蓄積します。

点線はMBの位置を示し、作用するクリアゾーンとその腹側の境界を強調しています。CDKを発現するハエで5dn。アクチンクリアゾーンは存在せず、筋膜的には2つまたは速い2つの免疫反応性がその領域を介して背側に広がり、ここで提示された方法を使用して、野生型のハエの脳をexvivo培養するために、CDKの5つの活性ROSコッチンとエンの薬理学的阻害剤の組み合わせで処理した。

ここに示されているのは、ハエに似た制御および薬物処理された野生型ハエの第3インスター幼虫脳のパネルであり、CDKファイブインヒビターで24時間処理されたドミナントネガティブなCDKファイブコンストラクト脳を発現し、明確なゾーンと高速シフトの特徴的な損失を示しています。2本の境界の白い線は、野生型fastの位置を示しています。ここに示されている2つの境界は、0時間から10時間までのショウジョウバエの体の代表的なシリーズです。

メンブレンターゲットで標識されたPF。MCDの8つのGFP括弧は、変態前のがくと呼ばれるMBの樹状突起を示しています。MB軸索は厚い束で背側に流れ、密集した樹状突起から蛍光シグナルが生じます。

この列は、示された時間に解剖された脳を示しています。括弧で示された領域の樹状突起の剪定は、PFの6〜8時間までに、ヘイズ樹状突起信号がなくなることに注意してください。このコラムの脳は、内部作用のゼロ時間A PFで解剖されました。

当時のダイソンスパイクと培養されたx vivoは、これらが樹状突起の発達的剪定を示さないことを示しました。むしろ、樹状突起シグナルは、ゼロ時間EPFでマークされたこのPPRを回避するためにPFを10時間で持続させますが、PFを1.5時間で解剖して培養します。このコラムでは、これらのDLAマッシュルーム本体の代表的なシリーズを0時間から10時間まで紹介します。

PFは、非培養サンプルと同様に、樹状突起シグナルはPFを8時間検出できません。このビデオを見た後、あなたは培養する方法をよく理解しているはずです rosler 脳をex vivoで保持する方法。あなたは、変態にコミットするホルモンスパイクの前または後に、後期の幼虫または白いPrepUから脳を分離できるはずです。その後、固定された材料を顕微鏡で分析するか、脳をライブイメージングの出発材料として使用できるようになります。