Transfektera RAW264.7 Celler med en luciferasrapportörgen

Introduction

Transfektion av nukleinsyror i celler har ett mångsidigt program i vetenskaplig forskning. Exempel innefattar (1) reportergener för att studera betydelsen av olika genelement i genuttryck, (2) protein expressionsplasmider för att överuttrycka proteinet av intresse, och (3) små störande RNA för att nedreglera genuttryckning. Genom att manipulera expressionsnivån av vissa gener och mäta den differentiella effekten av sådana manipulationer kan forskarna härleda genfunktioner i de valda biologiska system. Inte alla transfektionsmetoder ger samma transfektionseffektivitet, och till och med samma transfektion metod inte transfektera alla celltyper lika ^1. Därför har olika transfektion metoder utvecklats, såsom kalciumfosfatmetoden, DEAE-dextran, katjonisk lipid-transfektion, katjonisk icke-lipid-polymer-transfektion, elektroporering, och nucleofection ^2,3.

Transfektion in i makrofager är särciellt svårt på grund av det faktum att makrofager är professionella fagocyter som är mycket känsliga för främmande material inkluderande bakterier härledda (metylerat) DNA ^4. Införande av främmande DNA aktiverar Toll-like receptor 9 (TLR9) väg som leder till produktionen av cytokiner och kväveoxid ^5,6. Dessa aktiverade makrofager kan då vara mindre känsliga för behandling som forskarna har för avsikt att undersöka.

Vårt laboratorium rutinmässigt transfects den RAW264.7 makrofagcellinje med luciferas reportergener, och vi har utvecklat ett protokoll som är tillräckligt robust för att ha luciferas signal betydligt högre än bakgrunden, men också tillräckligt skonsam för makrofager att ligga kvar på sitt vilotillstånd. Beteenden av de transfekterade cellerna utvärderades genom ett eldfluga-luciferas reportergen härbärgepromotorregionen för IκBζ (pGL3- IκBζ). IκBζ uttryck uppregleras av bakteriecellväggskomponent läppopolyssacharide (LPS) ^7,8, och nedregleras av anti-inflammatorisk cytokin, interleukin-10 (IL-10) ^8. Att ta hänsyn till transfektion variation bland brunnar, vi samar transfektera en kontrollplasmid innehållande Renilla luciferas genen (t.ex. phRL-TK) för normaliseringsändamål. Protokollet som beskrivs är optimerad efter att ha testat olika parametrar inklusive tidpunkten för transfektion, typ av transfektionsreagens, mängder transfektionsreagens och plasmid-DNA, såväl som förhållandet av transfektionsreagens till plasmid-DNA. De två transfektionsreagenser ingår i detta protokoll är (1) en lipidbaserad transfektionsreagens och (2) ett protein / polyamin-baserade transfektion reagens.

Protocol

1. Plasmid-DNA Rening

1. Extrahera plasmid-DNA med användning av ett maxiprep-kit enligt tillverkarens protokoll. Resuspendera plasmid-DNA i 500 | il TE-buffert.
2. Utför en fenol: kloroform: isoamylalkohol-extraktion och isopropanolutfällning att avlägsna kvarvarande bakteriella föroreningar. Närvaron av LPS stör transfektion ^9.
   1. Lägg 500 | il fenol: kloroform: isoamylalkohol (25: 24: 1, pH 8) till plasmid-DNA och skaka kraftigt i 15 sek. Fenol orsakar allvarliga frätskador på hud och är ett bedövningsmedel så brinner inte alltid känt förrän det finns allvarliga skador. Utför fenol: kloroform: isoamyl utvinning i dragskåp och försiktig.
3. Inkubera blandningen i 5 min vid rumstemperatur. Centrifugera vid 13.000 xg under 10 min vid RT. Överför 350 | il av den övre vattenfasen i en ny 1,5 ml uppsamlingsrör.
4. Lägg 350 | il TE-buffert till röret som innehåller den undre organiska fasen. Skaka kraftigt i 15 sekunder. Centrifugera vid 13.000 xg under 5 min vid RT. Överför 350 pl övre vattenfasen till samma 1,5 ml provrör.
5. Lägg 70 | il 3 M natriumacetat (pH 5,2) och blanda väl. Lägg 700 pl 100% isopropanol. Blanda väl och inkubera 10 min vid RT. Centrifugera vid 13.000 xg under 10 Minat 4 ° C. Avlägsna supernatanten.
6. Lägg 500 pl av 75% etanol till pelleten. Vortex prover för att blanda och centrifugera vid 5000 xg under 5 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten. DNA är i pelleten.
7. Öppna locket på röret och lufttorka pelleten vid RT under 5 - 10 min. Pelleten bör bli genomskinlig. Lägg 500 | il TE-buffert för att resuspendera DNA-pelleten. Värm vid 50-60 ° C under 10 min för att lösa upp DNA-pelleten.
8. Mät absorbansen vid 260 nm (A260) och 280 nm (A280) med en spektrometer. Beräkna koncentrationen av DNA genom att multiplicera A260 värde av 50 ng / ul. Bedöma kvaliteten på DNA genom calculating A260 / A280-förhållande. DNA med hög kvalitet bör ge en A260 / A280 förhållandet 1,8-2,0.

2. Cell Odling och sådd

1. Kultur RAW264.7-celler i DMEM kompletterat med 9% fetalt kalvserum (DMEM / 9% FCS) i en 37 ° C, 5% _CO2 inkubator. Under varje passage, lossa cellerna från plattan genom kontinuerlig pipettering med hjälp av en pasteurpipett. Passage cellerna var 2 dagar, och frö 1,5-2.000.000 celler på en 10 cm vävnadskultur behandlas maträtt som lager. Tina en ny lager av celler var 5 - 6 veckor.
2. På dagen för transfektion, utsäde 200.000 celler per brunn i en 24-brunnsplatta i en volym av 500 | il av DMEM / 9% FCS. Inkubera cellerna i 4 h i 37 ° C inkubator.
3. Transfektera celler antingen med lipid-baserade reagens (steg 3,1) eller protein / polyamin-reagens (steg 3,2).

3. Transfektion

1. Lipidbaserat transfektion:
   1. Värm upp transfektion reagent till RT i mörker. Värm upp serumfritt medium och DMEM / 9% FCS till 37 ° C.
   2. Lägg 0,5 ^ g av plasmid-DNA till 50 | il av serumfritt medium i ett 1,5 ml rör. Lägg 2 pl av transfektionsreagens med pipettspetsen under ytan av vätskan. Vortex för 6 sekunder.
   3. Låt reagenset / DNA-blandningen i mörker vid RT i 30 min.
   4. Under 30 minuter inkubation, ta bort media från brunnen och tillsätt 250 pl färsk DMEM / 9% FCS till varje brunn.
   5. Efter 30 minuter, tillsätt 250 | il av DMEM / 9% FCS till reagenset / DNA-blandningen. Blanda väl genom att pipettera upp och ned.
   6. Lägg 300 pl av den utspädda blandningen till varje brunn. Inkubera under 2-4 h i en 37 ° C, 5% _CO2 inkubator.
   7. Ta transfektion lösning och tillsätt 500 pl DMEM / 9% FCS. Inkubera under 24-48 h i en 37 ° C, 5% _CO2 inkubator före cellstimulering.
2. Protein / polyamin-baserade transfektion:
   1. Värm upp serumfrittmedium och DMEM / 9% FCS till 37 ° C.
   2. Lägg 0,75 pl transfektionsreagens till 18,75 il serumfritt medium. Kort Vortex att blanda. Inkubera vid rumstemperatur under 5 minuter. Tillsätt 0,5 pl av 1 mikrogram / l DNA i den utspädda transfekterade reagens. Inkubera vid rumstemperatur under 10 minuter.
   3. Under 10 minuter inkubation, avlägsna media från varje brunn i 24-brunnar och tillsätt 250 | il färskt DMEM / 9% FCS till varje brunn.
   4. Efter 10 minuter, tillsätt 250 | il av DMEM / 9% FCS i reagenset / DNA-blandningen.
   5. Lägg 270 pl av den utspädda blandningen till brunnen. Inkubera i en 37 ° C och 5% _CO2 inkubator under 2-4 timmar.
   6. Ta transfektion lösning och tillsätt 500 pl DMEM / 9% FCS. Inkubera under 24-48 h i en 37 ° C, 5% _CO2 inkubator.

4. cellstimulering och Luciferase Assay

1. Byt media i brunnen med 250 pl av färskt DMEM / 9% FCS.
2. Tillsätt 50 pl LPS eller LPS + IL-10 Vid de önskade koncentrationerna till brunnen. Återför plattan till 37 ° C, 5% _CO2 inkubator. Stimulera 2 - 6 timmar.
3. Ta stimulering lösning genom aspiration, tvätta med iskall PBS och tillsätt 200 pl 1x Passive Lysis Buffer. Rock vid RT i 30 min. Skrapa och överföra lysatet till 1,5 ml rör och avlägsna cellrester genom centrifugering vid 20.000 xg under 10 minuter vid 4 ° C.
4. Överföring 40 pl av klarnat lysat (supernatant) till en vit, klar botten 96-brunnar för bestämning av luciferas signaler enligt tillverkarens protokoll.
5. Läs luciferas signalen med en luminometer över hela det synliga ljusspektrumet.

5. Dataanalys

1. Beräkna firefly: Renilla förhållandet genom att dividera enskilda värden för eldflugeluciferas av värdena Renilla luciferas från varje brunn.
2. Beräkna faldig förändring genom att dividera firefly: Renilla förhållandet mellan den behandlas väl avden för den obehandlade brunn.

Representative Results

Figur 1 jämför transfektion effektiviteten hos de två transfektionsreagenser i RAW264.7. Lipid-baserade reagens gav typiskt omkring 25% transfektion hastighet medan proteinet / polyamin-baserade transfektion resulterade i ca 5% effektivitet (Figur 1A). Skillnaden i transfektionseffektivitet observerades också i luciferas signaler i RAW264.7-celler transfekterade med pGL3-IκBζ promotorreporter (Figur 1B). Tillsats av LPS till dessa transfekterade celler ökade eldflugeluciferas signalen, en direkt indikation på ökad transkription aktiviteten hos IκBζ promotor reportern. Med andra ord, tydde resultaten på att LPS uppreglerade expressionen av IκBζ genen, i överensstämmelse med tidigare rapporter ^7,8. Figur 2 visar de typiska resultat som erhållits i våra experiment, med användning av lipidbaserade transfektion som ett exempel. Efter att ha fått individuella signalvärden från firefly luciferas och Renilla-luciferas (figurerna 2A och 2B), de eldflugeluciferas signaler normaliserades till Renilla-luciferas-signalen (fig 2C). Normalisering rekommenderas på grund av väl till brunnar variationen i transfektionseffektivitet. För att ta reda på om behandlingsbetingelserna (LPS eller LPS + IL-10) ändrat reporter signaler, Firefly: Renilla förhållande (dvs de normaliserade signaler) av behandlingsgrupperna jämfördes med den hos obehandlade (ostimulerad) prov (Figur 2D ). Våra data visade att behandling RAW264.7-celler med LPS uppregleras aktiviteten hos pGL3-IκBζ promotorreporter, vilket indikerar att LPS ökade transkriptionsnivån för IκBζ genen. I närvaro av IL-10, den IκBζ promotorreporter hade lägre aktivitet, vilket tyder på att IL-10 kunde inhibera LPS-inducerad transkription av IκBζ genen. Proteinet / polyamin-baserade transfektion vanligtvisgav lägre värden i både eldflugeluciferas och Renilla luciferas signaler. Figur 3 jämför hur lång vilotid mellan transfektion och stimulans (24 timmar eller 48 timmar), och visar att luciferas signaler minskat över tiden. Minskningen i signalen inte stör datatolknings när lipidbaserade transfektionsreagens användes (figur 3A); induktion av LPS och hämning av IL-10 observerades fortfarande efter 48 timmar av vila. Men var minskningen i signal större när proteinet / polyamin-baserade transfektion reagens användes (Figur 3B), särskilt Renilla luciferas signaler. Som ett resultat, var skillnaden mellan behandlingsgrupperna inte observeras efter en 48 h vila.

En oönskad effekt av transfektion är celldöd så effekterna av varje transfektion metod på graden av apoptos bedömdes. Celler transfekterades, eller inte, och utsattes för annexin-V och propidiumjodid (PI)färgning. Lysat som framställts från dessa celler analyserades också med avseende på närvaron av intakt och klyvd poly ADP-ribos-polymeras (PARP) -protein. Flödescytometrisk analys av annexin-V / PI färgade celler föreslog att lipidbaserade transfektion ökade något andelen Annexin-V-positiva celler jämfört med de otransfekterade cellerna, medan proteinet / polyamin-baserade transfektion inte (Figur 4A) . På liknande sätt lipidbaserade transfekterades något ökat andelen spjälkas PARP medan proteinet / polyamin-baserade transfektion inte (Figur 4B). Men trots de förhöjda antalet apoptotiska celler, morfologin hos cellerna genom Ijusmikroskopi förändrades inte (Figur 4C). Ännu viktigare, förblev det biologiska svaret av de lipidbaserade transfekterade celler identiska med de för de otransfekterade celler (Figur 4D). Cellerna stimulerades med LPS ± IL-10, och mängderna av TNF ^5; utsöndras i kultursupernatanten kvantifierades genom ELISA. Både de otransfekterade och lipidbaserade transfekterade celler gjort liknande mängder av TNFa som svar på LPS och inhiberades genom tillsats av IL10. Ingen TNFa gjordes när cellerna inte stimulerades (Figur 4D) tyder på att cellerna förblev naiv efter transfektion.

Figur 1. lipidbaserad transfektion gav högre transfektionseffektivitet än protein / polyamin-baserade transfektion. (A) RAW264.7 celler transfekterades en GFP-uttryckande plasmid med antingen lipidbaserade eller protein / polyamin-baserade transfektionsreagenser. GFP-signal mättes med flödescytometri efter 24 h. (B) RAW264.7-celler transfekterades med pGL3-IkBζ promotorreporter. Efter 48 timmar vila, calnar stimulerades med LPS under 6 timmar. Eldflugeluciferas signal mättes enligt tillverkarens anvisningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Typiska luciferas analysuppgifter. RAW264.7 celler transfekterades med TK-Renilla och IkBζ promotor reporter. Efter 24 h vila, stimulerades cellerna med LPS ± IL-10 för 2 timmar. (A) Eldflugeluciferas och (B) Renilla luciferas signaler mättes enligt luciferasanalys tillverkarens instruktioner. (C) Reporter aktivitet normaliserades till TK-Renilla-signalen och avsattes som Firefly / Renilla-förhållande. (D) Vik förändring beräknas genom att dividerafirefly. Renilla förhållandet mellan de stimulerade proverna från den hos ostimulerade provet Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Styrkan i luciferas-signalen är tidsberoende. (A) lipidbaserade transfekterade och (B) Protein / polyamin-baserade transfekterade cellerna fick vila för antingen 24 h eller 48 h före stimulering med LPS ± IL-10 under 2 h. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

(A) RAW264.7 celler transfekterades med IkBζ promotor reporter. Efter 24 timmar vila, var celldöd bestämdes genom Annexin-V och propidiumjodid (PI) färgning på en flödescytometer. (B) Transfekterade celler underkastades immunblotting-analys för PARP (full längd och klyvs) och GAPDH (laddningskontroll). Bandintensiteter ades sedan kvantifieras med hjälp av bildprogram. L = lipidbaserad transfektion, P = protein / polyamin-baserade transfektion, STP = 0,1 iM staurosporin. (C) Mikroskop bilder av celler transfekterade med lipidbaserade transfektionsreagens. (D) Celler transfekterade med lipidbaserade transfektionsreagens stimulerades med LPS ± IL-10 för 6 timmar, och nivåerna av pro-inflammatoriska cytokiner TNF mättes med hjälp av ELISA. Klicka hanre att se en större version av denna siffra.

Discussion

Protokollet som beskrivs här inte enbart fokusera på transfektionseffektivitet, utan syftar till att hitta en balans mellan effektivitet och bevarande av fysiologiska tillstånd hos cellerna. Specifikt lyckas vårt förfarande för att minimera toxicitet transfektionsreagens och maximera luciferas signal.

Ett kritiskt steg i protokollet är hälsan hos cellerna. Igenvuxna kulturer är inte lämpliga för transfektion som deras fysiologi förändringar, och kontinuerlig odling av RAW264.7 celler under en lång tid kan också ändra fenotyp och funktion hos cellerna ^10. Nyligen tinade celler som har ett lågt passagenummer rekommenderas att använda för transfektion.

En annan viktig faktor är valet av transfektionsreagenser. Lipidbaserade transfektionsreagens används typiskt i forskning på grund av dess användarvänlighet och kommersiella tillgänglighet. Vissa av dessa reagens orsakade unintended (och oftast oönskade) förändringar i den globala genuttryck i transfekterade celler ^11,12. För att lösa detta problem, är celler endast inkuberas med transfektionsreagens under några timmar i stället för den typiska O / N, eller en icke-lipidbaserat reagenset väljs för transfektion. Längre inkubationstid med transfektionsreagens ökar transfektionseffektivitet, men det kan också vara skadligt för cellerna antingen orsaka celldöd eller cellaktivering, som båda kan störa experimentell design. Figurerna 4A och 4B visar att proteinet / polyamine- baserade transfektion inte orsaka apoptos eller nekros, jämfört med otransfekterade celler. Lipid-baserade transfektion, även med kort inkubationstid, orsakade högre grad av celldöd. Det är korrelerad till högre transfektionseffektivitet hos lipidbaserade transfektionsreagens. Emellertid, när de transfekterade cellerna observerades under mikroskop, fanns det ingen märkbar morfologisk förändrings (Figur 4C). Aktiverade makrofager anta vanligtvis ett spretigt form, men båda de otransfekterade och transfekterade celler visade inte tecken på aktivering före stimulering, vilket tyder på att de var i sina vilande tillstånd. Dessutom, de transfekterade cellerna reagerade liknande till LPS och IL-10-stimulering som de otransfekterade celler (Figur 4D). Dessa observationer tyder sammantaget att denna transfektion förfarande inte ändrar cellernas naturliga beteende.

Tiden mellan transfektion och experimentell behandling (vilotiden) är också avgörande. Tillräcklig tid måste ges för luciferas gener för att uttrycka och för cellerna att återupprätta sitt vilotillstånd; kan dock en lång inkubationstid minska luciferas signaler, speciellt när transfektion effektivitet är inte hög.

Tillvägagångssättet här gäller den specifika luciferasreportergenen används i vårt labb. Smärre justeringar kommer att vara needed när en annan reporter används. Parametrar som ska testas innefattar olika eldflugeluciferas reporter: Renilla luciferas förhållande, vilotiden mellan transfektion och behandling, och behandlingsförhållanden. En 50: 1 förhållande av pGL3-IκBζ: phRL-TK används typiskt, men förhållandet kan variera från 1: 1 till 100: 1. Det visade sig att en 24 h vila mellan avlägsnandet av transfektionslösningen från cellerna och början av experimentella behandlingen gav den bästa signalen. Efter 48 timmar började luciferas signaler minskar, och skillnader mellan behandlingsgrupperna minskade eller till och med avskaffas.

Det beskrivna transfektionsförfarandet är inte begränsad till luciferas reporter analyser. Andra experimentell design som inte behöver en homogen befolkning kommer att gynnats; till exempel fluorescerande mikroskopi som bygger på observationer från enskilda celler. En nackdel är att lokalisera framgångsrikt transfekterade celler bland otransfekterade motsvarigheter, menfördelarna med att vara mindre tidskrävande och arbetsintensiv kan mer önskvärt. I de fall där stabila cellinjer är föredragna, ger våra protokoll ett medelvärde för inledande experiment där försöksförfarandet kan optimeras när stabila cellinjer genereras.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit	Life Technologies	K210007	Any maxiprep kit will work
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol	Life Technologies	15593-049	Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container.
DMEM	Thermo Scientific	SH30243.01	Warm in 37 °C water bath before use.
Fetal bovine serum	Thermo Scientific	SH30396.03	Inactivated at 56 °C water bath for 45 min before use.
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070	Warm to at least room temperature before use.
XtremeGene HP DBA transfection reagent	Roche	6366236001	Warm to room temperature before use.
GeneJuice	EMD Millipore	70967	Warm to room temperature before use.
5x Passive Lysis Buffer	Promega	E1941	30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System
Dual Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1910