एक luciferase रिपोर्टर जीन के साथ RAW264.7 प्रकोष्ठों Transfecting
Summary
Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell’s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.
Abstract
Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency1, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.
Introduction
कोशिकाओं में न्यूक्लिक एसिड की अभिकर्मक वैज्ञानिक अनुसंधान के क्षेत्र में एक विविध आवेदन किया है। उदाहरण (1) रिपोर्टर जीन, जीन अभिव्यक्ति में जीन के विभिन्न तत्वों की भूमिका का अध्ययन करने के लिए (2) प्रोटीन अभिव्यक्ति plasmids ब्याज की प्रोटीन overexpress करने के लिए, और (3) छोटे आरएनए हस्तक्षेप जीन अभिव्यक्ति downregulate के लिए शामिल हैं। विशेष जीनों की अभिव्यक्ति के स्तर से छेड़छाड़ और इस तरह के जोड़तोड़ का अंतर प्रभाव को मापने के द्वारा, शोधकर्ताओं चुना जैविक प्रणालियों में जीन कार्यों परिणाम निकालना कर सकते हैं। नहीं सभी अभिकर्मक तरीकों एक ही अभिकर्मक क्षमता प्रदान करते हैं, और यहां तक कि एक ही अभिकर्मक विधि समान रूप से 1 सभी प्रकार की कोशिकाओं transfect नहीं करता है। इसलिए, अलग अभिकर्मक तरीकों कैल्शियम फॉस्फेट विधि, DEAE dextran, cationic लिपिड अभिकर्मक, cationic गैर लिपिड बहुलक अभिकर्मक, इलेक्ट्रोपोरेशन, और nucleofection 2,3 के रूप में इस तरह विकसित किया गया है।
मैक्रोफेज में अभिकर्मक खासकर हैखासकर मुश्किल की वजह से मैक्रोफेज (methylated) डीएनए 4 व्युत्पन्न बैक्टीरिया सहित विदेशी माल के लिए बहुत संवेदनशील होते हैं कि पेशेवर फ़ैगोसाइट तथ्य यह है कि करने के लिए। विदेशी डीएनए का परिचय साइटोकिन्स और नाइट्रिक ऑक्साइड 5,6 के उत्पादन के लिए अग्रणी टोल की तरह रिसेप्टर 9 (TLR9) मार्ग को सक्रिय करता है। ये सक्रिय मैक्रोफेज तो शोधकर्ताओं की जांच करने का इरादा है कि इलाज के लिए कम जिम्मेदार हो सकता है।
हमारी प्रयोगशाला नियमित luciferase संवाददाता जीन के साथ RAW264.7 बृहतभक्षककोशिका सेल लाइन transfects, और हम पृष्ठभूमि की तुलना में काफी अधिक luciferase संकेत करने के लिए पर्याप्त मजबूत है कि एक प्रोटोकॉल विकसित की है, लेकिन मैक्रोफेज उनके आराम की स्थिति में रहने के लिए पर्याप्त भी कोमल है। ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के व्यवहार IκBζ (pGL3- IκBζ) के प्रमोटर क्षेत्र को शरण देने के एक जुगनू-luciferase संवाददाता जीन द्वारा मूल्यांकन किया गया। IκBζ अभिव्यक्ति बैक्टीरिया कोशिका दीवार घटक होंठ से upregulated हैopolyssacharide (एलपीएस) 7,8, और विरोधी भड़काऊ साइटोकाइन द्वारा downregulated, इंटरल्युकिन 10 (आईएल -10) 8। कुओं के बीच अभिकर्मक विभिन्नता के लिए खाते में करने के लिए, हम सामान्य बनाने के उद्देश्य के लिए Renilla luciferase जीन (जैसे, phRL-टी) युक्त नियंत्रण प्लाज्मिड transfect सह। वर्णित प्रोटोकॉल डीएनए प्लाज्मिड के लिए विभिन्न अभिकर्मक के समय, अभिकर्मक अभिकर्मकों के प्रकार, अभिकर्मक अभिकर्मकों और प्लास्मिड डीएनए की मात्रा सहित पैरामीटर, साथ ही अभिकर्मक अभिकर्मक के अनुपात के परीक्षण के बाद अनुकूलित है। इस प्रोटोकॉल में शामिल दो अभिकर्मक अभिकर्मकों (1) एक लिपिड आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक और (2) एक प्रोटीन / polyamine आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल केवल अभिकर्मक दक्षता पर ध्यान केंद्रित नहीं करता यहाँ वर्णित है, लेकिन कोशिकाओं के शारीरिक राज्यों की क्षमता और संरक्षण के बीच एक संतुलन कायम करना है। विशेष रूप से, हमारे प्रक्रिया अभिकर्म?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was funded by Canadian Institutes for Health Research (CIHR) grant. STC holds a doctoral research award from the CIHR and the Michael Smith Foundation. EYS holds a CIHR scholarship. The CIHR Transplantation Training Program also provided graduate scholarships to STC, EYS and SS.
Materials
| PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Life Technologies | K210007 | Any maxiprep kit will work |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Life Technologies | 15593-049 | Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container. |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | Warm in 37°C water bath before use. |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH30396.03 | Inactivated at 56°C water bath for 45 minutes before use. |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Warm to at least room temperature before use. |
| XtremeGene HP DBA transfection reagent | Roche | 6366236001 | Warm to room temperature before use. |
| GeneJuice | EMD Millipore | 70967 | Warm to room temperature before use. |
| 5X Passive Lysis Buffer | Promega | E1941 | 30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 |
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