Introduction
Proteiner er de mest udbredte makromolekyler i celler, og de spiller en vigtig rolle i næsten alle biologiske processer. Den biologiske aktivitet af de fleste proteiner kræver deres foldning i og vedligeholde, de native tredimensionelle strukturer. Proteiner med afvigende konformationer ikke kun mister deres normale funktioner, men også ofte danner opløselige oligomere arter eller aggregater, der forringer funktioner andre proteiner og er giftige for celler 1,2. For at modvirke protein misfoldning, celler ansætte både molekylære chaperoner, der bistår ufoldede eller delvist foldede polypeptider til at nå deres native konformation, og nedbrydningsprodukter veje, der eliminerer fejlfoldede proteiner 3. I betragtning af kompleksiteten og stokastiske natur af folde proces, protein misfoldning er uundgåelig, og det kan ikke vendes i tilfælde af mutationer, biosyntetiske fejl og post-translationelle skader 1. Derfor celler i sidste ende afhængige degradation veje til at opretholde deres protein kvalitet.
Betydningen af cellulært protein kvalitetskontrol (PQC) systemer understreges af forekomsten af protein-misfoldning sygdomme, herunder cancer, diabetes, og mange neurodegenerative lidelser, såsom Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, amyotrofisk lateral sklerose, Huntingtons sygdom (HD), og spinocerebellar ataksi (SCA) 4,5. For eksempel mutationer i tumor suppressor p53 er den mest hyppigt genetisk læsion i tumorer, der er forbundet med ~ 50-70% af alle tilfælde 6. En væsentlig del af p53-mutationer er missense mutationer, der ændrer konformationen af p53, hvilket fører til dannelsen af aggregater 7. Endvidere er proteiner med udvidede polyQ strækninger genetisk og patologisk forbundet med HD og SCA. Disse progressive og ofte dødelige sygdomme indlysende, når længden af polyQ stræk i de berørte proteiner overstiger en vis threshold, og bliver mere og mere alvorlige som længden af polyQ strækning forlænger 8.
En attraktiv fremgangsmåde til behandling af disse sygdomme er at terapeutisk styrke cellulære PQC systemer, især nedbrydningsvejene. Imidlertid er de involveret i nedbrydningen af defekte proteiner, især i mammale celler veje, forbliver dårligt forstået. Selv om det er anerkendt, at proteasomet er kritisk vigtigt for nedbrydningen af fejlfoldede proteiner, et vigtigt spørgsmål forbliver udefineret: hvordan misfoldet proteiner specifikt genkendt og målrettet for nedbrydning. Selv PQC systemer er blevet identificeret i cellulære rum herunder cytoplasmaet, det endoplasmatiske reticulum, og mitochondriet, de PQC systemer i kernen er fortsat uklare 2.
Nylige undersøgelser fra vores laboratorium har identificeret et system, der genkender og nedbryder en række fejlfoldede proteiner i kernenaf pattedyrceller 9. Dette system består af den promyelocytisk protein (PML), en nuklear protein og et medlem af den tredelte motiv-holdige (TRIM) proteinfamilie, og RNF4, en RING-domæne indeholdende protein. PML, og flere andre TRIM proteiner, besidder SUMO (lille ubiquitin-lignende modifikator) E3-ligaseaktivitet, hvilket letter specificitet og effektivitet af protein SUMOylation 10. RNF4 tilhører en lille gruppe af SUMO-målrettet ubiquitin ligaser (Stubl), som indeholder en eller flere sumo-interagerende motiver (SIMS) foruden RING domænet, som giver dem den ubiquitin-ligaseaktivitet 11. Vi fandt, at PML specifikt genkender fejlfoldede proteiner gennem diskrete substrat genkendelsessteder, der kan skelne forskellige funktioner på fejlfoldede proteiner. Ved binding, PML tags fejlfoldede proteiner med poly-kæder af SUMO2 / 3, to næsten identiske pattedyr SUMO proteiner, der kan danne poly-kæder på grund af eksistensen af et internt SUMOylation site. SUMOylated fejlfoldede proteiner derpå genkendes af RNF4, hvilket fører til deres ubiquitinering og proteasomalaktivitet nedbrydning. Vi endvidere vist, at PML-RNF4 system er vigtigt for beskyttelse mod neurodegeneration, som mangel på PML forværrer de adfærdsmæssige og neuropatologiske fejl i en musemodel af SCA type 1 (SCA1) 9.
For at skelne protein nedbrydning fra andre cellulære mekanismer, der kan regulere protein niveauer, blev satserne for protein omsætning målt 9. Blandt de hyppigst anvendte metoder til at bestemme protein omsætningen er puls chase og cycloheximid (CHX) chase. Disse to metoder undersøger over tid, henholdsvis den radioaktive isotop-mærkede proteiner af interesse i oversættelse-dygtige celler og totale allerede eksisterende proteiner af interesse i oversættelse-hæmmede celler. , En stor udfordring for at studere patogene og misfoldning-tilbøjelige proteiner er, at halveringstiden af disse proteiner kan være ekstremt long. For eksempel Ataxin-1, Ataxin-7, Huntingtin, α-synuclein, og TDP-43 har alle halveringstider på mere end 12 til 24 timer 9,12-16. De langsomme omsætningshastigheder af disse proteiner udelukker brugen af CHX chase analyse, fordi de celler, der huser disse proteiner ikke kan overleve forlænget oversættelse inhibering, især fordi de fejlfoldede proteiner selv kan være yderst giftige for celler. Pulsen-chase analyse med isotop mærkning kan også være en udfordring for proteiner, som er yderst sammenlægning-tilbøjelige. De fleste pulse-chase analyser afhængige immunpræcipitering at adskille proteinet af interesse fra alle de andre proteiner, som også radioaktivt mærkede. Denne procedure omfatter normalt langvarige immunpræcipitation og vask procedurer, hvorunder SDS-uopløselige aggregater kan danne, gør analyse med SDS-PAGE-elektroforese unøjagtige.
Her en protokol til at analysere nukleare fejlfoldede proteiner med en langsom omsætningshastighed beskrives 9. En patogen form af Ataxin-1 (Atxn1), som indeholder en strækning på 82 glutaminer (Atxn1 82Q) anvendes til dette formål 8. Når det udtrykkes i celler, en forbedret grønt fluorescerende protein (GFP) fusion af Atxn1 82Q former mikroskopisk synlige indeslutninger i kernen (figur 1A). Pulse chase analyse afslører, at halveringstiden af Ataxn1 82Q er over 18 timer 9. Atxn1 82Q er sammensat af arter med fejlfoldede konformationer med forskellige karakteristika, samt arter med nativ konformation. Det er sandsynligt, at disse arter nedbrydes med forskellige hastigheder, og derfor bør analyseres separat. Lysater fra Atxn1 82Q-GFP-udtrykkende celler fraktioneret i NP-40-opløselige (opløseligt eller NS, sandsynligvis repræsenterer native proteiner eller forkert foldede monomere / oligomert proteiner) og NP-40-uopløselig (NI, aggregeret / forkert foldede) portioner. Sidstnævnte kan yderligere opdeles i SDS-opløselige (SS; sandsynlige uordnede aggregater) eller SDS-resistent (SR; sandsynlige amyloidfibriller) Fraktioner (figur 1b). NS og SS-fraktioner kan analyseres ved SDS-PAGE efterfulgt af western blotting, hvorimod kan detekteres fraktionen SR ved filter retarderingsassays efterfulgt af immunblotting. CHX chase kombineres med detergentfraktionering metode, og opdagede, at halveringstiden for SS Atxn1 82Q er meget kortere end for NS Atxn1 82Q og total Atxn1 82Q (figur 2A), hvilket indikerer, at SS fraktion kan genkendes og nedbrydes i celler 9. Denne fremgangsmåde tilvejebringer således et effektivt værktøj til at studere dynamikken i fejlfoldede proteiner og sammenligne deres nedbrydning mønster.
Vi beskriver også en metode, der er egnet til high throughput screening for at identificere makromolekyler eller små forbindelser, der kan modulere nedbrydningen af fejlfoldede proteiner. Denne metode er baseret på en konformt destabiliseret mutant af ildflue luciferase (LucDM) 17, en model chaperone substrat. Vi har fused LucDM til et nukleart lokaliseringssignal (NLS) til at probe de PQC systemer på dette cellulært rum, og GFP (NLS-LucDM-GFP) til hjælp for påvisning. NLS-LucDM-GFP former mikroskopisk synlige nukleare aggregater i en lille procentdel af celler (figur 3A). Svarende til Atxn1 82Q, NLS-LucDM-GFP-men ikke dens vildtype modstykke NLS-LucWT-GFP-modificeres ved SUMO2 / 3 og reguleret af PML-RNF4 vej 9. NLS-LucDM-GFP danner også SS og SR arter, selv om de relative mængder af SS og SR arter er minimal i forhold til NS, anvendelse af betingelserne beskrevet i protokol 3 nedenfor. For at forenkle analysen, vi kun analysere SDS opløselige LucDM (herunder både NS og SS fraktioner) ved SDS-PAGE og western blot. Vigtigere, CHX chase assay viste, at halveringstiden af SDS-opløselige NLS-LucDM-GFP er meget kortere end den for dens vildtype-modparten (figur 3B), hvilket antyder, at LucDM er et specifikt substrat for det system, der genkender og nedbrydesfejlfoldede proteiner.
Nedbrydningen af LucDM-GFP forårsager et betydeligt fald i den samlede fluorescenssignal. Derfor har vi også udviklet en protokol for real-time detektion af cellulær LucDM-GFP hjælp mikroplade fluorescens-baserede assay. Mange high-throughput skærm (HTS) systemer er udviklet til medicin eller gener modificerende cellulære aggregater og cellulære levedygtighed forårsaget af afvigende proteiner 18-20. Imidlertid er meget få HTSs specielt designet til målretning nedbrydning i pattedyrceller. Denne protokol fungerer som et robust system til hurtig og omfattende analyse af virkningerne af proteinekspression, knockdown, og lægemiddelbehandling på cellulær fejlfoldet proteinnedbrydning. Brug HeLa celler som eksempel nedenfor beskrives de protokoller til analyse af disse to fejlfoldede proteiner. Analyserne kan også anvendes på andre cellelinier, selvom transfektionsbetingelser og tidsforløb kan være nødvendigt at være optimeret til individuelle cellelinier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af reagens
- Forbered cellelyse-buffer (50 mM Tris, pH 8,8, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5% NP-40). Supplement 2 mM DTT, 1x komplet protease cocktail, og 250 IU / ml Benzonase før brug.
- Forbered pellet puffer (20 mM Tris, pH 8,0, 15 mM MgCl2). Supplement 2 mM DTT, 1x komplet protease cocktail og 250 IU / ml Benzonase før brug.
- Forbered 3x kogende puffer (6% SDS, 20 mM Tris, pH 8,0). Supplement 150 mM DTT før brug.
- Forbered lav fluorescens DMEM medium til assays under anvendelse mikroplade fluorescenslæser. Bland 25 mM glucose, 0,4 mM glycin, 0,4 mM arginin, 0,2 mM cystein, 4,0 mM glutamin, 0,2 mM histidin, 0,8 mM isoleucin, 0,8 mM leucin, 0,8 mM lysin, 0,2 mM methionin, 0,4 mM phenylalanin, 0,4 mM serin, 0,8 mM threonin, 0,078 mM tryptophan, 0,4 mM tyrosin, 0,8 mM valin, 1,8 mM CaCl2, 0,81 mM MgSO4, 5,33 mM KCI, 44,0 mM NaHCO3, 110 mM NaCl, 0,9 mMNaH 2 PO4. Indstil pH af opløsningen under anvendelse af HCl eller NaOH til pH 7,4. Sterilisere mediet ved filtrering.
BEMÆRK: Dette medium indeholder komponenter af standard DMEM-medium med højt glucoseindhold, bortset fra at Fe (NO3) 3, vitaminer og phenolrødt, er udeladt. Phenol Red, riboflavin og pyridoxal i regelmæssig DMEM dyrkningsmedium signifikant interferere med påvisningen af fluorescenssignalet 21. Dyrkningsmedium uden disse elementer er afgørende for vellykket levende celler GFP billeddannelse. Mediet er stabil i 12 måneder ved opbevaring på køl.
2. Nedbrydning Analyse af Atxn1 82Q GFP
- Plade ca. 3 x 10 5 HeLa celler i 35 mm plader med DMEM medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), så der efter O / N-dyrkning af celler vokse til et sammenløb på 40-60% på tidspunktet for transfektion.
BEMÆRK: Antallet af plader, der er nødvendige er baseret på antallet af tidspunkter og behandlinger described nedenfor. - Transficere HeLa-celler med 0,3 ug Atxn1 82Q-GFP / pRK5 plasmidet i hver brønd med transfektionsreagens ifølge producentens anvisninger 9. Lav en master transfektion blanding indeholder DNA og transfektion reagens og udportionerer det for hver brønd.
- 4-5 timer efter transfektion, undersøge de levende celler under et omvendt fluorescerende mikroskop for GFP udtryk med excitation bølgelængde 450-490 nm. Retur celler tilbage til kuvøse efter billeddannelse.
BEMÆRK: Overhold både spredte GFP signaler og små prikker af GFP signaler i kernen på dette tidspunkt. - Fjern mediet ved vakuum aspiration, og der tilsættes 2 ml frisk DMEM indeholdende 50 ug / ml CHX. Behandl celler til 0, 4, 8, 12 og 16 timer med CHX før høst. At undersøge proteasomalaktivitet nedbrydning, indbefatter proteasominhibitor MG132 (10 uM) i én plade behandlet i 16 timer som en kontrol.
- Harvest én plade af celler på hvert tidspunkt. Fjern mediet ved vakuum aspiration end vaske pladerne to gange med 3 ml iskold 1x phosphatpufret saltvand (PBS). Snap-fryse pladen på tøris.
- Efter den sidste tidspunkt (16 timer), skrabe de frosne celler (fra alle tidspunkter) i 150 pi iskold cellelysebuffer og inkuberet på is i 30 minutter.
- Centrifuger cellelysater i en bordcentrifuge ved 17.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
- Overfør supernatanten, som indeholder NP-40-opløselige (NS) proteiner, til et andet rør ved hjælp af en pipette.
BEMÆRK: Brug supernatanter til måling proteinkoncentrationer ved Bradford assay, hvis nødvendigt. - Skyl pellets ved forsigtigt at tilsætte ca. 200 pi 1x PBS til rørene uden at forstyrre pellets. Fjern forsigtigt PBS ved vakuum aspiration eller pipette. Re-suspendere dem i 150 pi iskold cellepellet buffer, efterfulgt af 15-30 minutters inkubation på is.
BEMÆRK: Den resuspenderede pellet fraktion indeholder NP-40 uopløselige (NI) proteiner. Se figur 1B for en diagram af detergentfraktionering. - Tilføj 75 pi 3x kogende puffer i NS fraktioner og NP-40 uopløselige (NI) fraktioner resuspenderes fra pelletene. Opvarm prøverne ved 95 ° C på en varmeblok i 5 min.
BEMÆRK: Klumper i NP-40 uopløselige fraktioner opløses efter opvarmning og prøver vil fremgå. - Tilføj SDS-gel-ladningsbuffer til en alikvot af kogt NS og NI. Læg lige volumen af prøver indsamlet fra alle tidspunkter til SDS-PAGE-gel. De svarer volumen indlæst til ca. 20 ug NS fra prøve indsamlet på Time 0. BEMÆRK: NS, samt SDS-opløselige (SS) protein fra NI fraktion, kan løses ved hjælp af SDS adskille gel. I modsætning hertil er SDS-resistent (SR) aggregater fra NI fraktion fast i gel loading brøndene (figur 1B). At forbedre western blot-påvisning, kan dobbelte volumen af NI indlæses.
- Detect NS og SS Atxn1 82Q-GFP ved Western blot under anvendelse af anti-GFP-antistof og forøget kemiluminescens (ECL).
BEMÆRK: Atxn1 82Q i SS fraktionen er generelt mindre i forhold til NS fraktionen ved brug af denne protokol. Der er behov for Længere ECL eksponering for optimale signaler. - Undersøg SR Atxn1 82Q fra pellet fraktion ved filter retarderingsassays på en dot-blot-apparat (figur 1B). Kort fortalt nedsat en dot-blot apparat i besiddelse af en 0,2 um celluloseacetat membran. Belastning 80-120 pi kogt NI i hver brønd af dot-blot-apparatet.
BEMÆRK: Da der kun små mængder af SR aggregater dannes i celler, for dot-blot-assay, indlæse et volumen af SR fraktion, der er cirka 10-15 gange af rumfanget af NS fraktionen anvendes til western blot-analyse.- Efter filtrering af prøverne gennem membranen ved vakuum, kan Atxn1 82Q-GFP-aggregater sidder fast på membranen detekteres ved anti-GFP immunoblotting 9,12,22.
BEMÆRK: Se tidligere rapporter 9,12,22 for detaljeret beskrivelse af filter retardering assay. Dette trin er valgfritfordi SR Atxn1 82Q er minimal i forhold til SS og NS fraktioner efter den korte transfektion beskrevet i denne protokol. Desuden niveauerne af SR Atxn1 82Q stort set forblive den samme over CHX chase (figur 2B). Det er dog stadig vigtigt at undersøge, om de mængder af SS Atxn1 82Q påvirkes over tid for ethvert stof behandling eller genekspression i indledende forsøg. SS proteinarter bo i SDS-PAGE gel loading brønde kan påvises ved western blot. Men denne metode er mindre følsom og genererer mere variable resultater (figur 1b).
- Efter filtrering af prøverne gennem membranen ved vakuum, kan Atxn1 82Q-GFP-aggregater sidder fast på membranen detekteres ved anti-GFP immunoblotting 9,12,22.
3. Nedbrydning Assay af NLS-luciferase-GFP ved anvendelse af SDS-PAGE og Western Blot
- Plade ca. 3 x 10 5 HeLa celler i 35 mm plader med DMEM medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS). Efter O / N dyrkning, er et sammenløb af 40-60% nået på tidspunktet for transfektion. Antallet af plader, der er nødvendige er baseret på antallet af time punkter og behandlinger er beskrevet nedenfor.
- Transficere HeLa-celler med 1,0 ug NLS-luciferase-GFP / pRK5 plasmidet i hver brønd med transfektionsreagens ifølge producentens anvisninger 9. Foretag en master transfektion blanding indeholdende DNA og transfektionsreagens for aliquot af hver brønd.
- Efter O / N-transfektion (ca. 15 timer), undersøge de levende celler under et omvendt fluorescerende mikroskop for GFP udtryk med excitation bølgelængde 450-490 nm. Retur celler tilbage til kuvøse efter billeddannelse.
BEMÆRK: Spredt nuklear GFP signal kan observeres i størstedelen af cellerne (70%). En lille procentdel (5%) af celler har nukleare aggregater. - Fjern mediet ved vakuum aspiration, og der tilsættes 2 ml frisk DMEM indeholdende 50 ug / ml CHX. Behandl celler til 0, 1,5, 3, 4,5 og 6 timer med CHX før høst. At undersøge proteasomalaktivitet nedbrydning, indbefatter yderligere proteasominhibitor MG132 (10 uM) i én plade behandlet i 6 timer som kontrol.
- Harvest én plade af celler på hvert tidspunkt. Fjern mediet ved vakuumaspiration og vaske pladerne to gange med 3 ml iskold phosphatpufret saltvand (PBS). Snap-fryse pladen på tøris.
- Efter den sidste tidspunkt (6 timer) er afsluttet, celler frosset ved all-time points skrabes i 150 pi iskold cellelysebuffer og inkuberet på is i 30 minutter.
- Tilføj SDS-gel-ladningsbuffer til helcellelysater til en slutkoncentration på 2% SDS og 50 mM DTT. Inkuber prøverne på en varmeblok ved 95 ° C i 5 min.
- Analyser NLS-luciferase-GFP ved SDS-PAGE og western blot med anti-GFP-antistof. Læg lige volumen af prøver indsamlet fra alle tidspunkter til SDS-PAGE-gel. Lydstyrken lastet svarer til ca. 20 ug helcellelysater fra prøve indsamlet på Time 0.
4. Real-time Nedbrydning Assay af NLS-luciferase-GFP Brug fluorescensmikropladelæser
- Frø ca. 1 x 10 4HeLa-celler til sorte 96-brønds vævskulturplader med transparent bund. Efter O / N dyrkning, er et sammenløb af 50-70% nået på tidspunktet for transfektion.
BEMÆRK: 60 pi medium indeholdende fuldstændigt suspenderede HeLa-celler podes direkte i hver brønd. Tilsæt ikke ekstra medium eller sten plade frem og tilbage efter såning, ellers celler kan ujævnt fordelt. - Transficere HeLa-celler med 0,05-0,1 ug NLS-luciferase-GFP / pRK5 plasmid 9 i hver brønd under anvendelse af transfektion reagens ifølge producentens anvisninger. Lav en master transfektion blanding indeholder DNA og transfektion reagens og udportionerer det for hver brønd. Tre brønde med celler ikke transficeres med DNA, der tjener som kontrol for baggrundsfluorescens signal for hver behandling tilstand.
BEMÆRK: En alternativ måde at reducere transfektion variation er at transficere celler før såning. Men en stor del af cellerne transficeret med misfoldet proteins undlader at vedhæfte eller vise reduceret levedygtighed ved hjælp af denne metode. Det er sandsynligt, at nogle celler ikke kan stå stress forårsaget af trypsin fordøjelse ved ekspression toksiske fejlfoldede proteiner. Som følge heraf er den samlede fluorescerende signal signifikant reduceret. - 20-24 timer efter transfektion, undersøge de levende celler under et omvendt fluorescerende mikroskop for GFP udtryk med excitation bølgelængde 450-490 nm.
- Fjern mediet ved vakuumaspiration. Der tilsættes ca. 200 pi 1x PBS til hver brønd og derefter opsuge det at fjerne resterende mængde DMEM-medium.
- Tilføj 60 pi lav fluorescens DMEM-medium med 5% FBS og 50 pg / ml CHX. At undersøge proteasomalaktivitet nedbrydning, indbefatter yderligere proteasominhibitor MG132 (10 uM) i et sæt af prøver. Sæt triplo af brønde for hver behandling / tilstand.
BEMÆRK: MG132 behandling indgår som kontroller for proteasomalaktivitet nedbrydning, fordi det er afgørende for at udelukke andre faktorer, der kan forårsage dråbe fluorescence signal, herunder celledød og fluorescens quenching. - Mål fluorescenssignalet af GFP straks på en fluorescerende pladelæser efter tilsætning CHX.
BEMÆRK: Indstillingerne for software måling er vist i tabel 1. - Aflæs pladen hver time i op til 8-10 timer. Efter at have læst, returnere pladen tilbage til cellekultur inkubator.
- Eksportere data som regneark fil. Brug middelværdien af multi-læser for hver brønd som fluorescensintensitet. Normalisere værdier for hvert datapunkt til middelværdierne for Time 0 i de respektive grupper. Plot normaliserede fluorescens intensitet over tid som vist i figur 4A og 4B, og figur 5, højre paneler.
- Statistisk analyse af nedbrydningshastigheder mellem to tilstande ved hjælp af to-vejs ANOVA med gentagne målinger 23.
BEMÆRK: I denne analyse, "fluorescensintensitet" er den afhængige variabel hvorimod "treatment betingelser "og" tid "er de to faktorer. I stedet for at sammenligne data på de enkelte tidspunkter, to-vejs ANOVA med gentagne målinger analyserer forskellen mellem de to behandlingsgrupper over hele tidsforløbet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I en steady state analyse, kan mikroskopisk synlige Atxn1 82Q-GFP nukleare aggregater iagttages hos 30 - 50% af HeLa-celler 20 timer efter transfektion (figur 1A). Western blot analyse af NS og SS-fraktioner under anvendelse af anti-GFP-antistof viser en distinkt bånd af Atxn1 82Q-GFP mellem 100 kDa og 150 kDa markører, svarende til proteinets molekylvægt (figur 1B). Atxn1 82Q-GFP i SR fraktionen kan detekteres enten ved filter retardering assay eller ved SDS-PAGE og western blot som arter i toppen af stabelgelen (figur 1B). For halveringstid analyse under anvendelse af protokol beskrevet ovenfor, CHX chase starter 4-5 timer efter indledende transfektion før nogen store nukleare aggregater dannes. Halveringstiden af Atxn1 82Q-GFP i SS fraktion er omkring 5 timer, i modsætning til en lille eller ingen fald i Atxn1 82Q-GFP i NS fraktionen over 16 timer (figur 2A). Den Degraling af Atxn1 82Q-GFP er delvist inhiberet ved behandling af celler med MG132 (figur 2A). Vi har tidligere vist, at PML stimulerer nedbrydningen af fejlfoldet protein ved at fremme deres SUMOylation. Vi bruger PML knockdown som et eksempel på ændret nedbrydningsvej. PML siRNA behandling forlængede halveringstid Atxn1 82Q-GFP i SS fraktion (figur 2A). Er ikke konstateret åbenlyse ændringer i SR Atxn1 82Q-GFP i enten kontrol- eller PML siRNA-behandlede celler (Figur 2B og 2C).
Tyve timer efter transfektion NLS-LucDM-GFP-aggregater bliver mikroskopisk synlige hos 5 - 15% af HeLa-celler, men dette kan variere afhængigt af mængden af DNA, der er transficerede (figur 3A). Halveringstiden af SDS opløselig NLS-LucDM-GFP er 2 - 3 i timer (figur 3B og 3C). Fluorescensintensiteten af transficerede celler også falder i løbettid med CHX behandling (figur 4A og 4B). Seks timer efter CHX behandling, fluorescensintensiteten når et stabilt stadium og stopper faldende (figur 4A og 4B). På samme tidspunkt, opløselig NLS-LucDM-GFP er stort set nedbrudt (figur 3B og 3C), hvilket antyder, at den resterende fluorescens genereret fra aggregerede arter er resistente over for nedbrydning. Konsekvent, aggregeret, men ikke spredt, GFP forbliver i cellerne 9 timer efter CHX behandling (figur 4C). Interessant, transfektion ved anvendelse af en højere mængde af NLS-LucDM-GFP plasmid genererer flere nukleare aggregater samt højere intensitet resterende fluorescens, selv nedbrydningshastigheden ikke påvirkes (figur 4A og 4B). Anvendelse af enten SDS-PAGE efterfulgt af western blot eller fluorescens læsning, er vi i stand til at detektere inhibering af NLS-LucDM-GFP nedbrydning med MG132 behandling eller PML siRNA (figur 3C, 4A, 4B og 5).
Figur 1. Påvisning af Atxn1 82Q-GFP ved fluorescensmikroskopi og detergentfraktionering. (A) HeLa-celler blev transficeret med Atxn1 82Q-GFP og farvet med DAPI. Individuelle og flettede billeder vises. Scale bar = 10 um. (B) Et diagram viser vaskemiddel fraktionering af Atxn1-82Q udtrykkende celler som beskrevet i protokol 2. Molekylvægtmarkører er angivet til venstre på Western blot billeder af Atxn1-Atxn 82Q. Klik her for at se en større version af dette tal .
66 / 54266fig2.jpg "/>
. Figur 2. Nedbrydning assay af Atxn1 82Q-GFP ved anvendelse af detergentfraktionering HeLa-celler blev tidligere behandlet med kontrol (-) eller PML siRNA (A og C) eller ubehandlet (B). Celler blev transficeret med Atxn1 82Q-GFP og behandlet med CHX i fravær eller nærvær af MG132. Cellelysatladninger fraktioner blev analyseret ved SDS-PAGE efterfulgt af western blot (A, for NS og SS fraktioner) eller filter retardering assay (B og C, for SR fraktion) under anvendelse af anti-GFP-antistof. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Analyse af NLS-LucDM-GFP nedbrydning ved fluorescens MICRoscopy og Western blot. (A) HeLa-celler transficeret med NLS-LucDM-GFP blev farvet med DAPI. Individuelle og flettede billeder vises. Scale bar = 25 um. Arrowhead indikerer en celle med nukleare aggregater. (B og C) HeLa-celler blev transficeret med NLS-LucDM-GFP og vildtype-luciferase fusionsprotein NLS-LucWT-GFP (B), eller transficeret med kontrol eller PML siRNA, efterfulgt af transfektion med NLS-LucDM-GFP ( C). Celler blev behandlet med CHX og MG132 som angivet. Hele cellelysater blev analyseret ved western blot under anvendelse af anti-GFP-antistof. Billede er modificeret fra tidligere publikation med tilladelse 9. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Fluorescerende mikrotiterplade-baseret assay for NLS-LucDM-GFP nedbrydning. HeLa-celler podet på plader med 96 brønde blev transficeret med 0,05 ug (A) eller 0,1 pg (B og C) NLS-LucDM-GFP og behandlet med CHX i tilstedeværelse eller fravær af MG132. (A og B) Fluorescensintensiteter af brønde blev målt ved de angivne tidspunkter (Middelværdier ± standardafvigelser, n = 3). Paneler til venstre viser den oprindelige fluorescens læsning, mens panelerne til højre viser de værdier normaliseret til aflæsninger på Time 0 i de respektive behandlingsgrupper. Forskellen mellem grupperne behandlet med og uden MG132 blev analyseret ved to-vejs ANOVA med gentagne målinger. P-værdier mellem de to behandlingsgrupper er vist. (C) Brønde blev undersøgt før eller efter 9 timers CHX behandling, eller efter CHX og MG132 behandling, ved fluorescens mikroskop. For bedre at vise begge celler med lyse aggregeret NLC-LucDM-GFP og dem med dim diffust protein blev gamma værdi på 1,5 anvendes på alle billederne. Scale bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Et reduceret nedbrydningshastighed for NLS-LucDM-GFP i PML knockdown celler. HeLa-celler, der tidligere er behandlet med kontrol eller PML siRNA blev podet i plader med 96 brønde. Nedbrydning af NLS-LucDM-GFP blev analyseret som beskrevet i figur 4 (to-vejs ANOVA, p <0,0001). Klik her for at se en større version af dette tal.
54.266 / 54266fig6.jpg "/>
Figur 6. Fluorescens af Atxn1 82Q-GFP er uændret i CHX chase. HeLa-celler transficeredes med Atxn1 82Q-GFP. 24 timer efter transfektion, nedbrydning af Atxn1 82Q-GFP blev analyseret som beskrevet i figur 4. Figuren viser den oprindelige fluorescens læsning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Fluorescerende mikrotiterplade-baseret assay til nedbrydning af cytoplasmatiske LucDM-GFP. HeLa-celler podet på plader med 96 brønde blev transficeret med 0,1 ug LucDM-GFP behandlet med CHX i nærvær eller fravær af MG132. Resultaterne blev analyseret som beskrevet i figur 4 (to-vejs ANOVA, p <0,0001).TPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/54266/54266fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1 .: Måling indstillinger på fluorescens mikropladelæser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mekanismer, der regulerer nedbrydningen af fejlfoldede proteiner er afgørende for at opretholde homøostase af cellulære proteiner, og de sandsynligvis repræsenterer værdifulde lægemiddelmål for behandling af neurodegenerative lidelser og andre protein-misfoldning sygdomme. Her bliver assays der undersøger nedbrydningen af fejlfoldede proteiner beskrevet, under anvendelse af en patogen Atxn1 protein (Atxn1 82Q) og en nuklear lokaliseret luciferase mutant (NLS-LucDM) som eksempler.
For at undersøge nedbrydningen Atxn1 82Q, som har en halveringstid over 18 timer, vi indført en ny metode ved at kombinere celle fraktionering med klassisk CHX 9. Denne metode viste en meget hurtigere afslutning af fejlfoldede arter af Atxn1 82Q over tid. Desuden indføres LucDM udgør en model misfoldet substrat til at undersøge generelle nedbrydningsmekanismer af fejlfoldede proteiner. For at imødekomme behovet for et HTS-system til detektering fejlfoldet protein nedbrydning i pattedyr celles udviklede vi en hurtig nedbrydning assay for LucDM anvendelse af fluorescens-mikropladelæser. Systemet fungerer som et effektivt værktøj til kemiske og genetiske skærme.
Den Atxn1 82Q protein er til stede i NS, SS, og SR fraktioner af cellelysater. SR fraktioner bliver stadig mere udbredt under langvarig kultur efter transfektion, hvilket antyder, at det er i en form, der er vanskeligt at blive æret eller nedbrydes, f.eks, de amyloidfibriller. Generering af toksiske fejlfoldede arter eller aggregater, der ikke let kan nedbrydes kan blokere protein nedbrydningsveje, hindrer analyse af endogent cellulært maskineri kontrollerende afvigende proteiner 24, 25,26. For at undgå dannelse af en stor mængde SR, starter vi CHX chase 4-5 timer efter indledende transfektion. Vi har fundet, at dette er kritisk for analyse af cellulære tilstande, der kan forsinke nedbrydningen af SS-fraktionen. Foruden transfektion tid, er det også afgørende ikke at overwhelm celler ved at udtrykke Atxn1 82Q protein ved meget høje niveauer. Hvis der ikke observeres eller meget langsom nedbrydning for alle fraktioner, bør mindre mængde Atxn1 82Q plasmid anvendes til transfektion. Ideelt set bør analysen være færdig inden 12 timer som apoptotiske celler er bemærket ud over dette tidspunkt. I figur 2A, mængden af SS Atxn1 82 i kontrolceller, er markant anderledes end i PML siRNA-behandlede celler så korte som 8 timer. Forsigtighed skal tages, hvis en forskel i den behandlede gruppe kun observeres over 12 timer, da det kan være forårsaget af andre faktorer, der påvirker cellernes levedygtighed i stedet protein nedbrydning.
Sammenlignet med NS Atxn1 82Q, 82Q Atxn1 i SS fraktionen udskilles hurtigt, hvilket indikerer, at den repræsenterer en fejlfoldede arter, der let kan nedbrydes af proteasomet (figur 2A). I modsætning hertil var niveauerne af SR Atxn1 82Q forbliver uændrede i samme tidsforløb (figur 2B), hvilket bekræfterat det er en ikke-nedbrydelige arter. Alligevel bør analyse af SR fraktion være vigtigt for at analysere mekanismer, der direkte fjerner cytoplasmatiske aggregater (f.eks Autophagy) eller påvirke dannelsen af disse aggregater. Mærkbart, synes MG132 at være mindre effektive til at forhindre Atxn1 82Q fald i SS fraktion. Dette kan være forårsaget af elevation i ROS-niveauer upon proteasomhæmning 27, som kunne fremme sammenlægning af Atxn1 82Q.
En stor fordel ved LucDM-GFP assay er, at det kan tilpasses til HTS-analyse under anvendelse fluorescenspladelæser. Vi forsøgte i første omgang at udvikle et HTS-system for Atxn1 82Q. Men fordi kun en lille brøkdel af den samlede Atxn1 82Q protein nedbrydes over tid, fluorescensen af celler, der udtrykker GFP-Atxn1 82Q forbliver stort set uændret i løbet af CHX chase (figur 6). Andre fejlfoldede proteiner med samlet lang halveringstid ville have lignende problemer med real-time fluorescent assay. I modsætning hertil observeres et markant fald i den samlede NLS-lucDM-GFP-proteinet (figur 3 og 4). Dette træk, sammen med dets korte halveringstid (2-3 timer), gør denne model chaperone substrat til let detekteres ved fluorescensspektroskopi. I tidligere undersøgelser, GFPu, GFP-protein fusioneret til en konstruktiv nedbrydningssignal (CL-1), er blevet bredt anvendt som en reporter for funktionaliteten af ubiquitin-proteasom systemet 28,29. Det er også en fremtrædende surrogat fejlfoldet protein i celle- og dyremodeller 30. Sammenlignet med GFPu, en fordel ved nedbrydningen assayet beskrevet her er, at misfoldet luciferase er en flittigt brugt model chaperone substrat. Ved at undersøge luciferaseaktivitet, kan man let vurdere de native, denatureret, og genfoldede konformationer af luciferase in vitro og in vivo. Således vores system fungerer som en yderst nyttig platform til at forbinde proteinbinding og folde assays medcellulære nedbrydning system ved hjælp af den samme substrat 9.
Gennem realtid fluorescens målinger kan fås følgende værdier: Den start fluorescensintensitet, stabil resterende fluorescensintensitet, og protein halveringstid. Disse værdier er korreleret med henholdsvis mængden af den samlede protein før jagten, mængden af proteiner er resistente over for nedbrydning, og hastigheden af protein omsætning. Derfor er det muligt at bruge realtid fluorescens assay til at foretage en omfattende analyse af de niveauer og dynamikken i forskellige fejlfoldede protein arter. Lejlighedsvis, er en forholdsvis stor variation af udgangs fluorescens blandt replikater observeret (fx figur 5, venstre panel). Dette vil sandsynligvis være forårsaget af variation i celle såning eller transfektion. Men på trods af forskellen i udgangs fluorescensintensitet, signalet for alle replikater dråber på en meget lignende sats,. Normalisering af signaler from hver gang peger på intensiteten på tidspunktet 0 kan reducere velstående godt variation og mere præcist afspejler nedbrydningsraterne (figur 4A, 4B og figur 5, venstre vs. højre paneler).
Ud over den nukleare form vi analyserede også cytoplasmatisk LucDM-GFP. Cytoplasmatisk LucDM-GFP har en lignende nedbrydningsmønster undtagen blev observeret højere procentdel af resterende fluorescens, når den samme eksperimentelle fremgangsmåde blev påført som beskrevet i protokol 4 (figur 7). Nedbrydningen kunne inhiberes fuldstændig MG132, indikerer dette assay kan anvendes til at overvåge cytoplasmatisk protein kvalitetskontrol gennem proteasomalaktivitet nedbrydning. For fremtidige undersøgelser, ville det være interessant at undersøge, om LucDM-GFP kan anvendes til andre cellulære rum, fx, mitokondrier eller endoplasmatisk reticulum, når fusioneret til specifikke cellulære rum lokalisering signaler.
Som nævnt i protokollen for fluorescerende-baseret assay, er det afgørende at bruge lav-fluorescerende medium for at reducere fluorescerende baggrund og bruge mester mix af DNA og transfektionsreagens at reducere velhavende godt transfektion variation. Forstærkningen kontrol kan justeres på nogle fluorescerende plade læsere. Det er vigtigt at indstille forstærkningen til manuel stedet for optimeret og bruge den samme værdi i hele assayet (tabel 1). Værdien af forstærkningen kan indstilles til at maksimere aflæsningen fra cellulært GFP-fluorescens, så længe læsningen ikke går ud over detektionsgrænsen.
På nuværende tidspunkt, er vi stadig afhængige af transfektion til at udtrykke LucDM. For at reducere variation og forenkle analysen for HTS, en fremtidig mål er at etablere en stabil cellelinje med inducerbar ekspression af LucDM. Som mikroplade og dyrkningsmedium begge har baggrundsfluorescens, er det imidlertid afgørende at have GFP signal betydeligt højere end baggrunden. Unfortunately, stabile linjer, vi etablerede for nylig har alle lav udtryk for LucDM. Således vil udviklingen af en stabil linje med højere protein-ekspression i høj grad forbedre screening effektivitet.
Nedbrydningsprodukterne assays beskrevet her kan også anvendes på andre fejlfoldede proteiner. På grund af den dynamiske træk ved fejlfoldede proteiner, skal sammen med andre analyser for at afdække den tilbundsgående mekanismer kontrol protein kvalitet disse analyser. Disse analyser omfatter måling af steady state niveauer af aggregater og deres partitioner i forskellige celle fraktioner (figur 1) og analysere proteiner folde eller sammenlægning hjælp oprensede rekombinante proteiner. Disse analyser vil bidrage til at skelne direkte eller indirekte virkninger af lægemiddel eller genekspression på nedbrydning eller sammenlægning protein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M8699 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | 45000232 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Boehringer Mannheim | 4693159001 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Living Colors GFP Monoclonal Antibody | Clonetech | 632375 | |
| Anti-Actin mAb Rabbit, IgG | Sigma-Aldrich | A45060-200UL | |
| Amino acids | Sigma-Aldrich | Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium | |
| Olympus IX-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX71/IX81 | |
| 96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom | Sigma-Greiner | 89135-048 | |
| Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO | TECAN | Infinite 200® PRO | |
| Cellulose acetate membrane 0.2 µm | Sterlitech | CA023001 | |
| Prism 5 | GraphPad | Statistical analysis software |
References
- Dobson, C. M.
- Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H.
- Selkoe, D. J.
- Vousden, K. H., Prives, C. Blinded by the Light: The Growing Complexity of p53. Cell. 137, 413-431 (2009).
- Xu, J., et al. Gain of function of mutant p53 by coaggregation with multiple tumor suppressors. Nat Chem Biol. 7, 285-295 (2011).
- Orr, H. T., Zoghbi, H. Y.
- Guo, L., et al. A cellular system that degrades misfolded proteins and protects against neurodegeneration. Mol Cell. 55, 15-30 (2014).
- Chu, Y., Yang, X. SUMO E3 ligase activity of TRIM proteins. Oncogene. 30, 1108-1116 (2011).
- Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26, 4102-4112 (2007).
- Janer, A., et al. PML clastosomes prevent nuclear accumulation of mutant ataxin-7 and other polyglutamine proteins. J Cell Biol. 174, 65-76 (2006).
- Bauer, P. O., et al. Harnessing chaperone-mediated autophagy for the selective degradation of mutant huntingtin protein. Nat Biotechnol. 28, 256-263 (2010).
- Austin, J. A., et al. Disease causing mutants of TDP-43 nucleic acid binding domains are resistant to aggregation and have increased stability and half-life. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 4309-4314 (2014).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nat Chem Biol. 10, 677-685 (2014).
- Paxinou, E., et al. Induction of alpha-synuclein aggregation by intracellular nitrative insult. J Neurosci. 21, 8053-8061 (2001).
- Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat Methods. 8, 879-884 (2011).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466, 1069-1075 (2010).
- Fortini, M. E., Bonini, N. M. Modeling human neurodegenerative diseases in Drosophila: on a wing and a prayer. Trends Genet. 16, 161-167 (2000).
- Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PLoS One. 7, (2012).
- Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
- McDonald, J. H. Handbook of Biological Statistics. 3, 3rd, 173-179 (2014).
- Holmberg, C. I., Staniszewski, K. E., Mensah, K. N., Matouschek, A., Morimoto, R. I. Inefficient degradation of truncated polyglutamine proteins by the proteasome. EMBO J. 23, 4307-4318 (2004).
- Verhoef, L. G., Lindsten, K., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. Aggregate formation inhibits proteasomal degradation of polyglutamine proteins. Human molecular genetics. 11, 2689-2700 (2002).
- Jana, N. R., Zemskov, E. A., Wang, G., Nukina, N. Altered proteasomal function due to the expression of polyglutamine-expanded truncated N-terminal huntingtin induces apoptosis by caspase activation through mitochondrial cytochrome c release. Human molecular genetics. 10, 1049-1059 (2001).
- Fribley, A., Zeng, Q., Wang, C. Y. Proteasome inhibitor PS-341 induces apoptosis through induction of endoplasmic reticulum stress-reactive oxygen species in head and neck squamous cell carcinoma cells. Molecular and cellular biology. 24, 9695-9704 (2004).
- Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
- Chen, Q., et al. Intrasarcoplasmic amyloidosis impairs proteolytic function of proteasomes in cardiomyocytes by compromising substrate uptake. Circulation research. 97, 1018-1026 (2005).
- Link, C. D., et al. Conversion of green fluorescent protein into a toxic, aggregation-prone protein by C-terminal addition of a short peptide. The Journal of biological chemistry. 281, 1808-1816 (2006).
