Introduction
Белки являются наиболее распространенными макромолекулы в клетках, и они играют важную роль практически во всех биологических процессах. Биологическая активность большинства белков требует их сворачивания в, и поддержание, родные трехмерные структуры. Белки с аберрантных конформации не только теряют свои обычные функции, но и часто образуют растворимые олигомерные виды или агрегаты , которые ухудшают функции других белков и являются токсичными для клеток 1,2. Для противодействия белка неправильного фолдинга, клетки используют как молекулярные шапероны, которые помогают развернутые или частично свернутых полипептиды , чтобы достигнуть их нативную конформацию, а также пути деградации, которые устраняют белки 3 неправильно упакованные. Учитывая сложность и стохастический характер процесса складывания, белок неправильного сворачивания неизбежно, и оно не может быть отменено в случае мутаций, биосинтетических ошибок и посттрансляционными повреждений 1. Следовательно, клетки в конечном счете полагаются на degradatионные пути для поддержания их качества белка.
Важность контроля качества клеточного белка (PQC) системы подчеркивается преобладанием белков неправильного сворачивания заболеваний, включая рак, диабет и многих нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, болезнь Хантингтона (HD), и спиноцеребеллярная атаксия (SCA) 4,5. Например, мутации в супрессора р53 является наиболее часто генетическое поражение в опухолях, ассоциированных с ~ 50-70% всех случаев 6. Значительная часть мутаций р53 являются миссенс - мутации , которые изменяют конформацию р53, что приводит к образованию агрегатов 7. Кроме того, белки с расширенными polyQ участками генетически и патологически связаны с HD и ЗОБ. Эти прогрессивные и часто смертельных заболеваний проявляется, когда длина polyQ участке в пораженных белков превышает определенный Thresудерживать, и становится все более и более серьезными , как длина polyQ участке пролонгирует 8.
Привлекательным подходом для лечения этих заболеваний является терапевтически укрепления клеточных систем PQC, особенно пути деградации. Тем не менее, вовлеченного пути к деградации дефектных белков, в частности, те, в клетках млекопитающих, еще мало изучены. Несмотря на то, что было признано, что Протеасома является критически важным для деградации белков неправильно свернутых, жизненно важный вопрос остается неопределенным: как неправильно уложенный белки специфически узнавали и целенаправленной деградации. Более того, хотя системы PQC были идентифицированы в клеточных компартментах , включая цитоплазму, эндоплазматический ретикулум и митохондрии, системы PQC в ядре остаются неясными 2.
Недавние исследования, проведенные нашей лаборатории выявили систему, которая распознает и деградирует различные белки неправильно свернутых в ядреклеток млекопитающих 9. Эта система состоит из промиелоцитарного белка (PML), ядерный белок и член трехстороннего мотива, содержащего (TRIM) семейства белков, и RNF4, кольцо-домен, содержащий белок. PML, и несколько других TRIM белки, обладают Сумо (маленький убиквитин-подобный модификатор) лигазы активность E3, облегчающий специфичность и эффективность белка SUMOylation 10. RNF4 принадлежит к небольшой группе сумо ориентированных на убиквитинлигаза (STUbL), которые содержат один или несколько сумо взаимодействующих мотивов (ВИМС) в дополнение к домену RING , что дает им деятельности убиквитин лигазы 11. Мы обнаружили, что PML специфически распознает неправильно упакованные белки посредством дискретных участков распознавания субстрата, который может различить различные функции на неправильно свернутых белков. После связывания PML-теги неправильно свернутых белков с поли-цепей SUMO2 / 3, два почти идентичных SUMO белков млекопитающих, которые могут образовывать поли-цепи из-за наличия внутреннего сайта SUMOylation. SUMOylated Неправильно свернутые белки затем распознаются RNF4, что приводит к их убиквитинирование и протеосомной деградации. Кроме того , мы показали , что PML-RNF4 система важна для защиты от нейродегенерации, так как дефицит в PML усугубляет поведенческие и нейропатологических дефекты модели мыши типа SCA 1 (СЦА1) 9.
Чтобы отличить деградацию белков от других клеточных механизмов , которые могут регулировать уровни белка, скорости оборота белка измеряли 9. Среди наиболее часто используемых методов для определения оборачиваемости белка импульса Погоня и циклогексимид (СНХ) Погоня. Эти два метода изучения с течением времени, соответственно, радиоизотопные-меченых белков интереса к письменным переводом опытными клеток и общего количества уже существующих белков, представляющих интерес для письменного перевода тормозится клеток. Тем не менее, одной из основных задач для изучения патогенных и неправильного сворачивания склонной белков является то, что период полураспада этих белков может быть чрезвычайно Loнг. Например, атаксина-1, атаксина-7, Huntingtin, α-синуклеина, и TDP-43 все имеют период полураспада более 12 до 24 часов 9,12-16. Медленные темпы оборот этих белков исключает использование анализа СНХ чейза, потому что клетки, несущие эти белки не могут выжить длительное ингибирование трансляции, особенно потому, что неправильно свернутых белков сами по себе могут быть очень токсичными для клеток. Анализ импульсно-Погоня с изотопной метки также может быть сложной задачей для белков, которые являются весьма агрегацию склонны. Большинство импульсов-чейз анализы полагаются на иммунопреципитации отделить интересующий белок от всех других протеинов, которые также радиоактивно мечена. Эта процедура обычно включает в себя длительные иммунопреципитации и мыть процедуры, в ходе которых SDS-нерастворимые агрегаты могут образовываться, что делает анализ с SDS-PAGE электрофореза неточной.
Вот протокол для анализа ядерных белков с неправильно упакованные медленно скорость оборота описывается 9, Патогенную форму из атаксина-1 (Atxn1) , который содержит участок 82 глутаминов (Atxn1 82Q) используется для этой цели 8. При экспрессии в клетках, улучшенный зеленый флуоресцентный белок (GFP) слияние Atxn1 82Q форм микроскопически видимых включений в ядре (рис 1А). Анализ импульсов погоня показывает , что период полураспада Ataxn1 82Q составляет более 18 ч 9. Atxn1 82Q состоит из видов с неправильно свернутых конформации различных характеристик, а также видов с нативной конформации. Вполне вероятно, что эти виды разлагаются с разной скоростью, и, таким образом, следует анализировать отдельно. Лизаты из Atxn1 82Q-GFP-экспрессирующих клетки фракционированию в NP-40-растворимый (растворимый или NS, вероятно, представляющих родные белки или неправильно упакованных мономерные / олигомерные белки) и (NI, агрегированный /) Неправильно свернутые порции NP-40-нерастворимых. Последние могут быть дополнительно разделены на SDS-растворимой (SS, вероятно, неупорядоченные агрегаты) или ДСН-резистентный (SR; вероятные амилоидные фибриллы) Фракции (рис. 1б) NS и SS фракции могут быть проанализированы с помощью SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттинга, тогда как SR фракция может быть обнаружен с помощью фильтра замедляющих анализов с последующим иммуноблоттингом. СНХ Чейза сочетается с методом фракционирования для моющего средства, и обнаружили , что период полураспада SS Atxn1 82Q значительно короче , чем у NS Atxn1 82Q и общей Atxn1 82Q (рис 2А), что указывает , что фракция СС может быть легко распознаваться и деградирует в клетках 9. Таким образом, этот метод представляет собой мощный инструмент для изучения динамики белков и неправильно свернутых сравнить их картину деградации.
Мы также описываем способ, который пригоден для высокопроизводительного скрининга для выявления макромолекулами или небольших соединений, которые могут модулировать деградацию неправильно свернутых белков. Этот метод основан на конформационно дестабилизированной мутанта люциферазы светлячка (LucDM) 17, модель шаперонного подложки. У нас есть предохранительd LucDM к ядерной локализации сигнала (NLS), чтобы исследовать системы PQC в этом клеточном отсеке, и GFP (NLS-LucDM-GFP) для удобства обнаружения. NLS-LucDM-GFP формы микроскопически видимые ядерные агрегаты в небольшом проценте клеток (рис. 3 , а ) Подобно Atxn1 82Q, NLS-LucDM-GFP-но не его дикого типа аналог NLS-LucWT-GFP-модифицируется SUMO2 / 3 и регулируется PML-RNF4 пути 9. NLS-LucDM-GFP, также образует SS и SR видов, хотя относительные количества СС и СР видов являются минимальными по сравнению с NS, с использованием условий, описанных в протоколе 3 ниже. Для упрощения анализа, мы только анализируют SDS растворимый LucDM (включая как NS и фракции SS) с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Важно отметить, что СНХ Чейза анализ показал , что период полураспада в ДСН-растворимой NLS-LucDM-GFP значительно короче , чем у его дикого типа аналога (рис 3B), предполагая , что LucDM является специфическим субстратом для системы , которая распознает и деградируетНеправильно свернутые белки.
Деградация LucDM-GFP вызывает значительное снижение общего сигнала флуоресценции. Таким образом, мы также разработали протокол для обнаружения в режиме реального времени клеточного LucDM-GFP с помощью анализа микропланшет флуоресценции на основе. Многие экран с высокой пропускной способностью (HTS) системы разработаны для лекарств или генов , модифицирующих клеточные агрегаты и жизнеспособность клеток , вызванных аномальным белков 18-20. Тем не менее, очень немногие HTSs специально разработаны для нацеливания деградации в клетках млекопитающих. Этот протокол служит надежной системой для быстрого и крупномасштабного анализа эффектов экспрессии белка, нокдаун, и медикаментозное лечение на клеточном неправильно свернутых деградации белка. Использование клеток HeLa в качестве примера, ниже мы опишем протоколы для анализа этих двух белков неправильно свернутых. Анализы могут быть также применены к другим линиям клеток, хотя условия Трансфекция и время, конечно, возможно, должны быть оптимизированы для отдельных клеточных линий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление реактива
- Подготовка буфера для лизиса клеток (50 мМ Трис, рН 8,8, 100 мМ NaCl, 5 мМ MgCl 2, 0,5% NP-40). Дополнение 2 мМ ДТТ, 1 x полный коктейль протеазы, и 250 МЕ / мл Benzonase перед использованием.
- Подготовка гранул буфера (20 мМ Трис, рН 8,0, 15 мМ MgCl 2). Дополнение 2 мМ ДТТ, 1 x полный коктейль протеазы и 250 МЕ / мл Benzonase перед использованием.
- Приготовьте 3-кратный буфер кипения (6% SDS, 20 мМ Трис, рН 8,0). Дополнение 150 мМ DTT перед использованием.
- Приготовьте низкой флуоресценции DMEM среду для анализа с использованием микропланшет-ридера флуоресценции. Смешайте 25 мМ глюкозы, 0,4 мМ глицина, 0,4 мМ аргинин, 0,2 мМ цистеин, 4,0 мМ глутамина, 0,2 мМ гистидина, 0,8 мМ изолейцин, 0,8 мМ лейцина, 0,8 мМ лизина, 0,2 мМ метионин, 0,4 мМ фенилаланина, 0,4 мМ серин, 0,8 мМ треонин, 0,078 мМ триптофана, 0,4 мМ тирозин, 0,8 мМ валин, 1,8 мМ CaCl 2, 0,81 мМ MgSO 4, 5,33 мМ KCl, 44,0 мМ NaHCO 3, 110 мМ NaCl, 0,9 мМNaH 2 PO 4. Регулировка рН раствора с помощью HCl или NaOH до рН 7,4. Стерилизовать среды посредством фильтрации.
Примечание: Эта среда содержит компоненты стандартной среды DMEM с высоким содержанием глюкозы исключением того, что Fe (NO 3) 3, витамины и феноловый красный опущены. Фенол красный, рибофлавин и пиридоксаль в регулярной DMEM культуральной среде значительно мешают обнаружению сигнала флуоресценции 21. Питательная среда без этих компонентов имеет решающее значение для успешного клеток GFP изображений живых. Среда стабилен в течение 12 месяцев при хранении в холодильнике.
2. Деградация Количественный анализ Atxn1 82Q GFP
- Пластина примерно 3 х 10 5 клеток HeLa на 35 мм чашках со средой DMEM , дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), так что после того, как O / N культивировании клеток расти до слияния 40-60% в момент трансфекции.
Примечание: Число пластин, необходимых основано на количестве моментов времени и обработок двневписанной ниже. - Трансфекция HeLa клеток с 0,3 мкг Atxn1 82Q-GFP / pRK5 плазмиды в каждую лунку с использованием реагента для трансфекции в соответствии с инструкцией изготовителя 9. Сделать мастер трансфекции смесь, содержащую ДНК и трансфекции реагента и аликвоту его для каждой лунки.
- 4-5 часов после трансфекции, исследовать живые клетки под перевернутой флуоресцентного микроскопа для экспрессии GFP с длиной волны возбуждения 450-490 нм. Возвращение клетки обратно в инкубатор после визуализации.
Примечание: Соблюдайте как рассеянные сигналы GFP и небольшие крапинками GFP сигналов в ядре в это время. - Извлеките носитель с помощью вакуумной аспирации и добавляют 2 мл свежей DMEM, содержащей 50 мкг / мл СНХ. Treat клетки в течение 0, 4, 8, 12 и 16 ч с хлоргексидином до уборки урожая. Для изучения протеасомной деградации, включают протеасомы ингибитора MG132 (10 мкМ) в одной пластинке, обработанной в течение 16 ч в качестве контроля.
- Урожай одной пластины клеток в каждый момент времени. Удалите среду с помощью вакуумной аспирации А.Н.d мыть тарелки в два раза с 3 мл охлажденного на льду 1x фосфатном буферном солевом растворе (PBS). Snap-заморозить пластину на сухом льду.
- После последней временной точки (16 ч), скрести замороженные клетки (со всех точек времени) в 150 мкл охлажденного льдом буфера для лизиса клеток и инкубировали на льду в течение 30 мин.
- Центрифуга лизатов клетка в лабораторной центрифуге при 17000 х г в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
- Передача супернатант, который содержит NP-40-растворимых (NS) белки, в другую пробирку, используя пипетку.
Примечание: Используйте супернатантов для измерения концентрации белка Бредфорда, если это необходимо. - Ополосните гранулы, осторожно добавляя приблизительно 200 мкл PBS 1x в пробирки, не нарушая гранул. Осторожно удалите PBS с помощью вакуумной аспирации или пипеткой. Повторное приостановить их в 150 мкл охлажденного льдом буфера осадка клеток, а затем 15-30 мин инкубирования на льду.
Примечание: Ресуспендированный осадок фракция содержит NP-40 нерастворимые (NI) белки. Смотрите рисунок 1В для DIAGбаран моющего средства фракционирования. - Добавить 75 мкл 3x кипящую буфера в NS фракции и NP-40 неразрешимых (NI) фракций ресуспендировали из гранул. Тепло образцов при 95 ° С на блоке тепла в течение 5 мин.
Примечание: Глыбы в NP-40 нерастворимых фракций растворяют после нагревания и образцы станет ясно. - Добавить SDS-гель буфера загрузки к аликвоте вареных NS и NI. Нагрузка равный объем образцов, собранных со всех временных точках на SDS-PAGE геле. Объемные загружен примерно соответствует 20 мкг NS из образца, собранные на время 0. ПРИМЕЧАНИЕ: NS, а также SDS-растворимая (SS) белок от NI фракции, могут быть решены с помощью SDS, разделяющего геля. В противоположность этому , в ДСН-резистентный (SR) агрегатов из фракции Н.И. застревают в геле погрузочных скважин (Фигура 1В). Для улучшения детектированием Вестерн-блоттингом, двойной объем NI может быть загружен.
- Обнаружение NS и SS Atxn1 82Q-GFP с помощью Вестерн-блоттинга с использованием анти-GFP антитела и усиленной хемилюминесценции (ECL).
Примечание: Atxn1 82Q во фракции СС, как правило, меньше по сравнению с фракцией NS при использовании этого протокола. Более экспозиции СТЭК необходим для получения оптимальных сигналов. - Изучение SR Atxn1 82Q из фракции гранул с помощью замедляющих анализов фильтров с использованием дот-блот - устройства (рисунок 1В). Если коротко, то создать дот-блот аппарат держит ацетат мембрану 0,2 мкм целлюлозы. Нагрузка 80-120 мкл вареного NI в каждую лунку дот-блот-аппарата.
Примечание: Как только небольшие количества SR агрегатов образуются в клетках, для блоттинга точка, загрузите объем эсерской фракции, которая приблизительно в 10-15 раз от объема фракции NS, используемой для вестерн-блот-анализа.- После фильтрации проб через мембрану с использованием вакуума, Atxn1 82Q-GFP агрегаты приклеенной на мембране могут быть обнаружены с помощью анти-GFP иммуноблоттинга 9,12,22.
ПРИМЕЧАНИЕ: См предыдущих докладах 9,12,22 для подробного описания фильтра замедляющей анализа. Этот шаг является необязательнымпотому что SR Atxn1 82Q минимальна по сравнению с СС и NS фракций после короткой трансфекции, описанной в данном протоколе. Кроме того, уровни SR Atxn1 82Q в основном остаются теми же над СНХ погони (Фигура 2В). Тем не менее, он по-прежнему важно, чтобы изучить, возникла ли на суммы SS Atxn1 82Q с течением времени для любого лекарственного лечения или экспрессии генов в первоначальных экспериментах. SS видов белка остаются в SDS-PAGE гель-погрузочных скважин могут быть обнаружены с помощью вестерн-блоттинга. Тем не менее, этот метод менее чувствителен и генерирует более вариабельных результаты (рис 1б).
- После фильтрации проб через мембрану с использованием вакуума, Atxn1 82Q-GFP агрегаты приклеенной на мембране могут быть обнаружены с помощью анти-GFP иммуноблоттинга 9,12,22.
3. Деградация Количественный анализ NLS-люциферазы-GFP с помощью SDS-PAGE и Вестерн-блот
- Пластина примерно 3 х 10 5 клеток HeLa на 35 мм чашках со средой DMEM , дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). После того, как O / N культивированием, стечение 40-60% достигается во время трансфекции. Число пластин, необходимых на основе количества ТIME точки и процедуры описаны ниже.
- Трансфекция HeLa клеток с 1,0 мкг NLS-люциферазы-GFP / pRK5 плазмиды в каждую лунку с использованием реагента для трансфекции в соответствии с инструкцией изготовителя 9. Сделать мастер трансфекции смесь, содержащую ДНК и реагент для трансфекции аликвот каждую лунку.
- После того, как O / N трансфекцией (около 15 часов), исследовать живые клетки под перевернутой флуоресцентного микроскопа для экспрессии GFP с длиной волны возбуждения 450-490 нм. Возвращение клетки обратно в инкубатор после визуализации.
Примечание: Отраженный сигнал ядерной GFP, можно наблюдать в большинстве клеток (70%). Небольшой процент (5%) клеток имеют ядерные агрегаты. - Извлеките носитель с помощью вакуумной аспирации и добавляют 2 мл свежей DMEM, содержащей 50 мкг / мл СНХ. Лечить клеток для 0, 1,5, 3, 4,5 и 6 ч с хлоргексидином до уборки урожая. Для изучения протеасомной деградации, включают в себя дополнительный MG132 ингибитором протеасом (10 мкМ) в одной пластинке, обработанной в течение 6 часов в качестве контроля.
- Урожай одной пластины клеток в каждый момент времени. Удалите среду с помощью вакуумной аспирации и промыть пластины дважды с 3 мл охлажденного на льду фосфатно-буферном солевом растворе (PBS). Snap-заморозить пластину на сухом льду.
- После последней временной точки (6 ч) закончена, клетки замораживают при небывало точек соскабливают в 150 мкл ледяного буфера для лизиса клеток и инкубировали на льду в течение 30 мин.
- Добавить SDS гель-загрузочного буфера для лизатов целых клеток для конечной концентрации 2% SDS и 50 мМ DTT. Инкубируйте образцы на тепловом блоке при 95 ° С в течение 5 мин.
- Анализ NLS-люциферазы-GFP с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга с использованием анти-GFP антитела. Нагрузка равный объем образцов, собранных со всех временных точках на SDS-PAGE геле. Объем загружен приблизительно 20 мкг целых клеточных лизатов из образца, собранных в момент времени 0.
4. В режиме реального времени Деградация Количественный анализ NLS-люциферазы-GFP с помощью флуоресцентной Считыватель микропланшетов
- Семя приблизительно 1 х 10 4HeLa клетки в черные 96-луночные планшеты для тканевых культур с прозрачным дном. После того, как O / N культивированием, стечение 50-70% достигается во время трансфекции.
Примечание: по 60 мкл среды, содержащей полностью суспендированные клетки HeLa высевают непосредственно в каждую лунку. Не добавляйте дополнительную среднюю или каменную плиту вперед и назад, после посева, в противном случае клетки могут быть распределены неравномерно. - Трансфекция HeLa клетки с 0,05-0,1 мкг NLS-люциферазы-GFP / pRK5 плазмиды 9 в каждую лунку с использованием реагента для трансфекции в соответствии с инструкцией изготовителя. Сделать мастер трансфекции смесь, содержащую ДНК и трансфекции реагента и аликвоту его для каждой лунки. Три лунки с клетками, не трансфецировали ДНК, которая служит в качестве контроля для сигнала фонового флуоресценции для каждого условия лечения.
Примечание: альтернативный способ уменьшить вариацию трансфекция для трансфекции клеток перед посевом. Тем не менее, большая часть клеток, трансфицированных белком неправильно свернутыхs не присоединять или показать пониженную жизнеспособность с помощью этого метода. Вполне вероятно, что некоторые клетки не могут выдержать напряжение, вызванное трипсина пищеварения при экспрессии токсичных белков неправильно упакованных. В результате, общий флуоресцентный сигнал значительно снижается. - 20-24 ч после трансфекции, исследовать живые клетки под перевернутой флуоресцентного микроскопа для экспрессии GFP с длиной волны возбуждения 450-490 нм.
- Удалите среду с помощью вакуумной аспирации. Добавить приблизительно 200 мкл 1X PBS в каждую лунку и затем аспирацию, чтобы удалить остаточное количество DMEM среды.
- Добавьте 60 мкл низкой флуоресцентной DMEM среде с 5% FBS и 50 мкг / мл СНХ. Для изучения протеасомной деградации, включают в себя дополнительный MG132 ингибитор протеасом (10 мкМ) в одном наборе образцов. Набор трех экземплярах скважин для каждого лечения / состояния.
Примечание: лечение MG132 включен в качестве контроля для деградации протеосомной, потому что это очень важно, чтобы исключить другие факторы, которые могут вызвать падение флуоценция сигнал, в том числе гибель клеток и тушение флуоресценции. - Измерение флуоресценции сигнал GFP непосредственно на флуоресцентном планшет-ридере после добавления СНХ.
Примечание: Параметры измерения программного обеспечения приведены в таблице 1. - Прочитайте Пластинку каждый час в течение до 8-10 часов. После прочтения, верните пластину обратно в инкубатор для культивирования клеток.
- Экспортировать данные в файл электронной таблицы. Используйте среднее значение нескольких считывает для каждой лунки в качестве интенсивности флуоресценции. Нормализация значения каждой точки данных для средних значений времени 0 в соответствующих группах. Участок нормированной интенсивности флуоресценции с течением времени , как показано на фиг.4А и 4В, и фиг.5, правильно панелей.
- Провести статистический анализ скоростей разложения между двумя условиями , используя двухстороннюю ANOVA с повторными измерениями 23.
Примечание: В этом анализе, "интенсивность флуоресценции" является зависимой переменной, тогда как "сточных вусловия лор "и" время "являются два фактора. Вместо сравнения данных на отдельных временных точках, двухсторонняя ANOVA с повторными измерениями анализирует разницу между двумя группами лечения в течение всего периода курса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В стационарном режиме анализа, микроскопически видимые Atxn1 82Q-GFP ядерные агрегаты можно наблюдать в 30 - 50% клеток HeLa 20 ч после трансфекции (рис 1А). Вестерн - блот - анализ NS и SS фракции с использованием анти-GFP антитела показывает отчетливую полосу Atxn1 82Q-GFP между 100 кДа и 150 кДа маркеров, соответствующих молекулярной массе что белок (Фиг.1В). Atxn1 82Q-GFP , в SR фракции может быть обнаружено либо фильтра замедляющей анализа, или с помощью SDS-PAGE и вестерн - блоттинга , в качестве видов в верхней части концентрирующий гель (Фиг.1В). Для анализа полураспада с использованием протокола, описанного выше, СНХ погоня начинается 4-5 часа после первоначальной трансфекции до образования каких-либо крупных ядерных агрегатов. Полураспада Atxn1 82Q-GFP во фракции SS составляет около 5 ч, в отличие от небольшой или вообще без уменьшения Atxn1 82Q-GFP во фракции NS над 16 ч (фиг.2А). Degraдации из Atxn1 82Q-GFP частично подавляется обработкой клеток с MG132 (рис 2А). Ранее мы показали, что PML стимулирует деградацию белка неправильно свернутых способствуя их SUMOylation. Здесь мы используем PML нокдаун в качестве примера измененном пути деградации. PML миРНК лечение продлили период полураспада Atxn1 82Q-GFP во фракции SS (фиг.2А). Нет очевидных изменений в SR Atxn1 82Q-GFP не обнаружено либо контроля или PML миРНК-обработанных клеток (рис 2B и 2C).
Двадцать ч после трансфекции, NLS-LucDM-GFP агрегаты становятся микроскопически видимый в 5 - 15% клеток HeLa, но это может варьироваться в зависимости от количества ДНК, трансфицируют (фиг.3А). Период полураспада ДСН растворимого NLS-LucDM-GFP составляет 2 - 3 ч (рис 3В и 3С). Интенсивность флуоресценции трансфицированных клеток также уменьшается с течениемвремя после обработки СНХ (рис 4A и 4B). Шесть ч после обработки СНХ, интенсивность флуоресценции достигает стабильного этапа и перестает уменьшается (рис 4A и 4B). В тот же момент времени, растворимый NLS-LucDM-GFP , в значительной степени деградировали (рис 3B и 3C), предполагая , что оставшаяся флуоресценция генерируется из агрегированных видов , устойчивых к деградации. Последовательно, агрегируются, но не рассеивается, остается GFP в клетках 9 ч после обработки СНХ (рис 4в). Интересно отметить , что трансфекция с использованием большего количества NLS-LucDM-GFP плазмиды генерирует больше ядерных агрегатов, а также более высокую интенсивность флуоресценции , остающегося, хотя скорость разложения не влияет (рис 4A и 4B). Используя либо SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттинга или чтения флуоресценции, мы можем обнаружить ингибирование деградации NLS-LucDM-GFP путем обработки MG132 или PML миРНК (Цифры 3C, 4A, 4B и 5).
Рисунок 1. Обнаружение Atxn1 82Q-GFP с помощью флуоресцентной микроскопии и моющего средства фракционирования. (А) HeLa клетки трансфицировали Atxn1 82Q-GFP и окрашивали DAPI. Индивидуальные и объединенные изображения отображаются. Шкала бар = 10 мкм. (B) диаграмма , показывающая моющий фракционирование Atxn1-82Q экспрессирующих клеток , как описано в протоколе 2. Маркеры молекулярной массы указаны слева от вестерн - блот изображений Atxn1-Atxn 82Q. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры ,
66 / 54266fig2.jpg "/>
. Рисунок 2. Деградация анализ из Atxn1 82Q-GFP с помощью моющего средства фракционирования HeLa клетки были предварительно обработаны с контролем (-) или PML миРНК (A и C) или не-обработке (В). Клетки трансфицировали Atxn1 82Q-GFP и обрабатывают хлоргексидином в отсутствии или в присутствии MG132. Клеточных лизатов фракции анализировали с помощью SDS-PAGE с последующим вестерн - блоттинга (A, для NS и SS фракций) или анализа замедляющей фильтра (В и С, для SR фракции) с использованием анти-GFP антитела. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версию эта фигура.
Рисунок 3. Анализ деградации NLS-LucDM-GFP с помощью флуоресцентной MICRoscopy и вестерн - блот. (A) клетки HeLa , трансфицированные NLS-LucDM-GFP окрашивали DAPI. Индивидуальные и объединенные изображения отображаются. Шкала бар = 25 мкм. Arrowhead указывает на ячейку с ядерными агрегатах. (В и С) HeLa клетки трансфицировали НШ-LucDM-GFP и дикого типа люцифераза слитый белок NLS-LucWT-GFP (В), или трансфицированы с контролем или PML миРНК, с последующей трансфекцией НШ-LucDM-GFP ( С). Клетки обрабатывали СНХ и MG132, как указано. Цельные клеточные лизаты анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с использованием анти-GFP антитела. Изображение изменяется от предыдущей публикации с разрешением 9. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Флуоресцентный микропланшет на основе анализа для деградации NLS-LucDM-GFP. HeLa клетки высевали на 96 - луночные планшеты трансфицировали 0,05 мкг (А) или 0,1 мкг (В и С) NLS-LucDM-GFP и обрабатывают хлоргексидином в наличие или отсутствие MG132. (А и Б) Флуоресцентные интенсивности скважин были измерены в указанных временных точках (средние значения ± стандартное отклонение, n = 3). Панели слева показывают исходное показание флуоресценции, в то время как панели справа показывают значения нормированы на чтениях в момент времени 0 в соответствующих группах лечения. Разница между группами, обработанными и без MG132 анализировали с помощью двустороннего дисперсионного анализа с повторными измерениями. Значения P между двумя группами лечения указаны. (C) Скважины были рассмотрены до или после 9 ч лечения СНХ, или после того, как СНХ и MG132 лечения, с помощью флуоресцентного микроскопа. Для того, чтобы лучше показать обе ячейки с ярким агрегированного НЖК-LucDM-GFP и тех, с рассеянным тусклом белка, гамма-значение 1,5 применялась ко всем изображениям. Шкала бар = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Пониженная скорость деградации НШ-LucDM-GFP в PML нокдаун клеток. HeLa клетки , предварительно обработанный с контролем или PML миРНК были посеяны в 96 - луночные планшеты. Деградация NLS-LucDM-GFP анализировали , как описано на рисунке 4 (двусторонний ANOVA, р <0,0001). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
54266 / 54266fig6.jpg "/>
Рисунок 6. флуоресценция Atxn1 82Q-GFP остается неизменным в течение СНХ погони. Клетки HeLa трансфицировали Atxn1 82Q-GFP. 24 ч после трансфекции, деградация Atxn1 82Q-GFP анализировали , как описано на рисунке 4. На рисунке показано исходное чтение флуоресценции. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 7. Флуоресцентный анализ микропланшет на основе для деструкции цитоплазматических LucDM-GFP. Клеток HeLa , посеянных на 96 - луночные планшеты трансфецировали 0,1 мкг LucDM-GFP , обработанной СНХ , в присутствии или отсутствии MG132. Результаты анализировали , как описано в рисунке 4 (двусторонний ANOVA, р <0,0001).ТПС: //www.jove.com/files/ftp_upload/54266/54266fig7large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Таблица 1 .: Параметры измерения на флуоресцентном счетчике для микропланшетов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Механизмы, которые регулируют процесс деградации белков неправильно свернутых необходимы для поддержания гомеостаза клеточных белков, и они, вероятно, представляют собой ценные цели препарат для лечения нейродегенеративных расстройств и других белков-неправильного сворачивания заболеваний. При этом, анализы, которые исследуют деградацию белков неправильно свернутых описаны, используя патогенный белок Atxn1 (Atxn1 82Q) и ядерное локализованное люциферазы мутант (NLS-LucDM) в качестве примеров.
Для изучения деградации Atxn1 82Q, который имеет период полураспада в течение 18 часов, мы ввели новый метод путем объединения клеток фракционирование с классическим СНХ 9. Этот метод показал гораздо более быстрый клиренс из неправильно свернутых видов Atxn1 82Q с течением времени. Кроме того, введение LucDM обеспечивает модель неправильно уложенный субстрат для изучения общих механизмов деградации неправильно свернутых белков. Для того, чтобы удовлетворить потребность в системе HTS для обнаружения неправильно свернутых деградации белка в клетках млекопитающихs, мы разработали быстрый анализ деградации для LucDM с помощью флуоресцентной микропланшет-ридера. Система служит мощным инструментом для химических и генетических экранов.
Белок Atxn1 82Q присутствует в NS, SS, и SR фракции клеточных лизатов. Эсеровской фракции становятся все более распространенными при длительной культуре после трансфекции, предполагая , что он находится в такой форме, которая трудно быть почитаем или разлагаться, например, амилоидные фибриллы. Генерация токсичных неправильно свернутых видов или агрегатов , которые не могут быть легко разлагаются , могут блокировать пути деградации белка, препятствуя анализ эндогенного клеточного механизма , контролирующей аберрантной протеины 24, 25,26. Для того, чтобы избежать образования большого количества СР, мы начинаем СНХ Чейза 4-5 ч после начальной трансфекции. Мы обнаружили, что это очень важно для анализа клеточных условий, которые могут задержать деградацию фракции СС. В дополнение к времени трансфекции, важно также, чтобы не более чемзаливать клеток путем экспрессии Atxn1 82Q белка на очень высоком уровне. Если нет или очень медленной деградации не наблюдается для всех фракций, меньшее количество Atxn1 82Q плазмиды должны быть использованы для трансфекции. В идеале, тест должен быть завершен в течение 12 часов, как апоптотических клеток заметили за этот момент времени. На фигуре 2А, количество SS Atxn1 82 в контрольных клетках резко отличается от такового в PML миРНК-обработанных клетках , как короткие , как 8 часов. Внимание должно быть принято, если разница в группе, получавшей лечение только наблюдали за 12 ч, так как это может быть вызвано другими факторами, которые влияют на жизнеспособность клеток, а не деградации белка.
По сравнению с NS Atxn1 82Q, Atxn1 82Q во фракции SS быстро исчезает, указывая , что он представляет собой неправильно упакованные видов , которые могут быть легко деградирует с помощью протеасом (фиг.2А). В противоположность этому , уровни SR Atxn1 82Q остаются неизменными в течение того же времени курс (Фигура 2В), подтверждающиечто это не-разлагаемых видов. Тем не менее, анализ SR фракции должны иметь важное значение для анализа механизмов , которые непосредственно удаляет цитоплазматические агрегаты (например, аутофагии) или влияют на формирование этих агрегатов. Заметно, MG132 оказывается менее эффективным в предотвращении снижения Atxn1 82Q во фракции SS. Это может быть вызвано повышением в уровнях ROS при протеосомного торможения 27, которые могли бы способствовать агрегации Atxn1 82Q.
Большим преимуществом LucDM-GFP анализа является то, что он может быть адаптирован к анализу с использованием HTS флуоресцентном счетчике пластины. Сначала мы попытались разработать систему HTS для Atxn1 82Q. Однако, поскольку лишь небольшая часть общего белка Atxn1 82Q ухудшается с течением времени, флуоресценция клеток , экспрессирующих GFP-Atxn1 82Q остается в основном неизменной в течение СНХ погони (рисунок 6). Другие белки Неправильно свернутые с общей длительным периодом полураспада будет иметь подобные проблемы с в режиме реального времени фторомescent анализ. В отличие от этого , наблюдается заметное снижение общего белка NLS-lucDM-GFP (Рисунки 3 и 4). Эта особенность, вместе с его коротким периодом полураспада (2-3 ч), позволяет этой модели шаперонная субстрат легко обнаружить с помощью флуоресцентной спектроскопии. В предыдущих исследованиях, GFPu, белок GFP , слитый с конструктивным сигналом деградации (CL-1), широко используется в качестве репортера функциональности убиквитин-Протеасома системы 28,29. Также известный суррогатной неправильно уложенный белок в клеточных моделях и животных 30. По сравнению с GFPu, одно из преимуществ анализа деградации, описанного здесь является то, что неправильно уложенный люциферазы является широко используемой моделью шаперонная подложки. Исследуя активность люциферазы, можно легко оценить родной, денатурированные, и сложила конформации люциферазы в пробирке и в естественных условиях. Таким образом, наша система служит весьма полезной платформой для подключения связывающий белок и складных анализов сСистема сотовой деградации с использованием той же подложки 9.
Посредством измерения в режиме реального времени флуоресценции могут быть получены следующие значения: Исходной интенсивности флуоресценции, стабильной оставшейся интенсивности флуоресценции и белка полураспада. Эти значения коррелируют соответственно с количеством общего белка до охоты, количества белков, устойчивых к разложению, а также скорости оборота протеина. Таким образом, можно использовать флуоресцентного анализа в режиме реального времени, чтобы сделать всесторонний анализ уровней и динамики различных видов белка неправильно свернутых. Время от времени наблюдается относительно большое изменение исходной флуоресценции между повторами (например, рисунок 5, левая панель). Это, вероятно, вызвано изменчивостью посева клеток или трансфекции. Тем не менее, несмотря на разницу в исходной интенсивности флуоресценции, сигнал всех повторностей падает на очень одинаковой скоростью. Нормализация сигналов сюдам каждый раз указывает на интенсивность в момент времени 0 может уменьшить отклонение от скважины до скважины и более точно отражает темпы деградации (рис 4А, 4В и рисунка 5, слева против правая панели).
В дополнение к ядерной форме, мы также проанализировали цитоплазматический LucDM-GFP. Цитоплазматические LucDM-GFP , имеет аналогичную картину деградации , кроме наблюдалось более высокий процент оставшейся флуоресценции при той же экспериментальной методике была применена , как описано в Протоколе 4 (рисунок 7). Деградация может быть полностью ингибируется MG132, что указывает на этот анализ может быть использован для мониторинга цитоплазматический контроля качества белка путем деградации протеосомальной. Для будущих исследований, было бы интересно выяснить , является ли LucDM-GFP может быть применен и к другим сотовым отсеках, например, митохондрий или эндоплазматического ретикулума, когда слит с конкретными локализации сигналов сотовой отсека.
Как было отмечено в протоколе для люминесцентного на основе анализа, очень важно использовать низко флуоресцентные среды для снижения флуоресцентного фона и использовать основной смеси ДНК и трансфекции реагента для снижения хорошо к скважине вариации трансфекции. Регулировки усиления может быть скорректирована на некоторых читателей флуоресцентные пластины. Важно , чтобы установить усиление в ручной режим , а не оптимизировано и использовать то же значение на протяжении всего анализа (таблица 1). Значение коэффициента усиления можно регулировать, чтобы максимизировать чтение из клеточной флуоресценции GFP тех пор, пока показание не выходит за рамки предела обнаружения.
На данном этапе, мы по-прежнему полагаться на трансфекцией, чтобы выразить LucDM. Для уменьшения изменения и упрощения анализа для HTS, будущая цель заключается в создании стабильной клеточной линии с индуцируемой экспрессии LucDM. Однако, как микропланшет и культуральной среды и имеют фоновой флуоресценции, крайне важно иметь GFP сигнала значительно выше, чем фон. Unforсожалению, устойчивые линии мы установили в последнее время все они имеют низкую экспрессию LucDM. Таким образом, развитие устойчивой линии с более высокой экспрессии белка позволит существенно повысить эффективность скрининга.
Анализы деградации, описанные здесь, также могут быть применены к другим неправильно свернутых белков. Благодаря динамической особенности белков неправильно свернутых эти анализы должны быть в сочетании с любым другим анализом, чтобы раскрыть углубленные механизмы контроля качества белка. Эти анализы включают измерения устойчивые уровни агрегатов и их разделов в различных клеточных фракциях (Рисунок 1) и анализа белков складывании или агрегации с использованием очищенных рекомбинантных белков. Эти анализы помогут отличить прямое или косвенное воздействие экспрессии генов или наркотиков по деградации белка или агрегации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M8699 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | 45000232 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Boehringer Mannheim | 4693159001 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Living Colors GFP Monoclonal Antibody | Clonetech | 632375 | |
| Anti-Actin mAb Rabbit, IgG | Sigma-Aldrich | A45060-200UL | |
| Amino acids | Sigma-Aldrich | Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium | |
| Olympus IX-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX71/IX81 | |
| 96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom | Sigma-Greiner | 89135-048 | |
| Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO | TECAN | Infinite 200® PRO | |
| Cellulose acetate membrane 0.2 µm | Sterlitech | CA023001 | |
| Prism 5 | GraphPad | Statistical analysis software |
References
- Dobson, C. M.
- Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H.
- Selkoe, D. J.
- Vousden, K. H., Prives, C. Blinded by the Light: The Growing Complexity of p53. Cell. 137, 413-431 (2009).
- Xu, J., et al. Gain of function of mutant p53 by coaggregation with multiple tumor suppressors. Nat Chem Biol. 7, 285-295 (2011).
- Orr, H. T., Zoghbi, H. Y.
- Guo, L., et al. A cellular system that degrades misfolded proteins and protects against neurodegeneration. Mol Cell. 55, 15-30 (2014).
- Chu, Y., Yang, X. SUMO E3 ligase activity of TRIM proteins. Oncogene. 30, 1108-1116 (2011).
- Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26, 4102-4112 (2007).
- Janer, A., et al. PML clastosomes prevent nuclear accumulation of mutant ataxin-7 and other polyglutamine proteins. J Cell Biol. 174, 65-76 (2006).
- Bauer, P. O., et al. Harnessing chaperone-mediated autophagy for the selective degradation of mutant huntingtin protein. Nat Biotechnol. 28, 256-263 (2010).
- Austin, J. A., et al. Disease causing mutants of TDP-43 nucleic acid binding domains are resistant to aggregation and have increased stability and half-life. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 4309-4314 (2014).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nat Chem Biol. 10, 677-685 (2014).
- Paxinou, E., et al. Induction of alpha-synuclein aggregation by intracellular nitrative insult. J Neurosci. 21, 8053-8061 (2001).
- Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat Methods. 8, 879-884 (2011).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466, 1069-1075 (2010).
- Fortini, M. E., Bonini, N. M. Modeling human neurodegenerative diseases in Drosophila: on a wing and a prayer. Trends Genet. 16, 161-167 (2000).
- Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PLoS One. 7, (2012).
- Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
- McDonald, J. H. Handbook of Biological Statistics. 3, 3rd, 173-179 (2014).
- Holmberg, C. I., Staniszewski, K. E., Mensah, K. N., Matouschek, A., Morimoto, R. I. Inefficient degradation of truncated polyglutamine proteins by the proteasome. EMBO J. 23, 4307-4318 (2004).
- Verhoef, L. G., Lindsten, K., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. Aggregate formation inhibits proteasomal degradation of polyglutamine proteins. Human molecular genetics. 11, 2689-2700 (2002).
- Jana, N. R., Zemskov, E. A., Wang, G., Nukina, N. Altered proteasomal function due to the expression of polyglutamine-expanded truncated N-terminal huntingtin induces apoptosis by caspase activation through mitochondrial cytochrome c release. Human molecular genetics. 10, 1049-1059 (2001).
- Fribley, A., Zeng, Q., Wang, C. Y. Proteasome inhibitor PS-341 induces apoptosis through induction of endoplasmic reticulum stress-reactive oxygen species in head and neck squamous cell carcinoma cells. Molecular and cellular biology. 24, 9695-9704 (2004).
- Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
- Chen, Q., et al. Intrasarcoplasmic amyloidosis impairs proteolytic function of proteasomes in cardiomyocytes by compromising substrate uptake. Circulation research. 97, 1018-1026 (2005).
- Link, C. D., et al. Conversion of green fluorescent protein into a toxic, aggregation-prone protein by C-terminal addition of a short peptide. The Journal of biological chemistry. 281, 1808-1816 (2006).
