Summary
该协议描述了果蝇中可扩展的个体梳理分析技术，产生强大的定量数据来测量梳理行为。该方法是基于在一段时间内比较未修饰动物与修饰动物的身体上染料积累的差异。
Abstract
果蝇的美容行为是一个复杂的多步运动计划，需要协调的前肢和后肢的运动。在这里，我们提出了一个整理测定方案和新颖的室设计，可以成本效益可扩展，可以进行小型或大规模的果蝇梳理研究。苍蝇在整个身体上撒上了黄色染料，并给予时间从室内的身体上除去染料。然后将苍蝇沉积在一定体积的乙醇中以溶解染料。测量和记录用于修饰的和未移植的动物的染料 - 乙醇样品的相对光谱吸光度。该方案产生个体苍蝇染料积累的定量数据，可以容易地平均和比较样品。这允许实验设计容易地评估突变动物研究或电路操作的修饰能力。这个有效的过程既是通用又可扩展的。我们显示wWT动物和突变体动物之间的协议和比较数据为果蝇 I型多巴胺受体（DopR）的扫流。
Introduction
果蝇黑腹果蝇 （ D. melanogaster ）是一种强大的天生行为，涉及到多个独立运动程序的协调1 。果蝇清除身体的灰尘，微生物和其他可能抑制正常生理功能如视力和飞行的病原体，或导致显着的免疫挑战。在感测和响应机械2和免疫激活3时 ，苍蝇重复地将腿部在一起或在目标身体区域上摩擦，直到其足够清洁并且梳理进行到身体的另一部分。苍蝇执行在不同的较量疏导运动在很大程度上发生在刻板图案1,4。优先考虑信号，行为层次变得明显。电路和活动模式已被确定为支持ofa模型，首先发现层次顶部的修饰程序，并抑制随后修饰的身体区域的平行信号5 。最重要的是给头，然后是腹部，翅膀，最后是胸部5 。
黑腹果蝇的修饰程序是研究神经回路，调节分子信号和神经递质的理想系统。例如，神经纤维瘤功能6的损害， 果蝇脆弱的X型精神发育迟滞蛋白（ dfmr1 ） 7的损失和双酚A（BPA） 8的暴露都会导致过度的梳理和类似于神经纤维瘤病的离散人类症状的脆弱X综合征和自闭症谱系障碍和注意缺陷多动障碍（ADHD）的方面。修饰行为也可以是习惯在突变菌株2上差异化，将该运动程序提供给行为可塑性的研究。可以用果蝇建模的神经学现象的广度需要一种新颖的比较方法来测量苍蝇自身修养的能力。
囊泡单胺转运体和多巴胺和身体中的其它生物胺的相对丰度的联合作用已被证明介导果蝇梳理行为9,10。八聚胺和多巴胺刺激斩首苍蝇中可比的后腿修饰活性，而八胺的前驱酪胺也触发了较少的梳理7 。四多巴胺受体已经在果蝇 11，12，13，14被确定DopR，dDA1，dumb ）在后腿修饰行为中的作用15 。
疏导可以通过查看清洁度通过该动物可以用标记染料或荧光灰尘5,16喷粉整个身体后充分培训的程度来间接定量。残留在身体上的剩余灰尘可以用作总体行为的相对标记。经过足够的时间培养后，尘土飞逝，可能会在修饰行为中表现出特定的赤字。随着梳理调查变得更加广泛，方案已经将诸如斩首加入颈部连接神经10的措施 ，刷毛的触觉刺激以引起修复反应2 ，和录像的行为15 。修饰的直接观察可以通过使用视觉观察和手动记录特定事件疏导4的频率和持续时间来容易地研究。
我们设计了一个十五分钟的梳妆室，可以用3D打印机或激光切割机构造，蓝图设计可用于复制15 。该设计使用两个连接的中心板，其具有通过网格分开的开口和分开的两个另外的滑动顶部和底部平板，从中分别装载飞行物和/或染料。经过粉尘飞行时间后，我们将其沉积在乙醇中以溶解染料，并测量该溶液在染料波长处的吸光度。平板读数器可用于多个平行样品，或者单次读取分光光度计可用于单个样品。这种方法最大限度地减少了由处理引起的误差低成本测试法以更小，更具成本效益的规模运行。这种方法是由Julie Simpson和Andrew Seeds率先推出的方法衍生和修改的，他们使用带加热元件的较大梳妆室进行温度敏感电路操作5 。以下方案展示了全身梳理的量化，并显示了用于定量各个身体部位的染料积累的替代方法。我们还提供了WT和DopR突变体之间的样本比较数据，以及用于计算修饰行为的简单性能指标的方法。
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Protocol
准备
- 准备一个将活的果蝇从培养瓶移动到梳妆室的吸气器。吸气器允许有意识的动物转移到行为室，以确保麻醉不会影响随后的行为观察。
- 使用剪刀切割1.5英尺的管道ID“⅛”，OD¼“。至少1英寸的1毫升一次性微量吸头尖端。在切割尖端上握住1厘米长的网格（开口0.196英寸）。
注意：大多数1毫升尖端具有渐变线，其中尖端位于包装盒中，通常切割到该线。 - 将新鲜的1毫升微量吸头贴在网眼/切口上。观察网格形成两个尖端之间的紧密屏障。新尖端的内部为苍蝇创建了一个保持室。
- 切开新的微量移液器吸头的末端以扩大开口，以允许单个飞行通过。霍尔e将大致匹配梳妆室的开口（直径约1.5-2毫米）。
- 将嵌套的尖端贴合在管道的末端。将尖端推入管中以确保紧密配合，以允许真空压力。
- 在管的另一端，切下200μL微量吸头的尖端，并将狭窄的切割端装入管道。这是吸气器的“嘴”一侧。
- 使用剪刀切割1.5英尺的管道ID“⅛”，OD¼“。至少1英寸的1毫升一次性微量吸头尖端。在切割尖端上握住1厘米长的网格（开口0.196英寸）。
- 准备粉尘等分试管。称量大约5毫克的亮黄色染料在称重纸上。将灰尘倒入0.6 mL微量离心管中，并紧紧盖住盖子。
注意：我们建议在等分试样中使用丁腈手套，因为一些乳胶手套对染料是可渗透的。 - 对实验中的所有样品重复步骤1.2）（每个室中每次飞行一次）。
- 准备乙醇（EtOH）管：将1 mL 100％乙醇吸入1.5 mL微量离心管中。用于基因型或条件的标记管/ LI>
- 对实验中的所有样品重复步骤1.4）（每个室中每次飞行一次）。盖上并保存EtOH管以完成修饰测定。还包括至少一个“空白”样品，其仅为1mL EtOH而不用于阴性对照。
- 通过拧紧滑动顶板（具有较小的孔），但留下底板（带有较大的孔）以除去灰尘，组装每个梳妆室。
- 将每个必要的梳妆台平放在桌子上，顶面朝下。飞进入面是面朝下的。
- 将5毫克亮黄色染料分批装入每个室中，方法是将管子靠在所需孔上方的表面上。将舱室靠在桌子上，以确保所有的灰尘都通过网格落到顶板上。
- 将底板拧到每个室上，使得圆锥形开口的较宽端面朝外，孔不会靠在井上。保护机器人使其不会滑动并释放染料。
- 将房间翻转并将其平放在桌子上几次，以便灰尘通过网状物落在底板上。
- 将舱室的顶板滑入“打开位置”，使小孔与十五口井对齐，从而将苍蝇引入各个井。
飞尘和美化
- 通过轻轻地吸入吸气器的一端，如同使用吸管一样，将一个飞入吸入器。通过轻轻吹起并将开口朝向目标来存放苍蝇。
- 将一只蝇吸入用于实验的每个孔中。装载井后，滑动顶板，以便在整个舱室装载期间将飞行物捕获在舱室中，并将胶带放置在该井口的开口处，以防止在装载其他井时飞行逃生。如果多个苍蝇被吸入一个单一的好吧，离开这个开放，直到只剩下一只苍蝇。
- 在所有必需的井充满苍蝇之后，翻转室，使得底板向上，使得灰尘有可能通过穿过网状物覆盖苍蝇。
- 通过拧紧螺丝紧紧固定顶板和底板，并旋转室以将苍蝇粉碎4秒。
- 将房间（顶板朝下）撞在桌子上两次，使染料落到另一边。然后，将腔室翻转（顶板朝上）并敲击腔室两次，以确保染料沉淀在底部腔室的地板上，远离保持在顶部腔室中的苍蝇。
- 对于不允许修改的控制蝇，请立即进入协议的步骤3。对于将完成测定的苍蝇，请转到步骤2.7。
- 将房间平放在桌子或台面上，顶板向上放置三十分钟，以便苍蝇修剪。放下小屋呃在噪音和无振动的空间，以保持你的环境恒定，所有的修饰实验（照明水平，湿度和温度）。 RT或25°C带有湿度控制器的桌面孵化器是理想的选择。
3.样品制备和吸光度分析
- 将顶板向上保持，轻轻拧下底板，将其从室中取出，注意不要弄脏染料。
- 将房间放置在飞行CO 2垫上，气流低，直到苍蝇麻醉。
- 从室中拧下顶板。仔细使用镊子抓住一条腿，并从每个室移动一个除尘飞沫，并将其沉积在含有EtOH的1.5 mL微量离心管中。每个包含一个飞行的15个腔室的传送时间约为3-5分钟。如果/当使用多个室进行惊人的实验时，实验者应该考虑转移时间，以确保实验的有效分期。 一旦每个微量离心管包含1个飞，关闭盖子并将管反转三次以搅拌并混合染料和乙醇溶液。
- 孵育含有乙醇的管并在室温下飞行5小时，以确保将染料从飞入物中完全除去。 5小时后，短暂地旋转每个管（2秒），以确保染料从苍蝇中清除。
- 将等分试样将50μL实验的1.5mL试管插入96孔板的孔中（如果有的话），注意每个样品在板上的位置。加入200μLEtOH稀释样品5x。稀释避免了重灰尘飞扬或大修饰缺陷的天花板效应。
- 使用平板读数器分析每个样品在397 nm。或者，如果读板器不可用，则在标准分光光度计上测量可见光谱中各个样品和毛坯的吸光度。
- 通过读卡器阅读并记录样品，并将该电子表格与记录仪一起保存d样品在板上。
4.结果量化
- 编译所有样本的结果，并测量每个基因型或病症的方差。
注意：使用通过单因素方差分析和Bonferroni校正或多次平行比较的其他校正的统计分析将时间0分钟和时间30分钟的染料积累视为单独的条件。 - 使用以下等式计算每个基因型/条件的梳理百分比差异：[（时间0'处的染料积累平均值 - 时间30'处的染料累积平均值）/时间0处的染料累积平均值×100。
- 在条形图中表达每种基因型和条件的百分比，并比较基因型和条件。
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Representative Results
修整测定产生定量数据，以在设定的测量时间（30分钟）后，基于剩余在苍蝇体上的累积染料的相对剩余量来评估行为性能。 图1中突出显示了滑动梳理室设计的示例图像和测定的主要步骤。苍蝇通过在染料存在下涡旋聚集大量的染料从立即粉尘（ 图2d，2e ）。除尘蝇可以在分析后保留一定范围的染料积累（ 图2f，2g ）。因此，溶解在EtOH中的染料积累和测量个体样品的吸光度提供了可重复和高度定量的修饰能力评估。
在这项研究中， DopR调节后腿梳理，我们比较了一个强烈的hypomorph（
调查不同之处前腿对后腿修饰程序的补妆能力，我们在梳理过程中直接评估了可分离身体部位的染色积累（ 图4 ）。通过剖析分析后个体苍蝇的头部，翅膀或“身体”（腹部/胸部/腿部），我们能够可靠地定量基因型之间的差异和相似性。研究结果支持了一个解释，即对于前肢修饰程序没有差异，因为WT Vs的头部没有观察到显着差异。 DopR突变体。然而，在基因型之间观察到翼和身体测量的显着差异。这种补充技术对身体部位而不是整个苍蝇进行主要测定允许一种简单的方法来初步区分前肢和后腿修饰程序。这些结果进一步延伸，并通过仔细的行为观察和视频记录或跟踪前肢或h的各个组成部分得到支持indleg行为。来自图2-4的所有结果均经Gen，Brain和Behavior 15许可转载。
图1：果蝇美容测定工作流程。这个简化的流程图概述了梳妆协议的主要步骤，突出了一些必要的材料和设备。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2：基于染料积累的修饰量化。 （ a ）美容室。将个体苍蝇和亮黄色染料放置在各个孔中（1只蝇：1孔）。外形尺寸和补充数据生产蓝图。 （ b，d，f ）WT成年雄性果蝇（+ / +）。 （ c，e，g ） DopR f02676 / DopR f02676成年雄性果蝇。 （ b，c ）粉尘前飞。 （ d，e ）在梳理之前（时间：0分钟），在涡旋室喷粉后立即飞行。 （ f，g ）梳理后（时间：30分钟）。刻度棒=400μm。转载自基因，脑和行为许可15 。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3：调制美容行为所需的多巴胺受体（ DopR / dDA1 /哑 ）。 （ a，c，e ）Groomin在喷雾后0分钟或30分钟测量g野生型（蓝色）和突变型蝇（红色/橙色）。测量每种基因型和条件的SEM。 （ a，b ）每个基因型和条件n = 43苍蝇。 （A）WT和DopR f02676蝇二者显示出梳理行为（+ / + 30'相比，+ / + 0' = p值<0.0001，DopR f02676 30'相比DopR f02676 0' = p值<0.0001）。 DopR苍蝇不能与WT动物（ DopR f02676 30'相比+ / + 30'= p值<0.001）。每个基因型在0℃的急性粉尘会导致灰尘的等效积累（ns =不重要）。 （ b，d，f ）计算每种基因型（染料在0'染料累积，30'/染料累积0'×100时）的修饰百分比差异，提供比较梳理行为的相对值。 （ c ） DopR attp / DopR
g4.jpg“/>
图4：多巴胺受体功能增强Hindleg修饰。 （ a ）在除尘和随后的解剖后30分钟测量的WT（蓝色）和DopR f02676 / DopR f02676 （红色）的各个区域的整理 。机翼修整的p值= 0.0204。身体的p值= 0.0302。 n = 33-35飞行所有条件。测量每种基因型和条件的SEM。统一分析单因素方差分析和Bonferonni校正。转载自基因，脑和行为许可15 。 请点击此处查看此图的较大版本。
补充图：使用NIH Image J像素强度软件进行视觉量化修饰行为的替代方法。 （ A ）可视化dtype果蝇在解剖范围内。椭圆形将背腹定义为像素强度分析区域。 （ B ）使用Ultra Green V10荧光漆颜料进行除尘后的背腹显像。绿色荧光标准过滤器可捕获蓝绿色颜料。 （ C ）涂有UGV10颜料（预过滤）后的WT动物。 （ E ）用UGV10颜料涂覆后的WT动物（postgrooming）。 （ D ）用UGV10颜料（预过滤）涂布后的DopRf02676纯合突变体。 （ F ）用UGV10颜料（后修饰）涂布后的DopRf02676纯合突变体。 （ G ）所有条件下像素强度的量化。每个基因型或病症n = 15只苍蝇。统计分析单因素方差分析和Bonferonni校正。 ns =无显着差异***表示ap <0.001。 PL轻松点击这里下载此文件。
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Discussion
梳理分析相对简单，但我们会提醒实验者特别注意以下问题。在引入苍蝇和染料之后，通过拧紧顶板和底板上的螺丝来保持紧密的密封，对于可重现的结果至关重要。亮黄色染料非常细，松散的接头将会损失室内边缘的染料。每个井的染料含量的不规则性可能容易导致梳理量化，因为不均匀的粉尘会增加梳理事件的差异和假阳性率。此外，我们鼓励实验者在30分钟的梳理期间，意识到他们选择保持梳妆室的环境。温度，照明，时间和湿度的环境恒定对于果蝇行为测定的一致性能至关重要。在一个小的孵化器里拿着梳妆室，尽可能减少麻烦可变实验室环境是理想的最大可重复性的结果，但其他空间安排也可以成功。
关于染料积累测量，我们已经观察到染料对乳胶手套是可渗透的，所以丁腈手套是优选用于处理和称重粉尘的。注意不要将灰尘广泛地撒在实验室表面，因为它会很容易染色衣服，并可能污染表面或设备。隔离一个区域和一个飞台/ CO 2垫进行实验，最好含有染料暴露。我们还鼓励实验者确保使用UV透明的96孔板。亮黄色染料的397nm吸收峰接近紫外光谱，标准96孔板可能会给染料稀释带来弱或不准确的测量。染料也可溶于水，作为EtOH的替代品。然而， 果蝇不容易沉入水中，而没有明显的漩涡和小气泡染色动物体内染料的稠度和溶解度较低。乙醇显示出一致的更好的结果和较低的方差直接比较。
我们的测定可以轻松修改补充技术和更精细的研究，如分析后的飞体解剖（ 图4 ）。这种补充剂可能是必要的，以了解哪些修饰步骤受到影响，因为染料积累仅广泛地指向行为转变，而不直接解决基本的生物或神经原因。一旦观察到差异，使用视频记录或直接观察方法的平行实验对于理解修饰效率差异的行为根本是至关重要的。这可以通过NIH ImageJ软件程序的像素强度测量来直观地量化特定身体部位的灰尘颗粒积累，以及直接跟踪前肢和后腿通过对视频进行评分的行为。关于荧光粉的视觉定量的替代方法，实验室的早期实验使用了由碱性稀土金属硅酸铝 - 氧化铝铕衍生的荧光漆颜料。用荧光漆颜料粉化苍蝇后，梳理动物麻醉或斩断动物后，可以通过数字显微镜使用标准的荧光筛选器在解剖范围（ 补充资料 ）记录并分析身体。虽然这种方法确实允许与使用亮黄染料观察到的结果相似的像素强度的准确定量，但是我们发现该方法的生产量相对较慢，并且颜料颗粒的尺寸略有变化，并且比对于Brilliant黄色染料。然而，对于一些实验应用，这种替代方法是适当的，并且在可用的荧光中存在显着的多样性对于果蝇和非 果蝇应用或迭代除尘实验可能有用的沉淀色，其中单独事件的量化是必不可少的。应注意，油漆颜料本身是水溶性的，但在水中迅速失去荧光，严重妨碍了该颜料的用途，用于标准吸光度测量。
针对特定的前肢或后腿修饰事件的这些方法对于了解表型的确切性质是必不可少的，并且可以突出潜在的神经回路或运动程序进一步进行调查。此外，对于并行控制实验，必须排除可能影响修饰的潜在非特定行为原因。如果动物表现出广泛的运动缺陷或异常，则可能是修饰缺陷是继发于广泛的运动表型。 WT动物的简单视频跟踪与突变体或cir在操纵条件下，可以很容易地区分大小的速度变化或总行驶距离，而不考虑梳理缺陷。
整容测定是适用于这种复杂多步运动程序的小规模和大规模研究的通用方法;这些设计易于修改，以增加室尺寸或数量15 。该方法产生强大的定量数据，是比较评估苍蝇修饰能力的理想选择。这些室的生产具有成本效益，并且可以根据可用资源使用许多不同的机器（3D打印机，激光切割机，CNC铣床）来制造。该技术允许单个样品的中间产量可以容易地扩展用于遗传屏幕和功能电路映射研究。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
我们要感谢Brian Shepherd，Tat Udomritthiruj，Aaron Willey，Ruby Froom，Elise Pitmon和Rose Hedreen，以便早日测试和建立这种方法和室设计。感谢Kelly Tellez和Graham Buchan的阅读和编辑手稿。我们感谢Andrew Seeds和Julie Simpson的开创性工作，并就建议使用亮黄色染料（Sigma）提供建议和支持。这项工作由Mary E. Groff外科和医学研究与教育慈善信托基金，Bronfman科学中心和Hellman研究员计划部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-Flex Tygon PVC Clear Tubing | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators |
| Micropipette tips (1 mL and 200 μL) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Nylon Mesh Screen, 2 x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | Used to construct grooming chamber and mouth aspirators |
| Dumont #5 Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5050 | |
| Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | we recommend use of nitrile gloves while handling this product |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | set to "touch" |
| Ethanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 10025-726 | |
| 0.65 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 20170-293 | tubes can be reused with successive assays |
| UV 96-well plate | Corning | 26014017 | |
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | need to download catalog to access product number | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Incubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" acrylic plastic | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8 - 32 nuts | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8 - 32 x 1" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A199 | the bottom plate needs to be tapped for this size screw |
| 8 - 32 x 1/2" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A194 | the second plate from the top needs to be tapped |
| 2 - 56 3/8" flat head phillips machine screws | McMaster-Carr | 91500A088 | these hold the two middle plates together |
| 0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe | McMaster-Carr | 92510A044 | Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws. These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate |
References
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