Summary
Her presenterer vi en ny teknikk designet for å registrere elektroencefalografi (EEG) i frittflyttende neonatale epileptiske pupper og beskrive dens prosedyrer, funksjoner og anvendelser. Denne metoden gjør at man kan registrere EEG i mer enn 1 uke.
Abstract
EEG er en nyttig metode for å oppdage elektrisk aktivitet i hjernen. Videre er det et mye brukt diagnostisk verktøy for ulike nevrologiske forhold, som epilepsi og neurodegenerative forstyrrelser. Det er imidlertid teknisk vanskelig å få EEG-opptak hos nyfødte som det krever spesialisert håndtering og stor omhu. Her presenterer vi en ny metode for å registrere EEG hos nyfødte rottepupper (P8-P15). Vi laget en enkel og pålitelig elektrode ved hjelp av PC-pin-loci; Det kan enkelt bli implantert i skallen av en rottepupp for å registrere EEG-signaler av høy kvalitet i normal og epileptisk hjerne. Valpene fikk en intraperitoneal (ip) injeksjon av nevrotoksin kainsyre (KA) for å indusere epileptiske anfall. Den kirurgiske implantasjonen som utføres i denne prosedyren, er billigere enn andre EEG-prosedyrer for nyfødte. Denne metoden gjør det mulig å registrere høy kvalitet og stabile EEG-signaler i mer enn 1 uke. Videre kan denne prosedyren også brukes på voksen raTs og mus for å studere epilepsi eller andre nevrologiske lidelser.
Introduction
Det er godt etablert at kontinuerlig kommunikasjon mellom nevroner er nødvendig for å oppnå normal hjernefunksjon. Den interneuronale kommunikasjonen foregår primært ved synaps, hvor informasjon fra en neuron blir formidlet til et andre neuron. Denne synaptiske overføringen er formidlet av to typer dedikerte strukturelle arrangementer: elektriske eller kjemiske synapser 1 . Elektrofysiologi er feltet som fanger det elektriske potensialet som produseres under interneuronal kommunikasjon som styrer overordnede kroppsfunksjoner og oppførsel 2 . EEG er den mest brukte metoden blant mange elektrofysiologiske teknikker.
EEG er en teknikk som brukes til å oppdage endringer i elektriske signaler produsert av interne eller eksterne stimuli. Videre er det en viktig test for klinisk diagnose og utfallsprognose av ulike nevrologiske forhold som epilepsi, Parkinsons og Alzheimers sykdommerE, samt virkninger av farmakologiske og toksikologiske midler 3 . Generelt viser en epileptisk pasient hyperexcitability og nedsatt funksjonell tilkobling i hjernen; Disse er oppsummert som interictal epileptiform utslipp (IED) og kan registreres av EEG i form av skarpe, forbigående pigger; Skarpe bølger; Spike-bølge komplekser; Eller polyspikes 4 . Hovedtrekket i epileptisk hjerne er den spontane forekomsten av epileptiske anfall, som kan registreres enten fra hodebunnen eller fra hjernens parenchyma for å lokalisere hjerneområdet som er ansvarlig for anfallene 5 . Videre har EEG også svært viktige implikasjoner i nevrodegenerative forstyrrelser som Alzheimers sykdom (AD). Forskning tyder på at endrede EEG-opptak og svekkede oscillatoriske nettverk hos AD-pasienter er vanlige. Men vår kunnskap om patofysiologi av nettverksoscillasjoner i neurodegenerative sykdommer jegEr overraskende ufullstendig og må undersøkes nærmere 6 .
I denne protokollen har vi designet en enkel elektrode som man kan registrere EEG for å forstå den elektriske kommunikasjonen i både den normale og den patologiske hjernen. Den kirurgiske implantasjonen i denne metoden er billigere enn andre tilgjengelige prosedyrer 7 . Videre kan denne metoden brukes til å registrere høye og stabile EEG-signaler for lengre tidsrammer ( dvs. 2-4 timer hver dag i 1 uke). I tillegg brukte vi lettere elektroder (veier ca 26 mg) som gjør at dyrene oppfører seg mer naturlig 8 . Denne metoden er allment gjeldende for studier av EEG hos nyfødte rottepupper som krever forsterker og digitaliseringsapparat, som ofte brukes i elektrofysiologi-laboratoriet og krever ingen tilleggsutstyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrpleie, kirurgisk prosedyre og innspillingsprosedyrer var i samsvar med retningslinjene for Dyrepleie- og brukskomiteen i Sør-Kina.
1. Elektrodeforberedelse (Figur 1A-C)
MERK: Computer pin loci er rett og slett en ledet kontakt som en del av signalgrensesnittet i kommunikasjonsenheter. Den består av en mannlig kontakt som plugger inn i kvinnekontakten.
- Fjern forsiktig mann- og hunspinnene fra datamaskinstiften loci ( figur 1A ) ved hjelp av en pincer. Koble mann- og hunpinnene sammen for å danne en elektrode og bruk cyanoakrylat for å skape en sterk liming ( figur 1C ).
- Plasser elektrodene i et beger fylt med destillert vann og legg det til ultralydrenseren i 10 minutter. Flytt dem til en tørkeovn ved 45 ° C i 30 minutter. Steriliser elektrodene ved hjelp av UV-lys i 30 minutter.
2. Kirurgisk prosedyre (Figur 1D-F)
- Klargjør de steriliserte kirurgiske instrumenter og stereotaksiske apparater. Bedøve den nyfødte rottepoppen ved bruk av isofluranbedøvelse (2,5%) med luft. Når puppen er sterkt bedøvet, juster dosen av isofluran til 1,0%. Utfør en hale eller tå klemme før operasjonen for å sikre riktig dybde av anestesi.
- Fest puppens hode i det stereotaksiske apparatet ved å plassere ørestengene inn i ørekanalen og stram dem litt.
MERK: Ikke stram øreproppene for mye, da nyfødselshodeskallen er veldig myk. - Opprettholde det sterile kirurgiske feltet ved å sprøyte alt utstyr med 70% etanol. Lag en 15 mm snitt på hodet ved hjelp av en skalpell. Ved hjelp av tapper, trekk forsiktig hodebunnen fra midtlinjen ved de fire hjørnene. Legg litt saltholdig bomull under huden for å holde snittet bredt åpent ( figur 1D ).
- Finn bregma og lambda poeng på skallenOg merk dem med blyant. Bruk en sprøytenål (26 G) for å lage to burrhull i prefrontal cortex (PFC) og hippocampus.
MERK: PFC befinner seg på +1,8 mm bakover til bregma og -0,5 mm lateralt til midtlinjen, mens hippocampus ligger på -2,0 mm foran bregma og ± 0,5 mm lateralt til midtlinjen ( figur 1D og E ). Dypen av elektroden bør ikke være mer enn 2 mm under den kortikale overflaten for å minimere hjerneskade. - Bruk tanger for å holde elektrodene og sett inn referanse- og opptakselektroder i henholdsvis PFC og hippocampus. Påfør erytromycin salve rundt elektroden for å unngå mulig infeksjon. Fest elektroden ved hjelp av cyanoakrylat.
- Forbered dental akryl sement slik at den har en limaktig og viskøs konsistens. Påfør dental sement for å dekke elektrodene og resten av skallen.
MERK: Tørk skallen grundig før du bruker dental sement. Påfør 5% pikrinsyre på elektrodene for å beskytte dem.
MERK: Hele prosedyren skal gjøres i en biosafetyhette for å opprettholde sterile forhold. - Fjern dyret fra den stereotaksiske rammen og injiser 300 μL 10% glukose subkutant. Legg det på et oppvarmet teppe for gjenoppretting. Sørg for at dyret er varmt (37 ° C) og ambulatorisk ( dvs. helt gjenopprettet). Administrer buprenorfin intraperitonealt (0,05 mg / kg) for postkirurgisk smerte.
MERK: Ikke la et dyr være uovervåket før det har fått tilstrekkelig bevissthet (dvs. normal oppførsel og bevegelse). - Return pupen til sitt hjem bur med dammen etter at det gjenvinner bevisstheten. Vent i to dager til dyret er fullstendig gjenopprettet.
3. EEG-opptak
- Etter fullstendig utvinning, koble elektrodene implantert på skallen til pupen til forsterkeren i eget bur. Koble forsterkeren til en analog til digital cOmformer og fest konverteren til en datamaskin; Forbindelseslinjene skal behandles forsiktig slik at de ikke blir sammenflettet.
- Velg minst 10.000 Hz samplingsfrekvens på datainnsamlingsenheten for opptak (båndbredden til senderen er 1-100 Hz). Kontroller at dataene samples riktig.
- Etter å ha oppnådd baselineopptak, injiser puppen intraperitonealt med kaininsyre (KA) (2 mg / kg) for å indusere epileptiske anfall. 15 min etter KA-injeksjonen observerer og registrerer epileptiske utladninger. Beslag produserer gjennom KA er vanligvis fysisk.
MERK: Den ictal-toniske varigheten er ca 15,2 ± 0,9 s, anfallstid er ca 62 ± 5 s. Kramper kan forebygges i nyfødt rotte ved å gi IP-injeksjon av klorhydrat (400 mg / kg). - Lagre digitaliserte data og analyser det ved hjelp av signalbehandlingsprogramvarepakker, for eksempel spike2. Reveal kraftnivået til forskjellige frekvenskomponenter i neonatal EEG-signalet ved perfForme en strømspektrumanalyse. Beregn kraften i en 1-min tidsramme ved å finne rot-middel-kvadrat amplitude fra 1 til 100 Hz (EEG-bånd) 9 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hvis de ovennevnte kirurgiske prosedyrene utføres på riktig måte, vil en neonatal pup-EEG-opptak med en kanal, bli utført med suksess. 10 min etter KA-injeksjonen, oppstod et vanlig mønster av atferdsmessige tegn i form av uregelmessige bevegelser og riper, tremor og tap av balanse. Figur 2 viser de representative rå EEG-sporene og interiktale, ictal-tonic og ictal-clonic utvidede spor. Gjentatte interictale og ictal EEG utladningsmønstre startet 15-60 min (30 ± 5,2 min, gjennomsnittlig ± SEM) etter KA-injeksjon ( Figur 2A og 2B ). Figur 2D og 2E representerer tonisk-kloniske anfall som er den vanligste typen. Den ictal-toniske varigheten varte 15,2 ± 0,9 s ( Figur 2D ). De representative resultatene viste at toniske utladninger ble fulgt av kloniske utbrudd ( figur 2B, 2D og 2E).
E_content "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 1: Illustrasjon av kirurgisk implantasjonsprotokoll. ( A ) Små datapinner. ( B ) Kvinnepinne (venstre) og hanknapp (høyre). Målestangen brukes til å måle lengden på kvinnestiftet. ( C ) Tilkoblet hunn og hanknapp. ( D ) Exposed skull. Nr. 1 presenterer referansesiden, nr. 2 presenterer Bregma, nr. 3 og 4 nåværende innspillingssteder, og nr. 5 presenterer lambda. ( E ) Elektrodeimplantasjon. Nr. 1 presenterer referanselektroden, nr. 3 og 4 presenterer opptakselektroden. ( F ) Gjenopprettet rottepupp (P9). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
D / 55489 / 55489fig2.jpg "/>
Figur 2: KA-indusert Neonatal Seizure. ( A ) Et representativt EEG-spor fra en P10-rotte som ble injisert med KA (2 mg / kg, ip) viste tilbakefallende epileptiske utbrudd. ( B ) Utvidet visning av enkeltklyngelignende epileptiske utladninger fra boksen i A. ( C , D og E ). Typiske interiktale, iktaltoniske og ictal-kloniske spor utvidet fra boksen i B. ( F ) Summariserte data som viser Gjennomsnittlig EEG-effekt (1 min tidvindu) før og etter KA-injeksjonen (middel ± SEM). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Oppsett av EEG-opptak. Representativ sporopptak er shoWn i fritt flyttende neonatal rottepupp. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her rapporterer vi kirurgiske og innspillingsprosedyrer for å skaffe EEG i fritt bevegelige neonatale rottepupper ved hjelp av kablet metode ( Figur 3 ). Det har blitt foreslått at P7-P12 rottepuppen er i utviklingsalderen som tilsvarer en fullstendig human neonat 10 , 11 . Det er teknisk vanskelig å skaffe EEG-innspillingsdata av høy kvalitet når de arbeider med rottepups i denne aldersgruppen. I tillegg krever det spesialisert håndtering og stor omsorg 8 .
Tidligere studier som har undersøkt in vivo EEG-opptak hos neonatale rotter, er utført ved hjelp av kablede opptaksløsninger hos P12 eller eldre dyr 12 , men disse tilnærmingene er svært kostbare. Ved å stole på enkle elektroder har vi vært i stand til å lage en elektrode ( figur 1 ) som reduserer kostnadene ved eksperimentet til så lite som $ 1, samtidig som det gir høy tetthet EEGinnspillinger. Kirurgisk implantering i denne metoden kan ta så lite som 10 minutter, avhengig av operasjonens kompleksitet.
De kritiske trinnene i denne protokollen er implantasjon av elektroder. Det bør gjøres nøye. For å opprettholde konstant kontakt av elektroden med skallen, er følgende trinn viktig å vurdere. For det første, fjern vevsavfallet på skallen ved hjelp av sterilisert bomullspinne fordi det kan sette elektroden fra hjernen. For det andre, bruk cyanoakrylat riktig å feste elektroden med skallen. For det tredje, opprettholder den tilstrekkelige viskositeten til dental sement. Det er bedre å bruke dental sement i to lag; Første lag bør være litt tett for å dekke skallen mens det andre laget skal være litt rennende for å dekke hjørnene av første lag. Tapp tannssementet forsiktig med en pipettespiss for å slå det ned for å lage den sterke limbindingen. Hvis det er for vannaktig, kan det bygge et isolerende lag under elOde, og hvis det er for tett, vil tannssementet lett falle fra skallen på grunn av sin egen vekt. Det er også viktig å opprettholde ungdommens kroppstemperatur ved 37 ° C gjennom hele operasjonen for overlevelse.
Anvendelsen av denne prosedyren er begrenset til innspilling av EEG hos nyfødte rottepupper mellom P8 og P15, fordi de voksende valpene kan fjerne dentalsementet og elektroden fra skallen. Når det gjelder videre søknader, kan denne metoden også brukes til å registrere den elektriske aktiviteten til voksne rotter og mus etter mindre endring. Videre gir denne metoden seg godt å bruke i ulike atferdseksperimenter, for eksempel den forhøyede pluss labyrinten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation of China (31171355) og Natural Science Foundation of Guangdong (S2011010003403, 2014A030313440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer pin | |||
| Pincer | DELI Group Co., Ltd. | ||
| 502 super glue | DELI Group Co., Ltd. | 7144 | |
| Drying oven | Boxun | GZX-9140MBE | |
| Isofluorane | RWD Life Science | 902-0000-522 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 900-0068-507 | |
| Anesthesia apparatus | RWD Life Science | 902-0000-510 | |
| Homeothermic Heating Device | Harvard Apparatus | K 024509 | |
| Amplifier Model 3000 | A-M Systems | 61558 | |
| Micro1401 Analog Digital converter | Cambridge Electronic Design Ltd. | 4383 | Data acquisition unit |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Ltd. |
References
- Pereda, A. E. Electrical synapses and their functional interactions with chemical synapses. Nat Rev Neurosci. 15 (4), 250-263 (2014).
- Chorev, E., Epsztein, J., Houweling, A. R., Lee, A. K., Brecht, M. Electrophysiological recordings from behaving animals--going beyond spikes. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 513-519 (2009).
- Freeborn, D. L., McDaniel, K. L., Moser, V. C., Herr, D. W. Use of electroencephalography (EEG) to assess CNS changes produced by pesticides with different modes of action: effects of permethrin, deltamethrin, fipronil, imidacloprid, carbaryl, and triadimefon. Toxicol Appl Pharmacol. 282 (2), 184-194 (2015).
- Werhahn, K. J., Hartl, E., Hamann, K., Breimhorst, M., Noachtar, S. Latency of interictal epileptiform discharges in long-term EEG recordings in epilepsy patients. Seizure. 29, 20-25 (2015).
- Staba, R. J., Stead, M., Worrell, G. A.
- Nimmrich, V., Draguhn, A., Axmacher, N. Neuronal Network Oscillations in Neurodegenerative Diseases. Neuromolecular Med. 17 (3), 270-284 (2015).
- Zayachkivsky, A., Lehmkuhle, M. J., Dudek, F. E. Long-term Continuous EEG Monitoring in Small Rodent Models of Human Disease Using the Epoch Wireless Transmitter System. J Vis Exp. (101), e52554 (2015).
- Zayachkivsky, A., Lehmkuhle, M. J., Fisher, J. H., Ekstrand, J. J., Dudek, F. E. Recording EEG in immature rats with a novel miniature telemetry system. J Neurophysiol. 109 (3), 900-911 (2013).
- Dzhala, V. I., et al. NKCC1 transporter facilitates seizures in the developing brain. Nat Med. 11 (11), 1205-1213 (2005).
- Tucker, A. M., Aquilina, K., Chakkarapani, E., Hobbs, C. E., Thoresen, M. Development of amplitude-integrated electroencephalography and interburst interval in the rat. Pediatr Res. 65 (1), 62-66 (2009).
- Savard, A., et al. Involvement of neuronal IL-1beta in acquired brain lesions in a rat model of neonatal encephalopathy. J Neuroinflammation. 10, 110 (2013).
- Cuaycong, M., et al. A novel approach to the study of hypoxia-ischemia-induced clinical and subclinical seizures in the neonatal rat. Dev Neurosci. 33 (3-4), 241-250 (2011).
