Application de la pincée de patch automatisée guidée par image pour l'étude des neurones dans les tranches de cerveau

Summary

Ce protocole décrit comment mener des expériences automatiques de fixation de patch guidées par image à l'aide d'un système récemment développé pour un équipement d'électrophysiologie standard in vitro .

Abstract

La pince à blocs de cellules entières est la méthode standard d'or pour mesurer les propriétés électriques des cellules individuelles. Cependant, la pince de patch in vitro reste une technique difficile et à faible débit en raison de sa complexité et de sa grande dépendance vis-à-vis du fonctionnement et du contrôle de l'utilisateur. Ce manuscrit démontre un système de pincement de patch automatique guidé par image pour des expériences in vitro de patch clamp de cellules entières dans des tranches de cerveau aiguë. Notre système met en œuvre un algorithme basé sur la vision par ordinateur pour détecter les cellules marquées par fluorescence et pour les cibler pour une correction entièrement automatique à l'aide d'un micromanipulateur et d'un contrôle interne de la pression de la pipette. L'ensemble du processus est hautement automatisé, avec des exigences minimales pour l'intervention humaine. Les informations expérimentales en temps réel, y compris la résistance électrique et la pression interne de la pipette, sont documentées électroniquement pour des analyses futures et pour l'optimisation de différents types de cellules. Bien que notre système soit décrit dans le contexte du brai aiguN enregistrements de tranche, il peut également être appliqué à la pince de correction automatisée guidée par l'image des neurones dissociés, des cultures de tranches organotypiques et d'autres types de cellules non neuronales.

Introduction

La technique de pincement de patch a été développée pour la première fois par Neher et Sakmann dans les années 1970 pour étudier les canaux ioniques des membranes excitables ¹ . Depuis lors, le serrage des patchs a été appliqué à l'étude de nombreux sujets différents au niveau cellulaire, synaptique et de circuit - in vitro et in vivo - dans de nombreux types de cellules différentes, y compris les neurones, les cardiomyocytes, les ovocytes Xenopus et les liposomes artificiels ² . Ce processus implique l'identification correcte et le ciblage d'une cellule d'intérêt, un contrôle complexe du micromanipulateur pour déplacer la pipette patch à proximité immédiate de la cellule, l'application de pression positive et négative à la pipette au bon moment pour établir un patch rigide rigide, Et une interruption pour établir une configuration de patch de cellule complète. Le serrage des patchs est généralement effectué manuellement et nécessite une formation approfondie pour maîtriser. Même pour un chercheur expérimenté avec le patchClamp, le taux de réussite est relativement faible. Plus récemment, plusieurs tentatives ont été faites pour automatiser les expériences de patch-clamp. Deux stratégies principales ont évolué pour accomplir l'automatisation: augmenter l'équipement de serrage standard pour assurer le contrôle automatique du processus de correctif et la conception de nouveaux équipements et techniques dès le début. La première stratégie est adaptable au matériel existant et peut être utilisée dans une variété d'applications de pince de patch, y compris la pince de patch aveugle in vivo ^{3 , 4 , 5} , la pince de patch in vitro de tranches de cerveau aiguë, les cultures de coupe organotypiques et les neurones dissociés cultivés ⁶ . Il permet l'interrogation de circuits locaux complexes en utilisant simultanément plusieurs micromanipulateurs ⁷ . La méthode de correction planaire est un exemple de la nouvelle stratégie de développement, qui peut atteindre le haut débit simultané pAtch clamp de cellules en suspension à des fins de dépistage de drogue ⁸ . Cependant, la méthode de correction planaire n'est pas applicable à tous les types de cellules, en particulier les neurones avec des processus longs ou des circuits intacts contenant des connexions étendues. Cela limite son application à la cartographie des circuits complexes du système nerveux, ce qui constitue un atout majeur de la technologie de serre-câbles traditionnelle.

Nous avons développé un système qui automatise le processus de pincement de patch manuel in vitro en augmentant le matériel de serre-câbles standard. Notre système, Autopatcher IG, fournit l'étalonnage automatique de la pipette, l'identification des cibles de la cellule fluorescente, le contrôle automatique des mouvements des pipettes, la correction automatique des cellules entières et l'enregistrement des données. Le système peut automatiquement acquérir plusieurs images de tranches de cerveau à différentes profondeurs; Les analyser en utilisant la vision par ordinateur; Et extraire des informations, y compris les coordonnées des cellules marquées par fluorescence. Cette information peut alors êtreUtilisé pour cibler et corriger automatiquement les cellules d'intérêt. Le logiciel est écrit en Python, un langage de programmation open-source gratuit, utilisant plusieurs bibliothèques open-source. Cela garantit son accessibilité à d'autres chercheurs et améliore la reproductibilité et la rigueur des expériences d'électrophysiologie. Le système a une conception modulaire, de sorte qu'un matériel supplémentaire peut facilement être interfacé avec le système actuel démontré ici.

Protocol

1. Configuration du système

1. Construire l'unité de contrôle de la pression.
   1. Assembler l'unité de commande de pression en fonction de la carte de circuit ( Figure 1 ). Souder les pièces nécessaires sur la carte de circuit imprimé (PCB) fabriquée selon les schémas de circuit électrique ( figure 1b ). Utilisez des résistances standard, des diodes électroluminescentes, des transistors à effet de champ à semi-conducteurs en métal-oxyde (MOSFET), des condensateurs et des connecteurs (voir la table des matières ). Electrovannes à souder sur la PCB. Connectez la pompe à air et le capteur de pression d'air à la carte à circuit imprimé avec un fil électrique.
      REMARQUE: il faut environ 2 h pour construire l'unité de contrôle de la pression avec toutes les pièces nécessaires disponibles.
2. Connectez la carte d'acquisition de données secondaire (DAQ).
   1. Connectez les sorties de données de la carte de circuit imprimé à la carte DAQ, en suivant le tableau 1 .
      NOTE: Le tableau DAQJe cours en mode "single-ended". La carte du port se trouve dans le mode d'emploi (voir la table des matières ).
   2. Connectez "AIn Pr S" à l'un des canaux d'entrée analogique (AI) et "R-Gr" à l'un des motifs analogiques sur la carte DAQ secondaire.
   3. Connectez la sortie primaire de l'amplificateur à l'un des canaux AI et le sol à la masse analogique de la carte secondaire DAQ.
      REMARQUE: Un câble BNC standard peut être utilisé pour connecter la sortie primaire de l'amplificateur.
   4. Retirez l'autre extrémité et reliez le signal positif ( c.-à-d. Le noyau de cuivre) au canal AI et au sol ( c'est -à- dire le fil mince autour du noyau) au sol analogue. Répétez cette étape pour une deuxième chaîne si plusieurs canaux de patch sont utilisés.
      REMARQUE: l'entrée analogique de la carte DAQ sera configurée dans les étapes ultérieures.
   5. Connectez la puissance à la sortie de puissance de la carte DAQ secondaire. Utilisez une puissance séparée de 12 V doncPour la pompe.
3. Connectez le tube.
   1. Raccorder la pompe à air et les deux soupapes selon le tableau 2 . Utilisez un connecteur 3 voies pour connecter le tube doux du port supérieur de la soupape 2, du capteur de pression et du support de pipette lors de la dernière étape.
   2. Ajouter un autre connecteur 3 voies sur le tube raccordé au support de pipette si deux pipettes sont utilisées. Basculer manuellement entre les vannes et les pipettes utilisées lors du patch.
4. Installez Autopatcher IG.
   REMARQUE: Configuration requise: Autopatcher IG n'a été testé que sur un PC exécutant Windows 7. Il n'a pas été validé pour d'autres systèmes d'exploitation. La procédure décrite s'applique spécifiquement au matériel répertorié dans la table des matières.
   1. Téléchargez Autopatcher-IG de GitHub (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG).
   2. Installez Python (voir la Table des matériaux pour la version et l'adresse de téléchargement).
   3. Désinstaller PyQt4Bibliothèque en tapant "pip désinstaller PyQt4" dans un terminal de ligne de commande.
      REMARQUE: le système utilise une ancienne version de la bibliothèque PyQt4 pour obtenir la compatibilité avec les bibliothèques Qwt et Opencv.
   4. Installez les bibliothèques Python à partir des fichiers de roue historiques (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). Trouvez les fichiers suivants: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none -win32.whl) et Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl).
      1. Pour installer les fichiers de roue, accédez au répertoire où les fichiers sont enregistrés et tapez "pip install *** wheelfilename ***. Whl". Remplacer "*** wheelfilename ***" avec le nom réel du fichier.
         REMARQUE: "cp27" dans le nom du fichier de la roue indique que Python 2.7 et "win32" indiquent Windows 32 bits. Si "win32" ne fonctionne pas, essayez "win64".
   5. Pour contrôler la caméra CCD, téléchargez et installez l'installateurPour 64 bits (https://www.qimaging.com/support/software/). Téléchargez ensuite MicroManager pour 64 bits (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release) pour contrôler l'appareil photo en Python.
   6. Pour contrôler les manipulateurs et le stade du microscope, installez le logiciel de contrôle fourni par le fabricant.
      REMARQUE: ce faisant, le pilote nécessaire pour contrôler les manipulateurs est également installé. Le package d'installation est généralement fourni dans un CD-ROM.
   7. Pour contrôler la carte DAQ secondaire, installez Universal Library à partir du CD-ROM fourni avec l'achat de la carte DAQ.
5. Configurez le matériel pour Autopatcher IG.
   1. Connectez les contrôleurs de l'étape du microscope et du manipulateur à l'ordinateur via les ports USB.
   2. Assignez les numéros de port COM à l'unité 0: étape du microscope, unité 1: manipulateur à gauche et unité 2: manipulateur droit, dans cet ordre, dans le fichier de configuration "ports.csv" dans le dossier "configuration". LPrévoyez les autres paramètres dans le fichier ports.csv ( c.-à-d. "SCI" ​​et "1") inchangé.
      REMARQUE: les informations du numéro de port COM peuvent être trouvées en exécutant le logiciel de configuration du manipulateur fourni par le fabricant. Accédez à l'onglet "Paramètres", sélectionnez "paramètres" et la page "Motion" et lisez les étiquettes pour chaque onglet en haut. Alternativement, ces informations peuvent être trouvées dans le Gestionnaire de périphériques PC.
   3. Assignez les numéros de canal d'entrée analogique sur la carte DAQ pour un capteur de pression et un canal de raccordement 1 et 2 (correspondant aux unités 1 et 2). Entrez le numéro de chaîne dans le fichier "DAQchannels.csv" dans le dossier "configuration".
      REMARQUE: il est recommandé d'ouvrir les fichiers .csv avec l'application Notepad au lieu d'une feuille de calcul, car elle peut modifier les informations lors de l'enregistrement des modifications.
6. Run Autopatcher IG.
   1. Allumez l'amplificateur, le contrôleur de microscope et le contrôleur de manipulation. EnsuQue le logiciel de l'amplificateur fonctionne.
   2. Exécutez Autopatcher IG avec Python à partir d'un terminal de ligne de commande comme suit: d'abord, modifiez le répertoire (commande "cd" pour les terminaux les plus fréquents) où Autopatcher IG est installé, tapez "python Autopatcher_IG.pyw" dans le terminal de ligne de commande et appuyez sur le bouton "La touche Entrée.
      REMARQUE: Ne lancez pas le logiciel de contrôle du manipulateur avant d'exécuter Autopatcher IG car il occupera le stade du microscope et le manipulateur, ce qui entraîne l'absence d'accès au matériel de Autopatcher IG. Le logiciel de contrôle du Manipulateur peut être exécuté après que Autopatcher IG est entièrement activé s'il existe des modules supplémentaires à contrôler ( p. Ex., Le radiateur en ligne).
7. Calibrer la pipette primaire.
   1. Tirez les pipettes patch comme décrit précédemment ⁹ . Remplissez une pipette en verre étiré avec une solution interne et chargez-la sur la tête.
      REMARQUE: les pipettes en verre vides ont différents contrastes sousLe microscope et peut conduire à un étalonnage inexact.
   2. Déplacez la pointe de la pipette sur le champ visuel du microscope et mettez-la au foyer. Si le pavé numérique sert à déplacer les manipulateurs et / ou au microscope, mettez à jour les coordonnées en appuyant sur "z" sur le clavier.
      REMARQUE: Cette action n'est pas nécessaire si le clavier (stade du microscope: A / D - axe x, axe W / S-Y, axe R / F-z; manipulateurs: H / K - axe x, U / L'axe J-Y, O / L - l'axe z, le numéro 1/2 unité) sert à contrôler le mouvement car les coordonnées seront mises à jour en temps réel.
   3. Cliquez sur le bouton "Démarrer l'étalonnage" sur l'interface utilisateur graphique principale (GUI) pour l'unité correspondante sur laquelle la pipette est chargée ( Figure 2 ).
      REMARQUE: Une fenêtre contextuelle apparaît lorsque le calibrage est terminé.
      REMARQUE: L'étalonnage sera effectué automatiquement, ce qui nécessitera environ 3,5 min. En cliquant sur le même bouton (commuté maintenant sur "annuler l'étalonnage" afL'amorçage du calibrage) annulera la tentative d'étalonnage.
   4. Enregistrez l'étalonnage en cliquant sur "Enregistrer l'étalonnage" au bas de l'interface graphique principale (il enregistre l'étalonnage actuel pour les deux manipulateurs et peut être chargé dans le futur).
      REMARQUE: Le champ de vision sous un grossissement faible (4 ou 10X) et élevé (40X) doit être aligné pour que l'étalonnage secondaire fonctionne correctement. Reportez-vous au mode d'emploi du système optique utilisé pour les procédures d'alignement.

Procédure de serrage automatique des patchs

1. Préparez des tranches de cerveau aiguë, comme décrit précédemment ¹⁰ .
2. Préparez des pipettes en verre pour la pince de patch.
3. Placez une tranche de cerveau au centre de la chambre d'enregistrement. Stabilisez la tranche avec une tranche de retenue, ou "harpe".
4. Détecter la cellule fluorescente.
   1. Trouvez la zone d'intérêt sous l'objectif 4X. Déplacez le stade du microscope en allumant le cliMode ck-to-move ("CTM") et cliquez sur le centre de la zone d'intérêt. Alternativement, utilisez le clavier pour déplacer le stade du microscope (A / D - axe des x, axe W / S-Y, axe R / F-z).
   2. Passez à l'objectif à grand grossissement et ajustez la mise au point en déplaçant le microscope dans l'axe z, en utilisant R / F sur le clavier.
      REMARQUE: il est recommandé d'ajuster le niveau du bain-marie afin que le plan focal sous les lentilles de faible et haute amplification soit identique ou similaire dans l'axe des z.
   3. Cliquez sur le bouton "Détecter la cellule" dans la colonne GUI principale, "Unité 0." Si la LED ou la source de lumière laser de la configuration ne peut pas être contrôlée par le signal TTL, allumez manuellement la LED / laser; Une fenêtre pop-up apparaîtra lorsque la détection de la cellule sera terminée.
      1. Éteignez la LED / laser si nécessaire; Une liste des coordonnées de la cellule apparaîtra dans l'interface utilisateur "Mémoires de mémoire". Supprimez les cellules indésirables de la liste en cliquant sur le bouton "X" à côté des coordonnées.
      2. Sinon, si les cellules cibles ne sont pas étiquetées par fluorescence, cliquez sur "Mode souris" sur l'interface graphique principale. Cliquez sur la cellule d'intérêt; Un point jaune avec un nombre apparaîtra sur la cellule, et les coordonnées de la cellule apparaîtront dans la "GUI de la mémoire".
5. Calibrer la pipette secondaire.
   1. Remplissez 1/3 d'une pipette en verre avec une solution interne. Chargez la pipette sur le porte-pipette fixé au niveau de la tête.
   2. Utilisez l'objectif à faible grossissement. Apportez la pipette dans le champ visuel et réglez la mise au point à l'aide du clavier (H / K - axe x, axe U / J-Y, axe O / L-z). Utilisez "1" et "2" pour basculer entre l'unité 1 et l'unité 2.
   3. Chargez l'étalonnage principal en cliquant sur "Charger l'étalonnage". Cliquez sur le bouton "Étalonnage secondaire" sur l'interface graphique principale sous l'unité utilisée. Par exemple, si l'unité 2 est utilisée, cliquez sur le bouton "Étalonnage secondaire" dans la "unité 2" coLumn. Suivez les instructions de la fenêtre contextuelle pour passer à l'objectif de grand grossissement.
6. Relâchez une cellule cible.
   1. Assurez-vous que le logiciel "MultiClamp" ( c'est-à-dire l' amplificateur) est en cours d'exécution. Cliquez sur le bouton "Contrôle de patch" pour ouvrir l'interface graphique "Patch Control"; Cela peut prendre jusqu'à quelques minutes pour ouvrir cette GUI.
   2. Utilisez l'objectif de grossissement 40X en cochant "40X" sur la colonne "Unité 0" principale de l'interface graphique. Cliquez sur le bouton "aller vers" à côté de la cellule d'intérêt sur la liste des coordonnées dans la GUI "Memory position"; Le microscope se déplacera vers la cellule.
   3. Cliquez sur le bouton CTM de l'unité utilisée dans l'interface graphique principale pour activer le mouvement à la suite d'un clic de souris. Cliquez sur la cellule d'intérêt; La pointe de la pipette se déplacera vers la cellule.
   4. Cliquez sur le bouton "Patch" sur la GUI "Patch Control".
      REMARQUE: la correction automatique commence, et la pression et la résistance peuvent être surveillées surLa GUI "Patch Control".
      1. Utilisez le bouton "Unité 1 sélectionné" pour commuter le signal d'entrée entre les deux unités.
         REMARQUE: Le système s'approche de la cellule cible, applique une pression négative, associe le potentiel de la membrane cellulaire et détermine la formation de la géométrie à partir d'une série de seuils de pression et de résistance et de logique.
      2. Manipulez le processus automatique en tout point en cliquant sur les boutons respectifs de la GUI "Patch Control". Par exemple, cliquez de nouveau sur le bouton "Patch" pour annuler l'essai de patch et cliquez sur "Prochaine étape" pour avancer le processus de correctif à l'étape suivante, quel que soit le seuil.
         REMARQUE: Une fenêtre contextuelle informera l'utilisateur lorsqu'un gigaseal s'est formé, et l'option d'appliquer zap avec une grande pression négative sera présentée.
   5. Sélectionnez "Oui" pour briser avec zap combiné et aspiration. Alternativement, sélectionnez "Non" pour briser avec l'aspiration uniquement.
      
   6. Enregistrez le journal des tests de l'expérience.
      REMARQUE: si un essai de correctif échoue, une fenêtre contextuelle informera l'utilisateur et le processus de correctif sera réinitialisé.
   7. Revenez à l'étape 2.4 et répétez les étapes avec une cellule différente.
7. Affiner les seuils de correction (facultatif).
   REMARQUE: Seuils pour la gamme initiale de résistance à la pipette, pression positive et négative, résistance à la gueule, etc. Peut être modifié à partir d'un fichier de configuration.
   1. Ouvrez le fichier "PatchControlConfiguration.csv" dans le dossier "Configuration" à la destination où le système est installé. Modifiez les nombres correspondant à chaque valeur de seuil. Ne modifiez pas le nom des valeurs; Cela entraînera des entrées méconnaissables dans le système.
   2. Imposez les nouvelles valeurs de seuil immédiatement en appuyant sur "CtRl + L "sans redémarrer le programme; le redémarrage du programme implémentera la plus récente valeur de seuil du fichier.

3. Performing Recordings

REMARQUE: Le mode dans l'amplificateur de microélectrode commandé par ordinateur sera automatiquement réglé sur la Clamp Actuelle ("IC") par le logiciel autopatcher une fois qu'un patch réussi a été atteint. Les enregistrements de puces de patchs à cellules entières peuvent être effectués à l'aide du logiciel d'enregistrement de choix (ce système n'inclut pas une fonction d'enregistrement). Si plusieurs cellules cibles ont été identifiées, après avoir terminé un enregistrement, revenez à l'étape 2.4 et essayez une autre cellule.

1. Effectuer des expériences automatiques d'application de médicaments locaux en utilisant un picospritzer (facultatif).
   REMARQUE: ici, une expérience d'application de médicament locale est utilisée comme exemple pour décrire comment utiliser la fonction "Séquence de commande" supplémentaire pour contrôler le matériel externe via des signaux TTL.
   1. Connectez le port A chaNnel 0 et le sol sur la carte DAQ secondaire à l'entrée de déclenchement de démarrage sur le numériseur à l'aide d'un câble BNC dénudé (comme décrit à l'étape 1.2.3). Connectez un canal de sortie numérique sur le numériseur au déclencheur externe sur le picospritzer.
   2. Préparez le picospritzer selon le mode d'emploi. Connectez la sortie d'air picospritzer au support de pipette drogue-puff attaché à un micromanipulateur.
   3. Chargez une pipette remplie d'un médicament de choix. Fixez-le sur le porte-pipettes. Calibrez la pipette, comme décrit à l'étape 1.7.
   4. Après avoir réparé une cellule comme décrit à l'étape 2.6, sélectionnez l'emplacement souhaité pour la livraison du médicament en cliquant avec la souris dans l'interface graphique de la caméra sous "mode souris" (basculée à partir de l'interface graphique principale). Alternativement, utilisez l'interface graphique "Grille" pour concevoir une grille, chaque pixel dans la grille étant l'un des emplacements cibles.
      REMARQUE: la grille peut être manipulée dans l'interface utilisateur de la caméra en faisant glisser avec la souris.
   5. Dans le "Command SequGUI, sélectionnez l'unité de manipulation sur laquelle la pipette du médicament est montée. Cliquez sur "charger les points de la souris" ou "charger les points de la grille" pour importer toutes les coordonnées pour la livraison du médicament.
      1. Cliquez sur chaque entrée de coordonnées pour éditer le signal TTL de commande spécifique dans la colonne de droite. Dans la première entrée de commande, cliquez sur le chiffre le plus à droite pour l'activer de "0" à "1", en envoyant un signal TTL + 5-V. Réglez l'heure (T) sur la durée souhaitée du signal TTL, en ms.
      2. Dans la deuxième entrée de commande, réglez tous les chiffres sur "0" et réglez T sur la durée de l'enregistrement de l'essai. Modifier les commandes pour toutes les entrées de coordonnées. Ajoutez les entrées de commande en cliquant sur "+" si plusieurs signaux TTL sont nécessaires.
         REMARQUE: les bits de 8 chiffres représentent les voies du port A 0-7 sur le DAQ secondaire (les ports 1 à 3 sont occupés par la pompe et deux soupapes) peuvent être commutés si nécessaire.
   6. Créez un protocole d'enregistrement dans le module d'acquisition de données afinQue le démarrage d'un balayage est déclenché par le déclencheur de démarrage externe. Modifiez le protocole pour délivrer le médicament au moment désiré.
   7. Dans l'interface graphique "Séquence de commande", cliquez sur "Exécuter" à gauche pour exécuter toutes les coordonnées. Sinon, cliquez sur "Exécuter" sur la droite pour exécuter uniquement la séquence sélectionnée.
      REMARQUE: la pipette se déplacera vers chaque coordonnée et exécutera le signal TTL tel que défini pour lancer le balayage d'enregistrement.

Representative Results

Notre système a été testé sur sa capacité à réparer les cellules dans des tranches de cerveau aiguë, des cellules souches pluripotentes induites par la souris (iPSC) différenciées en neurones et des cellules HEK 293 exprimant artificiellement des canaux d'intérêt. La figure 3 montre une expérience utilisant des souris transgéniques Thy1-ChR2-YFP (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J) ciblant les neurones pyramidaux de la couche 5 marquée par fluorescence dans le cortex visuel. La cellule cible était l'une des cellules positives à fluorescence verte identifiées automatiquement ( figure 3b ). La figure 3a est l'image de contraste différentiel différentiel (DIC) du neurone parcheminée. La configuration de la cellule entière a été réalisée par le protocole de correctif automatique aux étapes 2.5 à 2.6 et a été validée par des potentiels d'action induits par injection de courant ( Figure 3c )

1 "> Pour démontrer la fonction" Séquence de commande "supplémentaire, nous avons fourni un KCl de 500 mM pour 200 ms à trois endroits sur une tranche de cerveau tout en réparant une cellule ( Figure 4 ). Tout d'abord, nous avons sélectionné 3 emplacements sur la tranche du cerveau: une fin Le coordonnateur a été chargé dans la "GUI de l'interface de commande". Les coordonnées ont été chargées dans l'interface utilisateur "Séquence de commande" sous "Unité1", qui était le manipulateur que le KCl- Contenant la pipette a été montée. Nous avons réglé les commandes dans la colonne de gauche pour envoyer un signal TTL + 5-V pendant 500 ms, suivi de 0 V pour 10 s ( Figure 4a ), du port A canal 0 sur la carte secondaire DAQ, Qui a été connecté à l'entrée «déclencheur de démarrage» du numériseur. La figure 4c montre que la cellule patchée était un neurone d'épanchement régulier. La pipette d'application de médicament (Unité 1) a traversé les trois emplacements sélectionnés aUtomatically ( Figure 4b ), et nous avons enregistré 10 s pour chaque application sous tension-clamp ( Figure 4d ). La couleur des traces de la figure 4d correspond à la couleur de bordure de la figure 4b . Lorsque KCl a été gonflé à la cellule, un grand courant intérieur a été observé, ce qui diminue lentement lorsque le KCl est diffusé. Un colorant fluorescent rouge a été ajouté à la solution de KCl pour indiquer la distribution spatiale de l'administration de médicament et a été imagé en utilisant une DIC combinée et une image épifluorescente. Cette expérience a illustré la facilité et la flexibilité de notre système pour contrôler le mouvement du manipulateur / microscope et du matériel externe via des signaux TTL.

Figure 1. Unité de contrôle de la pression. A: carte de circuit imprimé (PCB) pour le raccordement des soupapes, pressionCapteur et pompe à air. La gauche montre des détails sur la PCB, les emplacements d'étiquetage des sorties mentionnées dans le protocole. La droite montre la connexion entre la PCB et la pompe à air, le port USB et le tube. B: Carte de circuit pour la PCB. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2. Autopatcher GUI. Les boutons mentionnés dans le protocole sont affichés en carrés rouges et sont numérotés. 1: Démarrer l'étalonnage, 2: Enregistrer l'étalonnage, 3: Étalonnage de la charge, 4: Calibrage secondaire, 5: Détecter la cellule, 6: Contrôle du patch, 7: Aller à (coordonnée de la cellule cible) et 8: Patch. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3. Un exemple de la cellule positive à la ChR2-YFP Patched. A: amplification 40X sous optique DIC. B: image épifluorescente de la même cellule dans le panneau A (éclairage LED à 488 nm). C: Enregistrements de pince à courant de la cellule déchirée lors d'une série d'injections de courant alternatif hyperpolarisant et dépolarisant. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4. Réalisation d'une expérience automatisée de livraison de médicaments. A: Emplacements sélectionnés chargés dans l'interface utilisateur "Séquence de commande". La colonne de gauche montreLa liste des coordonnées et la colonne de droite montre la liste des commandes sous forme de signaux TTL pour chaque emplacement. B: Captures d'écran pendant l'expérience de la demande de médicament correspondant aux trois sites sélectionnés. L'unité 1 était la pipette contenant du KCl et l'unité 2 était la pipette de correction. La solution de KCl a été mélangée avec du colorant fluorescent rouge à des fins de visualisation. Les images ont été obtenues en combinant DIC et l'imagerie par fluorescence. C: Les injections à l'étape actuelle montrent un neurone d'épanchement régulier. D: traces d'enregistrement de tension-pince de l'application locale de solution de KCl 500 mM à trois endroits. La trace rouge avec courant vers l'intérieur a été enregistrée à partir de l'essai lorsque l'application KCl était proche de la cellule corrigée. La flèche rouge indique le moment de l'application KCl. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Outlet sur le PCB	Nom du port sur le tableau DAQ	N ° de port sur le tableau DAQ	Remarque
DOUT V1	Port A channel 1	22	Vanne de régulation 1
DOUT V2	Port A channel 2	23	Soupape de commande 2
DOUT P	Port A channel 3	24	Pompe à air de commande
Gr	Sol	29	Sol

Tableau 1. La carte de circuit imprimé (PCB) à la configuration de la connexion de la carte d'acquisition secondaire de données (DAQ). Utilisez cette table pour connecter les sorties PCB (première colonne de gauche) aux ports sur la carte DAQ (deuxième colonne de gauche). Le nom et le numéro de port sur le DAQ secondaire se réfèrent au mode à une seule extrémité.

Tableau 2. Connexions de tubes de l'unité de contrôle de pression au (x) titulaire (s) de pipette. Pour chaque connexion, connectez les ports correspondants, mis en surbrillance avec une boîte grise, en utilisant des tubes doux (voir la Table des matériaux ).

Discussion

Ici, nous décrivons une méthode pour les enregistrements automatiques de pince à patchs guidés par image in vitro . Les étapes clés de ce processus sont résumées comme suit. Tout d'abord, la vision par ordinateur est utilisée pour reconnaître automatiquement la pointe de la pipette à l'aide d'une série d'images acquises au microscope. Cette information est ensuite utilisée pour calculer la fonction de transformation de coordonnées entre le microscope et les systèmes de coordonnées du manipulateur. La vision par ordinateur est utilisée pour détecter automatiquement les cellules marquées par fluorescence et pour identifier leurs coordonnées. Ces étapes sont intégrées au ciblage par pipette et à l'algorithme de correction automatique en utilisant les langages de programmation Python open source, PyQT et OpenCV.

Par rapport aux méthodes existantes de pince de patch in vitro , ce système apporte des améliorations significatives dans les différents domaines. Cela minimise l'intervention humaine. Ce système automatise la plupart des étapes de l'expérience de pincement de patch, en minimisant la requêteL'intervention humaine. Certaines des étapes manuelles restantes, y compris la commutation entre les objectifs de microscope à faible ou à grand grossissement, peuvent être automatisées à l'aide de matériel motorisé supplémentaire.

La méthode patch-clamp améliore le débit. Les expériences de patch-clamp utilisant ce système ont atteint des taux de réussite plus élevés et des temps plus courts pour chaque essai, contribuant ainsi à une augmentation significative du débit global. L'algorithme de vision par ordinateur pour la détection de cellules fluorescentes et la détection de pointe de pipette est très robuste et le taux d'erreur était très faible. L'erreur moyenne pour la détection de la pointe de la pipette était de 1,6 μm et le taux de faux positif pour la détection des cellules fluorescentes était de 4,9% ± 2,25%. Une comparaison détaillée entre le correctif manuel traditionnel et le correctif automatique a été effectuée ⁶ .

Une documentation détaillée des expériences est possible. Les logs de patchs de chaque essai peuvent être sauvegardés et analysés post hoc . Tellement détailléLa documentation n'était pas disponible pour le correctif manuel. Cela permet une analyse systématique des expériences de parement dans des conditions expérimentales uniques, des types de cellules, des espèces et des préparations en tranche.

Cette méthode montre la compatibilité avec l'équipement standard de pince de patch in vitro . Notre système, tel que démontré dans ce manuscrit, est conçu pour augmenter les plates-formes existantes de pince à patchs in vitro , ce qui leur permet d'effectuer des correctifs automatiques. Contrairement à l'approche planaire, ce système convient aux laboratoires qui effectuent déjà un serrage manuel pour convertir leurs équipements à un coût minimal. Dans le même temps, il existe encore l'option de patch manuellement ou semi-automatique en utilisant le même système.

En raison de l'adaptabilité du système mentionné ci-dessus, l'expérimentateur requiert la connexion du matériel et la configuration du logiciel lorsque le système est configuré pour la première fois. Des problèmes peuvent en résulterDe l'affectation incorrecte des ports et des bibliothèques de pilotes inadéquates pour le contrôle de certains matériels. Reportez-vous aux étapes 1.2 - 1.4 lors du dépannage.

Par rapport à l'automatisation partielle des systèmes existants, ce système permet d' obtenir le niveau maximum d'automatisation dans le serrage classique dans patch vitro de tranches de cerveau aiguës (et autres préparations in vitro). Cela est vrai pour toutes les étapes, de la détection des cellules à l'étalonnage de la pipette au patch ^{7 , 11} . Le seul goulot d'étranglement est le processus manuel de remplissage et de modification des pipettes patch entre les chemins. Les développements récents dans la réutilisation des pipettes patch peuvent potentiellement résoudre ce problème ¹² . En plus de la qualité de la préparation de la tranche, la raison la plus courante pour les essais infructueux provient des erreurs mécaniques du manipulateur et du mouvement de la tranche dans la chambre. Ces limitations sont hors de notre contrôle dansSystème actuel. Des efforts sont déployés pour mettre en place une détection en boucle fermée, en temps réel et un contrôle du mouvement de la pipette pour répondre à ce problème.

Pour un développement futur, nous sommes intéressés à développer les capacités actuelles de détection de cellules fluorescentes à la détection générale des cellules sous l'optique DIC.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCD Camera	QImaging	Rolera Bolt
Electrophysiology rig	Scientifica	SliceScope Pro 2000	Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is “Linlab2”.
Amplifier	Molecular Devices	MultiClamp 700B	computer-controlled microelectrode amplifier
Digitizer	Molecular Devices	Axon Digidata 1550
LED light source	Cool LED	pE-100	488 nm wavelength
Data acquisition board	Measurement Computing	USB1208-FS	Secondary DAQ. See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf
Solenoid valves	The Lee Co.	LHDA0531115H
Air pump	Virtual industry	VMP1625MX-12-90-CH
Air pressure sensor	Freescale semiconductor	MPXV7025G
Slice hold-down	Warner instruments	64-1415 (SHD-40/2)	Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm
Python	Anaconda	version 2.7 (32-bit for windows)	https://www.continuum.io/downloads
Screw Terminals	Sparkfun	PRT - 08084	Screw Terminals 3.5 mm Pitch (2-Pin)
(2-Pin)
N-Channel MOSFET 60 V 30 A	Sparkfun	COM - 10213
DIP Sockets Solder Tail - 8-Pin	Sparkfun	PRT-07937
LED - Basic Red 5 mm	Sparkfun	COM-09590
LED - Basic Green 5mm	Sparkfun	COM-09592
DC Barrel Power Jack/Connector (SMD)	Sparkfun	PRT-12748
Wall Adapter Power Supply - 12 V DC 600 mA	Sparkfun	TOL-09442
Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG)	Sparkfun	PRT-11367
Locking Male x Female x Female Stopcock	ARK-PLAS	RCX10-GP0
Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings	Fisher scientific	14-171-129	Outer Diameter: 1/8 in. Inner Diameter: 1/16 in.
BNC male to BNC male coaxial cable	Belkin Components	F3K101-06-E
560 Ohm Resistor (5% tolerance)	Radioshack	2711116
Picospritzer	General Valve	Picospritzer II