Anvendelse af automatiseret billedstyret patchklemme til undersøgelse af neuroner i hjerneskiver

Summary

Denne protokol beskriver, hvordan man udfører automatiske billedstyrede patch-clamp-eksperimenter ved hjælp af et system, der for nylig er udviklet til standard in vitro- elektrofysiologiudstyr.

Abstract

Hele-celle patch clamp er guldstandardmetoden til måling af de enkelte cellers elektriske egenskaber. In vitro patch clamp forbliver imidlertid en udfordrende og lav gennemløbsteknik på grund af dets kompleksitet og høj afhængighed af brugerens drift og kontrol. Dette manuskript demonstrerer et billedstyret automatisk patch clamp system til in vitro helcelle patch clamp eksperimenter i akut hjerne skiver. Vores system implementerer en computersvisionsbaseret algoritme til at detektere fluorescensmærkede celler og målrette dem til fuldautomatisk patching ved hjælp af en mikromanipulator og intern pipette trykregulering. Hele processen er meget automatiseret, med minimal krav til menneskelig intervention. Realtids eksperimentelle oplysninger, herunder elektrisk modstand og intern pipettryk, dokumenteres elektronisk for fremtidig analyse og optimering til forskellige celletyper. Selvom vores system er beskrevet i sammenhæng med akut braiN skiveoptagelser, kan den også anvendes til den automatiserede billedstyrede patchclamp af dissocierede neuroner, organotypiske skivekulturer og andre ikke-neuronale celletyper.

Introduction

Patch-klemmeteknikken blev først udviklet af Neher og Sakmann i 1970'erne for at studere de ioniske kanaler af excitable membraner ¹ . Siden da er patch clamping blevet anvendt til undersøgelsen af ​​mange forskellige emner på det cellulære, synaptiske og kredsløbsniveau - både in vitro og in vivo - i mange forskellige celletyper, herunder neuroner, cardiomyocytter, Xenopus oocytter og kunstige liposomer ² . Denne proces indebærer den korrekte identifikation og målretning af en celle af interesse, indviklet mikromanipulatorkontrol for at bevæge patchpipetten i nærheden af ​​cellen, påføring af positivt og negativt tryk på pipetten på det rette tidspunkt for at etablere en stram gigasepatch, Og en indbrud for at etablere en helcelle patch konfiguration. Patch clamping udføres typisk manuelt og kræver omfattende træning til master. Selv for en forsker med plasterClamp, succesrate er forholdsvis lav. For nylig er der blevet forsøgt at automatisere patch-clamp eksperimenter. To hovedstrategier er udviklet til at opnå automatisering: Forøgelse af standard patch clamp udstyr til automatisk styring af patching processen og design af nyt udstyr og teknikker fra bunden. Den tidligere strategi kan tilpasses eksisterende hardware og kan anvendes i en række patch-klemme applikationer, herunder in vivo blind patch clamp ^{3 , 4 , 5} , in vitro patch clamp af akut hjerne skiver, organotypiske skive kulturer og dyrkede dissocierede neuroner ⁶ . Det gør det muligt at forhøre komplekse lokale kredsløb ved at bruge flere mikromanipulatorer samtidigt ⁷ . Den plane patch metode er et eksempel på den nye udviklingsstrategi, som kan opnå den høje gennemstrømning samtidig pAtch klemme af celler i suspension til lægemiddel screening formål ⁸ . Den plane patch-metode er imidlertid ikke anvendelig på alle celletyper, især neuroner med lange processer eller intakte kredsløb, der indeholder omfattende forbindelser. Dette begrænser dets anvendelse til kortlægning af det indviklede kredsløb i nervesystemet, hvilket er en vigtig fordel ved traditionel patch clamp-teknologi.

Vi har udviklet et system, der automatiserer den manuelle patch clamp proces in vitro ved at øge standard patch clamp hardware. Vores system, Autopatcher IG, giver automatisk pipettekalibrering, identifikation af fluorescerende celle, automatisk styring af pipettebevægelse, automatisk helcellepatching og datalogning. Systemet kan automatisk erhverve flere billeder af hjerneskiver på forskellige dybder; Analysere dem ved hjælp af computersyn Og ekstraher information, herunder koordinaterne af fluorescensmærkede celler. Disse oplysninger kan så væreBruges til at målrette og automatisk patchceller af interesse. Softwaren er skrevet i Python-et gratis, open source programmeringssprog - ved hjælp af flere open source-biblioteker. Dette sikrer dets tilgængelighed til andre forskere og forbedrer reproducerbarheden og rigoriteten af ​​elektrofysiologiske eksperimenter. Systemet har et modulært design, således at ekstra hardware nemt kan forbindes med det nuværende system demonstreret her.

Protocol

1. Systemopsætning

1. Konstruer trykreguleringsenheden.
   1. Monter trykstyringsenheden i overensstemmelse med kredsløbskortet ( Figur 1 ). Lod de nødvendige dele på det printkort, der er fremstillet i overensstemmelse med de elektriske kredsløbsskemaer ( figur 1b ). Brug standardmodstande, lysdioder, metaloxid halvlederfelt-Eeffect-transistorer (MOSFET'er), kondensatorer og stik (se Materialebordet ). Loddemetalventiler på printkortet. Tilslut luftpumpe og lufttrykføler til printkortet med elektrisk ledning.
      BEMÆRK: Det skal tage cirka 2 timer at konstruere trykreguleringsenheden med alle nødvendige dele, der stilles til rådighed.
2. Tilslut det sekundære datafangstkort (DAQ).
   1. Tilslut dataudgange fra det printkort til DAQ-kortet, som vist i tabel 1 .
      BEMÆRK: DAQ board wilJeg kører i "Single-ended mode." Portkortet findes i brugervejledningen (se Materialebordet ).
   2. Tilslut "AIn Pr S" til en af ​​de analoge indgangs- (AI) kanaler og "R-Gr" til en af ​​de analoge grunde på det sekundære DAQ-kort.
   3. Tilslut primærudgangen fra forstærkeren til en af ​​AI-kanalerne og jorden til den analoge jord på det sekundære DAQ-kort.
      BEMÆRK: Et standard BNC-kabel kan bruges til at forbinde primærudgangen fra forstærkeren.
   4. Strip den anden ende og forbind det positive signal ( dvs. kobberkerne) til AI-kanalen og jorden ( dvs. den tynde ledning omkring kernen) til den analoge jord. Gentag dette trin til en anden kanal, hvis der anvendes flere end en patchkanal.
      BEMÆRK: Den analoge indgang til DAQ-kortet vil blive konfigureret i senere trin.
   5. Tilslut strøm til strømudgangen på det sekundære DAQ-kort. Brug en separat 12 V strøm såUrce for pumpen.
3. Tilslut slangen.
   1. Tilslut luftpumpen og de to ventiler i henhold til tabel 2 . Brug en 3-vejs stik for at forbinde blødt slange fra ventil 2-topporten, tryksensoren og pipetteholderen i sidste trin.
   2. Tilsæt en anden 3-vejs stik til slangen, der er forbundet med pipetteholderen, hvis der anvendes to pipetter. Skift manuelt mellem ventilerne og pipetterne, der er i brug, når de lappes.
4. Installer Autopatcher IG.
   BEMÆRK: Systemkrav: Autopatcher IG blev kun testet på en pc, der kører Windows 7. Det er ikke blevet valideret for andre operativsystemer. Den beskrevne procedure gælder specifikt for den hardware, der er angivet i Materialetabellen.
   1. Download Autopatcher-IG fra GitHub (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG).
   2. Installer Python (se Materialetabellen til versionen og downloadadressen).
   3. Afinstaller PyQt4Bibliotek ved at skrive "pip afinstallere PyQt4" i en kommandolinjeterminal.
      BEMÆRK: Systemet bruger en ældre version af PyQt4 biblioteket for at opnå kompatibilitet med Qwt og Opencv biblioteker.
   4. Installer Python-biblioteker fra historiske hjulfiler (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). Find følgende filer: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none -win32.whl) og Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl).
      1. For at installere hjulfilerne skal du gå til det bibliotek, hvor filerne er gemt og skrive "pip install *** wheelfilename ***. Whl." Stedfortræder "*** wheelfilename ***" med det faktiske navn på filen.
         BEMÆRK: "cp27" i hjulfilnavnet angiver Python 2.7 og "win32" angivet Windows 32-bit. Hvis "win32" ikke virker, skal du prøve "win64".
   5. For at styre CCD kameraet, download og installer installationsprogrammetFor 64-bit (https://www.qimaging.com/support/software/). Derefter download MicroManager til 64-bit (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release) for at styre kameraet i Python.
   6. For at styre manipulatorerne og mikroskopfasen skal du installere styringssoftware fra producenten.
      BEMÆRK: Ved at gøre dette er driveren, der er nødvendig for at styre manipulatorerne, også installeret. Installationspakken leveres almindeligvis i en cd-rom.
   7. For at styre det sekundære DAQ-kort skal du installere Universal Library fra cd-rom, der leveres med køb af DAQ-kortet.
5. Konfigurer hardware til Autopatcher IG.
   1. Forbind mikroskopsteget og manipulatorstyrerne til computeren via USB-porte.
   2. Tildel COM-portnumre til enhed 0: Mikroskop stadium, enhed 1: venstre manipulator og enhed 2: højre manipulator i denne rækkefølge i "ports.csv" konfigurationsfilen i "konfiguration" mappen. LEave de andre parametre i ports.csv fil ( dvs. "SCI" ​​og "1") uændret.
      BEMÆRK: Oplysningerne om COM-portnummer kan findes ved at køre software til konfiguration af manipulatorkonfiguration fra producenten. Gå til fanen "Settings", vælg "Settings" og "Motion" siden, og læs etiketterne for hver fane øverst. Alternativt kan disse oplysninger findes i PC Device Manager.
   3. Tilordne analoge indgangskanalnumre på DAQ-kortet til en trykføler og patchkanal 1 og 2 (svarende til enhed 1 og 2). Indtast kanalnummeret i filen "DAQchannels.csv" i mappen "konfiguration".
      BEMÆRK: Det anbefales at åbne .csv-filerne med Notepad-applikationen i stedet for et regneark, da det kan ændre oplysningerne, når der gemmes ændringer.
6. Kør Autopatcher IG.
   1. Tænd for forstærkeren, mikroskop controller og manipulator controller. EnsuAt forstærkersoftwaren kører.
   2. Kør Autopatcher IG med Python fra en kommandolinjeterminal som følger: Først skal du ændre katalogen (kommando "cd" for de fleste almindelige terminaler), hvor Autopatcher IG er installeret, skriv "python Autopatcher_IG.pyw" i kommandolinjeterminalen og tryk på "Indtast nøgle.
      BEMÆRK: Kør ikke manipulatorstyringssoftwaren, før du kører Autopatcher IG, fordi det vil optage mikroskopfasen og manipulatoren, hvilket forårsager, at Autopatcher IG ikke kan finde hardwareen. Manipulatorstyringssoftware kan køres, efter at Autopatcher IG er startet fuldt ud, hvis der er flere moduler, der skal styres ( f.eks. Inlinevarmeren).
7. Kalibrér den primære pipette.
   1. Træk patchpipetter som beskrevet tidligere ⁹ . Fyld en glaspipette med intern opløsning og læg den på hovedet.
      BEMÆRK: Tomme glaspipetter har forskellige kontraster underMikroskopet og kan føre til unøjagtig kalibrering.
   2. Flyt pipettespidsen til mikroskopets synsfelt og bring det i fokus. Hvis opkaldstastaturet bruges til at bevæge manipulatorerne og / eller mikroskopfasen, skal du opdatere koordinaterne ved at trykke på "z" på tastaturet.
      BEMÆRK: Denne handling er ikke nødvendig, hvis tastaturet (mikroskopfase: A / D - x-akse, W / S-y-akse, R / F-z-aksen, manipulatorer: H / K - x-akse, J - y-akse, O / L - z-akse, 1/2 - enhedsnummer) bruges til at styre bevægelsen, fordi koordinaterne opdateres i realtid.
   3. Klik på knappen "Start kalibrering" på det primære grafiske brugergrænseflade (GUI) for den tilsvarende enhed, hvorpå pipetten er ilagt ( Figur 2 ).
      BEMÆRK: Et pop op-vindue vises, når kalibreringen er færdig.
      BEMÆRK: Kalibrering udføres automatisk, hvilket vil tage ca. 3,5 min. Klik på den samme knap (skiftede nu til "afbryd kalibrering" afFor at indlede kalibrering) vil afbryde kalibreringsforsøget.
   4. Gem kalibreringen ved at klikke på "Gem kalibrering" nederst i hovedgrænsefladen (det gemmer den nuværende kalibrering for begge manipulatorer og kan indlæses i fremtiden).
      BEMÆRK: Visningsfeltet under lav (4 eller 10X) og høj (40x) forstørrelse skal justeres til sekundærkalibrering for at fungere korrekt. Se brugsanvisningen til det optiske system, der anvendes til justeringsprocedurerne.

2. Automatisk patchklemme procedure

1. Forbered akut hjerne skiver, som beskrevet tidligere ¹⁰ .
2. Klargør glaspipetter til klapklemmen.
3. Placer en hjerne skive i midten af ​​optagekammeret. Stabiliser skiven med en skivehold, eller "harpe".
4. Registrér fluorescerende celle.
   1. Find det område af interesse under 4X objektivet. Flyt mikroskopetrinnet ved at tænde cliCk-to-move ("CTM") tilstand og klik på midten af ​​interessepunktet. Alternativt kan du bruge tastaturet til at flytte mikroskopets trin (A / D - x-akse, W / S-y-akse, R / F-z-akse).
   2. Skift til forstørrelseslinsen og juster fokuset ved at flytte mikroskopet i z-aksen ved at bruge R / F på tastaturet.
      BEMÆRK: Det anbefales at justere vandbadniveauet, så brændpunktet under lav- og højforstørrende linser er ens eller lignende i z-aksen.
   3. Klik på knappen "Detect Cell" i hovedgrænsefladen, "Unit 0." Hvis lysdioden eller laserlyskilden til opsætningen ikke kan styres af TTL-signalet, skal du tænde lysdioden / laseren manuelt; Et pop op-vindue vil blive vist, når celledetektion er færdig.
      1. Sluk for LED / laser, hvis det er nødvendigt; En liste over cellekoordinater vises i GUI'en "Memory positions". Fjern uønskede celler fra listen ved at klikke på knappen "X" ved siden af ​​koordinaterne.
      2. Alternativt, hvis målceller ikke er mærket fluorescens, skal du klikke på "Mus-tilstand" på hovedguiten. Klik på den celle af interesse; En gul prik med et tal vises på cellen, og cellens koordinater vises i "Hukommelsespositioner" GUI.
5. Kalibrere den sekundære pipette.
   1. Fyld 1/3 af en glaspipette med intern opløsning. Læg pipetten på pipetteholderen fastgjort til hovedtrinnet.
   2. Brug lav forstørrelse linse. Tag pipetten ind i synsfeltet og juster fokuset ved hjælp af tastaturet (H / K - x-akse, U / J-y-akse, O / L-z-akse). Brug "1" og "2" til at skifte mellem enhed 1 og enhed 2.
   3. Indlæs den primære kalibrering ved at klikke på "Indlæs kalibrering". Klik på knappen "Sekundær kalibrering" på hovedgrænsefladen under den enhed, der er i brug. Hvis f.eks. Enhed 2 er i brug, skal du klikke på knappen "Sekundær kalibrering" i "Unit 2" column. Følg pop-up vinduet instruktioner for at skifte til høj forstørrelse objektiv.
6. Patch en målcelle.
   1. Sørg for, at softwaren "MultiClamp" ( dvs. forstærker) kører. Klik på "Patch control" knappen for at åbne "Patch control" GUI; Det kan tage op til et par minutter at åbne denne GUI.
   2. Brug 40X forstørrelseslinsen ved at markere "40X" på hovedgrænsefladen "Unit 0". Klik på knappen "Gå til" ved siden af ​​den berørte celle på koordinatlisten i "Hukommelsesposition" GUI; Mikroskopet flytter til cellen.
   3. Klik på CTM-knappen på den enhed, der bruges i hovedguiten, for at aktivere bevægelse efter et klik med musen. Klik på den celle af interesse; Pipettespidsen flytter til cellen.
   4. Klik på "Patch" knappen på "Patch kontrol" GUI.
      BEMÆRK: Automatisk patching begynder, og tryk og modstand kan overvåges"Patch kontrol" GUI.
      1. Brug knappen "Unit 1 selected" til at skifte indgangssignalet mellem de to enheder.
         BEMÆRK: Systemet vil nærme sig målcellen, anvende negativt tryk, matche cellemembranpotentialet og påvise gigaseformation baseret på en række tryk- og modstandstærskler og logik.
      2. Manipuler den automatiske proces til enhver tid ved at klikke på de respektive knapper på "Patch Control" GUI. For eksempel skal du klikke på knappen "Patch" igen for at annullere patchforsøg og klikke på "Næste trin" for at fremme patchingprocessen til næste trin uanset tærsklen.
         BEMÆRK: Et pop op-vindue giver besked til brugeren, når en gigaseal er dannet, og muligheden for at anvende zap sammen med stort negativt tryk vil blive præsenteret.
   5. Vælg "Ja" for at bryde ind med kombineret zap og sugning. Alternativt kan du vælge "Nej" for kun at bryde ind med sugning.
      
   6. Gem eksperimentpatchloggen.
      BEMÆRK: Hvis et patchforsøg ikke lykkes, meddeler et pop op-vindue brugeren, og patchprocessen nulstilles.
   7. Gå tilbage til trin 2.4 og gentag trinene med en anden celle.
7. Definer patching tærsklerne (valgfrit).
   BEMÆRK: Tærskler for det oprindelige pipette resistensområde, positivt og negativt tryk, gigase-resistens mv . Kan ændres fra en konfigurationsfil.
   1. Åbn filen "PatchControlConfiguration.csv" i mappen "Konfiguration" på den destination, hvor systemet er installeret. Ændre tallene svarende til hver tærskelværdi. Du må ikke ændre navnene på værdierne Dette vil resultere i uigenkaldelige indgange i systemet.
   2. Gennemfør de nye tærskelværdier straks ved at trykke på "CtRl + l "uden genstart af programmet; genstart af programmet vil implementere den nyeste tærskelværdi fra filen.

3. Udførelse af optagelser

BEMÆRK: Moden i den computerstyrede mikroelektrodeforstærker indstilles automatisk til Current Clamp ("IC") af autopatcher-softwaren, når en vellykket patch er opnået. Hele celle patch clamp optagelser kan gøres ved hjælp af den valgte optagelsessoftware (dette system indeholder ikke en optagefunktion). Hvis flere målceller blev identificeret, efter at have afsluttet en optagelse, skal du gå tilbage til trin 2.4 og prøve en anden celle.

1. Udfør automatiske lokale lægemiddelapplikationseksperimenter ved hjælp af en picospritzer (valgfrit).
   BEMÆRK: Her anvendes et lokalt lægemiddelapplikationseksperiment som et eksempel for at beskrive, hvordan man bruger den ekstra kommandosekvensfunktion til at styre ekstern hardware via TTL-signaler.
   1. Tilslut port A chaNnel 0 og jorden på det sekundære DAQ board til start trigger indgangen på digitalisereren ved hjælp af et fjernet BNC kabel (som beskrevet i trin 1.2.3). Tilslut en digital udgangskanal på digitaliseringen til den eksterne trigger på picospritzeren.
   2. Forbered picospritzeren i henhold til brugervejledningen. Tilslut picospritzer-luftudgangen til pipetteholderen til lægemiddelpuffer, der er fastgjort til en mikromanipulator.
   3. Indlæs en pipette fyldt med et lægemiddel af valg. Fastgør det til pipetteholderen. Kalibrere pipetten som beskrevet i trin 1.7.
   4. Når du har patchet en celle som beskrevet i trin 2.6, skal du vælge et ønsket sted for lægemiddellevering ved at klikke med musen i kameravisningen GUI under "mouse mode" (skiftet fra hoved GUI). Alternativt kan du bruge "Gitter" GUI til at designe et gitter med hver pixel i gitteret som et af målstederne.
      BEMÆRK: Gitteret kan manipuleres i kameravisningen GUI ved at trække med musen.
   5. I "Command SequEnce "GUI, vælg den manipuleringsenhed, som lægemiddelpipetten er monteret på. Klik på" Indlæs musepunkter "eller" Indlæs gitterpunkter "for at importere alle koordinater til lægemiddellevering.
      1. Klik på hver koordinatpost for at redigere det specifikke TTL-signal i den højre kolonne. I den første kommandoindtastning skal du klikke på det højeste ciffer for at vende det fra "0" til "1", og sende et + 5-V TTL-signal. Indstil tiden (T) til den ønskede TTL-signalvarighed, i ms.
      2. I den anden kommandostilling skal alle cifre indstilles til "0" og indstilles T til varigheden af ​​prøveperioden for prøveperioden. Rediger kommandoer for alle koordinatposter. Tilføj kommandoer ved at klikke på "+", hvis flere TTL-signaler er nødvendige.
         BEMÆRK: De 8-cifrede bit repræsenterer port A-kanaler 0-7 på den sekundære DAQ (porte 1 - 3 er optaget af pumpen og to ventiler) kan om nødvendigt skiftes.
   6. Opret en optagelsesprotokol i dataindsamlingsmodulet såAt starten på et feje udløses af den eksterne start trigger. Rediger protokollen for at levere lægemidlet på det ønskede tidspunkt.
   7. I "Kommandosekvens" GUI skal du klikke på "Kør" til venstre for at køre alle koordinater. Alternativt kan du klikke på "Kør" til højre for kun at køre den valgte sekvens.
      BEMÆRK: Pipetten vil bevæge sig til hver koordinat og udføre TTL-signalet som defineret for at starte registreringsfejl.

Representative Results

Vores system er blevet testet på dets evne til at patchere celler i akut hjerne skiver, mus inducerede Pluripotent Stamceller (iPSCs) differentieret til neuroner og HEK 293 celler kunstigt udtrykker kanaler af interesse. Figur 3 viser et forsøg med anvendelse af Thy1-ChR2-YFP-transgene mus (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J) målrettet fluorescensmærkede lag 5 pyramidale neuroner i den visuelle cortex. Målcellen var en af ​​de automatisk identificerede grønne fluorescerende positive celler ( figur 3b ). Figur 3a er Differential Interference Contrast (DIC) billedet af det patched neuron. Helecellekonfigurationen blev opnået ved hjælp af den automatiske patchprotokol i trin 2,5 - 2,6 og blev valideret af trinstrøms injektionsinducerede aktionspotentialer ( figur 3c )

1 "> For at demonstrere den ekstra" Command Sequence "-funktion leverede vi 500 mM KCl i 200 ms til tre steder på en hjerneskive, mens du laver en celle ( Figur 4 ). Først valgte vi 3 steder på hjerneskiven: en tæt Til den patchede cellekrop og to langt væk fra den patched celle. Koordinaterne blev gemt i GUI'en "Memory Positions". Koordinaterne blev indlæst til "Command Sequence" GUI under "Unit1", som var manipulatoren, at KCl- Vi indstiller kommandoerne i den venstre kolonne for at sende et + 5-V TTL-signal for 500 ms efterfulgt af 0 V i 10 s ( Figur 4a ) fra port A-kanal 0 på det sekundære DAQ-kort, Som var forbundet til digitizer "start trigger" input. Figur 4c viser, at den patched celle var en regelmæssig spiking neuron. Drogeapplikationspipetten (Unit 1) travers de tre udvalgte steder aUtomatisk ( figur 4b ), og vi registrerede 10 s for hver applikation under spændingsklemme ( figur 4d ). Farven på sporene i figur 4d svarer til grænsekarven i figur 4b . Når KCl blev pustet i cellen, blev der observeret en stor indadgående strøm, hvilket langsomt blev reduceret som KCl diffunderet. Rødt fluorescerende farvestof blev tilsat til KCl-opløsningen for at indikere den rumlige fordeling af lægemiddelafgivelse og blev afbildet under anvendelse af kombineret DIC og epifluorescerende billeddannelse. Dette eksperiment illustrerede vores systems lethed og fleksibilitet til at styre manipulator / mikroskop bevægelse og ekstern hardware via TTL signaler.

Figur 1. Trykreguleringsenhed. A: Printkort (PCB) til tilslutning af ventiler, trykSensor og luftpumpe. Til venstre vises oplysninger om PCB, mærkning af udgange, der er nævnt i protokollen. Retten viser forbindelsen mellem printpladen og luftpumpen, USB-porten og slangen. B: Kredsløbskort til printkortet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2. Autopatcher GUI. De knapper, der er nævnt i protokollen, vises i røde firkanter og er nummereret. 1: Start kalibrering, 2: Gem kalibrering, 3: Indlæs kalibrering, 4: Sekundær kalibrering, 5: Opdag cellen, 6: Patch Control, 7: Gå til (målcellekoordinat) og 8: Patch. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3. Et eksempel på den patcherede ChR2-YFP-positive celle. A: 40X forstørrelse under DIC optik. B: Epifluorescensbillede af samme celle i panel A (LED-belysning ved 488 nm). C: Aktuelle klemmeoptagelser fra den patched celle under en række hyperpolariserende og depolariserende trinstrømsinjektioner. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4. Gennemførelse af et automatiseret lægemiddelleveringseksperiment. A: Udvalgte placeringer indlæst til GUI for kommandosekvens. Den venstre kolonne viserListen over koordinater og den højre kolonne viser listen over kommandoer i form af TTL-signaler for hver placering. B: Skærmbilleder under lægemiddelapplikationseksperimentet svarende til de tre valgte steder. Enhed 1 var den KCl-holdige pipette og enhed 2 var patchpipetten. KCl-opløsning blev blandet med rødt fluorescerende farvestof med henblik på visualisering. Billeder blev opnået ved at kombinere DIC og fluorescensbilleddannelse. C: Trinstrømsinjektioner, der viser en regelmæssig spiking neuron. D: Spændingsklemmer optager spor fra lokal anvendelse af 500 mM KCl opløsning på tre steder. Det røde spor med indadgående strøm blev registreret fra forsøget, da KCl-applikationen var tæt på den patched celle. Den røde pil angiver tidspunktet for KCl-applikationen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Outlet på printkortet	Portnavn på DAQ-bestyrelsen	Port # på DAQ bord	Bemærkning
DOUT V1	Port A kanal 1	22	Kontrolventil 1
DOUT V2	Port A kanal 2	23	Kontrolventil 2
DOUT P	Port A kanal 3	24	Betjen luftpumpen
gr	Jord	29	Jord

Tabel 1. Trykt kredsløbskort (PCB) til konfiguration af sekundær dataoverførsel (DAQ). Brug denne tabel til at forbinde PCB-udgange (første kolonne fra venstre) til porte på DAQ-kortet (anden kolonne fra venstre). Portnavnet og nummeret på den sekundære DAQ refererer til single-ended mode.

Tabel 2. Slangeforbindelser fra trykreguleringsenheden til pipetteholderen (e). For hver forbindelse skal du forbinde de tilsvarende porte, fremhævet med en grå boks, ved hjælp af blødt rør (se Materialebordet ).

Discussion

Her beskriver vi en metode til automatiske billedstyrede patch clamp-optagelser in vitro . Nøgle trin i denne proces er opsummeret som følger. For det første bruges computersyn til automatisk at genkende pipettespidsen ved hjælp af en række billeder erhvervet via et mikroskop. Disse oplysninger bruges til at beregne koordinattransformationsfunktionen mellem mikroskopet og manipulatorkoordinatsystemerne. Computer vision bruges til automatisk at detektere fluorescensmærkede celler og at identificere deres koordinater. Disse trin er integreret med pipette målretning og den automatiske patching algoritme ved hjælp af open source Python programmeringssprog, PyQT og OpenCV biblioteker.

Sammenlignet med eksisterende in vitro patch clamp metoder, dette system gør betydelige forbedringer på de forskellige områder. Det minimerer menneskelig indgriben. Dette system automatiserer de fleste trin i patch clamp-eksperimentet, minimerer reqPensionering for menneskelig indgriben. Nogle af de resterende manuelle trin, herunder omskiftning mellem linser med lav / høj forstørrelsesmikroskop, kan automatiseres ved hjælp af ekstra motoriseret hardware.

Patch-clamp-metoden forbedrer gennemstrømningen. Patch-clamp eksperimenter ved hjælp af dette system opnåede højere succesrate og kortere tider for hvert forsøg, hvilket bidrager til en betydelig stigning i den samlede gennemgang. Computervisionsalgoritmen til detektion af fluorescerende celler og pipetipsdetektering er meget robust, og fejlfrekvensen var meget lav. Den gennemsnitlige fejl ved pipette-spidsdetektion var 1,6 μm, og den falskpositive hastighed for fluorescerende celle detektion var 4,9% ± 2,25%. En detaljeret sammenligning mellem traditionel manuel patching og automatisk patching er lavet ⁶ .

Detaljeret dokumentation af eksperimenter er mulig. Patch logs af hvert forsøg kan gemmes og analyseres efter hoc . Sådan detaljeretDokumentation var ikke tidligere tilgængelig til manuel patching. Dette muliggør systematisk analyse af patchforsøg i unike forsøgsbetingelser, celletyper, arter og skivepræparater.

Denne metode viser kompatibilitet med standard in vitro patch clamp udstyr. Vores system, som det fremgår af dette manuskript, er designet til at udvide eksisterende in vitro patch clamp rigge, hvilket giver dem kapacitet til at foretage automatisk patching. I modsætning til den plane patch tilgang er dette system velegnet til laboratorier, der allerede udfører manuel patch-klemning for at konvertere deres udstyr til minimal pris. Samtidig er der stadig mulighed for at patch manuelt eller semi-automatisk ved hjælp af det samme system.

På grund af tilpasningsevnen af ​​det ovenfor nævnte system er det nødvendigt at forbinde hardware og konfigurere softwaren af ​​eksperimentet, når systemet er oprettet for første gang. Der kan opstå problemerFra forkert porttildeling og utilstrækkelige driverbiblioteker til styring af visse hardware. Se venligst trin 1.2 - 1.4 ved fejlfinding.

Sammenlignet med den delvise automatisering af eksisterende systemer opnår dette system det maksimale niveau af automatisering i den konventionelle in vitro patch-klemning af akutte hjerneskiver (og andre in vitro- præparater). Dette gælder for alle trin, fra celle detektion til pipette kalibrering til patching ^{7 , 11} . Den eneste flaskehals er den manuelle proces med påfyldning og ændring af patchpipetterne mellem stier. Nylige udviklinger i genbrug af patchpipetter kan potentielt løse dette problem ¹² . Ud over kvaliteten af ​​skiveforberedelsen stammer den mest almindelige årsag til mislykkede forsøg fra manipulator mekaniske fejl og bevægelsen af ​​skiven i kammeret. Disse begrænsninger er uden for vores kontrol iNuværende system. Der gøres en indsats for at gennemføre nærliggende, real-time detektion og styring af pipettebevægelsen for at tage højde for dette problem.

Til fremtidig udvikling er vi interesserede i at udvide de nuværende fluorescerende celle detekteringsfunktioner til generel celle detektion under DIC optik.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCD Camera	QImaging	Rolera Bolt
Electrophysiology rig	Scientifica	SliceScope Pro 2000	Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is “Linlab2”.
Amplifier	Molecular Devices	MultiClamp 700B	computer-controlled microelectrode amplifier
Digitizer	Molecular Devices	Axon Digidata 1550
LED light source	Cool LED	pE-100	488 nm wavelength
Data acquisition board	Measurement Computing	USB1208-FS	Secondary DAQ. See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf
Solenoid valves	The Lee Co.	LHDA0531115H
Air pump	Virtual industry	VMP1625MX-12-90-CH
Air pressure sensor	Freescale semiconductor	MPXV7025G
Slice hold-down	Warner instruments	64-1415 (SHD-40/2)	Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm
Python	Anaconda	version 2.7 (32-bit for windows)	https://www.continuum.io/downloads
Screw Terminals	Sparkfun	PRT - 08084	Screw Terminals 3.5 mm Pitch (2-Pin)
(2-Pin)
N-Channel MOSFET 60 V 30 A	Sparkfun	COM - 10213
DIP Sockets Solder Tail - 8-Pin	Sparkfun	PRT-07937
LED - Basic Red 5 mm	Sparkfun	COM-09590
LED - Basic Green 5mm	Sparkfun	COM-09592
DC Barrel Power Jack/Connector (SMD)	Sparkfun	PRT-12748
Wall Adapter Power Supply - 12 V DC 600 mA	Sparkfun	TOL-09442
Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG)	Sparkfun	PRT-11367
Locking Male x Female x Female Stopcock	ARK-PLAS	RCX10-GP0
Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings	Fisher scientific	14-171-129	Outer Diameter: 1/8 in. Inner Diameter: 1/16 in.
BNC male to BNC male coaxial cable	Belkin Components	F3K101-06-E
560 Ohm Resistor (5% tolerance)	Radioshack	2711116
Picospritzer	General Valve	Picospritzer II