Toepassing van geautomatiseerde beeldgeleide patchclamp voor de studie van neuronen in hersenschijven

Summary

Dit protocol beschrijft hoe u automatische beeldgeleide patch-clamp experimenten kunt uitvoeren met behulp van een systeem dat onlangs is ontwikkeld voor standaard in vitro elektrofysiologie apparatuur.

Abstract

Hele-cel patch klem is de gouden standaard methode om de elektrische eigenschappen van enkele cellen te meten. De in vitro patchclamp blijft echter een uitdagende en low-throughtechniek vanwege de complexiteit en hoge afhankelijkheid van gebruikersoperatie en -controle. Dit manuscript demonstreert een beeldgeleid automatische patchclamp systeem voor in vitro full-cell patch clamp experimenten in acute hersenplakken. Ons systeem implementeert een computergebaseerd algoritme om fluorescente gelabelde cellen te detecteren en te richten op volautomatische patches met behulp van een micromanipulator en interne pipetdrukregeling. Het gehele proces is zeer geautomatiseerd, met minimale eisen voor menselijke interventie. Realtime experimentele informatie, inclusief elektrische weerstand en interne pipettedruk, worden elektronisch gedocumenteerd voor toekomstige analyse en voor optimalisatie voor verschillende celtypen. Hoewel ons systeem wordt beschreven in het kader van acute braiN snijopnamen, kan het ook worden toegepast op de geautomatiseerde beeldgeleide patchclamp van gedissocieerde neuronen, organotypische snijculturen en andere niet-neuronale celtypes.

Introduction

De patch clamp techniek werd in de jaren 1970 ontwikkeld door Neher en Sakmann om de ionische kanalen van excitabele membranen ¹ te bestuderen. Sindsdien is patchclamping toegepast op de studie van veel verschillende onderwerpen op het cellulaire, synaptische en circuitniveau - zowel in vitro als in vivo - in veel verschillende celsoorten, waaronder neuronen, cardiomyocyten, Xenopus-oocyten en kunstmatige liposomen ² . Dit proces omvat de juiste identificatie en targeting van een cel van belang, ingewikkelde micromanipulatorbesturing om de patchpipet in de nabijheid van de cel te bewegen, de toepassing van positieve en negatieve druk op het pipet op het juiste moment om een ​​strakke gigasepatch te vestigen, En een inbraak om een ​​configuratie van een hele celcartridge te maken. Patch klemmen worden doorgaans handmatig uitgevoerd en vereist uitgebreide training om te beheersen. Zelfs voor een onderzoeker die ervaring heeft met de patchKlem, de succesfrequentie is relatief laag. Meer recent zijn er meerdere pogingen gedaan om patch-clamp experimenten te automatiseren. Twee hoofdstrategieën zijn ontwikkeld om automatisering te verwezenlijken: standaard patch klem apparatuur verlenen om automatische controle van het patchproces en het ontwerp van nieuwe apparatuur en technieken vanaf de grond te bieden. De voormalige strategie is aan te passen aan bestaande hardware en kan worden gebruikt in een verscheidenheid aan patchclamp toepassingen, waaronder in vivo blind patch klem ^{3 , 4 , 5} , in vitro patch klem van acute hersenplakken, organotypische snij culturen en gekweekte gedissocieerde neuronen ⁶ . Het stelt de interrogatie van complexe lokale circuits mogelijk tegelijkertijd in gebruik door meerdere micromanipulatoren ⁷ . De platte patchmethode is een voorbeeld van de nieuwe ontwikkelingsstrategie, die de gelijktijdige p-high-throughput kan bereikenAtch klem van cellen in suspensie voor geneesmiddel screening doeleinden ⁸ . De platte patchmethode is echter niet van toepassing op alle celtypes, met name neuronen met lange processen of intacte schakelingen die uitgebreide verbindingen bevatten. Dit beperkt de toepassing ervan om de ingewikkelde schakelingen van het zenuwstelsel in kaart te brengen, wat een belangrijk voordeel is van de traditionele patchclamp-technologie.

We hebben een systeem ontwikkeld dat het handmatig patch clamp proces in vitro automatiseert door de standaard patch clamp hardware te versterken. Ons systeem, Autopatcher IG, biedt automatische pipette-kalibratie, identificatie van de fluorescerende cel, automatische controle van pipettebeweging, automatische full-cell patching en data logging. Het systeem kan automatisch meerdere beelden van breinschijfjes op verschillende diepten verwerven; Analyseren ze met behulp van computer visie; En extract informatie, inclusief de coördinaten van fluorescent gelabelde cellen. Deze informatie kan dan zijnGebruikt om de cellen van belang te richten en automatisch te patcheren. De software is geschreven in Python, een gratis open source-programmeertaal, met behulp van verschillende open-source bibliotheken. Dit zorgt voor toegankelijkheid voor andere onderzoekers en verbetert de reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid van elektrofysiologische experimenten. Het systeem heeft een modulair ontwerp, zodat extra hardware gemakkelijk kan worden aangesloten op het huidige systeem dat hier wordt aangetoond.

Protocol

1. Systeeminstelling

1. Constructeer de drukregelaar.
   1. Monteer de drukregelaar volgens de schakelkaart ( Figuur 1 ). Soldeert de benodigde onderdelen op de printplaat (PCB) die is vervaardigd volgens de elektrische schema's ( Figuur 1b ). Gebruik standaard weerstanden, LED's, Metaal-Oxide Semiconductor Field-Eeffect Transistors (MOSFET's), condensatoren en connectoren (zie de Tabel van Materialen ). Soldeerseloïde kleppen op de printplaat. Sluit de luchtpomp en de luchtdruksensor aan op de printplaat met elektrische draad.
      OPMERKING: Het duurt ongeveer 2 uur om de drukregelaar te construeren met alle benodigde onderdelen die beschikbaar zijn.
2. Sluit de raad van de secundaire gegevensverzameling (DAQ) aan.
   1. Sluit de uitgangen van de printplaat aan op de DAQ-kaart, volgens tabel 1 .
      OPMERKING: De DAQ board wilIk loop in de modus Single-ended. De havenkaart is te vinden in de gebruikershandleiding (zie de Tabel van Materialen ).
   2. Sluit "AIn Pr S" aan op een van de analoge ingangen (AI) kanalen en "R-Gr" op een van de analoge gronden op het secundaire DAQ board.
   3. Sluit de primaire uitgang van de versterker aan op een van de AI-kanalen en de grond op de analoge grond van de secundaire DAQ-kaart.
      OPMERKING: een standaard BNC-kabel kan worden gebruikt om de primaire uitgang van de versterker te verbinden.
   4. Strip het andere uiteinde en verbind het positieve signaal ( dwz koperkern) aan het AI-kanaal en de grond ( dwz de dunne draad om de kern) op de analoge grond. Herhaal deze stap voor een tweede kanaal als er meerdere patchkanalen worden gebruikt.
      OPMERKING: De analoge ingang van de DAQ-kaart wordt in latere stappen geconfigureerd.
   5. Sluit de stroom aan op de stroomuitgang van de secundaire DAQ-kaart. Gebruik hiervoor een aparte 12 V stroomUrce voor de pomp.
3. Sluit de slang aan.
   1. Sluit de luchtpomp en de twee kleppen aan volgens tabel 2 . Gebruik een 3-polige stekker om de zachte buis te verbinden met de bovenste poort van de klep 2, de druksensor en de pipethouder in de laatste stap.
   2. Voeg een andere 3-polige connector toe aan de buis die op de pipethouder is aangesloten, als er twee pipetten worden gebruikt. Schakel handmatig tussen de kleppen en de pipetten in gebruik bij het plakken.
4. Installeer Autopatcher IG.
   OPMERKING: Systeemvereiste: Autopatcher IG werd alleen getest op een pc met Windows 7. Het is niet gevalideerd voor andere besturingssystemen. De beschreven procedure is specifiek van toepassing op de hardware die vermeld staat in de Tabel.
   1. Download Autopatcher-IG van GitHub (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG).
   2. Installeer Python (zie de Tabel van Materialen voor de versie en downloadadres).
   3. Verwijder de PyQt4Bibliotheek door te typen "pip verwijderen PyQt4" in een command line terminal.
      OPMERKING: Het systeem maakt gebruik van een oudere versie van de PyQt4-bibliotheek om compatibiliteit met de Qwt- en Opencv-bibliotheken te bereiken.
   4. Installeer Python bibliotheken uit historische wielbestanden (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). Zoek de volgende bestanden: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-geen -win32.whl) en Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl).
      1. Om de wielbestanden te installeren, ga naar de map waar de bestanden opgeslagen zijn en typ "pip install *** wheelfilename ***. Whl." Vervangend "*** wheelfilename ***" met de werkelijke naam van het bestand.
         OPMERKING: "cp27" in de wielbestandnaam geeft aan Python 2.7 en "win32" geeft Windows 32-bits aan. Als "win32" niet werkt, probeer dan "win64."
   5. Om de CCD-camera te bedienen, download en installeer het installatieprogrammaVoor 64-bits (https://www.qimaging.com/support/software/). Download dan MicroManager voor 64-bits (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release) om de camera in Python te controleren.
   6. Om de manipulatoren en het microscoopfase te controleren, installeer de besturingssoftware die door de fabrikant wordt geleverd.
      OPMERKING: hiermee wordt de bestuurder die nodig is om de manipulatoren te controleren, ook geïnstalleerd. Het installatiepakket wordt meestal op een cd-rom geleverd.
   7. Om de secundaire DAQ-kaart te bedienen, installeer u de universele bibliotheek van cd-rom, voorzien van de aankoop van de DAQ-kaart.
5. Configureer de hardware voor Autopatcher IG.
   1. Sluit de microscoopfase en de manipulatorregelaars aan op de computer via USB-poorten.
   2. COM-poortnummers toewijzen aan eenheid 0: microscoopfase, eenheid 1: linker manipulator en eenheid 2: rechter manipulator, in deze volgorde, in het configuratiebestand "ports.csv" in de map "configuratie". LEave de andere parameters in het ports.csv bestand ( dwz "SCI" ​​en "1") ongewijzigd.
      OPMERKING: De COM-poortnummerinformatie kan worden gevonden door de door de fabrikant geleverde software voor de configuratie van de manipulator te gebruiken. Ga naar het tabblad 'Instellingen', selecteer 'Instellingen' en de 'Beweging' pagina en lees de labels voor elke tabblad bovenaan. Als alternatief kan deze informatie worden gevonden in de PC Device Manager.
   3. Analoge ingangskanaalnummers op de DAQ-kaart toewijzen voor een druksensor en patchkanalen 1 en 2 (overeenkomend met eenheid 1 en 2). Voer het kanaalnummer in in het bestand "DAQchannels.csv" in de map "configuratie".
      OPMERKING: Het is aan te raden om de .csv-bestanden te openen met de notitiebloktoepassing in plaats van een spreadsheet, omdat het de informatie kan wijzigen bij het opslaan van wijzigingen.
6. Run Autopatcher IG.
   1. Zet de versterker, de microscoopcontroller en de controller aan. ensuLet erop dat de versterkersoftware loopt.
   2. Voer Autopatcher IG met Python uit een command line-terminal als volgt uit: eerst de directory wijzigen (commando "cd" voor de meeste gebruikelijke terminals) waar Autopatcher IG is geïnstalleerd, typ "python Autopatcher_IG.pyw" in de command line terminal en druk op de "Enter toets.
      OPMERKING: Rij niet de software voor het bedienen van de manipulator voordat u Autopatcher IG uitvoert omdat het de microscoopfase en de manipulator zal bezetten, waardoor Autopatcher IG de hardware niet kan vinden. Manipulator controle software kan worden uitgevoerd nadat Autopatcher IG volledig is gestart als er extra modules zijn die moeten worden bestuurd ( bijvoorbeeld de inline-verwarming).
7. Kalibreer de primaire pipet.
   1. Trek patchpipetten zoals eerder beschreven ⁹ . Vul een getrokken glaspipet met interne oplossing en laad het op de hoofdtrap.
      OPMERKING: Leeg glazen pipetten hebben verschillende contrasten onderDe microscoop en kan leiden tot onnauwkeurige kalibratie.
   2. Verplaats de pipettip naar het visuele veld van de microscoop en breng hem in focus. Als de draaiknop wordt gebruikt om de manipulatoren en / of de microscoopfase te verplaatsen, moet u de coördinaten updaten door op "z" op het toetsenbord te drukken.
      OPMERKING: Deze actie is niet nodig als het toetsenbord (microscoopfase: A / D - x-as, W / S - y-as, R / F - z-as; manipulatoren: H / K - x-as, J - y-as, O / L - z-as, 1/2 - eenheidsnummer) wordt gebruikt om beweging te regelen omdat de coördinaten in real time worden geüpdatet.
   3. Klik op de knop 'Start kalibreren' op de hoofd Grafische gebruikersinterface (GUI) voor het corresponderende apparaat waarop de pipet is geladen ( Figuur 2 ).
      OPMERKING: een pop-upvenster verschijnt wanneer de kalibratie is voltooid.
      OPMERKING: De kalibratie wordt automatisch uitgevoerd, wat ongeveer 3,5 minuten duurt. Door op dezelfde knop te klikken (nu geschakeld naar "kalibrering annuleren" afTer instelling van de kalibratie) zal de kalibratiepoging afbreken.
   4. Bewaar de kalibratie door op "Onderhoud kalibratie" onderaan de hoofd GUI te slaan (het bewaart de huidige kalibratie voor beide manipulatoren en kan in de toekomst worden geladen).
      OPMERKING: Het zichtveld bij lage (4 of 10X) en hoge (40x) vergroting moet uitgelijnd zijn voor secundaire kalibratie om goed te functioneren. Raadpleeg de gebruiksaanwijzing van het optische systeem dat in gebruik is voor de uitlijningsprocedures.

2. Automatische Patch Clamp Procedure

1. Bereid acute hersenplakken, zoals eerder beschreven ¹⁰ .
2. Bereid de glazen pipetten voor de patch klem.
3. Plaats een breinschijf in het midden van de opname kamer. Stabiliseer het snijstuk met een plakknop, of 'harp'.
4. Ontdek de fluorescerende cel.
   1. Vind het gebied van belang onder de 4X lens. Verplaats de microscoopfase door cli aan te zettenCk-to-move ("CTM") modus en klik op het midden van het gewenste gebied. Als alternatief gebruik u het toetsenbord om de microscoopstadium te verplaatsen (A / D - x-as, W / S - y-as, R / F - z-as).
   2. Overschakelen naar de hoge vergrotingslens en pas de focus aan door de microscoop in de z-as te verplaatsen, met behulp van R / F op het toetsenbord.
      OPMERKING: Het is aan te raden het waterbadniveau aan te passen, zodat het brandpuntvlak onder de lage en hoge vergrotingslensjes hetzelfde of vergelijkbaar is in de z-as.
   3. Klik op de knop 'Detect Cell' in de hoofd GUI kolom, 'Unit 0.' Als de LED of laserlichtbron van de instelling niet door het TTL-signaal kan worden bediend, schakelt u de LED / laser handmatig in; Een pop-upvenster verschijnt wanneer de cel detectie is voltooid.
      1. Zet de LED / laser uit indien nodig; Een lijst met celcoördinaten verschijnt in de GUI van de "Geheugenposities". Verwijder ongewenste cellen uit de lijst door op de knop "X" naast de coördinaten te klikken.
      2. Als alternatief, als targetcellen niet fluorescent gelabeld zijn, klikt u op "Muismodus" in de hoofd GUI. Klik op de cel van belang; Een gele stip met een nummer verschijnt op de cel, en de coördinaten van de cel verschijnen in de GUI van de "Geheugenposities".
5. Kalibreer het secundaire pipet.
   1. Vul 1/3 van een glazen pipet met interne oplossing. Laad de pipet op de pipethouder die op de hoofdtrap is bevestigd.
   2. Gebruik de lage vergrotingslens. Breng de pipet in het zichtveld en pas de focus aan met behulp van het toetsenbord (H / K - x-as, U / J - y-as, O / L - z-as). Gebruik "1" en "2" om te schakelen tussen eenheid 1 en eenheid 2.
   3. Laad de primaire kalibratie door op "Kalibratie laden" te klikken. Klik op de knop "Secundaire kalibratie" op de hoofd GUI onder het apparaat dat in gebruik is. Als bijvoorbeeld eenheid 2 in gebruik is, klikt u op de knop "Secondary calibration" in de "Unit 2" column. Volg de instructies van het pop-upvenster om over te schakelen naar de hoge vergrotingslens.
6. Patch een doelcel.
   1. Zorg ervoor dat de software "MultiClamp" ( ie versterker) wordt uitgevoerd. Klik op de knop "Patch control" om de "Patch control" GUI te openen; Het kan tot een paar minuten duren om deze GUI te openen.
   2. Gebruik de 40X vergrotingslens door "40X" in de hoofd GUI "Unit 0" kolom te selecteren. Klik op de knop "Ga naar" naast de cel van belang in de coördinatielijst in de GUI van de "Geheugenpositie" De microscoop zal naar de cel gaan.
   3. Klik op de CTM-knop van het apparaat dat in gebruik is in de hoofd GUI om de beweging na een muisklik te activeren. Klik op de cel van belang; De pipet tip zal verhuizen naar de cel.
   4. Klik op de "Patch" knop op de "Patch control" GUI.
      OPMERKING: Automatisch patchen begint en de druk en weerstand kunnen worden gecontroleerdDe "Patch control" GUI.
      1. Gebruik de "Unit 1 selected" knop om het ingangssignaal tussen de twee units te schakelen.
         OPMERKING: Het systeem zal de doelcellen naderen, negatieve druk toepassen, het celmembraanpotentieel aanpassen en gigaseformatie detecteren op basis van een reeks druk- en weerstandsdrempels en logica.
      2. Manipuleer het automatische proces op elk gewenst moment door op de respectieve knoppen op de GUI te klikken. Klik bijvoorbeeld opnieuw op de knop "Patch" om het patchproces te annuleren en klik op "Next stage" om het patchproces naar de volgende stap te bevorderen, ongeacht de drempelwaarde.
         OPMERKING: een pop-up venster zal de gebruiker op de hoogte stellen wanneer een gigaseal is gevormd, en de optie om zap samen te werken met grote negatieve druk wordt gepresenteerd.
   5. Selecteer "Ja" om in te gaan met gecombineerde zap en zuigkracht. Als alternatief selecteert u "Nee" om alleen in te zuigen.
      
   6. Sla het experimentlogboek op.
      OPMERKING: Als een patchproef mislukt is, zal een pop-upvenster de gebruiker in kennis stellen en wordt het patchproces opnieuw ingesteld.
   7. Ga terug naar stap 2.4 en herhaal de stappen met een andere cel.
7. Verfijn de laaddrempels (optioneel).
   OPMERKING: Drempelwaarden voor het initiële pipetresistentiebereik, positieve en negatieve druk, gigase-resistentie, enz . Kan gewijzigd worden vanuit een configuratiebestand.
   1. Open het bestand "PatchControlConfiguration.csv" in de map "Configuration" op de plaats waar het systeem is geïnstalleerd. Verander de nummers die overeenkomen met elke drempelwaarde. Verander de namen van de waarden niet; Dit zal resulteren in onherkenbare invoer in het systeem.
   2. Installeer de nieuwe drempelwaarden onmiddellijk door te drukken op "CtRl + l "zonder het programma opnieuw te starten; het programma wordt herstart door de nieuwste drempelwaarde uit het bestand te implementeren.

3. Opnamen uitvoeren

OPMERKING: De modus in de computer gestuurde micro-elektrode versterker wordt automatisch ingesteld op Current Clamp ("IC") door de autopatcher software zodra een succesvolle patch is bereikt. Opnameprogramma's voor hele cellen kunnen worden uitgevoerd met behulp van de gewenste opnameprogramma (dit systeem bevat geen opnamefunctie). Als er meerdere targetcellen zijn geïdentificeerd, ga je na een opname terug naar stap 2.4 en probeer een andere cel.

1. Voer automatische lokale drugtoepassingsexperimenten uit met behulp van een picospritzer (optioneel).
   OPMERKING: hier wordt een lokaal drug applicatie experiment gebruikt als voorbeeld om te beschrijven hoe u de extra "Command Sequence" functie kunt gebruiken om externe hardware te controleren via TTL signalen.
   1. Verbind poort A chaNnel 0 en de grond op de secundaire DAQ board naar de start trigger ingang op de digitizer met behulp van een gestripte BNC kabel (zoals beschreven in stap 1.2.3). Sluit een digitale uitgangskanaal op de digitizer aan op de externe trigger op de picospritzer.
   2. Bereid de picospritzer volgens de gebruikershandleiding op. Sluit de picospritzer-luchttoevoer aan op de pijphouder die aan een micromanipulator is bevestigd.
   3. Laad een pipet vol met een geneesmiddel van keuze. Bevestig het aan de pipethouder. Kalibreer de pipet, zoals beschreven in stap 1.7.
   4. Nadat u een cel heeft gelegd zoals beschreven in stap 2.6, selecteert u een gewenste locatie voor de levering van geneesmiddelen door met de muis te klikken in de GUI van de cameraweergave onder "muismodus" (geschakeld vanaf de hoofd GUI). Als alternatief gebruik je de GUID 'Grid' om een ​​raster te ontwerpen, met elke pixel in het raster als één van de doellocaties.
      OPMERKING: Het raster kan gemanipuleerd worden in de GUI van de cameraweergave door met de muis te slepen.
   5. In de "Command SequEnce "GUI, selecteer de manipulatie-eenheid waarop de drugpipet is gemonteerd. Klik op" Muispunten laden "of" Laadpunten laden "om alle coördinaten voor de levering van geneesmiddelen te importeren.
      1. Klik op elke coördinatenpost om het specifieke TTL-signaal van de opdracht in de rechterkolom te bewerken. Klik in het eerste commando-ingang op het rechterste cijfer om het van "0" naar "1" te zetten, om een ​​+ 5-V TTL-signaal te verzenden. Stel de tijd (T) in op de gewenste TTL-signaalduur, in ms.
      2. Stel in de tweede opdrachtinvoer alle cijfers in op "0" en stel T in op de duur van de opnamelengte van de proef. Beheer opdrachten voor alle coördinaten. Voeg commando-vermeldingen toe door op "+" te klikken als meerdere TTL-signalen nodig zijn.
         OPMERKING: De 8-cijferige bits vertegenwoordigen poort A-kanalen 0-7 op de secundaire DAQ (poorten 1 - 3 worden bezet door de pomp en twee afsluiters) kunnen eventueel worden geschakeld.
   6. Maak een opname protocol in de data acquisition module dusDat het begin van een sweep wordt geactiveerd door de externe start-trigger. Bewerk het protocol om het geneesmiddel op de gewenste tijd te leveren.
   7. Klik in de GUI van de opdrachtregel op "Run" aan de linkerkant om alle coördinaten uit te voeren. Als alternatief klikt u op "Uitvoeren" rechts om alleen de geselecteerde volgorde te draaien.
      OPMERKING: De pipet zal naar elke coördinaat verplaatsen en het TTL-signaal uitvoeren zoals gedefinieerd om de opname-sweep te starten.

Representative Results

Ons systeem is getest op het vermogen om cellen in acute hersenplakken te plakken, met muis geïnduceerde Pluripotent Stamcellen (iPSC's) die gedifferentieerd zijn in neuronen, en HEK 293 cellen kunstmatig kanalen van belangstelling uitdrukken. Figuur 3 toont een experiment met behulp van Thy1-ChR2-YFP transgene muizen (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J), gericht op fluorescent gelabelde laag 5 pyramidale neuronen in de visuele cortex. De doelcel was een van de automatisch geïdentificeerde groene fluorescerende positieve cellen ( Figuur 3b ). Figuur 3a is het Differentieel Interferentie Contrast (DIC) beeld van de patched neuron. De volledige celconfiguratie werd bereikt door het automatische patchprotocol in stappen 2.5 - 2.6 en werd gevalideerd door stapstroominjectie-geïnduceerde actiepotenties ( Figuur 3c )

1 "> Om de extra" Command Sequence "-functie te demonstreren, hebben we 500 mM KCl voor 200 ms geleverd aan drie locaties op een hersenschijf tijdens het plakken van een cel ( Figuur 4 ). Eerst hebben we 3 locaties op de breinschijf geselecteerd: één dicht Naar de patchvormige cellichaam en twee ver weg van de gelapte cel. De coördinaten werden opgeslagen in de GUI van de geheugenposities. De coördinaten werden geladen naar de "Command Sequence" GUI onder "Unit1", die de manipulator was dat de KCl- Wij zetten de commando's in de linkerkolom aan om een ​​5T TTL signaal voor 500 ms te verzenden, gevolgd door 0 V voor 10 s ( Figuur 4a ), van poort A kanaal 0 op de secundaire DAQ board, Die verbonden was met de ingang van de digitaliserings "trigger trigger". Figuur 4c laat zien dat de patched cel een regelmatige spiking neuron was. De drugapplicatiepipette (Unit 1) traceerde de drie geselecteerde locaties eenAutomatisch ( figuur 4b ) en we hebben 10 s voor elke applicatie onder spanningsklem opgenomen ( figuur 4d ). De kleur van de sporen in figuur 4d komt overeen met de randkleur in figuur 4b . Toen KCl in de cel werd gepofd, werd een grote inwendige stroom waargenomen, die langzaam afneemde als KCl gediffuseerd. Rode fluorescerende kleurstof werd toegevoegd aan de KCl oplossing om de ruimtelijke verdeling van geneesmiddelafgifte aan te geven en werd afgebeeld onder toepassing van gecombineerde DIC en epifluorescente beeldvorming. Dit experiment illustreerde het gemak en de flexibiliteit van ons systeem om manipulator- / microscoopbeweging en externe hardware te beheersen via TTL-signalen.

Figuur 1. Drukregelaar. A: Printplaat (PCB) voor het aansluiten van de kleppen, drukSensor en luchtpomp. Links verschijnen details op het printplaat, labeling locaties van uitvoeringen die in het protocol worden genoemd. Het recht geeft de verbinding tussen de printplaat en de luchtpomp, de USB-poort en de slang aan. B: Circuitkaart voor de printplaat. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Autopatcher GUI. De knoppen die in het protocol worden genoemd, worden in rode vierkanten weergegeven en genummerd. 1: Kalibratie starten, 2: Kalibratie opslaan, 3: Kalibratie laden, 4: Secundaire kalibratie, 5: Cel detecteren, 6: Patchcontrole, 7: Ga naar (doelcelcoördinaat) en 8: Patch. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Een voorbeeld van de gepatchte ChR2-YFP-positieve cel. A: 40X vergroting onder DIC optics. B: Epifluorescentiebeeld van dezelfde cel in paneel A (LED-verlichting bij 488 nm). C: Actuele klemopnamen van de gelapte cel tijdens een reeks van hyperpolariserende en depolariserende stroomstroominjecties. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Het uitvoeren van een geautomatiseerde drugleveringsexperiment. A: Geselecteerde locaties geladen in de GUI van de opdrachtregel. De linker kolom laat zienDe lijst met coördinaten en de rechterkolom toont de lijst met commando's in de vorm van TTL-signalen voor elke locatie. B: Screenshots tijdens het medicijn applicatie experiment dat overeenkomt met de drie geselecteerde locaties. Unit 1 was de KCl-bevattende pipet en Unit 2 was de patchpipet. KCl oplossing werd gemengd met rode fluorescerende kleurstof voor het doel van visualisatie. Beelden werden verkregen door het combineren van DIC en fluorescentie beeldvorming. C: Stapstroominjecties die een normale spiking neuron tonen. D: Spanningsklem opname sporen van de lokale toepassing van 500 mM KCl oplossing op drie locaties. Het rode spoor met inwendige stroom werd geregistreerd uit het proefschrift toen de KCl-applicatie dicht bij de patched cel was. De rode pijl geeft de timing van de KCl-toepassing aan. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Uitlaat op de printplaat	Havennaam op de DAQ board	Haven # op DAQ board	Opmerking
DOUT V1	Poort Een kanaal 1	22	Regelklep 1
DOUT V2	Haven A kanaal 2	23	Regelklep 2
DOUT P	Haven A kanaal 3	24	Controleer de luchtpomp
Gr	Grond	29	Grond

Tabel 1. Printplaat (PCB) naar configuratieconfiguratie voor de tweede data-aanschaf (DAQ). Gebruik deze tabel om PCB-uitgangen (eerste kolom van links) aan te sluiten op poorten op de DAQ-kaart (tweede kolom van links). De poortnaam en het nummer op de secundaire DAQ hebben betrekking op de single-ended mode.

Tabel 2. Slangverbindingen van de drukregelaar naar de pipethouder (s). Voor elke aansluiting verbindt u de bijbehorende poorten, gemarkeerd met een grijze doos, met zachte buizen (zie de tabel van materialen ).

Discussion

Hier beschrijven we een methode voor automatische beeldgeleide patchclamp opnames in vitro . De belangrijkste stappen in dit proces worden als volgt samengevat. Ten eerste wordt computervisie gebruikt om de pipettip automatisch te herkennen met behulp van een reeks beelden die via een microscoop zijn verkregen. Deze informatie wordt dan gebruikt om de coördinaat transformatie functie te berekenen tussen de microscoop en de manipulator coördinatensystemen. Computervisie wordt gebruikt om fluorescent gelabelde cellen automatisch te detecteren en hun coördinaten te identificeren. Deze stappen zijn geïntegreerd met pipette-targeting en het automatische patchalgoritme met behulp van de open source Python programmeertaal, PyQT en OpenCV bibliotheken.

In vergelijking met bestaande in vitro patch clamp methoden, maakt dit systeem aanzienlijke verbeteringen op de verschillende gebieden. Het minimaliseert menselijke interventie. Dit systeem automatiseert de meeste stappen in het patchclamp-experiment, waarbij de req wordt geminimaliseerdPensioen voor menselijke tussenkomst. Enkele van de resterende handmatige stappen, inclusief het schakelen tussen de lenzen met een lage / hoge vergrotingsmicroscoop, kunnen geautomatiseerd worden met extra gemotoriseerde hardware.

De patch-clamp methode verbetert de doorvoer. Patch-clamp experimenten die gebruik maken van dit systeem behaalden hogere succesfrequenties en kortere tijden voor elke proef, bijgedragen tot een significante toename van de totale doorvoer. Het computervisie algoritme voor detectie van fluorescerende cellen en pipetpunten is zeer robuust, en de foutfrequentie was zeer laag. De gemiddelde fout voor de detectie van pipetpunten was 1,6 μm en de valse positieve snelheid voor fluorescentie-detectie was 4,9% ± 2,25%. Een gedetailleerde vergelijking tussen traditionele handmatige patching en automatische patching is gemaakt ⁶ .

Gedetailleerde documentatie van experimenten is mogelijk. Patch logs van elke proef kunnen worden opgeslagen en geanalyseerd post hoc . Zo gedetailleerdDocumentatie was niet eerder beschikbaar voor handmatig patchen. Dit zorgt voor een systematische analyse van patch experimenten in unieke experimentele condities, celtypen, soorten en plakpreparaten.

Deze methode toont compatibiliteit met standaard in vitro patch klem apparatuur. Ons systeem, zoals aangetoond in dit manuscript, is ontworpen om bestaande in vitro patchclamp riggen te vergroten, waardoor ze de mogelijkheid hebben om automatische patchen te voeren. In tegenstelling tot de platte patchaanpak, is dit systeem geschikt voor laboratoria die al handmatige patchspanning uitvoeren om hun apparatuur tegen minimale kosten te converteren. Tegelijkertijd is er nog steeds de optie om handmatig of semi-automatisch te patcheren met hetzelfde systeem.

Vanwege de aanpassingsvermogen van het bovengenoemde systeem, is de verbinding van de hardware en het configureren van de software vereist door de experimentator wanneer het systeem voor het eerst is ingesteld. Er kunnen problemen optredenVan onjuiste poorttoewijzing en onvoldoende bestuurdersbibliotheken voor de controle van bepaalde hardware. Raadpleeg de stappen 1.2 - 1.4 bij het oplossen van problemen.

Vergeleken met de gedeeltelijke automatisering van bestaande systemen bereikt dit systeem het maximale automatiseringsniveau in de conventionele in vitro patch klemmen van acute hersenplakken (en andere in vitro preparaten). Dit geldt voor alle stappen, van celdetectie tot pipetkalibratie tot patch ^{7 , 11} . De enige knelpunt is het handmatige proces om de patchpipetten te vullen en te veranderen tussen de paden. Recente ontwikkelingen in het hergebruik van patchpipetten kunnen dit probleem ¹² oplossen. Naast de kwaliteit van de voorbereiding van de plak, komt de meest voorkomende reden voor mislukte proeven af ​​van manipulator mechanische fouten en de beweging van de plak in de kamer. Deze beperkingen staan ​​buiten onze controle in dehuidige systeem. Er wordt geprobeerd om close-loop, real-time detectie en controle van de pipetbeweging te implementeren om dit probleem in aanmerking te nemen.

Voor toekomstige ontwikkeling, zijn we geïnteresseerd in het uitbreiden van de huidige fluorescerende cel detectie mogelijkheden voor algemene cel detectie onder DIC optics.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCD Camera	QImaging	Rolera Bolt
Electrophysiology rig	Scientifica	SliceScope Pro 2000	Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is “Linlab2”.
Amplifier	Molecular Devices	MultiClamp 700B	computer-controlled microelectrode amplifier
Digitizer	Molecular Devices	Axon Digidata 1550
LED light source	Cool LED	pE-100	488 nm wavelength
Data acquisition board	Measurement Computing	USB1208-FS	Secondary DAQ. See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf
Solenoid valves	The Lee Co.	LHDA0531115H
Air pump	Virtual industry	VMP1625MX-12-90-CH
Air pressure sensor	Freescale semiconductor	MPXV7025G
Slice hold-down	Warner instruments	64-1415 (SHD-40/2)	Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm
Python	Anaconda	version 2.7 (32-bit for windows)	https://www.continuum.io/downloads
Screw Terminals	Sparkfun	PRT - 08084	Screw Terminals 3.5 mm Pitch (2-Pin)
(2-Pin)
N-Channel MOSFET 60 V 30 A	Sparkfun	COM - 10213
DIP Sockets Solder Tail - 8-Pin	Sparkfun	PRT-07937
LED - Basic Red 5 mm	Sparkfun	COM-09590
LED - Basic Green 5mm	Sparkfun	COM-09592
DC Barrel Power Jack/Connector (SMD)	Sparkfun	PRT-12748
Wall Adapter Power Supply - 12 V DC 600 mA	Sparkfun	TOL-09442
Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG)	Sparkfun	PRT-11367
Locking Male x Female x Female Stopcock	ARK-PLAS	RCX10-GP0
Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings	Fisher scientific	14-171-129	Outer Diameter: 1/8 in. Inner Diameter: 1/16 in.
BNC male to BNC male coaxial cable	Belkin Components	F3K101-06-E
560 Ohm Resistor (5% tolerance)	Radioshack	2711116
Picospritzer	General Valve	Picospritzer II