Aplicación de la abrazadera de parche guiada por imágenes automatizada para el estudio de neuronas en cortes cerebrales

Summary

Este protocolo describe la forma de llevar a cabo automático de imágenes guiadas por pinzas de abrazadera experimentos utilizando un sistema desarrollado recientemente para estándar de equipos de electrofisiología in vitro .

Abstract

La abrazadera del remiendo de la célula entera es el método gold-standard para medir las características eléctricas de células individuales. Sin embargo, la abrazadera de parche in vitro sigue siendo una técnica desafiante y de bajo rendimiento debido a su complejidad y alta dependencia en el funcionamiento y control del usuario. Este manuscrito demuestra un sistema de abrazadera de parche automático guiado por imágenes para experimentos in vitro de clamp de parche de células enteras en cortes cerebrales agudos. Nuestro sistema implementa un algoritmo basado en la visión por computadora para detectar células marcadas fluorescentemente y para dirigirlas para un parche totalmente automático usando un micromanipulador y un control interno de la presión de la pipeta. Todo el proceso es altamente automatizado, con requisitos mínimos para la intervención humana. La información experimental en tiempo real, incluida la resistencia eléctrica y la presión interna de la pipeta, se documentan electrónicamente para análisis futuros y para la optimización a diferentes tipos de células. Aunque nuestro sistema se describe en el contexto de agudos braiN, también se puede aplicar a la abrazadera de parche guiada por imágenes automatizada de neuronas disociadas, cultivos de corte organotípico y otros tipos de células no neuronales.

Introduction

La técnica de la abrazadera del remiendo fue desarrollada por primera vez por Neher y Sakmann en los años 70 para estudiar los canales iónicos de las membranas excitables ¹ . Desde entonces, el pinzamiento de parches ha sido aplicado al estudio de muchos sujetos diferentes a nivel celular, sináptico y de circuito tanto in vitro como in vivo en muchos tipos de células diferentes, incluyendo neuronas, cardiomiocitos, ovocitos de Xenopus y liposomas artificiales ² . Este proceso implica la identificación correcta y el direccionamiento de una célula de interés, un control intrincado del micromanipulador para mover la pipeta de parche en proximidad cercana a la célula, la aplicación de presión positiva y negativa a la pipeta en el momento apropiado para establecer un parche estrecho gigaseal, Y una ruptura para establecer una configuración de parches de célula completa. La fijación del parche se realiza típicamente manualmente y requiere un entrenamiento extensivo para dominar. Incluso para un investigador experimentado con el parcheClamp, la tasa de éxito es relativamente baja. Más recientemente, se han hecho varios intentos para automatizar experimentos de parche-abrazadera. Dos estrategias principales han evolucionado para lograr la automatización: aumentar el equipo estándar de la abrazadera del remiendo para proporcionar el control automático del proceso de remiendo y el diseño de nuevo equipo y de técnicas de la tierra para arriba. La estrategia anterior es adaptable al hardware existente y puede utilizarse en una variedad de aplicaciones de abrazadera de parche, incluyendo abrazadera de parche ciego in vivo ^{3 , 4 , 5} , clamp de parche in vitro de cortes de cerebro agudo, cultivos de corte organotípico y neuronas disociadas cultivadas ⁶ . Permite la interrogación de circuitos locales complejos utilizando simultáneamente múltiples micromanipuladores ⁷ . El método de parche planar es un ejemplo de la nueva estrategia de desarrollo, que puede lograr el rendimiento simultáneo p de alto rendimientoAtch clamp de células en suspensión para fines de cribado de drogas ⁸ . Sin embargo, el método de parche plano no es aplicable a todos los tipos de células, particularmente neuronas con procesos largos o circuitos intactos que contienen conexiones extensas. Esto limita su aplicación a la cartografía de los intrincados circuitos del sistema nervioso, que es una ventaja clave de la tecnología de pinza de parche tradicional.

Hemos desarrollado un sistema que automatiza el proceso manual de la abrazadera del remiendo in vitro aumentando el hardware estándar de la abrazadera del remiendo. Nuestro sistema, Autopatcher IG, proporciona la calibración automática de la pipeta, la identificación de la blanco de la célula fluorescente, el control automático del movimiento de la pipeta, remiendo automático de la célula entera, y registro de datos. El sistema puede adquirir automáticamente múltiples imágenes de rodajas de cerebro a diferentes profundidades; Analizarlos utilizando la visión por computadora; Y extraer información, incluyendo las coordenadas de las células marcadas fluorescentemente. Esta información puede serUsado para apuntar y automáticamente parche las células de interés. El software está escrito en Python -un lenguaje de programación libre y de código abierto- que utiliza varias bibliotecas de código abierto. Esto asegura su accesibilidad a otros investigadores y mejora la reproducibilidad y el rigor de los experimentos de electrofisiología. El sistema tiene un diseño modular, de modo que el hardware adicional puede ser fácilmente interconectado con el sistema actual demostrado aquí.

Protocol

1. Configuración del sistema

1. Construir la unidad de control de presión.
   1. Monte la unidad de control de presión de acuerdo con el mapa de circuitos ( Figura 1 ). Soldar las piezas necesarias en la placa de circuito impreso (PCB) fabricada de acuerdo con los esquemas de circuitos eléctricos ( Figura 1b ). Utilice resistencias estándar, LED, Transistores de campo-Eficiencia de semiconductores de metal-óxido (MOSFET), condensadores y conectores (consulte la Tabla de materiales ). Solde las válvulas de solenoide en la PCB. Conecte la bomba de aire y el sensor de presión de aire a la PCB con un cable eléctrico.
      NOTA: La construcción de la unidad de control de presión debe tomar alrededor de 2 h con todas las piezas necesarias disponibles.
2. Conecte la tarjeta de adquisición de datos secundarios (DAQ).
   1. Conecte las salidas de datos de la placa de circuito impreso a la tarjeta DAQ, siguiendo la Tabla 1 .
      NOTA: La tarjeta de DAQ wilL estar funcionando en "Single-ended mode". El mapa de puertos se puede encontrar en el manual del usuario (ver la Tabla de Materiales ).
   2. Conecte "AIn Pr S" a uno de los canales de entrada analógica (AI) y "R-Gr" a uno de los motivos analógicos en la placa DAQ secundaria.
   3. Conecte la salida primaria del amplificador a uno de los canales AI y la tierra a la tierra analógica de la tarjeta DAQ secundaria.
      NOTA: Se puede utilizar un cable BNC estándar para conectar la salida primaria del amplificador.
   4. Desmonte el otro extremo y conecte la señal positiva ( es decir, el núcleo de cobre) al canal AI y la tierra ( es decir, el cable delgado alrededor del núcleo) a la tierra analógica. Repita este paso para un segundo canal si se utiliza más de un canal de parche.
      NOTA: La entrada analógica de la tarjeta DAQ se configurará en pasos posteriores.
   5. Conecte la alimentación a la salida de potencia de la tarjeta DAQ secundaria. Utilice una alimentación de 12 VPara la bomba.
3. Conecte el tubo.
   1. Conectar la bomba de aire y las dos válvulas de acuerdo con la Tabla 2 . Utilice un conector de 3 vías para conectar el tubo blando desde el puerto superior de la válvula 2, el sensor de presión y el soporte de la pipeta en el último paso.
   2. Añada otro conector de 3 vías al tubo conectado al soporte de la pipeta si se usan dos pipetas. Cambie manualmente entre las válvulas y las pipetas que se usan al aplicar parches.
4. Instalar el Autopatcher IG.
   NOTA: Requisitos del sistema: Autopatcher IG sólo se probó en un PC con Windows 7. No se ha validado para otros sistemas operativos. El procedimiento descrito se aplica específicamente al hardware enumerado en la Tabla de Materiales.
   1. Descargue Autopatcher-IG desde GitHub (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG).
   2. Instale Python (consulte la Tabla de materiales para la versión y la dirección de descarga).
   3. Desinstalar el PyQt4Biblioteca ", escribiendo" pip uninstall PyQt4 "en un terminal de línea de comandos.
      NOTA: El sistema utiliza una versión anterior de la biblioteca PyQt4 para lograr la compatibilidad con las bibliotecas Qwt y Opencv.
   4. Instale las bibliotecas de Python de los archivos históricos de la rueda (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). Encuentre los archivos siguientes: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none -win32.whl) y Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl).
      1. Para instalar los archivos de rueda, vaya al directorio donde se guardan los archivos y escriba "pip install *** wheelfilename ***. Whl." Sustituya "*** wheelfilename ***" con el nombre real del archivo.
         NOTA: "cp27" en el nombre de archivo de rueda indica Python 2.7 y "win32" indicó Windows de 32 bits. Si "win32" no funciona, pruebe "win64".
   5. Para controlar la cámara CCD, descargue e instale el instaladorPara 64 bits (https://www.qimaging.com/support/software/). A continuación, descargue MicroManager para 64 bits (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release) para controlar la cámara en Python.
   6. Para controlar los manipuladores y la etapa del microscopio, instale el software de control proporcionado por el fabricante.
      NOTA: Al hacer esto, también se instala el controlador necesario para controlar los manipuladores. El paquete de instalación se suministra normalmente en un CD-ROM.
   7. Para controlar la placa DAQ secundaria, instale la biblioteca universal desde el CD-ROM, que se suministra con la compra de la tarjeta DAQ.
5. Configure el hardware para Autopatcher IG.
   1. Conecte la etapa del microscopio y los controladores del manipulador a la computadora a través de los puertos USB.
   2. Asigne números de puerto COM a la unidad 0: etapa del microscopio, unidad 1: manipulador izquierdo, y unidad 2: manipulador derecho, en este orden, en el archivo de configuración "ports.csv" en la carpeta "configuration". LGuardan los otros parámetros en el archivo ports.csv ( es decir, "SCI" ​​y "1") sin cambios.
      NOTA: La información del número de puerto COM se puede encontrar ejecutando el software de configuración del manipulador proporcionado por el fabricante. Vaya a la pestaña "Configuración", seleccione "Configuración" y la página "Movimiento", y lea las etiquetas de cada ficha en la parte superior. Alternativamente, esta información se puede encontrar en el Administrador de dispositivos de PC.
   3. Asigne números de canal de entrada analógica en la tarjeta DAQ para un sensor de presión y los canales de parche 1 y 2 (correspondientes a la unidad 1 y 2). Introduzca el número de canal en el archivo "DAQchannels.csv" en la carpeta "configuration".
      NOTA: Se recomienda abrir los archivos .csv con la aplicación Bloc de notas en lugar de una hoja de cálculo, ya que puede alterar la información al guardar los cambios.
6. Ejecutar Autopatcher IG.
   1. Encienda el amplificador, el controlador del microscopio y el controlador del manipulador. EnsuQue el software del amplificador está funcionando.
   2. Ejecute Autopatcher IG con Python desde un terminal de línea de comandos de la siguiente manera: primero, cambie el directorio (comando "cd" para la mayoría de terminales comunes) donde está instalado Autopatcher IG, escriba "python Autopatcher_IG.pyw" en el terminal de línea de comandos y pulse el botón "Introducir clave.
      NOTA: No ejecute el software de control del manipulador antes de ejecutar Autopatcher IG porque ocupará la etapa del microscopio y el manipulador, haciendo que Autopatcher IG no pueda encontrar el hardware. El software de control del manipulador se puede ejecutar después de que Autopatcher IG se inicia completamente si hay módulos adicionales que se deben controlar ( por ejemplo, el calentador en línea).
7. Calibre la pipeta primaria.
   1. Tire de las pipetas de parche como se describe anteriormente ⁹ . Llenar una pipeta de vidrio con solución interna y cargarla en la cabeza.
      NOTA: Las pipetas de vidrio vacías tienen diferentes contrastesEl microscopio y puede conducir a una calibración incorrecta.
   2. Mueva la punta de la pipeta al campo visual del microscopio y póngala en foco. Si se utiliza el teclado de marcación para mover los manipuladores y / o la etapa del microscopio, actualice las coordenadas presionando "z" en el teclado.
      NOTA: Esta acción no es necesaria si el teclado (eje del microscopio: A / D - eje x, eje W / S - y, eje R / F - z, manipuladores: H / J - eje y, O / L - eje z, 1/2 - número de unidad) se utiliza para controlar el movimiento porque las coordenadas se actualizarán en tiempo real.
   3. Haga clic en el botón "Iniciar calibración" en la interfaz gráfica de usuario principal (GUI) para la unidad correspondiente en la que se carga la pipeta ( Figura 2 ).
      NOTA: Una ventana emergente aparecerá cuando finalice la calibración.
      NOTA: La calibración se llevará a cabo automáticamente, lo que tomará aproximadamente 3,5 min. Haciendo clic en el mismo botón (cambiado ahora a "cancelar calibración"Que inicia la calibración) abortará el intento de calibración.
   4. Guarde la calibración haciendo clic en "guardar calibración" en la parte inferior de la GUI principal (guarda la calibración actual para ambos manipuladores y se puede cargar en el futuro).
      NOTA: El campo de visión con una ampliación baja (4 o 10X) y alta (40X) debe estar alineado para que la calibración secundaria funcione correctamente. Consulte el manual de usuario del sistema óptico en uso para los procedimientos de alineación.

2. Procedimiento automático de la abrazadera del remiendo

1. Preparar rebanadas cerebrales agudas, como se describió anteriormente ¹⁰ .
2. Prepare pipetas de vidrio para la abrazadera de parche.
3. Coloque una rebanada de cerebro en el centro de la cámara de grabación. Estabilice la rebanada con una rebanada de sujeción, o "arpa".
4. Detectar la célula fluorescente.
   1. Encuentre el área de interés debajo de la lente 4X. Mueva la etapa del microscopio encendiendo cliCk-to-move ("CTM") y haga clic en el centro del área de interés. Alternativamente, utilice el teclado para mover la platina del microscopio (A / D - eje x, W / S - eje y, R / F - eje z).
   2. Cambie a la lente de gran aumento y ajuste el enfoque moviendo el microscopio en el eje z, usando R / F en el teclado.
      NOTA: Se recomienda ajustar el nivel del baño de agua para que el plano focal bajo las lentes de aumento alto y alto sea igual o similar en el eje z.
   3. Haga clic en el botón "Detectar celda" en la columna GUI principal, "Unidad 0." Si el LED o la fuente de luz láser de la configuración no pueden ser controlados por la señal TTL, encienda manualmente el LED / láser; Aparecerá una ventana emergente cuando se complete la detección de celdas.
      1. Apague el LED / láser si es necesario; Aparecerá una lista de coordenadas de celda en la GUI "Posiciones de memoria". Elimine las celdas no deseadas de la lista haciendo clic en el botón "X" junto a las coordenadas.
      2. Alternativamente, si las células objetivo no están marcadas con fluorescencia, haga clic en "Modo ratón" en la GUI principal. Haga clic en la celda de interés; Aparecerá un punto amarillo con un número en la celda y las coordenadas de la celda aparecerán en la GUI de "Memory positions".
5. Calibrar la pipeta secundaria.
   1. Llene 1/3 de una pipeta de vidrio con solución interna. Cargue la pipeta en el soporte de la pipeta unido a la cabeza.
   2. Utilice la lente de baja ampliación. Coloque la pipeta en el campo visual y ajuste el enfoque utilizando el teclado (H / K - eje x, U / J - eje y, eje O / L - z). Utilice "1" y "2" para cambiar entre la unidad 1 y la unidad 2.
   3. Cargue la calibración primaria haciendo clic en "Cargar calibración". Haga clic en el botón "Calibración secundaria" en la GUI principal debajo de la unidad que está en uso. Por ejemplo, si la unidad 2 está en uso, haga clic en el botón "Calibración secundaria" de laColumna Siga las instrucciones de la ventana emergente para cambiar a la lente de gran aumento.
6. Parche una célula objetivo.
   1. Asegúrese de que el software "MultiClamp" ( es decir, amplificador) esté funcionando. Haga clic en el botón "Patch control" para abrir la GUI del "Patch Control"; Puede tardar hasta unos minutos en abrir esta GUI.
   2. Utilice la lente de ampliación 40X marcando "40X" en la columna GUI principal "Unidad 0". Haga clic en el botón "ir a" situado junto a la celda de interés en la lista de coordenadas en la GUI "Memory position" (posición de memoria); El microscopio se moverá a la célula.
   3. Haga clic en el botón CTM de la unidad en uso en la GUI principal para activar el movimiento con un clic del ratón. Haga clic en la celda de interés; La punta de la pipeta se moverá a la celda.
   4. Haga clic en el botón "Parche" en la GUI "Control de parches".
      NOTA: Se iniciará el parcheo automático y se podrá controlar la presión y la resistencia enEl "Control de parches" GUI.
      1. Utilice el botón "Unidad 1 seleccionada" para cambiar la señal de entrada entre las dos unidades.
         NOTA: El sistema se aproximará a la célula objetivo, aplicará presión negativa, ajustará el potencial de la membrana celular y detectará la formación de la gigasa basándose en una serie de umbrales de presión y resistencia y lógica.
      2. Manipule el proceso automático en cualquier punto haciendo clic en los respectivos botones de la interfaz gráfica de "Control de parches". Por ejemplo, haga clic en el botón "Parche" de nuevo para cancelar la prueba de parches y haga clic en "Próxima etapa" para avanzar el proceso de parcheado al siguiente paso, independientemente del umbral.
         NOTA: Una ventana emergente notificará al usuario cuando se haya formado un gigaseal, y se presentará la opción de aplicar zap junto con una presión negativa grande.
   5. Seleccione "Sí" para romper con zap combinado y succión. Alternativamente, seleccione "No" para romper con succión solamente.
      
   6. Guarde el registro de revisiones del experimento.
      NOTA: Si una prueba de parche no tiene éxito, una ventana emergente notificará al usuario y se reiniciará el proceso de revisión.
   7. Vuelva al paso 2.4 y repita los pasos con una celda diferente.
7. Refinar los umbrales de parcheo (opcional).
   NOTA: Umbrales para el rango inicial de resistencia de la pipeta, presión positiva y negativa, resistencia gigasca, etc. Se puede modificar desde un archivo de configuración.
   1. Abra el archivo "PatchControlConfiguration.csv" en la carpeta "Configuración" en el destino donde está instalado el sistema. Cambie los números correspondientes a cada valor de umbral. No cambie los nombres de los valores; Esto resultará en entradas irreconocibles en el sistema.
   2. Implemente los nuevos valores de umbral presionando "CtRl + L "sin reiniciar el programa, al reiniciar el programa se implementará el valor de umbral más reciente del archivo.

3. Realización de grabaciones

NOTA: El modo en el amplificador de microelectrodo controlado por computadora se ajustará automáticamente a Clamp de corriente ("IC") por el software de autopatcher una vez que se ha logrado un parche exitoso. Las grabaciones de parches de parches de células enteras se pueden hacer usando el software de grabación de elección (este sistema no incluye una función de grabación). Si se identificaron varias células diana, después de terminar una grabación, vuelva al paso 2.4 y pruebe otra célula.

1. Realizar experimentos automáticos de aplicación de fármacos locales usando un picospritzer (opcional).
   NOTA: Aquí se usa un experimento de aplicación de fármaco local como un ejemplo para describir cómo usar la función adicional de "Secuencia de Comando" para controlar hardware externo a través de señales TTL.
   1. Puerto de conexión A chaNnel 0 y la tierra de la placa DAQ secundaria a la entrada de disparo de inicio en el digitalizador utilizando un cable BNC desnudo (como se describe en el paso 1.2.3). Conecte un canal de salida digital en el digitalizador al gatillo externo del picospritzer.
   2. Prepare el picospritzer de acuerdo con el manual del usuario. Conecte la salida de aire del picospritzer al soporte de la pipeta del droga-soplo unido a un micromanipulator.
   3. Cargue una pipeta llena con un medicamento de su elección. Sujételo al soporte de la pipeta. Calibre la pipeta, como se describe en el paso 1.7.
   4. Después de remendar una celda como se describe en el paso 2.6, seleccione un lugar deseado para la entrega de fármacos haciendo clic con el ratón en la GUI de vista de cámara en "modo de ratón" (cambiado desde la GUI principal). Como alternativa, utilice la GUI "Grid" para diseñar una cuadrícula, con cada píxel en la cuadrícula como una de las ubicaciones de destino.
      NOTA: La cuadrícula se puede manipular en la GUI de la vista de la cámara arrastrándola con el ratón.
   5. En el comando "Sequ, Seleccione la unidad manipuladora en la que está montada la pipeta de medicamento Haga clic en "cargar puntos de ratón" o "cargar puntos de cuadrícula" para importar todas las coordenadas para la entrega de fármacos.
      1. Haga clic en cada entrada de coordenadas para editar la señal TTL de comando específico en la columna derecha. En la primera entrada de comando, haga clic en el dígito más a la derecha para pasar de "0" a "1", enviando una señal TTL +5-V. Ajuste el tiempo (T) a la duración deseada de la señal TTL, en ms.
      2. En la segunda entrada de comando, ajuste todos los dígitos a "0" y ajuste T a la duración de la duración de grabación de la prueba. Editar comandos para todas las entradas de coordenadas. Agregue entradas de comando haciendo clic en "+" si son necesarias varias señales TTL.
         NOTA: Los bits de 8 dígitos representan los canales A del canal A 0-7 en el DAQ secundario (los puertos 1 - 3 son ocupados por la bomba y dos válvulas) si es necesario.
   6. Crear un protocolo de grabación en el módulo de adquisición deQue el inicio de un barrido es activado por el disparador de inicio externo. Edite el protocolo para entregar el medicamento en el momento deseado.
   7. En la GUI "Command Sequence", haga clic en "Ejecutar" a la izquierda para ejecutar todas las coordenadas. Alternativamente, haga clic en "Ejecutar" a la derecha para ejecutar sólo la secuencia seleccionada.
      NOTA: La pipeta se moverá a cada coordenada y ejecutará la señal TTL como se define para iniciar el barrido de grabación.

Representative Results

Nuestro sistema ha sido probado en su capacidad de parche de células en los cortes de cerebro agudo, inducida por el ratón Pluripotent Stem Cells (iPSCs) diferenciadas en neuronas, y células HEK 293 que expresan artificialmente los canales de interés. La Figura 3 muestra un experimento utilizando ratones transgénicos Thy1-ChR2-YFP (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J) dirigidos a neuronas piramidales de capa 5 marcadas fluorescentemente en la corteza visual. La célula diana fue una de las células positivas fluorescentes verdes automáticamente identificadas ( Figura 3b ). La Figura 3a es la imagen de Contraste de Interferencia Diferencial (DIC) de la neurona remendada. La configuración de células enteras se logró mediante el protocolo de parche automático en las etapas 2.5 - 2.6 y se validó mediante potenciales de acción inducidos por inyección de corriente escalonada ( Figura 3c )

1 "> Para demostrar la función adicional de" Secuencia de Comandos ", entregamos KCl 500 mM durante 200 ms a tres ubicaciones en una porción de cerebro mientras se remendaba una célula ( Figura 4 ). Primero, seleccionamos 3 posiciones en la porción del cerebro: Al cuerpo de la célula remendada y dos lejos de la célula remendada.Las coordenadas se almacenaron en la GUI de "Memory Positions" Las coordenadas se cargaron en la GUI "Command Sequence" bajo "Unit1", que era el manipulador que el KCl- En la columna izquierda se envió una señal TTL de +5 V durante 500 ms, seguido por 0 V durante 10 s ( Figura 4a ), desde el canal A del canal A en la placa DAQ secundaria, Que estaba conectada a la entrada del "disparador de inicio" del digitalizador.La figura 4c muestra que la célula remendada era una neurona de punteo regular.La pipeta de aplicación de fármaco (unidad 1) atravesó las tres localizaciones seleccionadas aUtomatically ( Figura 4b ], y hemos registrado 10 s para cada aplicación bajo tensión-abrazadera ( Figura 4d ). El color de las huellas en la figura 4d corresponde al color del borde en la figura 4b . Cuando se inhaló KCl en la célula, se observó una gran corriente interna, que disminuyó lentamente a medida que se difundió KCl. Se a~nadió colorante fluorescente rojo a la solución de KCl para indicar la distribución espacial de la liberación de fármaco y se formó una imagen utilizando DIC combinada y formación de imágenes epifluorescentes. Este experimento ilustró la facilidad y flexibilidad de nuestro sistema para controlar el movimiento del manipulador / microscopio y hardware externo a través de señales TTL.

Figura 1. Unidad de control de presión. A: Placa de circuito impreso (PCB) para conectar las válvulas, presiónSensor y bomba de aire. La izquierda muestra detalles sobre el PCB, etiquetando las ubicaciones de salidas que se mencionan en el protocolo. La derecha muestra la conexión entre la PCB y la bomba de aire, el puerto USB y la tubería. B: Mapa de circuito para el PCB. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. GUI de Autopatcher. Los botones mencionados en el protocolo se muestran en cuadrados rojos y están numerados. 1: Iniciar Calibración, 2: Guardar Calibración, 3: Calibración de Carga, 4: Calibración Secundaria, 5: Detectar Celda, 6: Control de Patch, 7: Ir a (coordenada de celda de destino) y 8: Parche. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Un Ejemplo de la Célula ChR2-YFP-posicionada Patched. A: Aumento de 40X bajo óptica DIC. B: Imagen de epifluorescencia de la misma célula en el panel A (iluminación LED a 488 nm). C: Grabaciones de pinza de corriente de la célula remendada durante una serie de inyecciones de corriente de paso hiperpolarizantes y despolarizantes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Realización de un experimento automatizado de entrega de fármacos. R: Ubicaciones seleccionadas cargadas en la GUI de "Secuencia de comandos". La columna izquierda muestraLa lista de coordenadas y la columna derecha muestra la lista de comandos en forma de señales TTL para cada ubicación. B: Capturas de pantalla durante el experimento de aplicación de fármacos correspondientes a las tres ubicaciones seleccionadas. La unidad 1 era la pipeta que contenía KCl y la unidad 2 era la pipeta de parcheo. Se mezcló la solución de KCl con un colorante fluorescente rojo con el propósito de visualización. Las imágenes se obtuvieron combinando DIC y fluorescencia. C: Paso de corriente inyecciones mostrando una neurona de punta regular. D: Grabación de voltaje registrando trazas de la aplicación local de solución de KCl 500 mM en tres lugares. El rastro rojo con corriente interna se registró desde el ensayo cuando la aplicación de KCl estaba cerca de la célula remendada. La flecha roja indica la temporización de la aplicación de KCl. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Salida en el PCB	Nombre del puerto en el directorio de DAQ	Puerto # en la tarjeta DAQ	Observación
DOUT V1	Puerto A canal 1	22	Válvula de control 1
DOUT V2	Puerto A canal 2	23	Válvula de control 2
DOUT P	Puerto A canal 3	24	Bomba de aire de control
Gramo	Suelo	29	Suelo

Tabla 1. Placa de circuito impreso (PCB) a la configuración de conexión de la tarjeta de adquisición de datos secundarios (DAQ). Utilice esta tabla para conectar las salidas de la PCB (primera columna desde la izquierda) a los puertos de la tarjeta DAQ (segunda columna desde la izquierda). El nombre y el número de puerto en el DAQ secundario se refieren al modo de un solo final.

Tabla 2. Conexiones de la tubería desde la unidad de control de presión al (los) titular (es) de la pipeta. Para cada conexión, conecte los puertos correspondientes, resaltados con una caja gris, usando tubos blandos (vea la Tabla de Materiales ).

Discussion

En este caso, se describe un método para grabar autoadhesivo guiado por imágenes autoadhesivas in vitro . Los pasos clave en este proceso se resumen de la siguiente manera. En primer lugar, la visión por ordenador se utiliza para reconocer automáticamente la punta de la pipeta utilizando una serie de imágenes adquiridas a través de un microscopio. Esta información se utiliza entonces para calcular la función de transformación de coordenadas entre el microscopio y los sistemas de coordenadas del manipulador. La visión por ordenador se utiliza para detectar automáticamente las células marcadas con fluorescencia e identificar sus coordenadas. Estos pasos se integran con la orientación por pipeta y el algoritmo de parcheado automático que utiliza el lenguaje de programación Python de código abierto, las bibliotecas PyQT y OpenCV.

En comparación con los métodos de fijación de parche in vitro existentes, este sistema hace mejoras significativas en las diversas áreas. Minimiza la intervención humana. Este sistema automatiza la mayoría de los pasos en el experimento de parche, minimizando la necesidadPara la intervención humana. Algunos de los pasos manuales restantes, incluyendo la conmutación entre las lentes de microscopio de ampliación baja / alta, se pueden automatizar usando hardware motorizado adicional.

El método de abrazadera de parche mejora el rendimiento. Los experimentos de patch-clamp utilizando este sistema lograron mayores tasas de éxito y tiempos más cortos para cada ensayo, lo que contribuyó a un aumento significativo en el rendimiento general. El algoritmo de visión por ordenador para la detección de células fluorescentes y la detección de puntas de pipeta es muy robusto, y la tasa de error fue muy baja. El error medio para la detección de la punta de la pipeta fue de 1,6 μm, y la tasa de falsos positivos para la detección de células fluorescentes fue de 4,9% ± 2,25%. Se ha realizado una comparación detallada entre el parcheo manual tradicional y el parche automático ⁶ .

La documentación detallada de los experimentos es posible. Los registros de parches de cada prueba se pueden guardar y analizar post hoc . Tales detallesLa documentación no estaba disponible anteriormente para el parche manual. Esto permite el análisis sistemático de experimentos de parche en condiciones experimentales únicas, tipos de células, especies y preparaciones de rebanadas.

Este método muestra compatibilidad con el equipo de pinza de parche estándar in vitro . Nuestro sistema, como se demuestra en este manuscrito, está diseñado para aumentar las instalaciones de fijación de parche in vitro existentes, dándoles la capacidad de realizar parches automáticos. A diferencia del método de parche planar, este sistema es adecuado para laboratorios que ya realizan pinzas manuales para convertir sus equipos a un costo mínimo. Al mismo tiempo, todavía existe la opción de parcheo manual o semiautomático usando el mismo sistema.

Debido a la adaptabilidad del sistema mencionado anteriormente, la conexión del hardware y la configuración del software es requerida por el experimentador cuando el sistema se configura por primera vez. Pueden surgir problemasDesde asignación incorrecta de puertos y bibliotecas de controladores inadecuadas para el control de ciertos equipos. Consulte los pasos 1.2 - 1.4 para solucionar problemas.

En comparación con la automatización parcial de los sistemas existentes, este sistema logra el nivel máximo de automatización en el clavado in vitro convencional de rebanadas de cerebro agudas (y otras preparaciones in vitro ). Esto es cierto para todos los pasos, desde la detección de la célula hasta la calibración de la pipeta hasta el parche ^{7 , 11} . El único cuello de botella es el proceso manual de llenar y cambiar las pipetas de parche entre los senderos. Los desarrollos recientes en la reutilización de las pipetas parche pueden resolver potencialmente este problema ¹² . Además de la calidad de la preparación de la rebanada, la razón más común para los ensayos sin éxito se origina de los errores mecánicos del manipulador y del movimiento de la rebanada en la cámara. Estas limitaciones están fuera de nuestrosistema actual. Se están haciendo esfuerzos para implementar la detección en tiempo real y control en tiempo real del movimiento de la pipeta para dar cuenta de este problema.

Para el desarrollo futuro, estamos interesados ​​en ampliar las capacidades actuales de detección de células fluorescentes a la detección general de células bajo óptica DIC.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCD Camera	QImaging	Rolera Bolt
Electrophysiology rig	Scientifica	SliceScope Pro 2000	Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is “Linlab2”.
Amplifier	Molecular Devices	MultiClamp 700B	computer-controlled microelectrode amplifier
Digitizer	Molecular Devices	Axon Digidata 1550
LED light source	Cool LED	pE-100	488 nm wavelength
Data acquisition board	Measurement Computing	USB1208-FS	Secondary DAQ. See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf
Solenoid valves	The Lee Co.	LHDA0531115H
Air pump	Virtual industry	VMP1625MX-12-90-CH
Air pressure sensor	Freescale semiconductor	MPXV7025G
Slice hold-down	Warner instruments	64-1415 (SHD-40/2)	Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm
Python	Anaconda	version 2.7 (32-bit for windows)	https://www.continuum.io/downloads
Screw Terminals	Sparkfun	PRT - 08084	Screw Terminals 3.5 mm Pitch (2-Pin)
(2-Pin)
N-Channel MOSFET 60 V 30 A	Sparkfun	COM - 10213
DIP Sockets Solder Tail - 8-Pin	Sparkfun	PRT-07937
LED - Basic Red 5 mm	Sparkfun	COM-09590
LED - Basic Green 5mm	Sparkfun	COM-09592
DC Barrel Power Jack/Connector (SMD)	Sparkfun	PRT-12748
Wall Adapter Power Supply - 12 V DC 600 mA	Sparkfun	TOL-09442
Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG)	Sparkfun	PRT-11367
Locking Male x Female x Female Stopcock	ARK-PLAS	RCX10-GP0
Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings	Fisher scientific	14-171-129	Outer Diameter: 1/8 in. Inner Diameter: 1/16 in.
BNC male to BNC male coaxial cable	Belkin Components	F3K101-06-E
560 Ohm Resistor (5% tolerance)	Radioshack	2711116
Picospritzer	General Valve	Picospritzer II