Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע אוטומטית תמונה מודרך תיקון ניסויים מהדק באמצעות מערכת שפותחה לאחרונה עבור תקן במבחנה electrophysiology ציוד.
Abstract
מהדק תיקון של כל התא הוא שיטה סטנדרטית זהב למדוד את המאפיינים החשמליים של תאים בודדים. עם זאת, במבחנה תיקון מהדק נשאר מאתגר נמוך התפוקה הטכניקה בשל המורכבות שלה ואת ההסתמכות הגבוהה על פעולת המשתמש ושליטה. כתב יד זה מדגים תמונה מודרכת אוטומטית תיקון מערכת מהדק עבור במבחנה כולו תא תיקון ניסויים מהדק פרוסות המוח חריפה. המערכת שלנו מיישמת מחשב מבוסס חזון אלגוריתם כדי לזהות תאים שכותרתו fluorescently ו למקד אותם עבור תיקון אוטומטי מלא באמצעות micromanipulator ואת השליטה הפנימית פיפטה הלחץ. התהליך כולו הוא אוטומטי מאוד, עם דרישות מינימליות להתערבות אנושית. מידע ניסיוני בזמן אמת, כולל התנגדות חשמלית ולחץ פיפטה פנימי, מתועדים בצורה אלקטרונית לניתוח עתידי ולאופטימיזציה לסוגים שונים של תאים. למרות שהמערכת שלנו מתוארת בהקשר של בריאה חריפהN הקלטות פרוסה, זה יכול גם להיות מיושם על התמונה אוטומטית מודרך תיקון מהדק של נוירונים מנותקים, תרבויות פרוסות organotypic, וסוגים אחרים של תאים שאינם נוירונים.
Introduction
הטכניקה מהדק תיקון פותחה לראשונה על ידי Neher ו Sakmann בשנות ה -70 ללמוד את הערוצים היוניים של ממברנות נרגש 1 . מאז, תיקון clamping הוחל על המחקר של נושאים שונים רבים ברמה התאית, הסינפטית והמעגלית - הן במבחנה והן ב- vivo - בסוגי תאים שונים, כולל נוירונים, קרדיומיוציטים, ביציות Xenopus וליפוזומים מלאכותיים 2 . תהליך זה כרוך זיהוי נכון ומיקוד של תא של עניין, שליטה micromanipulator מורכבים להעביר את פיפטה תיקון בקרבה לתא, היישום של לחץ חיובי ושלילי פיפטה בזמן הנכון להקים תיקון gigaseal הדוק, ואת הפריצה להקים תצורה שלמה תיקון התאים. תיקון clamping מתבצעת בדרך כלל ידני דורש הכשרה מקיפה כדי לשלוט. אפילו עבור חוקר מנוסה עם התיקוןמהדק, שיעור ההצלחה נמוך יחסית. לאחרונה, כמה ניסיונות נעשו כדי להפוך את הניסויים תיקון clamp. שתי אסטרטגיות עיקריות התפתחו כדי להשיג אוטומציה: הגדלת תקן מתקן מהדק תיקון לספק בקרה אוטומטית של תהליך התיקון ואת העיצוב של ציוד וטכניקות חדשות מהיסוד. האסטרטגיה לשעבר היא הסתגלות החומרה הקיימת ניתן להשתמש במגוון רחב של יישומים מהדק תיקון, כולל vivo עיוור תיקון מהדק 3 , 4 , 5 , מהדק תיקון במבחנה של פרוסות מוח חריפה, תרבויות פרוסה organotypic, נוירונים מנותקים תרבותית 6 . זה מאפשר חקירה של מעגלים מקומיים מורכבים באמצעות micromanipulators מרובים בו זמנית 7 . שיטת התיקון המישורית היא דוגמה לאסטרטגיית הפיתוח החדשה, אשר יכולה להשיג את התפוקה הגבוהה בו-זמניתאטך מהדק של תאים ההשעיה למטרות הסריקה תרופה 8 . עם זאת, שיטת תיקון מישורי אינו מתאים לכל סוגי התאים, במיוחד נוירונים עם תהליכים ארוכים או מעגלים שלמים המכילים חיבורים נרחבים. זה מגביל את היישום שלה כדי מיפוי מעגלים מורכבים של מערכת העצבים, המהווה יתרון מרכזי של הטכנולוגיה המסורתית תיקון מהדק.
פיתחנו מערכת אשר ממכן את תהליך הידוק תיקון הידן במבחנה על- ידי הגדלת חומרה סטנדרטי תיקון מהדק. המערכת שלנו, Autopatcher IG, מספק כיול פיפטה אוטומטי, זיהוי תא פלואורסצנטי זיהוי, שליטה אוטומטית של תנועת פיפטה, תיקון אוטומטי כל התא, ואת נתוני רישום. המערכת יכולה באופן אוטומטי לרכוש תמונות מרובות של פרוסות המוח בעומקים שונים; לנתח אותם באמצעות ראיית מחשב; ו לחלץ מידע, כולל את הקואורדינטות של תאים שכותרתו fluorescently. מידע זה יכול להיותהמשמש לכוון תאים תיקון אוטומטי של עניין. התוכנה נכתבת בפייתון - שפת תכנות חופשית וקוד פתוח - באמצעות מספר ספריות קוד פתוח. זה מבטיח נגישות שלה חוקרים אחרים ומשפר את reproducibility וקשיחות של ניסויים electrophysiology. המערכת יש עיצוב מודולרי, כך חומרה נוספת יכולה בקלות להיות interfaced עם המערכת הנוכחית הפגינו כאן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
.1 הגדרת מערכת
- לבנות את יחידת בקרת הלחץ.
- הרכב את יחידת בקרת הלחץ על פי מפת המעגל ( איור 1 ). הלחמה את החלקים הדרושים על לוח מעגלים מודפסים (PCB) המיוצרים על פי שרטוטים המעגל החשמלי ( איור 1 ב ). השתמש נגדים סטנדרטיים, נוריות, מתכת אוקסיד מוליכים למחצה שדה טרנזיסטורים EEffect (MOSFETs), קבלים, ומחברים (ראה טבלה של חומרים ). שסתומים סולנואידים הלחמה על PCB. חבר את משאבת האוויר ואת חיישן לחץ האוויר אל PCB עם חוט חשמל.
הערה: יידרשו כ- 2 שעות כדי לבנות את יחידת בקרת הלחץ, כאשר כל החלקים הדרושים יהיו זמינים.
- הרכב את יחידת בקרת הלחץ על פי מפת המעגל ( איור 1 ). הלחמה את החלקים הדרושים על לוח מעגלים מודפסים (PCB) המיוצרים על פי שרטוטים המעגל החשמלי ( איור 1 ב ). השתמש נגדים סטנדרטיים, נוריות, מתכת אוקסיד מוליכים למחצה שדה טרנזיסטורים EEffect (MOSFETs), קבלים, ומחברים (ראה טבלה של חומרים ). שסתומים סולנואידים הלחמה על PCB. חבר את משאבת האוויר ואת חיישן לחץ האוויר אל PCB עם חוט חשמל.
- חבר את רכישת הנתונים המשניים (DAQ) לוח.
- חבר את נתוני הפלט מהמעגל המודפס ללוח DAQ, לאחר טבלה 1 .
הערה: לוח ה- DAQ wilאני פועל במצב "מצב יחיד". מפת הנמל ניתן למצוא במדריך למשתמש (ראה טבלה של חומרים ). - חבר את "A PR S" לאחת מערוצי הקלט האנלוגי (AI) ו- "R-GR" לאחת מהתחומים האנלוגיים בלוח ה- DAQ המשני.
- חבר את הפלט העיקרי מהמגבר לאחד מערוצי AI ואת הקרקע לאדמה האנלוגית של לוח DAQ המשני.
הערה: ניתן להשתמש בכבל BNC סטנדרטי לחיבור הפלט הראשי מהמגבר. - הפרד את הקצה השני ולחבר את האות החיובי ( כלומר הליבה נחושת) לערוץ AI ואת הקרקע ( כלומר חוט דק סביב הליבה) לאנלוגי הקרקע. חזור על שלב זה לערוץ השני אם נעשה שימוש ביותר מערוץ תיקון אחד.
הערה: הקלט האנלוגי ללוח DAQ יוגדר בשלבים מאוחרים יותר. - חבר חשמל ליציאת הכוח של לוח ה- DAQ המשני. השתמש כוח נפרד 12 V כךלכווץ את המשאבה.
- חבר את נתוני הפלט מהמעגל המודפס ללוח DAQ, לאחר טבלה 1 .
- חבר את הצינור.
- חבר את משאבת האוויר ואת שני השסתומים לפי טבלה 2 . השתמש במחבר תלת-כיווני לחיבור הצינור הרך מהשקע העליון של השסתום, לחיישן הלחץ ולבעל פיפטה בשלב האחרון.
- הוסף עוד מחבר 3-way לצינור מחובר בעל פיפטה אם שתי טפטפות משמשים. החלף ידנית בין השסתומים לבין טפטפות בשימוש בעת תיקון.
- התקן Autopatcher IG.
הערה: דרישות המערכת: Autopatcher IG נבדק רק במחשב שבו פועל Windows 7. הוא לא אומת עבור מערכות הפעלה אחרות. ההליך המתואר חל באופן ספציפי על החומרה המפורטת בטבלה של חומרים.- הורד Autopatcher- IG מ GitHub (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG).
- התקן Python (עיין בטבלה של חומרים עבור הגרסה וכתובת ההורדה).
- הסר את PyQt4על ידי הקלדת "pip להסיר את PyQt4" במסוף שורת הפקודה.
הערה: המערכת משתמשת בגירסה ישנה יותר של ספריית PyQt4 כדי להשיג תאימות עם הספריות Qwt ו- Opencv. - התקן ספריות Python מקבצי גלגל היסטוריים (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). מצא את הקבצים הבאים: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none -win32.whl), ו Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl).
- כדי להתקין את קבצי הגלגל, עבור לספרייה שבה הקבצים נשמרים והקלד "pip install *** weelfilename *** whl." תחליף "*** wheelfilename ***" עם השם האמיתי של הקובץ.
הערה: "cp27" שם הקובץ גלגל מציין פייתון 2.7 ו "win32" ציינו Windows 32-bit. אם "win32" לא עובד, נסה "win64".
- כדי להתקין את קבצי הגלגל, עבור לספרייה שבה הקבצים נשמרים והקלד "pip install *** weelfilename *** whl." תחליף "*** wheelfilename ***" עם השם האמיתי של הקובץ.
- כדי לשלוט במצלמת CCD, הורד והתקן את תוכנית ההתקנהעבור 64 סיביות (https://www.qimaging.com/support/software/). ואז להוריד MicroManager עבור 64 סיביות (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release) כדי לשלוט על המצלמה Python.
- כדי לשלוט על המניפולטורים ואת הבמה מיקרוסקופ, להתקין את תוכנת הבקרה המסופקים על ידי היצרן.
הערה: על ידי כך, הנהג הדרוש כדי לשלוט על מניפולטורים מותקן גם. חבילת ההתקנה מסופקת בדרך כלל בתקליטור. - כדי לשלוט בלוח ה- DAQ המשני, התקן את הספרייה האוניברסלית מתקליטור, המסופק עם רכישת לוח DAQ.
- הגדר את החומרה עבור Autopatcher IG.
- חבר את הבמה מיקרוסקופ בקרי מניפולטור למחשב באמצעות יציאות USB.
- הקצאת מספרי יציאות COM ליחידה 0: שלב מיקרוסקופ, יחידה 1: מניפולטור שמאלי ויחידה 2: מניפולטור ימני, בסדר זה, בקובץ ההגדרות ports.csv בתיקייה "Configuration". LEave את הפרמטרים האחרים בקובץ ports.csv ( כלומר "SCI" ו - "1") ללא שינוי.
הערה: ניתן למצוא את מידע מספר היציאה של COM על - ידי הפעלת תוכנת תצורת מניפולטור המסופקת על - ידי היצרן. עבור אל הכרטיסייה "הגדרות", בחר "הגדרות" ואת "Motion" הדף, ולקרוא את התוויות עבור כל כרטיסייה בחלק העליון. לחלופין, מידע זה ניתן למצוא ב- PC Device Manager. - הקצה מספרי ערוץ קלט אנלוגי בלוח DAQ לחיישן לחץ וערוץ תיקון 1 ו -2 (המקביל ליחידה 1 ו -2). הזן את מספר הערוץ בקובץ "DAQchannels.csv" בתיקייה "תצורה".
הערה: מומלץ לפתוח את קובצי .csv ביישום 'פנקס רשימות' במקום בגיליון אלקטרוני, שכן הוא עשוי לשנות את המידע בעת שמירת שינויים.
- הפעל Autopatcher IG.
- הפעל את המגבר, בקר מיקרוסקופ, בקר מניפולטור. להנפיקכי תוכנת מגבר פועל.
- הפעל Autopatcher IG עם Python ממסוף שורת פקודה כדלקמן: ראשית, שנה את הספרייה (הפקודה "cd" עבור מסופים נפוצים ביותר) כאשר Autopatcher IG מותקן, הקלד "python Autopatcher_IG.pyw" במסוף שורת הפקודה, ולחץ על "Enter".
הערה: אל תפעיל את תוכנת הבקרה מניפולטור לפני הפעלת Autopatcher IG כי זה יהיה לכבוש את הבמה מיקרוסקופ מניפולטור, גורם Autopatcher IG כדי להיות מסוגל למצוא את החומרה. תוכנת מניפולטור ניתן להפעיל לאחר Autopatcher IG הוא יזם באופן מלא אם יש מודולים נוספים להיות נשלט ( למשל, תנור inline).
- לכייל את פיפטה העיקרית.
- משוך טפיחות תיקון כפי שתואר לעיל 9 . מלאו פיפטה זכוכית משוך עם פתרון פנימי לטעון אותו על הבמה הראש.
הערה: ריפודים זכוכית ריקים יש ניגודים שונים תחתהמיקרוסקופ ועשוי להוביל לכיול לא מדויק. - להזיז את קצה פיפטה לשדה הראייה מיקרוסקופ ולהביא אותו להתמקד. אם לוח החיוג משמש להעברת המניפולטורים ו / או לשלב המיקרוסקופ, עדכן את הקואורדינטות על ידי לחיצה על "z" במקלדת.
הערה: פעולה זו אינה נחוצה אם המקלדת (שלב המיקרוסקופ: A / D - x-axis, W / S - ציר y, R / F - z- ציר, מניפולטורים: H / K - x- ציר, U / ציר ה- Y, ציר ה- O / L - z, 1/2 - מספר היחידה) משמש לשליטה בתנועה, שכן הקואורדינטות יעודכנו בזמן אמת. - לחץ על "התחל כיול" כפתור בממשק המשתמש הגרפי הראשי (GUI) עבור היחידה המתאימה שבה פיפטה נטען ( איור 2 ).
הערה: חלון מוקפץ יופיע עם השלמת הכיול.
הערה: הכיול יתבצע באופן אוטומטי, אשר ייקח כ 3.5 דקות. לחיצה על אותו כפתור (עובר עכשיו "לבטל כיול" afכיול כיול) יבטל את ניסיון הכיול. - שמור את הכיול על ידי לחיצה על "שמור כיול" בתחתית GUI הראשי (זה חוסך את הכיול הנוכחי עבור שני מניפולטורים ניתן לטעון בעתיד).
הערה: שדה הראייה תחת הגדלה נמוכה (4 או 10X) וגבוה (40X) חייב להיות מיושר כדי כיול משני יפעל כהלכה. עיין במדריך למשתמש של המערכת האופטית הנמצאת בשימוש עבור הליכי היישור.
- משוך טפיחות תיקון כפי שתואר לעיל 9 . מלאו פיפטה זכוכית משוך עם פתרון פנימי לטעון אותו על הבמה הראש.
2. תיקון תיקון אוטומטי נוהל
- הכן פרוסות מוח חריפה, כפי שתואר לעיל 10 .
- הכן פיפטות זכוכית עבור מהדק תיקון.
- מקום אחד פרוסת המוח במרכז החדר ההקלטה. לייצב את הפרוסה עם פרוסה להחזיק למטה, או "נבל".
- זיהוי תא פלואורסצנטי.
- מצא את השטח של עניין תחת עדשה 4X. להזיז את הבמה מיקרוסקופ ידי הפעלת cliCk-to-Move ("CTM") ולחץ על מרכז אזור העניין. לחלופין, השתמש בלוח המקשים כדי להזיז את הבמה מיקרוסקופ (A / D - x- ציר, W / S - ציר Y, R / F - Z- ציר).
- עבור עדשה הגדלה גבוהה ולהתאים את המיקוד על ידי הזזת המיקרוסקופ בציר z, באמצעות R / F על המקלדת.
הערה: מומלץ להתאים את מפלס האמבט למים כך שמישור הפוקוס מתחת לעדשות הנמוכות והגדולות יהיה זהה או דומה בציר ה- z. - לחץ על "זיהוי תא" כפתור בעמודה GUI הראשי, "יחידה 0." אם LED או מקור אור לייזר של ההתקנה לא יכול להיות נשלט על ידי אות TTL, להפעיל ידנית את LED / לייזר; חלון מוקפץ יופיע עם סיום זיהוי התא.
- כבה את LED / לייזר במידת הצורך; רשימה של קואורדינטות תא יופיע "זיכרון עמדות" GUI. הסר תאים לא רצויים מהרשימה על ידי לחיצה על הלחצן "X" ליד הקואורדינטות.
- לחלופין, אם תאים היעד אינם שכותרתו fluorescently, לחץ על "מצב עכבר" על GUI הראשי. לחץ על התא של עניין; נקודה צהובה עם מספר יופיע על התא, ואת הקואורדינטות של התא יופיעו "זיכרון עמדות" GUI.
- לכייל את פיפטה משנית.
- ממלאים 1/3 של פיפטה זכוכית עם פתרון פנימי. טען את פיפטה על בעל פיפטה המצורפת לשלב הראש.
- השתמש בעדשה בהגדלה נמוכה. להביא את פיפטה לשדה החזותי ולהתאים את המיקוד באמצעות לוח המקשים (H / K - x-axis, U / J- ציר Y, O / L - Z- ציר). השתמשו ב- "1" ו- "2" כדי לעבור בין יחידה 1 ליחידה 2.
- טען את הכיול הראשי על ידי לחיצה על "טען כיול". לחץ על הלחצן "כיול משני" ב- GUI הראשי מתחת ליחידה הנמצאת בשימוש. לדוגמה, אם יחידה 2 נמצאת בשימוש, לחץ על הלחצן "כיול משני" ביחידה "Unit 2"לום. בצע את הוראות החלון המוקפץ כדי לעבור לעדשה בהגדלה גבוהה.
- תיקון תא מטרה.
- ודא כי "MultiClamp" ( כלומר מגבר) התוכנה פועלת. לחץ על כפתור "בקרת תיקון" כדי לפתוח את "בקרת תיקון" GUI; זה עלול לקחת עד כמה דקות כדי לפתוח את GUI.
- השתמש בעדשה הגדלה 40X על ידי סימון "40X" בעמודה GUI "יחידה 0" הראשי. לחץ על "עבור" כפתור ליד התא עניין על רשימת קואורדינטות ב "מיקום זיכרון" GUI; המיקרוסקופ יעבור לתא.
- לחץ על כפתור CTM של היחידה בשימוש ב- GUI הראשי כדי לאפשר תנועה לאחר לחיצה על העכבר. לחץ על התא של עניין; קצה פיפטה יעבור לתא.
- לחץ על כפתור "תיקון" על "בקרת תיקון" GUI.
הערה: יתבצע תיקון אוטומטי, וניתן לפקח על הלחץ וההתנגדותאת "בקרת תיקון" GUI.- השתמש בלחצן "יחידה 1 שנבחרה" כדי להחליף את אות הכניסה בין שתי היחידות.
הערה: המערכת תתקרב לתא המטרה, תפעיל לחץ שלילי, תתאים לפוטנציאל הממברנה של התא ותזהה את היווצרות הגיגסאל על בסיס סדרה של לחץ וסף התנגדות והיגיון. - לתפעל את התהליך האוטומטי בכל נקודה על ידי לחיצה על הכפתורים המתאימים על "בקרת תיקון" GUI. לדוגמה, לחץ על כפתור "תיקון" שוב כדי לבטל את תיקון התיקון ולחץ על "השלב הבא" כדי לקדם את תהליך התיקון לשלב הבא, ללא קשר לסף.
הערה: חלון מוקפץ יודיע למשתמש כאשר נוצר gigaseal, ואת האפשרות להחיל zap יחד עם לחץ שלילי גדול יוצגו.
- השתמש בלחצן "יחידה 1 שנבחרה" כדי להחליף את אות הכניסה בין שתי היחידות.
- בחר "כן" כדי לפרוץ עם zap בשילוב יניקה. לחלופין, בחר "לא" כדי לפרוץ עם יניקה בלבד.
- שמור את יומן התיקון לניסוי.
הערה: אם ניסיון תיקון אינו מצליח, חלון מוקפץ יודיע למשתמש ותהליך האיפוס יאופס. - חזור לשלב 2.4 וחזור על השלבים בתא אחר.
- צמצם את סף התיקון (אופציונלי).
הערה: סף עבור טווח התנגדות פיפטה הראשונית, לחץ חיובי ושלילי, התנגדות gigaseal, וכו ' . ניתן לשנות מקובץ תצורה.- פתח את הקובץ "PatchControlConfiguration.csv" בתיקייה "תצורה" ביעד שבו המערכת מותקנת. שנה את המספרים המתאימים לכל ערך סף. אל תשנה את שמות הערכים; פעולה זו תביא לרשומות בלתי מזוהות במערכת.
- ליישם את ערכי הסף החדש מיד על ידי לחיצה על "CtRl + L "ללא הפעלה מחדש של התוכנית, הפעלה מחדש של התוכנית תיישם את ערך הסף החדש מהקובץ.
3. ביצוע הקלטות
הערה: מצב מגבר microelectrode נשלט על ידי המחשב ייקבע באופן אוטומטי ל - Clamp Current ("IC") על ידי תוכנת autopatcher לאחר תיקון מוצלח הושגה. כל תא תיקון קליפות הקלטות יכול להיעשות באמצעות תוכנת הקלטה של בחירה (מערכת זו אינה כוללת פונקציית הקלטה). אם זיהו מספר תאי מטרה, לאחר סיום ההקלטה, חזרו לשלב 2.4 ונסו תא אחר.
- בצע ניסויים אוטומטיים של התרופה המקומית באמצעות picospritzer (אופציונלי).
הערה: כאן, ניסוי מקומי יישום סמים משמש כדוגמה כדי לתאר כיצד להשתמש בפונקציה "רצף פקודה" נוספת כדי לשלוט בחומרה חיצונית באמצעות אותות TTL.- התחבר יציאה ChaNel 0 והאדמה בלוח ה - DAQ המשני לקלט ההתחלה של ה - digitizer באמצעות כבל BNC חשוף (כמתואר בשלב 1.2.3). חיבור אחד ערוץ הפלט הדיגיטלי על digitizer ההדק חיצוני על picospritzer.
- הכן את picospritzer בהתאם להוראות השימוש. חבר את יציאת האוויר picospritzer לבעלים פיפטה סם התרופה המצורפת micromanipulator.
- טען פיפטה מלא סמים של בחירה. צרף אותו מחזיק פיפטה. לכייל את פיפטה, כמתואר בשלב 1.7.
- לאחר תיקון של תא כמתואר בשלב 2.6, בחר את המיקום הרצוי עבור משלוח סמים על ידי לחיצה על העכבר בתצוגה המצלמה GUI תחת "מצב העכבר" (מנותק מן GUI הראשי). לחלופין, השתמש "רשת" GUI לעיצוב רשת, עם כל פיקסל ברשת כאחד המיקומים היעד.
הערה: הרשת יכולה להיות מניפולציה במצלמה להציג GUI על ידי גרירת עם העכבר. - ב "פקודה Sequ, בחר את יחידת מניפולטור כי פיפטה סמים הוא רכוב על לחץ "לטעון נקודות העכבר" או "נקודות לטעון רשת" לייבא את כל הקואורדינטות עבור משלוח סמים.
- לחץ על כל ערך קואורדינטות כדי לערוך את הפקודה הספציפית TTL הפקודה בעמודה הימנית. בפקודה הראשונה, לחץ על הספרה הימנית ביותר כדי להפוך אותה מ "0" ל "1," שליחת אות 5 + V TTL. הגדר את הזמן (T) למשך האות הרצוי של TTL, ב- ms.
- בפקודת הפקודה השנייה, הגדר את כל הספרות ל - "0" והגדר את T למשך משך ההקלטה של הניסוי. עריכת פקודות עבור כל ערכי הקואורדינטות. הוספת ערכי פקודה על ידי לחיצה על "+" אם יש צורך במספר אותות TTL.
הערה: הספרות של 8 הספרות מייצגות יציאת ערוצים 0-7 על ה - DAQ המשני (יציאות 1 - 3 נמצאות על ידי המשאבה ושני שסתומים) ניתנות לשינוי, אם יש צורך.
- יצירת פרוטוקול ההקלטה במודול רכישת נתונים כךכי ההתחלה של מטאטא מופעלת על ידי מפעיל מפעיל חיצוני. ערוך את הפרוטוקול כדי לספק את התרופה בזמן הרצוי.
- ב "רצף פקודות" GUI, לחץ על "הפעלה" בצד שמאל כדי להפעיל את כל הקואורדינטות. לחלופין, לחץ על "הפעלה" בצד שמאל כדי להפעיל רק את הרצף שנבחר.
הערה: פיפטה יעבור לכל קואורדינטה ולבצע את אות TTL כהגדרתו כדי להתחיל את ההקלטה להקליט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המערכת שלנו נבדקה על היכולת שלה תיקון תאים פרוסות מוח חריפה, עכבר המושרה Pluripotent תאי גזע (iPSCs) מובחנת לנוירונים, ו HEK 293 תאים באופן מלאכותי להביע ערוצים של עניין. איור 3 מראה ניסוי באמצעות Thy1-ChR2-YFP עכברים מהונדסים (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J) מיקוד fluorescently שכותרתו שכבת 5 נוירונים פירמידליים בקליפה החזותית. תא המטרה היה אחד זיהו אוטומטית תאים ירוקים חיובי ניאון ( איור 3 ב ). איור 3 א הוא דיפרנציאלי התערבות ניגודיות (DIC) תמונה של נוירון טלאים. תצורת כל התא הושג על ידי פרוטוקול תיקון אוטומטי צעדים 2.5-2.6 ו תוקף על ידי הזרקת הזרם הנוכחי המושרה פוטנציאל פעולה ( איור 3 ג )
1 "> כדי להדגים את הפונקציה" רצף פקודה "נוספת, סיפקנו 500 מ"מ KCl עבור 200 ms לשלושה מיקומים על פרוסת המוח בזמן תיקון הטלאי ( איור 4 ). ראשית, בחרנו 3 מיקומים על פרוסת המוח: אחד סגור אל גוף התא המצולק ושניים רחוקים מהתא המוקפא.הקואורדינטות מאוחסנות בממשק הגרפי של "Memory Position" GUI. הקואורדינטות הועמסו ל GUI "Command Sequence" תחת "Unit1", שהיה המניפולטור שה- KCl- המכיל פיפטה המכילה רכוב על.אנו להגדיר את הפקודות בעמודה השמאלית לשלוח אות 5 + V TTL עבור 500 ms, ואחריו 0 V במשך 10 שניות ( איור 4 א ), מן יציאה ערוץ 0 על לוח DAQ משני, אשר היה מחובר קלט "התחל גורם" digitizer איור 4c מראה כי התא תוקנו היה נוירון spiking רגיל.הפיפטה יישום סמים (יחידה 1) חצה את שלושת המיקומים שנבחרו אבאופן אוטומטי ( איור 4 ב ), והקלטנו 10 שניות עבור כל יישום תחת מתח מהדק ( איור 4 ד ). צבע העקבות באיור 4 ד מתאים לצבע הגבול בתרשים 4 ב . כאשר KCl היה נפוח על התא, זרם פנימי גדול שנצפתה, אשר הלך ופחת לאט כמו KCl מתפזרת. צבע פלואורסצנטי אדום נוסף לפתרון KCl כדי לציין את ההתפלגות המרחבית של מסירת התרופה, והוא צילם באמצעות הדמיה משולבת DIC ו- epifluorescent. ניסוי זה אייר את הקלות והגמישות של המערכת שלנו כדי לשלוט בתנועה מניפולטור / מיקרוסקופ וחומרה חיצונית באמצעות אותות TTL.
איור 1. יחידת בקרת לחץ. A: מעגל מודפס Board (PCB) לחיבור שסתומים, לחץחיישן, משאבת אוויר. משמאל מראה פרטים על PCB, תיוג מיקומים של פלטי המוזכרים בפרוטוקול. הימין מראה את החיבור בין PCB לבין משאבת אוויר, יציאת USB, ואת הצינור. B: מפת מעגל עבור PCB. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. Autopatcher GUI. הלחצנים שהוזכרו בפרוטוקול מוצגים בריבועים אדומים וממוספרים. 1: כיול כיול, 2: כיול כיול, 3: כיול עומס, 4: כיול משני, 5: זיהוי תא, 6: בקרת תיקון, 7: עבור אל (יעד תא תיאום), ו 8: תיקון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. דוגמה של תא CHR2-YFP חיובי טלאים. A: הגדלה 40X תחת אופטיקה DIC. B: תמונה Epifluorescence של אותו תא בלוח A (תאורת LED ב 488 ננומטר). C: ההקלטה הנוכחית הקלטות מן התא טלאים במהלך סדרה של hyperpolarizing ו depolarizing צעד זריקות הנוכחי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. ביצוע ניסוי אוטומטי משלוח סמים. ת: מיקומים נבחרים נטענים ל "רצף פקודות" GUI. העמודה השמאלית מראה את רשימת הקואורדינטות, ואת העמודה הימנית מציגה את רשימת פקודות בצורה של אותות TTL עבור כל מיקום. ב ': צילומי מסך במהלך הניסוי ליישומי סמים המתאימים לשלושת המיקומים שנבחרו. יחידה 1 היה פיפטה המכיל KCl ו יחידה 2 היה פיפטה תיקון. הפתרון KCl היה מעורבב עם צבע פלואורסצנטי אדום לצורך הדמיה. התמונות הושגו על ידי שילוב של DIC ו הדמיה פלואורסצנטי. C: הזרקת הזרם הנוכחי מראה נוירון קבוע spiking. D: מתח הקלטה מהדק עקבות מיישום מקומי של 500 מ"מ פתרון KCl ב שלושה מקומות. עקבות אדום עם הזרם פנימה נרשם מן הניסוי כאשר יישום KCl היה קרוב לתא טלאים. החץ האדום מציין את התזמון של יישום KCl. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
| מוצא על PCB | שם היציאה בלוח ה- DAQ | יציאה # על לוח DAQ | הֶעָרָה |
| DOUT V1 | ערוץ ערוץ 1 | 22 | שסתום בקרה 1 |
| DOUT V2 | ערוץ ערוץ 2 | 23 | שסתום בקרה 2 |
| ד | ערוץ ערוץ 3 | 24 | בקרת משאבת אוויר |
| Gr | קרקע, אדמה | 29 | קרקע, אדמה |
טבלה 1. מודפס מועצת המעגלים (PCB) כדי רכישת נתונים משנית (DAQ) תצורת חיבור הלוח. השתמש בטבלה זו לחיבור יציאות PCB (העמודה הראשונה משמאל) ליציאות בלוח ה- DAQ (העמודה השנייה משמאל)). שם היציאה ומספר ה- DAQ המשני מתייחסים למצב חד-פעמי.
טבלה 2. חיבורי חיבורים מיחידת בקרת לחץ למחזיקי פיפטה. עבור כל חיבור, חבר את היציאות המתאימות, מסומן בקופסה אפורה, תוך שימוש בצינור רך (ראה טבלת החומרים ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מתארים שיטה אוטומטית התמונה מונחה תיקון קלימפ הקלטות במבחנה . השלבים העיקריים בתהליך זה מסוכמים כדלקמן. ראשית, ראיית מחשב משמש באופן אוטומטי לזהות את קצה פיפטה באמצעות סדרה של תמונות שנרכשו באמצעות מיקרוסקופ. מידע זה משמש לאחר מכן לחשב את הפונקציה שינוי הקואורדינטות בין המיקרוסקופ לבין מערכות לתאם מניפולטור. ראיית מחשב משמש באופן אוטומטי לזהות תאים שכותרתו fluorescently כדי לזהות את הקואורדינטות שלהם. שלבים אלה משולבים עם מיקוד פיפטה ואלגוריתם תיקון אוטומטי באמצעות שפת קוד פתוח שפת Python, PyQT, וספריות OpenCV.
לעומת הקיים במבחנה תיקון שיטות מהדק, מערכת זו עושה שיפורים משמעותיים במספר תחומים. זה מקטין את ההתערבות האנושית. מערכת זו ממכן את רוב הצעדים של הניסוי מהדק תיקון, למזער את reqUirement עבור התערבות אנושית. חלק מהשלבים הידניים הנותרים, כולל מעבר בין עדשות המיקרוסקופ נמוכות / גבוהות, יכולות להיות אוטומטיות תוך שימוש בחומרה ממונעת נוספת.
שיטת תיקון המדבקת משפרת את התפוקה. ניסויים של תיקון Clamp באמצעות מערכת זו השיגו שיעורי הצלחה גבוהים יותר וזמנים קצרים יותר עבור כל ניסוי, דבר שתרם לעלייה משמעותית בתפוקה הכוללת. אלגוריתם חזון המחשב עבור זיהוי תא ניאון זיהוי קצה פיפטה הוא חזק מאוד, ושיעור השגיאה היה נמוך מאוד. השגיאה הממוצעת עבור איתור קצה פיפטה היה 1.6 מיקרומטר, ושיעור חיובי שקר עבור זיהוי תא ניאון היה 4.9% ± 2.25%. השוואה מפורטת בין תיקון ידני מסורתי לבין תיקון אוטומטי נעשה 6 .
תיעוד מפורט של ניסויים אפשרי. תיקון יומנים של כל משפט ניתן לשמור ולנתח פוסט הוק . כאלה מפורטיםתיעוד לא היה זמין בעבר עבור תיקון ידני. זה מאפשר ניתוח שיטתי של ניסויים תיקון בתנאים ניסויים ייחודיים, סוגי תאים, מינים, ההכנות פרוסה.
שיטה זו מראה תאימות עם תקן במבחנה תיקון מתקן מהדק. המערכת שלנו, כפי שהוכח בכתב היד הזה, נועד להגדיל את הקיים במבחנה מהדק קלאס תיקון, נותן להם את היכולת לבצע תיקון אוטומטי. שלא כמו הגישה התיקון מישורי, מערכת זו מתאימה למעבדות כבר ביצוע תיקון הידוק קלמפינג כדי להמיר את הציוד שלהם במחיר מינימלי. יחד עם זאת, עדיין יש אפשרות לתקן באופן ידני או חצי אוטומטי באופן אוטומטי באמצעות אותה מערכת.
בגלל יכולת ההסתגלות של המערכת שהוזכרה לעיל, חיבור החומרה והתצורה של התוכנה נדרש על ידי הנסיין כאשר המערכת מוגדרת בפעם הראשונה. בעיות עלולות לגרוםממשימות יציאה שגויות וספריות מנהלי התקנים לא מתאימות עבור בקרת חומרה מסוימת. עיין בצעדים 1.2 - 1.4 בעת פתרון בעיות.
לעומת אוטומציה חלקית של מערכות קיימות, מערכת זו משיגה את הרמה המקסימלית של אוטומציה קונבנציונאלי במבחנה תיקון clamping של פרוסות המוח חריפה (ותכשירים אחרים במבחנה ). זה נכון עבור כל השלבים, החל זיהוי התא כדי כיול פיפטה כדי תיקון 7 , 11 . צוואר הבקבוק היחיד הוא תהליך ידני של מילוי ושינוי טפיחות תיקון בין שבילים. ההתפתחויות האחרונות בשימוש חוזר של טפיחות תיקון יכול לפתור את הבעיה הזאת 12 . מלבד איכות הכנה פרוסה, הסיבה הנפוצה ביותר עבור ניסויים מוצלחים נובע מניפולטור שגיאות מכניות התנועה של הפרוסה בחדר. מגבלות אלה הן מעבר לשליטתנוהמערכת הנוכחית. המאמצים נעשים כדי ליישם קרוב לולאה, בזמן אמת איתור ובקרה של תנועת פיפטה כדי להסביר את הבעיה.
לפיתוח עתידי, אנו מעוניינים להרחיב את יכולות זיהוי התא הנוכחי ניאון לזיהוי התא הכללית תחת אופטיקה DIC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
בקשה לפטנט לא זמני "מערכות ושיטות לאוטומציה ממוחשבת של תיקון אלקטרומגנטי אוטומטי ב- VITRO," מס 'קטלוגי: 15 / 353,719 בארה"ב, הוגש ב -16 בנובמבר 2016, Ref. לא. PRF 67270-02.
Acknowledgments
אנו אסירי תודה על התמיכה הכספית של קרן וייטהול. ברצוננו להודות לסמואל ט 'קיסינג'ר על ההערות החשובות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CCD Camera | QImaging | Rolera Bolt | |
| Electrophysiology rig | Scientifica | SliceScope Pro 2000 | Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is “Linlab2”. |
| Amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | computer-controlled microelectrode amplifier |
| Digitizer | Molecular Devices | Axon Digidata 1550 | |
| LED light source | Cool LED | pE-100 | 488 nm wavelength |
| Data acquisition board | Measurement Computing | USB1208-FS | Secondary DAQ. See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf |
| Solenoid valves | The Lee Co. | LHDA0531115H | |
| Air pump | Virtual industry | VMP1625MX-12-90-CH | |
| Air pressure sensor | Freescale semiconductor | MPXV7025G | |
| Slice hold-down | Warner instruments | 64-1415 (SHD-40/2) | Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm |
| Python | Anaconda | version 2.7 (32-bit for windows) | https://www.continuum.io/downloads |
| Screw Terminals | Sparkfun | PRT - 08084 | Screw Terminals 3.5 mm Pitch (2-Pin) |
| (2-Pin) | |||
| N-Channel MOSFET 60 V 30 A | Sparkfun | COM - 10213 | |
| DIP Sockets Solder Tail - 8-Pin | Sparkfun | PRT-07937 | |
| LED - Basic Red 5 mm | Sparkfun | COM-09590 | |
| LED - Basic Green 5mm | Sparkfun | COM-09592 | |
| DC Barrel Power Jack/Connector (SMD) | Sparkfun | PRT-12748 | |
| Wall Adapter Power Supply - 12 V DC 600 mA | Sparkfun | TOL-09442 | |
| Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG) | Sparkfun | PRT-11367 | |
| Locking Male x Female x Female Stopcock | ARK-PLAS | RCX10-GP0 | |
| Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings | Fisher scientific | 14-171-129 | Outer Diameter: 1/8 in. Inner Diameter: 1/16 in. |
| BNC male to BNC male coaxial cable | Belkin Components | F3K101-06-E | |
| 560 Ohm Resistor (5% tolerance) | Radioshack | 2711116 | |
| Picospritzer | General Valve | Picospritzer II |
References
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Collins, M. D., Gordon, S. E. Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology. J Vis Exp. (76), (2013).
- Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).
- Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice. J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).
- Kodandaramaiah, S. B., et al. Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo. Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).
- Wu, Q., et al. Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro. J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).
- Perin, R., Markram, H. A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system. J Vis Exp. (80), e50630 (2013).
- Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip. Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), (2008).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S.
- Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research. Front Neuroinform. 8 (3), (2014).
- Kolb, I., et al. Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse. Sci Rep. 6, (2016).
