Summary
Här beskriver vi en metod som kombinerar i situ MHC-tetramer färgning med immunohistokemi att bestämma localizationen, fenotyp och kvantitet av antigen-specifika T-celler i vävnader. Detta protokoll används för att bestämma de rumsliga och fenotypiska egenskaperna av antigen-specifika CD8 T-celler i förhållande till andra celltyper och strukturer i vävnader.
Abstract
T-celler är kritiska till många immunologiska processer, inklusive att upptäcka och eliminera virus-infekterade celler, att förhindra autoimmunitet, bistå i B-cell och plasma-cell produktion av antikroppar, och att upptäcka och eliminera cancerceller. Utvecklingen av MHC-tetramer färgning av antigen-specifika T-celler som analyseras med flödescytometri har revolutionerat vår förmåga att studera och förstå immunobiology av T-celler. Medan extremt användbart för att bestämma kvantiteten och fenotyp av antigen-specifika T-celler, kan inte flödescytometri avgöra den rumsliga lokaliseringen av antigen-specifika T-celler till andra celler och strukturer i vävnader och nuvarande områdesindelningen tekniker för att extrahera T behövs celler för flödescytometri har begränsad effekt i icke-lymfoida vävnader. In situ MHC-tetramer färgning (IST) är en teknik för att visualisera T-celler som är specifika för antigener av intresse i vävnader. I kombination med immunhistokemi (IHC), kan IST bestämma överflöd, plats och fenotyp av antigen-specifika CD8 och CD4 T-celler i vävnader. Här beskriver vi ett protokoll för att fläcken och räkna upp antigen-specifika CD8 T-celler, med specifika fenotyper ligger inom specifika vävnad fack. Dessa förfaranden är detsamma som vi använde i vår senaste publikation av Li et al., med titeln ”Simian Immunodeficiency Virus-producerande celler i folliklar undertrycks delvis av CD8+ celler In Vivo.” De metoder som beskrivs är i stort sett tillämpliga eftersom de kan användas för att lokalisera, fenotyp och kvantifiera i huvudsak alla antigen-specifika CD8 T-cell som MHC tetramers finns, i alla vävnader.
Introduction
T-celler är kritiska till många immunologiska processer, inklusive att upptäcka och eliminera virus-infekterade celler, att förhindra autoimmunitet, bistå i B-cell och plasma-cell produktion av antikroppar, och att upptäcka och eliminera cancerceller. Utvecklingen av peptid/MHC klass I tetramer färgning av antigen-specifika CD8 T-celler1 och senare utveckling av MHC klass II tetramer färgning av CD4 T celler2 av flödescytometri revolutionerat vår förmåga att studera och förstå de Immunobiology av T-celler. Medan extremt användbart för att bestämma kvantiteten och fenotyp av antigen-specifika T-celler, tillåter flödescytometri inte för detektion av rumsliga localizationen av antigen-specifika T-celler till andra celler och strukturer i vävnader, och nuvarande områdesindelningen tekniker att extrahera T-cellerna behövs för flödescytometri har begränsad effekt i icke-lymfoida vävnader3.
Vi och andra har utvecklat metoder som använder peptid-loaded MHC klass I och klass II tetramer eller multimer reagens för att färga antigen-specifika CD8 och CD4 T-celler i vävnader4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. dessa IST metoder för bestämning av plats, överflöd och fenotyp av antigen-specifika CD8 och CD4 T-celler i vävnader och ge ett medel för att upptäcka dessa celler i förhållande till andra celler och strukturer i vävnaderna. Vår grupp har i stor utsträckning används MHC-jag tetramer färgning för att studera humant immunbristvirus (HIV)- och simian immunodeficiency virus (SIV) - specifika CD8 T-celler i lymfatisk, genitala och rektal vävnader för att få en förståelse för HIV och SIV immunpatogenes och för att identifiera korrelerar lyckad vaccination strategier14,15,16,17. Dessutom kan utvecklat vi också en teknik som kombinerar IST med i situ hybridisering (ISH) för att lokalisera och kvantifiera virus-specifika CD8 T-celler och virus-infekterade celler i vävnader och effektor-to-target i vivo halter 18 , 19.
Här beskriver vi ett protokoll som använder peptid-loaded MHC-jag tetramers att fläcken antigen-specifika CD8 T-celler i färsk vävnad sektioner, till motfärg vävnader med IHC, och kvantifiera celler med specifika fenotyper i vävnad fack. Dessa förfaranden är samma som användes i vår senaste publikation av Li et al., där vi bestämt läge, överflöd, och fenotyp av SIV-specifika T-celler i lymfatisk vävnad under kronisk SIV infektion i makaker20.
För detta förfarande, färska vävnader är sektioneras och inkuberas över natten med peptid-loaded MHC-jag tetramers konjugerat med fluorescein kaliumtiocyanat molekyler (FITC). De är sedan fast i PARAFORMALDEHYD. Efter fastställande av vävnaden, förstärks signalen från de MHC-tetramers med kanin anti-FITC antikroppar och inkuberas med fluorescently märkta anti-kanin IgG-antikroppar, som ytterligare förstärker signalen från de bundna tetramers. IHC används i samband med IST för att karakterisera antigen-specifika T-celler och omgivande celler. Antikroppar som känner igen epitoper på ytan av celler eller i extracellulära ingår i den primära inkubationen med tetramers. Antikroppar som känner igen intracellulära epitoper kräver genomträngning av cellväggen före färgning. De färgade vävnadssnitt är avbildade med confocal Mikroskop och analyseras med hjälp av confocal programvara. Märkt celler är kvantifierade använder konfokalmikroskopi programvara eller ImageJ. Protokollet beskrivs kan användas för att färga i huvudsak en antigen-specifika CD8 T cell i vilken vävnad för vilka MHC-jag tetramers är tillgängliga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dag 1: färsk vävnad snittning och primära inkubation
- använda en skalpell skär färsk vävnad i små (ca 0,5 cm bred av 0,5 cm lång) bitar. Separat limma varje vävnad till en kolv och bädda in dem med 3-5 mL 4% låg-smälta agarosen i PBS. Märka kolven med vävnad informationen med hjälp av ett klistermärke. Lägg den i en kyld hållare i en ishink stelna.
- Slå på mikrotomen och Ställ in tjockleken på avsnitten till 200 µm. Installera ett rakblad på mikrotomen och kolven monterad med vävnad i mikrotomen badet.
- Förbereda fosfatbuffrad saltlösning med heparin (PBS-H) genom att lägga till 100 µg/mL eller 18,7 U/mL heparin PBS att bevara RNA och tillåta potentiella ISH applikationer nedströms. Fyll mikrotomen badet, täcka inbäddade vävnaden, med 100-120 mL av kylda, sterila PBS-H. Lägga till PBS-H isbitar i badet att hålla temperaturen vid 0 - 2 ° C. Start mikrotomen och skära vävnaden i 200 µm sektioner.
Obs: Det är viktigt att hålla vävnader kyld på is att minimera cellulär aktivitet i vävnader och eftersom färsk vävnad är lättare att avsnitt när det kyls. PBS ensam kan användas om det finns inga planer för nedströms ISH. - Alternativt för vävnader som inte skär bra med en mikrotom (t.ex. tarm och lunga), Använd en skalpell eller rakblad för att skära vävnaden i tunna strimlor som nära som möjligt till 200 µm.
- Etikett locket på 24-väl vävnadsodling plattor med den experimentella exempelinformation och placera vävnad kamrarna i motsvarande brunnarna. Använd en pensel att överföra avsnitten till en vävnad kammare som i brunnen av en 24-väl vävnadsodling tallrik innehållande 1 mL kylt PBS-H.
Obs: Återanvändbara vävnad chambers bör göras innan färgning. Vävnaden kammare kan göras med en 14 mL polypropylen runda-botten snapin-cap tube och ståltrådsnät. Använda ett vasst rakblad avskurna botten av en 14 mL polypropylen runda-botten snapin-cap tube. Skär trådnät i en cirkel för att passa i hålet på botten av röret. Värme wire mesh cirkeln med en bunsenbrännare tills det är glödhet. Fastställs av wire mesh cirkeln mycket snabbt och skjut röret på mesh. Kontrollera att trådnät är ordentligt ansluten till botten av röret och sedan försiktigt skära av toppen av röret vid 3 mL märket med ett vasst rakblad. Sätta upp till 3 vävnadssnitt in varje vävnad kammaren, eller upp till 1 cm 2 vävnad per brunn. Hålla minst en tom brunn mellan brunnarna med olika antikroppar kombinationer för att undvika korskontaminering. - Fortsätt till primär tetramer och antikropp färgning omedelbart efter avslutat överföringen av alla skära sektioner in i vävnader kamrarna. Hålla avsnitten nedsänkt och kylda i 1 mL PBS-H vid alla tidpunkter.
- Inkubera avsnitten vävnad över natten med 0,5 µg/mL FITC-konjugerad, peptid-lastat MHC-jag tetramers utspädd i PBS-H med 2% normala get serum (NGS). Inkluderar musen eller andra icke-kanin antikroppar riktade mot extracellulära epitoper av intresse i denna inkubation (t.ex. råtta anti-CD8 antikroppar utspädd 1: 500 i PBS-H med 2% NGS). Placera 1 mL utspädd antikroppar i varje brunn.
Obs: Bör vara försiktig när du väljer CD8 antikroppar, som vissa kan förbättra och några kan hämma MHC tetramers bindande till T-cell receptorer 4 , 21. Rat mot mänskliga CD8 antikroppen beskrivs här är instabil och ibland resulterar i något svag färgning. Det används här för trippel märkning eftersom det är den enda icke-kaninen och icke-mus CD8 antikropp testade att färgade rhesus makaker CD8 T-celler. - Använd 1 mL lösning per brunn för primär antikropp och alla efterföljande inkubationer och utföra detta och alla efterföljande inkubationer vid 4 ° C, med plattorna på en gungande plattform.
Obs: Vävnader ska flyta fritt i kammaren.
2. Dag 2: Fixering och sekundära inkubation
- efter den primära inkubationen, tvätta i avsnitt två gånger med 1 mL av kylda PBS-H för 20 min varje tvätt. Gör detta genom att överföra vävnad avdelningar till en annan 24-väl vävnadsodling tallrik innehållande 1 mL kylt PBS-H i motsvarande brunnarna.
Obs: Var noga med att inte droppa innehållet från en experimental prov till en annan när du flyttar mellan vävnad chambers. För alla efterföljande inkubationer och tvättar, på samma sätt överföra vävnad kammaren till en ren tallrik som innehåller en lämplig lösning. Var noga med att övervaka avsnitten i vävnad kamrarna under förfarandet för att kontrollera att avsnitten inte fastnar på sidorna av vävnad kamrarna. Om de gör, driva dem tillbaka i lösningen. - Fixa avsnitten med 1 mL färsk PBS-buffrat 4% PARAFORMALDEHYD för 2 h i rumstemperatur (inte över fixa). Tvätta med kallt PBS-H två gånger för 5 min.
Varning: PARAFORMALDEHYD är giftiga; Använd lämplig personlig skyddsutrustning.
Obs: Om antigen retrieval och vilket behövs för att upptäcka intracellulära epitoper, antigener kan hämtas genom kokning avsnitten i 0,01 mol urea efter PARAFORMALDEHYD fixering. - Överför avsnitten i 24-väl kultur plattor som innehåller 0,01 mol urea och placera dessa plåtar i en mikrovågsugn. Koka i avsnitt tre gånger för ca 10 s vardera för totalt 30 s.
Obs: Var mycket försiktig, som kokande lösningen kan tvinga avsnitten ur brunnarna. Om detta händer, Använd en pensel till pushbaksida avsnitten från sidorna av vävnad kammaren eller från locket på plattan i botten av lämplig vävnad kammaren. - Prior till sekundär antikropp ruvning, permeabilize och blockera vävnadssnitt genom inkubering blockerande lösning innehållande PBS-H, 0,3% tvättmedel (PBS-H-T) och 2% NGS på en rocker för 1 h vid 4 ° C. utföra efterföljande antikropp inkubationer med PBS-H-T/2% NGS.
- För den sekundära inkuberingen överföra avsnitten i vävnad kamrarna till brunnar innehållande kanin anti-FITC antikropp utspädd 1:10,000 i PBS-H-T/2% NGS. Inkubera över natten.
- Utför counterstaining med musen anti-CD20 antikroppen utspädd 1: 200 i PBS-H-T/2% NGS. För det här alternativet Hämta epitoper om det behövs, genomsyra cellerna och blockera före denna inkubation, enligt ovan.
3. Dag 3: Tertiary inkubation
- efter den andra inkubationen, tvätta i avsnitt tre gånger i PBS-H vid 4 ° C i minst 20 min.
- Utför en slutlig inkubering med lämplig fluorescently märkt antikroppar (t.ex. get anti-kanin konjugerat grönaktigt gul, get anti råtta konjugerade långt rött färgämne och geten antimus konjugerade grön dye antikroppar utspädd 1:5 000, 1:5, 000 och 1:2, 000, respektive i PBS-H-T/2% NGS). Inkubera över natten.
Obs: vid denna punkt, ruvning kan förlängas upp till tre dagar om det behövs. Hålla avsnitten skyddas från ljus av inslagning plattorna i aluminiumfolie under denna EVbation steg och därefter, som ljus släcker fluorophores.
4. Dag 4: Montering av avsnitten
- tvätt i avsnitt tre gånger i PBS-H i minst 20 min.
Obs: Om planering för nedströms ISH 19, fixa avsnitten i 4% PARAFORMALDEHYD för 1 h att säkra tetramers och antikroppar på plats och sedan tvätta avsnitten två gånger med PBS-H för 5 min varje.
Varning: PARAFORMALDEHYD är giftiga; Använd lämplig personlig skyddsutrustning. - Använda en pensel för att överföra avsnitten till ett objektglas. Var noga med att inte peta vävnaden för mycket. Täck varje avsnitt med glycerol/gelatin som innehåller 4 mg/mL n-propylgallat eller en annan monteringsmedium innehållande en fluorophore konserveringsmedel. Täck med ett täckglas.
- Lagra bilderna i ljus-skyddad bild behållare vid -20 ° C. Skölj vävnadsodling plattorna och ta bort etiketterna på locken använder alkohol.
Obs: Plattorna kan återanvändas.
5. Förvärv av Confocal mikroskopbilder
- ta högupplösta bilder med en confocal Mikroskop, med lämpliga lasrar och filter för varje fluorophore ( figur 1A och B).
Obs: I det här exemplet confocal Mikroskop (se Tabell för material) användes. Bilder samlades med 561 nm laser vid 20% effekt för de grönaktig gul-märkt antigen-specifika T-cellerna, 488-nm laser vid 10% effekt för grön-märkt CD20-uttryckande B-celler och 640-nm laser vid 15% effekt för långt red-märkta CD8 T-celler. 20 X mål och en numerisk bländare på 0,8 användes. - Samla sekventiellt z-serie på 3 µm (eller andra) intervaller i de tre kanalerna i flera 800 x 800 pixel fält. Konstruera ett montage av fälten insamlade ( figur 1 c -E). Namnge varje montage bild baserat på information av den motsvarande bilden och spara för analys.
- Utföra kvantitativ bildanalys med respektive confocal Mikroskop analys och kvantifiering programvaran eller använda ImageJ.
6. Kvantitativ bildanalys
Obs: kvantitativ bildanalys kan åstadkommas med confocal Mikroskop analys och kvantifiering programvara eller med hjälp av ImageJ programvara. Här, ImageJ användes som ett exempel.
- Öppna en confocal montage genom att dra den till fönstret ImageJ ( figur 2A).
Obs: ImageJ kan direkt öppna montage som samlas in av många olika confocal Mikroskop. Om monteringen inte öppnas direkt av ImageJ, Exportera valda z-sökningen som en TIFF-fil att öppna den. - Duplicera den markerade z-scan för analys (" bild "-> " duplicera ") ( figur 2B).
- Dela upp de olika kanalerna (" bild "-> " färg "-> " Split kanaler ") ( figur 2 c).
- Rita ROI för kvantitativ analys i vara objektiva och lägga till ROI chefen genom att trycka på motsvarande kanal " T " på tangentbordet. Mäta området.
Obs: ROI chefen för ImageJ visar området i µm 2 ( figur 2D). - Justera fluorescens ljusstyrka och kontrast av kanalen som skall analyseras (" bild "-> " justera "-> " ljusstyrka/kontrast ") ( figur 2E).
- Platta ROI på bilden (" ROI manager "-> " plattar ") ( figur 2F).
- Kvantifiera de positiva cellerna i bilden med den " flerpunkts " verktyg ( figur 2 g).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar hur samlar confocal bilder med confocal Mikroskop. Figur 2 visar kvantitativ bildanalys med ImageJ. Figur 3 och 4 visar representativa bilder av lymfkörteln vävnad från en SIV infekterade rhesus makaker färgas med MHC tetramers, CD8 antikroppar och antikroppar mot CD20 och visar specificiteten av MHC-tetramer färgningen. Figur 3 jämför MHC klass I tetramers laddad med en peptid från SIV jämfört med sektioner från samma vävnaden färgas med MHC klass I tetramers laddad med en irrelevant peptid. Figur 4 visar att cellerna färgas med den MHC/SIV-peptid tetramer Co betsad med CD8 antikroppar, men inte CD20-antikroppar, som bets B-celler. Figur 5 visar ett exempel på ett montage som skapats från flera confocal z-serie fält används för kvantifiering av tetramer färgade celler med specifika fenotyper i olika anatomiska fack på lymfkörteln. Utvidgningen visar ett område av lymfkörteln med en B-cell follikel avgränsas av CD20 färgning och omgivande T cell zon, där MHC-tetramer-färgade celler kan upptäckas, av vilka några express Co Ki67 som är en markör för T-cellaktivering och spridning. Denna färgning kombination tillåter bestämning av fenotypen av SIV-specifika CD8 T-celler innanför och utanför B-cell folliklar, i relation till SIV-specifika CD8 T-celler och till andra Ki67 uttrycker celler, och B-celler.
Figur 1: Representant skärmdumpar visar hur samlar Confocal bilder med Confocal Mikroskop. (A) förvärv läge brukade samla confocal bilder. (B) kanaler används för bildsamling. (C) 20 X mål och 800 x 800 pixel fält användes i bildsamling. (D) ett sekventiell z-stack samlades 3 µm mellanrum. (E) plattor antogs för att avgränsa och samla in bilder i flera fält. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representant skärmdumpar visar kvantitativ bildanalys med ImageJ. (A) öppna en confocal montage genom att dra den till fönstret ImageJ. (B) duplicera den markerade z-scan för analys. (C) dela upp de olika kanalerna. (D) dra ROI för kvantitativ analys i motsvarande kanal vara objektiva och lägga till den till ROI manager genom att trycka på ”T.” (E) justera fluorescens ljusstyrkan och kontrasten i kanalen för att analyseras. (F) plattar ROI på bilden. (G) antal positiva celler i bilden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : IST kombinerat med IHC i armhålan lymfkörtel sektioner från en SIV-infekterade Rhesus makaker. Bosse - A * 02 tetramers laddad med SIV Nef YY9 peptider användes för att färga antigen-specifika CD8 T-celler och liknande tetramers laddad med en irrelevant FLP peptid från hepatit B-virus användes som en negativ kontroll (röd). Musen anti-CD20-antikroppar användes för att färga CD20+ B cells (grön), och råtta anti-CD8 antikroppar användes att färga CD8+ T cells (blå). (A) A representativ bild från en armhålan lymfkörtel avsnittet färgas med YY9 tetramers, CD20 och CD8 antikroppar. (B) samma bild som i panelen en visar den YY9 tetramer fläcken ensam. (C) representativ bild av ett avsnitt från samma armhålan lymfkörtel, fläckade FLP tetramers och antikroppar mot CD20 och CD8. (D) samma bild som i panelen C med den FLP tetramer fläcken ensam. Skala barer = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 : IST kombinerat med IHC visar specificiteten av MHC-tetramer färgning. Representativa armhålan lymfkörtel avsnitt fläckade Mamu - A * 02 tetramers laddad med Nef YY9 peptider etikett SIV-specifika CD8 T-celler (röd), musen anti-CD20-antikroppar till etikett B-celler (grön) och råtta anti-CD8 antikroppar mot etikett CD8 T-celler (blå) (A ). En SIV-specifika CD8 T-cell är tetramer + (B), CD20– (C), och CD8+ (D). Skala barer = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: IST kombinerat med IHC Visa plats, överflöd och fenotyp av Antigen-specifika CD8 T-celler. (A) representativa armhålan lymfkörtel avsnitt fläckade Mamu - A * 02 tetramers laddad med Nef YY9 peptider att märka SIV-specifika CD8 T-celler (röd), Ki67 antikroppar att märka prolifererande celler (grön) och IgM-antikroppar till etikett B celler (blå). Skalstapeln = 100 µm. (B) utvidgningen av en vald region i panelen A. IgM färgning definierar follikulära området som markeras som ”F” extrafollicular området markeras som ”EF”. Tetramer+ celler är markerade med pilar. Skalstapeln = 100 µm. representativa tetramer+ Ki67– cell (C, D, E) och tetramer+ Ki67+ cell (F, G, H). Skalstapeln = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IST kombinerat med IHC ger ett viktigt verktyg för att identifiera, karakterisera och kvantifiera antigen-specifika CD8 T-celler i inhemska miljöer med ramen av andra celler och vävnad strukturer. Här beskrivs vi detaljerade förfaranden för IST kombinerat med IHC, följt av kvantitativ bildanalys, att bestämma plats, överflöd och fenotyp av antigen-specifika CD8 T-celler i lymfkörtlarna från rhesus makaker. Liknande färgning kan tillämpas på människa, mus eller andra arter vävnader för vilka MHC-jag tetramers är tillgängliga. Dessutom kan peptid MHC klass II tetramer eller dextramer färgning utföras med relativt liknande metoder för att märka antigen-specifika CD4 T-celler i vävnader4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. IST kan också kombineras med ISH att bestämma, till exempel i vivo effektor-to-target cell nivåer18,19. I framtiden, ska det bli intressant att bära IST/IHC ytterligare genom att kombinera IST/IHC med avancerade i situ RNA och DNA upptäckt metoder. Senaste framsteg i situ hybridisering analyser inbegripa utveckling av RNAscope och DNAscope24. Dessa tekniker möjliggör upptäckt av målet RNA och DNA i vävnader. Det ska bli spännande att kombinera dessa metoder med IST och IHC samtidigt upptäcka virus-specifika-CD8 T-celler, viral RNA, viral DNA och antikropp-märkt antigener av intresse.
Medan vi ursprungligen beskrev IST metoder med färska vävnader, vävnader som har fastställts för en kort varaktighet, och frysta vävnader4, under de senaste åren har vi uteslutande använt färska vävnadssnitt, eftersom de konsekvent producera högsta kvalitet fläckar och möjliggör undersökning av celler i tjock vävnadssnitt. Som ett alternativ till förfaranden som presenteras här, en kan gälla vävnader tetramers, inkubera över natten, fixa, bädda in och frysa i frysning medium (t.ex. OCT), producera frysta tunnslip och utföra IHC senare22. Likaså vi fläcken rutinmässigt en delmängd av vävnadssnitt med tetramers ensam och sedan frysa avsnitten i okt att möjliggöra ytterligare counterstaining kombinationer i framtiden. Qdot 655-konjugerad peptid-MHC multimers kan dessutom användas för att direkt visualisera antigen-specifika T-celler i frysförvarade vävnad avsnitt13.
Vi har beskrivit här indirekt tetramer färgning. Direkt färgning med APC - eller PE-konjugerad tetramers har också visat sig fungera4,22. I detta fall är koncentrationen av MHC tetramer krävs högre än den som används i indirekta tetramer färgning. I våra händer var en koncentration av 20 µg/mL APC-märkt tetramer effektiva på att upptäcka antigen-specifika celler. Färgning intensiteten var dock mycket lägre än den som erhålls med indirekt märkning, vilket inkluderar förstärkning med anti-FITC antikroppar.
Vi fann att användningen av en komprimering-baserade mikrotom (se Tabell för material) för färsk vävnad skärande lättade processen att skära färska vävnadssnitt som jämfört med hjälp av en vibrerande mikrotomen23. Men i fall där en komprimering-baserade mikrotom inte är tillgänglig, kan en vibrerande mikrotomen eller skalpell användas för färsk vävnad snittning.
En stor begränsning av denna teknik är användningen av friska vävnader. Använda färska vävnader är mycket svårare än fasta eller frysta vävnader eftersom de kräver omedelbar uppmärksamhet och bearbetning. Vi har framgångsrikt levererat färska vävnader övernattning på is i vävnadsodling medium eller PBS-H. Det har dock enstaka problem med frakt; till exempel har snöstormar försenat leveransen av vävnader för 48 h eller mer. I dessa fall fann vi att färska vävnader sektioneras och de färgade 48 h efter utvinning generellt visar specifik färgning, med tecken på vissa vävnad nedbrytning; vävnader som målat 72 h efter extraktion är alltför nedbrutna för färgning. Vi fann också att sändningen av färska vävnader med isblock som är för kallt eller alltför nära till vävnaderna kan frysa vävnader under frakt; Denna frysning förstör generellt vävnaden för färgning. Därför är det oerhört viktigt att leverera färska vävnader kyld, men inte fryst, och att inleda IST färgning inom 24 h. färsk vävnad behandling också kräver en hel del av student och personalen tid, som vävnader från flera djur eller studiedeltagarna inte kan insamlade och färgas tillsammans på ett senare datum. Trots dessa svårigheter finner vi att färsk vävnad sektioner är det bästa valet för vackra, specifika IST/IHC färgning.
En annan begränsning för metoden IST/IHC som beskrivs här är indirekta färgning. På grund av begränsningar på antalet skilda arter av djur tillgängliga att generera sekundära antikroppar kombinationer, är vi begränsade av indirekta antikropp färgning metoder till tre eller fyra fluorescerande antikropp färgning kombinationer i taget. Detta begränsar mängden information som kan samlas på en vävnad platta. Direkta IHC färgning övervinner denna begränsning och kan utöka kapacitet, upptäcka åtta eller fler antikropp-taggade antigener samtidigt, om än med varje antikropp som producerar en mycket svagare fluorescerande signal jämfört med indirekta metoder. Således kan indirekt IHC användas som ett alternativ till indirekta IHC för counterstaining IST-färgade vävnader, vilket möjliggör upptäckt av ökade antalet cellulära antigener i kombination med IST detektion av antigen-specifika CD8 T-celler.
I vissa fall uppstå betydande autofluorescens eller icke-specifik tetramer eller antikropp bindande med IST/ISH. På grund av detta är bra positiva och negativa kontroller nödvändiga för att urskilja specifika fläckar från bakgrunden och autofluorescent färgning. Bra negativa kontroller för MHC tetramers inkluderar negativa kontrollen vävnader (t.ex. icke-infekterade vävnader; vävnader som färgas med MHC jag tetramers laddad med irrelevanta peptider eller irrelevanta MHC tetramers; eller, i en nypa, vävnader som färgas med nr tetramers men med förstärkande antikroppar).
Sammanfattningsvis är MHC I IST kombinerat med IHC ett värdefullt verktyg för att bestämma plats, överflöd och fenotyp av antigen-specifika CD8 T-celler i vävnader. Denna metod möjliggör detektion av antigen-specifika CD8 T-celler i inhemska miljöer, med relativ lokaliseringen till andra typer av celler och vävnad strukturer upprätthålls. Denna metod är allmänt tillämplig eftersom det kan användas för att lokalisera, fenotyp och kvantifiera i huvudsak någon antigen-specifika CD8 T-cell för vilken MHC tetramers finns, i alla vävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av Public Health Service bidrag från National Institutes of Health (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MHC-I monomer | NIH tetramer core facility | Materials for MHC-tetramer preparation | |
| ExtrAvidin-FITC | Sigma-Aldrich | E2716 | Materials for MHC-tetramer preparation |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Low melt agarose | Promega | V3121 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | SLBL6391V | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-6878 | |
| Urea | J.T.Baker | 4204-05 | |
| Glycerol gelatin | Sigma-Aldrich | SLBH2672V | |
| n-propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| rat-a-h-CD8 (1:500) | Acris | 0714 | Antibody unstable, use single use frozen aliquot |
| m-a-h-CD20 (1:500) | NOVOCASTRA | 6026819 | |
| m-a-h-Ki67 (1:500) | Vector | 6022201 | |
| goat-a-m-A488 (1:2,000) | Jackson Immunoresearch | 124083 | |
| goat-a-rb-Cy3 (1:5,000) | Jackson Immunoresearch | 106232 | |
| goat-a-rat-Cy5 (1:5,000) | Jackson Immunoresearch | 118088 | |
| goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000) | Jackson Immunoresearch | 86579 | |
| Compresstome: VF-300 Microtome | Precisionary Instruments, LLC | 1079 | |
| Quick Set Instant Adhesive | Loctite | 46551 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon | 353226 | |
| Microscope slide | Globe scienfitic Inc. | #1321 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc | 121-6 | |
| Feather Disposable Scalpel | FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD. | No. 21 | |
| Round paintbrush #2 | PRINCETON ART & BRUSH CO. | 4350R | Can trim as needed with razor |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| FV10-ASW_Viewer4.0 | Olympus |
References
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen. J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Steinert, E. M., et al. Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance. Cell. 161 (4), 737-749 (2015).
- Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
- Haanen, J. B., et al. In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity. Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining using MHC class I tetramers. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).
- Li, Y., et al. Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors. Immunobiology. 216, 947-960 (2011).
- Bischof, F., et al. Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers. J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).
- Massilamany, C., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS ONE. 9, e87519 (2014).
- Massilamany, C., et al. In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers. J Vis Exp. (90), e51679 (2014).
- Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues. PLoS ONE. 10 (6), e0128862 (2015).
- Tjernlund, A., et al. In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques. Retrovirology. 7, 7-12 (2010).
- Connick, E., et al. CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue. J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).
- Hong, J. J., et al. Localized Populations of CD8low/− MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium. PLoS ONE. 4 (1), e4131 (2009).
- Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIVΔnef immunization and SIVmac251 vaginal challenge. PLoS ONE. 8 (12), e81623 (2013).
- Connick, E., et al. Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL. J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).
- Li, Q., et al. Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection. Science. 323, 1726-1729 (2009).
- Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ. J Vis Exp. (30), e1561 (2009).
- Li, S., et al. Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo. J Virol. 90, 11168-11180 (2016).
- Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
- Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response. Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).
- Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biol Proced Online. 17, (2015).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
