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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

सीटू में MHC-tetramer धुंधला और मात्रात्मक विश्लेषण स्थान, बहुतायत, और Phenotype के ऊतकों में प्रतिजन-विशिष्ट सीडी टी कोशिकाओं का निर्धारण करने के लिए

Published: September 22, 2017 doi: 10.3791/56130
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Veterinary and Biomedical Sciences, University of Minnesota

Summary

यहाँ, हम एक विधि का वर्णन करते हैं जो सीटू MHC-tetramer में immunohistochemistry के साथ धुंधला कर स्थानीयकरण, phenotype, और ऊतकों में प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए जोड़ती है. इस प्रोटोकॉल को अंय कक्ष प्रकार और संरचना के ऊतकों के सापेक्ष प्रतिजन-विशिष्ट सीडी टी कोशिकाओं के स्थानिक और phenotypic विशेषताओं का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

Abstract

टी कोशिकाओं कई प्रतिरक्षा प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण हैं, का पता लगाने और वायरस से संक्रमित कोशिकाओं को नष्ट करने, प्रतिरोधक क्षमता को रोकने, बी सेल में सहायता और एंटीबॉडी के प्लाज्मा सेल उत्पादन, और पता लगाने और कैंसर की कोशिकाओं को नष्ट करने । MHC के विकास-tetramer प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं के धुंधला प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण हमारे अध्ययन और टी कोशिकाओं के immunobiology समझने की क्षमता में क्रांति आई है । मात्रा और प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं की phenotype निर्धारित करने के लिए अत्यंत उपयोगी है, जबकि cytometry प्रवाह प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं के स्थानिक स्थानीयकरण अन्य कोशिकाओं और संरचनाओं के ऊतकों में, और वर्तमान एग्रीगेट तकनीक निर्धारित नहीं कर सकता टी कोशिकाओं प्रवाह cytometry के लिए आवश्यक निकालने के लिए गैर-लसीकावत् ऊतकों में सीमित प्रभावशीलता है । सीटू में MHC-tetramer धुंधला (IST) के ऊतकों में ब्याज की एंटीजन के लिए विशिष्ट है कि टी कोशिकाओं को कल्पना करने के लिए एक तकनीक है । immunohistochemistry (आइएचसी) के साथ संयोजन में, IST बहुतायत, स्थान, और phenotype के ऊतकों में प्रतिजन-विशिष्ट सीडी और सीडी टी कोशिकाओं का निर्धारण कर सकते हैं । यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए दाग और antigen-विशिष्ट सीडी T कोशिकाओं की गणना, विशिष्ट ऊतक डिब्बों के भीतर स्थित विशेष phenotypes के साथ. इन प्रक्रियाओं हम ली एट अलद्वारा हमारे हाल ही में प्रकाशन में इस्तेमाल किया है कि एक ही हैं., हकदार "सिमियन इम्यूनो वायरस-कूप में कोशिकाओं के उत्पादन को आंशिक रूप से Vivo मेंसीडी+ कोशिकाओं द्वारा दबा रहे हैं." वर्णित विधियों मोटे तौर पर लागू कर रहे है क्योंकि वे स्थानीयकरण, phenotype, और अनिवार्य रूप से कोई antigen-विशिष्ट सीडी टी सेल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो MHC tetramers, किसी भी ऊतक में उपलब्ध हैं ।

Introduction

टी कोशिकाओं कई प्रतिरक्षा प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण हैं, का पता लगाने और वायरस से संक्रमित कोशिकाओं को नष्ट करने, प्रतिरोधक क्षमता को रोकने, बी सेल में सहायता और एंटीबॉडी के प्लाज्मा सेल उत्पादन, और पता लगाने और कैंसर की कोशिकाओं को नष्ट करने । पेप्टाइड/MHC वर्ग के विकास मैं प्रतिजन-विशिष्ट सीडी टी कोशिकाओं के धुंधला tetramer1 और MHC वर्ग द्वितीय के और अधिक हाल के विकास tetramer टी कोशिकाओं के धुंधला2 प्रवाह सीडी द्वारा हमारे अध्ययन करने और समझने की क्षमता क्रांति टी कोशिकाओं की immunobiology. मात्रा और प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं की phenotype निर्धारित करने के लिए अत्यंत उपयोगी है, जबकि प्रवाह cytometry अन्य कोशिकाओं और ऊतकों में संरचनाओं के लिए प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं के स्थानिक स्थानीयकरण का पता लगाने के लिए अनुमति नहीं देता, और वर्तमान प्रवाह cytometry के लिए आवश्यक टी कोशिकाओं को निकालने के लिए एग्रीगेट तकनीक गैर-लसीकावत् ऊतकों में सीमित प्रभावशीलता है3.

हम और दूसरों के लिए पेप्टाइड-लोड MHC वर्ग मैं और वर्ग द्वितीय tetramer या multimer रिएजेंट का उपयोग करने के तरीके विकसित किया है antigen-विशिष्ट सीडी और सीडी टी कोशिकाओं के ऊतकों में4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. इन IST विधियों स्थान, बहुतायत, और phenotype के ऊतकों में प्रतिजन-विशिष्ट सीडी और सीडी टी कोशिकाओं के निर्धारण के लिए अनुमति देते हैं और ऊतकों में अन्य कोशिकाओं और संरचनाओं के सापेक्ष इन कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एक साधन प्रदान करते हैं । हमारे समूह बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया है MHC-मैं मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी) का अध्ययन करने के लिए धुंधला tetramer-और सिमियन इम्यूनो वायरस (SIV)-सीडी, जननांग, और मलाशय के ऊतकों में विशिष्ट लसीकावत् टी कोशिकाओं एचआईवी और SIV की समझ हासिल करने के लिए immunopathogenesis और सफल टीकाकरण रणनीतियों के14,15,16,17की पहचान को संबद्ध । इसके अलावा, हमने एक ऐसी तकनीक भी विकसित की है, जो सीटू संकरण (ISH) के साथ जोड़ती है और वायरस-विशिष्ट सीडी टी कोशिकाओं और ऊतकों में वायरस-संक्रमित कोशिकाओं को स्थानीयकृत करती है और vivo effecter-to-लक्ष्य स्तरों को निर्धारित करता है 18 , 19.

यहाँ, हम का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल का वर्णन पेप्टाइड-लोड MHC-मैं tetramers का उपयोग कर नए ऊतक वर्गों में प्रतिजन-विशिष्ट सीडी टी कोशिकाओं दाग करने के लिए, counterstain ऊतकों आइएचसी, और विशिष्ट ऊतक डिब्बों में विशिष्ट phenotypes के साथ कोशिकाओं को यों तो. इन प्रक्रियाओं के रूप में ही ली एट अलद्वारा हमारे हाल ही के प्रकाशन में इस्तेमाल किया गया है, जिसमें हम स्थान, बहुतायत, और मकाक20में जीर्ण SIV संक्रमण के दौरान लसीकावत् ऊतक में SIV विशेष टी कोशिकाओं के phenotype निर्धारित ।

इस प्रक्रिया के लिए, ताजा ऊतकों और खोदी है पेप्टाइड-भरी MHC के साथ रात भर की मशीन-मैं fluorescein thiocyanate अणुओं (FITC) के लिए संयुग्मित tetramers । वे तो paraformaldehyde में तय कर रहे हैं. ऊतक फिक्सिंग के बाद, MHC tetramers से संकेत खरगोश विरोधी FITC एंटीबॉडी का उपयोग कर परिलक्षित होता है और फ्लोरोसेंट टैग विरोधी खरगोश आईजीजी एंटीबॉडी, जो आगे सीमा tetramers से संकेत बढ़ाना के साथ मशीन । आइएचसी IST प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं और आसपास के कक्षों की विशेषता के साथ संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता है । एंटीबॉडी कि कोशिकाओं की सतह पर या extracellular अंतरिक्ष में epitopes पहचान tetramers के साथ प्राथमिक मशीन में शामिल हैं । एंटीबॉडी कि पहचान intracellular epitopes सेल दीवार के permeation की आवश्यकता है धुंधला करने से पहले । सना हुआ ऊतक वर्गों एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर imaged कर रहे है और फोकल सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण । लेबल कोशिकाओं मात्रा फोकल माइक्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर या ImageJ का उपयोग कर रहे हैं । वर्णित प्रोटोकॉल के लिए अनिवार्य रूप से किसी भी ऊतक जो MHC-I tetramers उपलब्ध है में किसी भी प्रतिजन-विशिष्ट सीडी टी सेल दाग इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. दिन 1: ताजा ऊतक अनुभाग और प्राथमिक मशीन

  1. एक स्केलपेल का उपयोग करने के लिए छोटे में ताजा ऊतक कटौती (लगभग ०.५ सेमी चौड़ा द्वारा ०.५ सेमी लंबा) टुकड़े । अलग गोंद एक सवार के लिए प्रत्येक ऊतक और उंहें 4% कम की 3-5 मिलीलीटर के साथ एंबेड-पंजाब में पिघल agarose । एक स्टीकर का उपयोग कर ऊतक जानकारी के साथ सवार लेबल । यह एक बर्फ की बाल्टी में एक ठंडा धारक में डाल जमना.
  2. चालू करें और microtome वर्गों की मोटाई सेट करने के लिए २०० & #181; m. microtome पर एक उस्तरा ब्लेड स्थापित करें और सवार microtome स्नान में ऊतक के साथ घुड़सवार डालें.
  3. हेपरिन के साथ फास्फेट बफर खारा तैयार (पंजाब-ए-एच) जोड़कर १०० & #181; g/ml या १८.७ U/ml हेपरिन को सेना की रक्षा के लिए और संभावित ISH अनुप्रयोगों के बहाव की अनुमति । microtome स्नान भरें, एंबेडेड ऊतक को कवर, १०० के साथ-१२० ठंडा, बाँझ पंजाबियों की मिलीलीटर-एच । 0-2 पर तापमान को बनाए रखने के लिए पंजाब-ज आइस क्यूब्स जोड़ें नहाने के लिए & #176; C. microtome शुरू करें और टिशू को २०० & #181; मी सेक्शन में काटें ।
    ध्यान दें: यह ऊतकों के भीतर सेलुलर गतिविधि को कम करने के लिए बर्फ पर ठंडा रखने के लिए महत्वपूर्ण है और क्योंकि ताजा ऊतक अनुभाग के लिए आसान है जब यह ठंडा है । अकेले पंजाबियों अगर वहां बहाव ISH के लिए कोई योजना नहीं है इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  4. वैकल्पिक रूप से, ऊतकों कि एक microtome ( जैसे, आंत और फेफड़े) के साथ अच्छी तरह से कटौती नहीं है के लिए, एक स्केलपेल या उस्तरा ब्लेड का उपयोग करने के लिए संभव के रूप में बंद के रूप में पतली स्ट्रिप्स में ऊतक में कटौती २०० & #181; m.
  5. प्रायोगिक नमूना जानकारी के साथ 24-well टिशू कल्चर प्लेटों के ढक्कन लेबल और इसी कुएं में ऊतक कक्षों जगह है । एक तूलिका का उपयोग करने के लिए एक ऊतक एक 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट के एक कुआं में सेट करने के लिए वर्गों स्थानांतरण ठंडा पंजाबियों की 1 मिलीलीटर-H
    नोट: पुनः प्रयोज्य ऊतक कक्षों धुंधला की शुरुआत करने से पहले किया जाना चाहिए । ऊतक कक्षों एक 14 मिलीलीटर गोल नीचे स्नैप-कैप ट्यूब और तार जाल का उपयोग किया जा सकता है । एक तेज उस्तरा ब्लेड का प्रयोग करें एक 14 मिलीलीटर के नीचे कट गोल नीचे स्नैप-कैप ट्यूब बंद । ट्यूब के नीचे छेद फिट करने के लिए एक सर्कल में वायर की जाली काट लें । एक Bunsen बर्नर का उपयोग तार मेष सर्कल गर्मी जब तक यह लाल-गर्म है । तार मेष सर्कल नीचे बहुत जल्दी सेट और जाल पर ट्यूब धक्का । जांच करें कि तार जाल सुरक्षित रूप से ट्यूब के नीचे से जुड़ा हुआ है और फिर ध्यान से 3 मिलीलीटर निशान पर ट्यूब के ऊपर से काट एक तेज उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर । प्रत्येक ऊतक चैंबर में 3 ऊतक वर्गों के लिए रखो, या अप करने के लिए 1 सेमी 2 ऊतक प्रति अच्छी तरह से । क्रॉस-प्रदूषित होने से बचने के लिए विभिन्न एंटीबॉडी युग्मों के साथ कुओं के बीच कम से एक खाली कुआं रखें ।
  6. प्राथमिक tetramer और एंटीबॉडी ऊतकों मंडलों में सभी कट वर्गों के हस्तांतरण परिष्करण के बाद तुरंत धुंधला करने के लिए आगे बढ़ना । सभी समय में जलमग्न और पंजाब के 1 मिलीलीटर में ठंडा वर्गों रखें ।
  7. ०.५ & #181; g/mL FITC-संयुग्मित, पेप्टाइड-लोड MHC-मैं पंजाब में पतला tetramers-2% सामांय बकरी सीरम (NGS) के साथ एच के साथ रातोंरात गर्मी । माउस या अंय गैर खरगोश इस मशीन में ब्याज की extracellular epitopes पर निर्देशित एंटीबॉडी शामिल ( उदा, चूहा विरोधी सीडी-पंजाब में 1:500 पतला-एच 2% NGS के साथ) । एक अच्छी तरह से पतला एंटीबॉडी के 1 मिलीलीटर प्लेस ।
    ध्यान दें: देखभाल सीडी एंटीबॉडी का चयन करते समय लिया जाना चाहिए, के रूप में कुछ बढ़ाने और कुछ कर सकते हैं बाधित कर सकते हैं MHC tetramers बंधन टी सेल रिसेप्टर्स < सुप वर्ग = "xref" > ४ , < सुप क्लास = "xref" > २१ . चूहा विरोधी मानव सीडी एंटीबॉडी यहां वर्णित अस्थिर है और कुछ हद तक कमजोर धुंधला में परिणाम है । यह यहां ट्रिपल लेबलिंग के लिए प्रयोग किया जाता है क्योंकि यह केवल गैर खरगोश और गैर माउस सीडी एंटीबॉडी परीक्षण कि दाग रीसस समूल सीडी टी कोशिकाओं है ।
  8. प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए अच्छी तरह से प्रति समाधान के 1 मिलीलीटर का उपयोग करें और बाद में सभी की मशीन, और यह और सभी बाद की सभी प्रकार की मशीन पर 4 & #176; C, एक कमाल मंच पर प्लेटों के साथ ।
    नोट: ऊतकों को चैंबर में स्वतंत्र रूप से फ्लोट करना चाहिए.
< p class = "jove_title" > 2. 2 दिन: निर्धारण और माध्यमिक मशीन

  1. प्राथमिक मशीन के बाद, दो बार वर्गों धो ठंडा पंजाब के 1 मिलीलीटर-20 मिनट प्रत्येक धोने के लिए एच के साथ । एक अलग 24-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति ठंडा पंजाबियों के 1 मिलीलीटर-इसी कुएं में एच युक्त प्लेट के लिए ऊतक कक्षों स्थानांतरित करके ऐसा करें ।
    नोट: एक प्रयोगात्मक नमूना से सामग्री एक और जब ऊतक कक्षों के बीच चलती में ड्रिप नहीं सावधान रहना । सभी बाद की मशीन और धुल के लिए, इसी तरह एक साफ उचित समाधान युक्त प्लेट के लिए ऊतक चैंबर हस्तांतरण । हो प्रक्रिया के दौरान ऊतक कक्षों में वर्गों पर नजर रखने के लिए सुनिश्चित करें कि वर्गों ऊतक कक्षों के पक्षों को अटक नहीं कर सुनिश्चित करने के लिए । अगर वे करते हैं, उंहें समाधान में वापस धक्का ।
  2. ताजा पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ वर्गों को ठीक-कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए 4% paraformaldehyde बफर (ओवर फिक्स नहीं है) । 5 min.
    के लिए दो बार ठंडे पंजाबियों के साथ धो-एच सावधानी: Paraformaldehyde विषाक्त है; उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण पहनें ।
    नोट: यदि antigen पुनर्प्राप्ति और permeabilization intracellular epitopes का पता लगाने के लिए आवश्यक है, एंटीजन paraformaldehyde निर्धारण के बाद ०.०१ मॉल यूरिया में वर्गों उबलते द्वारा पुनर्प्राप्त किया जा सकता है ।
  3. ०.०१ मॉल यूरिया युक्त 24 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में वर्गों हस्तांतरण और एक माइक्रोवेव ओवन में इन प्लेटों जगह है । वर्गों के बारे में 10 एस प्रत्येक के लिए तीन बार फोड़ा, 30 एस
    की कुल के लिए नोट: बहुत सावधान रहना, समाधान उबलते के रूप में कुओं से बाहर वर्गों को मजबूर कर सकते हैं । यदि ऐसा होता है, एक तूलिका का उपयोग करने ऊतक चैंबर के पक्ष से या प्लेट के ढक्कन से वापस उपयुक्त ऊतक चैंबर के नीचे में वर्गों धक्का ।
  4. से पहले माध्यमिक एंटीबॉडी की मशीन, permeabilize और ब्लॉकिंग समाधान में उंहें पंजाब-एच, ०.३% डिटर्जेंट (पंजाब-एच-टी), और 2% NGS पर 1 ज के लिए एक झूली कुरसी पर 4 & #176; C. प्रदर्शन के साथ बाद में एंटीबॉडी की मशीन द्वारा ऊतक वर्गों पंजाब-एच-टी/२% NGS.
    5. माध्यमिक मशीन के लिए
  5. , ऊतक चैंबर में वर्गों के स्थानांतरण खरगोश विरोधी FITC एंटीबॉडी से युक्त कुओं को पतला 1: पंजाब में 10000-H-T/2% NGS । रात भर गर्मी.
  6. प्रदर्शन counterstaining माउस का उपयोग एंटी-CD20 एंटीबॉडी पतला 1:200 में पंजाब-एच-टी/2% NGS । इस विकल्प के लिए, यदि आवश्यक हो तो epitopes पुनः प्राप्त, कोशिकाओं रिस, और ब्लॉक इस मशीन से पहले, जैसा कि ऊपर वर्णित है ।
< p class = "jove_title" > 3. 3 दिन: तृतीयक मशीन

  1. दूसरी मशीन के बाद, पंजाब में तीन बार के वर्गों धो-H पर 4 & #176; C कम 20 min.
    2. के लिए
  2. उचित फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी के साथ एक अंतिम मशीन प्रदर्शन ( जैसे, बकरी विरोधी खरगोश संयुग्मित हरा पीला, बकरी विरोधी चूहा संयुग्मित अब तक लाल डाई, और बकरी विरोधी माउस संयुग्मित ग्रीन डाई एंटीबॉडी पतला 1:5000, 1:5000, और 1:2000, पंजाब में क्रमशः-H-T/2% NGS) । रात भर गर्मी.
    नोट: इस बिंदु पर, गर्मी के लिए तीन दिनों के लिए बढ़ाया जा सकता है अगर जरूरत है । इस दौरान टिन पन्नी में प्लेटें लपेटकर प्रकाश से संरक्षित अनुभागों को रखें incuबाटियों कदम और उसके बाद, के रूप में प्रकाश बुझती fluorophores.
< p class = "jove_title" > 4. 4 दिन: वर्गों को बढ़ते

  1. पंजाब में तीन बार वर्गों धो-H कम 20 मिनट के लिए ज.
    नोट: यदि अनुप्रवाह ISH < सुप वर्ग के लिए योजना = "xref" > 19 , 4% paraformaldehyde में वर्गों को ठीक करने के लिए 1 ज में tetramers और एंटीबॉडी सुरक्षित करने के लिए जगह में और फिर वर्गों के साथ दो बार धो-एच 5 मिनट के लिए प्रत्येक.
    सावधानी: Paraformaldehyde विषाक्त है; उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण पहनें ।
  2. एक तूलिका का उपयोग करने के लिए एक खुर्दबीन स्लाइड वर्गों हस्तांतरण । ऊतक बहुत ज्यादा प्रहार नहीं सावधान रहना । कोट ग्लिसरॉल/जिलेटिन युक्त 4 मिलीग्राम/एमएल एन-propyl gallate या एक fluorophore परिरक्षक युक्त एक और बढ़ते माध्यम से प्रत्येक खंड । एक coverslip.
    3. के साथ कवर
  3. किसी हल्के-रक्षित स्लाइड कंटेनर में स्लाइड् स को-20 & #176; C. टिशू कल्चर प्लेट्स कुल्ला और शराब का उपयोग कर पलकों पर लेबल को हटा दें ।
    नोट: प्लेटों reused किया जा सकता है ।
< p class = "jove_title" > 5. फोकल माइक्रोस्कोप छवियों का अधिग्रहण

  1. प्रत्येक fluorophore के लिए उपयुक्त पराबैंगनीकिरण और फिल्टर का उपयोग कर, एक फोकल माइक्रोस्कोप के साथ उच्च संकल्प छवियों पर कब्जा (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1a और बी ).
    नोट: इस उदाहरण में, एक फोकल माइक्रोस्कोप (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग किया गया था । छवियों हरे पीले लेबल प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं के लिए 20% बिजली में ५६१ एनएम लेजर का उपयोग कर एकत्र किए गए, ४८८-एनएम लेजर ग्रीन के लिए 10% बिजली पर-लेबल CD20-व्यक्त बी कोशिकाओं, और ६४०-एनएम लेजर 15% बिजली पर अब तक लाल लेबल सीडी टी कोशिकाओं के लिए । 20X उद्देश्य और ०.८ के एक संख्यात्मक एपर्चर इस्तेमाल किया गया ।
  2. क्रमिक रूप से 3 & #181; m (या अन्य) अंतराल में तीन चैनल में एकाधिक ८०० x ८०० पिक्सेल फ़ील्ड में z-श्रृंखला एकत्र करें । एकत्र क्षेत्रों की एक असेंबल का निर्माण (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 1C -E ). संगत स्लाइड की जानकारी के आधार पर प्रत्येक असेंबल छवि का नाम और विश्लेषण के लिए सहेजें ।
  3. संबंधित फोकल माइक्रोस्कोप विश्लेषण और ठहराव सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मात्रात्मक छवि विश्लेषण प्रदर्शन या ImageJ.
    4. का उपयोग
< p class = "jove_title" > 6. मात्रात्मक छवि विश्लेषण

< p class = "jove_content" > नोट: मात्रात्मक छवि विश्लेषण फोकल माइक्रोस्कोप विश्लेषण और ठहराव सॉफ्टवेयर का उपयोग कर या ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है । यहां, ImageJ एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया गया था ।

  1. इसे ImageJ विंडो (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्र 2a ) में खींचकर एक फोकल असेंबल खोलें ।
    नोट: ImageJ सीधे कई अलग फोकल सूक्ष्मदर्शी द्वारा एकत्र montages खोल सकते हैं । यदि असेंबल सीधे ImageJ द्वारा खोला नहीं जा सकता, चयनित z-स्कैन एक TIFF फ़ाइल के रूप में इसे खोलने के लिए निर्यात करें ।
  2. डुप्लिकेट चयनित z-स्कैन विश्लेषण के लिए (& #34; Image & #34;-& #62; & #34;D uplicate & #34;) (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा b ).
  3. बखर अलग चैनल (& #34; Image & #34;-& #62; & #34; रंग & #34;-& #62; & #34; Split channels & #34;) (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 2c ).
  4. संबंधित चैनल में मात्रात्मक विश्लेषण के लिए रॉय आकर्षित करने के लिए उद्देश्य हो सकता है और इसे रॉय प्रबंधक को दबाकर & #34; T & #34; कुंजीपटल पर । क्षेत्र को मापने.
    नोट: ImageJ के रॉय प्रबंधक में क्षेत्र दिखाता है & #181; m 2 (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 2d ).
  5. विश्लेषण करने के लिए चैनल की प्रतिदीप्ति चमक और कंट्रास्ट समायोजित करें (& #34; Image & #34;-& #62; & #34; समायोजित & #34;-& #62; & #34; चमक/कंट्रास्ट & #34;) (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 2E ).
  6. छवि पर रोि (& #34; रोि धक & #34;-& #62; & #34; समतल & #34;) (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 2F ).
  7. का उपयोग कर छवि में धनात्मक कोशिकाओं को बढ़ाता है & #34; बहु-बिंदु & #34; टूल (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 2g ).

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Representative Results

चित्रा 1 दिखाता है कि एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर फोकल छवियों को इकट्ठा करने के लिए । चित्र 2 ImageJ का उपयोग करके मात्रात्मक छवि विश्लेषण प्रदर्शित करता है । आंकड़े 3 और 4 दिखाने के प्रतिनिधि एक SIV से लिम्फ नोड के ऊतकों छवियों संक्रमित रीसस MHC tetramers, सीडी एंटीबॉडी, और CD20 एंटीबॉडी के साथ दाग, और MHC-tetramer धुंधला की विशिष्टता का प्रदर्शन करने के लिए सेवा करते हैं । चित्रा 3 MHC वर्ग मैं एक ही MHC वर्ग मैं एक अप्रासंगिक पेप्टाइड के साथ भरी tetramers के साथ सना हुआ ऊतक से वर्गों की तुलना में SIV से एक पेप्टाइड के साथ भरी हुई tetramers तुलना करता है. चित्रा 4 से पता चलता है कि MHC/SIV-पेप्टाइड tetramer के साथ दाग कोशिकाओं सीडी एंटीबॉडी के साथ सह दाग रहे हैं, लेकिन CD20 एंटीबॉडी, जो बी कोशिकाओं दाग नहीं है । चित्रा 5 लिम्फ नोड पर विभिन्न संरचनात्मक डिब्बों में विशिष्ट phenotypes के साथ tetramer सना हुआ कोशिकाओं के ठहराव के लिए इस्तेमाल किया एकाधिक फोकल जेड श्रृंखला क्षेत्रों से बनाया गया एक असेंबल का एक उदाहरण से पता चलता है । इज़ाफ़ा CD20 धुंधला द्वारा एक बी सेल कूप delineated के साथ लिम्फ नोड के एक क्षेत्र से पता चलता है, और टी सेल क्षेत्र, जिसमें MHC-tetramer-सना हुआ कोशिकाओं का पता लगाया जा सकता है, जिनमें से कुछ के सह एक्सप्रेस Ki67 जो टी सेल सक्रियण और प्रसार के एक मार्कर है आसपास । यह धुंधला संयोजन SIV-विशिष्ट सीडी टी कोशिकाओं के अंदर और बाहर बी कोशिका के रोम के phenotype के निर्धारण की अनुमति देता है, संबंध में SIV-विशिष्ट सीडी टी कोशिकाओं के लिए और अंय Ki67 व्यक्त कोशिकाओं, और बी कोशिकाओं के लिए ।

Figure 1
चित्र 1: प्रतिनिधि स्क्रीनशॉट कैसे एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर फोकल छवियों को इकट्ठा करने के लिए दिखा । (A) अधिग्रहण मोड फोकल छवियों को इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया । (B) छवि संग्रह के लिए उपयोग किए जाने वाले चैनल । (C) 20X उद्देश्य और ८०० x ८०० पिक्सेल फ़ील्ड्स का उपयोग छवि संग्रह में किया गया । (D) 3 µm अंतराल पर एक अनुक्रमिक z-स्टैक संग्रहीत किया गया था । (E) टाइल्स को एकाधिक फ़ील्ड्स में चित्रित और संग्रहीत करने के लिए अपनाया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : प्रतिनिधि मात्रात्मक छवि ImageJ का उपयोग विश्लेषण का प्रदर्शन स्क्रीनशॉट । (A) इसे ImageJ विंडो में खींचकर एक फोकल असेंबल खोलें । (B) विश्लेषण के लिए चयनित z-स्कैन डुप्लिकेट करें । (C) विभिंन चैनलों को विभाजित करें । (D) उद्देश्य के लिए संबंधित चैनल में मात्रात्मक विश्लेषण के लिए roi आरेखित करें और इसे "T" दबाकर roi प्रबंधक में जोड़ें । (E) विश्लेषण किए जाने वाले चैनल की प्रतिदीप्ति चमक और कंट्रास्ट समायोजित करें । (च) छवि पर ROI को समतल करना । (G) छवि में धनात्मक कक्षों को गिनना । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : IST एक SIV-संक्रमित रीसस समूल से कांख लिम्फ नोड वर्गों में आइएचसी के साथ संयुक्त. मामू-ए * 02 tetramers लोड SIV Nef YY9 पेप्टाइड्स प्रतिजन-विशिष्ट सीडी टी कोशिकाओं दाग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और इसी तरह tetramers हेपेटाइटिस बी वायरस से एक अप्रासंगिक FLP पेप्टाइड के साथ लोड एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया (लाल). माउस विरोधी CD20 एंटीबॉडी CD20+ बी कोशिकाओं (हरा) दाग के लिए इस्तेमाल किया गया था, और चूहे विरोधी सीडी एंटीबॉडी सीडी+ टी कोशिकाओं (नीला) दाग करने के लिए इस्तेमाल किया गया. (क) एक कांख लिम्फ नोड अनुभाग से एक प्रतिनिधि छवि YY9 tetramers, CD20, और सीडी एंटीबॉडी के साथ सना हुआ । (ख) पैनल में एक ही छवि के रूप में एक दिखा YY9 tetramer अकेले दाग । (ग) एक ही कांख लिम्फ नोड से एक अनुभाग की प्रतिनिधि छवि, FLP tetramers और CD20 और सीडी एंटीबॉडी के साथ दाग । (घ) FLP tetramer दाग अकेले के साथ पैनल सी में के रूप में एक ही छवि । स्केल बार्स = १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : IST MHC की विशिष्टता-tetramer धुंधला दिखा आइएचसी के साथ संयुक्त । प्रतिनिधि कांख लिम्फ नोड अनुभाग सना हुआ मामू के साथ-A * 02 tetramers Nef YY9 पेप्टाइड्स के साथ लोड करने के लिए लेबल SIV-विशिष्ट सीडी टी कोशिकाओं (लाल), माउस विरोधी CD20 एंटीबॉडी लेबल करने के लिए बी कोशिकाओं (हरा), और चूहा विरोधी सीडी एंटीबॉडी लेबल सीडी टी कोशिकाओं (नीला) (एक ). एक SIV-विशिष्ट सीडी टी सेल tetramer + (B), CD20- (C), और सीडी+ (D) है । स्केल बार्स = 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: IST आइएचसी के साथ संयुक्त करने के लिए स्थान, बहुतायत, और Antigen-विशिष्ट सीडी T कक्षों की Phenotype को दिखाने के लिए । (क) प्रतिनिधि कांख लिम्फ नोड खंड के मामू के साथ सना हुआ-a * 02 tetramers Nef YY9 पेप्टाइड्स के साथ भरी हुई लेबल करने के लिए SIV-विशिष्ट सीडी टी कोशिकाओं (लाल), Ki67 एंटीबॉडी लेबल करने के लिए proliferating कोशिकाओं (हरा), और आईजीएम एंटीबॉडी लेबल करने के लिए बी कोशिकाओं (नीला). स्केल बार = १०० µm. (B) पैनल a. आईजीएम धुंधलान में चयनित क्षेत्र की इज़ाफ़ा फुफ्फुसीय क्षेत्र को परिभाषित करता है, जिसे "F;" के रूप में चिह्नित किया गया है extrafollicular क्षेत्र को "EF" के रूप में चिह्नित किया गया है । Tetramer+ कक्षों को तीरों के साथ दर्शाया गया है । स्केल बार = १०० µm. प्रतिनिधि tetramer+ Ki67- कोशिका (C, D, E) और tetramer+ Ki67+ सेल (F, G, H). स्केल बार = 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

IST आइएचसी के साथ संयुक्त का पता लगाने, निस्र्पक, और अंय कोशिकाओं और ऊतक संरचनाओं के संदर्भ के साथ मूल वातावरण में प्रतिजन-विशिष्ट सीडी टी कोशिकाओं को बढ़ाता है के लिए एक आवश्यक उपकरण प्रदान करता है । यहां, हम आइएचसी के साथ संयुक्त, मात्रात्मक छवि विश्लेषण के बाद, स्थान, बहुतायत, और रीसस मकाक से लिम्फ नोड्स में प्रतिजन-विशिष्ट सीडी टी कोशिकाओं के phenotype निर्धारित करने के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं का वर्णन किया । इसी तरह धुंधला मानव, माउस, या अंय प्रजातियों के ऊतकों जो MHC-मैं tetramers उपलब्ध है के लिए लागू किया जा सकता है । इसके अलावा, पेप्टाइड MHC वर्ग द्वितीय tetramer या dextramer धुंधला के ऊतकों में प्रतिजन-विशिष्ट सीडी टी कोशिकाओं लेबल करने के लिए अपेक्षाकृत इसी तरह के तरीके का उपयोग किया जा सकता है4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. IST भी ISH के साथ जोड़ा जा सकता है, उदाहरण के लिए, vivo effecter-लक्ष्य सेल स्तर18,19 में निर्धारित करने के लिए । भविष्य में, यह करने के लिए दिलचस्प हो जाएगा ist/आइएचसी के संयोजन ist/आइएचसी सीटू आरएनए और डीएनए डिटेक्शन के तरीके में उन्नत के साथ । में सीटू संकरण परख में हाल ही में प्रगति RNAscope और DNAscope24के विकास में शामिल हैं । इन तकनीकों के ऊतकों में लक्ष्य आरएनए और डीएनए का पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं । यह IST और आइएचसी के साथ इन तरीकों से गठबंधन करने के लिए एक साथ वायरस विशिष्ट-सीडी टी कोशिकाओं, वायरल आरएनए, वायरल डीएनए, और ब्याज की एंटीबॉडी लेबल एंटीजन का पता लगाने के लिए रोमांचक होगा ।

जबकि हम मूल रूप से वर्णित IST ताजा ऊतकों के साथ तरीके, ऊतकों कि एक छोटी अवधि के लिए तय किया गया था, और जमे हुए ऊतकों4, हाल के वर्षों में, हम विशेष रूप से ताजा ऊतक वर्गों का इस्तेमाल किया है, के रूप में वे लगातार उच्चतम गुणवत्ता के दाग का उत्पादन और मोटी ऊतक वर्गों में कोशिकाओं की परीक्षा के लिए अनुमति देते हैं । यहां प्रस्तुत प्रक्रियाओं के लिए एक विकल्प के रूप में, एक ऊतकों को tetramers लागू कर सकते हैं, रात भर, ठीक, एंबेड, और ठंड में cryopreserve मध्यम (जैसे, OCT), जमे हुए पतले वर्गों का उत्पादन, और बाद में22आइएचसी प्रदर्शन । इसी तरह, हम नियमित रूप से अकेले tetramers के साथ ऊतक वर्गों के एक सबसेट दाग और फिर अक्टूबर में वर्गों फ्रीज करने के लिए भविष्य में अतिरिक्त counterstaining संयोजन के लिए अनुमति देते हैं । इसके अलावा, Qdot ६५५-संयुग्मित पेप्टाइड-MHC multimers सीधे cryopreserved ऊतक वर्गों में प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है13.

हमने यहां अप्रत्यक्ष tetramer दाग का वर्णन किया है । APC-या पीई-संयुग्मित tetramers का उपयोग कर प्रत्यक्ष दाग भी4,22काम दिखाया गया है । इस मामले में, MHC tetramer की एकाग्रता की आवश्यकता है कि अप्रत्यक्ष tetramer धुंधला में इस्तेमाल से अधिक है । हमारे हाथ में, एक एकाग्रता की 20 µ g/mL-लेबल tetramer antigen-विशिष्ट कक्षों का पता लगाने में प्रभावी था । हालांकि, धुंधला तीव्रता कि अप्रत्यक्ष लेबलिंग, जो विरोधी FITC एंटीबॉडी के साथ प्रवर्धन भी शामिल है के साथ प्राप्त की तुलना में बहुत कम था ।

हमने पाया है कि एक संपीड़न आधारित microtome का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) ताजा ऊतक काटने के लिए एक हिल microtome का उपयोग कर के रूप में की तुलना में ताजा ऊतक वर्गों को काटने की प्रक्रिया में ढील23. हालांकि, उदाहरणों में जहां एक संपीड़न-आधारित microtome उपलब्ध नहीं है, एक हिल microtome या स्केलपेल ताजा ऊतक अनुभागीकरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

इस तकनीक का एक प्रमुख सीमा ताजा ऊतकों का उपयोग है । ताजा ऊतकों का प्रयोग अधिक से अधिक कठिन है निर्धारित या जमे हुए ऊतकों क्योंकि वे तत्काल ध्यान और प्रसंस्करण की आवश्यकता होती है । हम सफलतापूर्वक ऊतक संस्कृति माध्यम या पंजाब-एच में बर्फ पर रातोंरात ताजा ऊतकों भेज दिया है । हालांकि, वहां शिपिंग के साथ सामयिक मुद्दों गया है; उदाहरण के लिए, हिमपात तूफान ४८ ज या अधिक के लिए ऊतकों के लदान में देरी हो गई है । इन उदाहरणों में, हमने पाया है कि ताजा ऊतकों खोदी और उन सना हुआ ४८ एच पद निष्कर्षण आम तौर पर विशिष्ट धुंधला दिखा, कुछ ऊतक गिरावट के संकेत के साथ; ऊतक ७२ एच पद के दाग-निष्कर्षण भी दाग के लिए नीचा दिखा रहे हैं । हम यह भी पाया कि बर्फ ब्लॉकों के साथ ताजा ऊतकों का लदान है कि बहुत ठंडा या भी ऊतकों को बंद कर रहे है शिपिंग के दौरान ऊतकों फ्रीज कर सकते हैं; इस ठंड आम तौर पर धुंधला के लिए ऊतक नष्ट कर देता है । इस प्रकार, यह अत्यंत ताजा ऊतकों ठंडा जहाज, लेकिन जमे हुए नहीं है, और शुरू करने के लिए 24 घंटे के भीतर धुंधलाना IST ताजा ऊतक प्रसंस्करण भी छात्र और कर्मचारियों के समय का एक बड़ा सौदा की आवश्यकता है, के रूप में कई जानवरों या अध्ययन के प्रतिभागियों से ऊतकों नहीं हो सकता एकत्र और एक बाद की तारीख पर एक साथ दाग । इन कठिनाइयों के बावजूद, हम पाते है कि ताजा ऊतक वर्गों के लिए सबसे अच्छा विकल्प है सुंदर, विशिष्ट IST/आइएचसी धुंधला ।

IST/आइएचसी विधि की एक और सीमा यहां वर्णित अप्रत्यक्ष धुंधला दृष्टिकोण है । माध्यमिक एंटीबॉडी संयोजन उत्पंन करने के लिए उपलब्ध जानवरों की विशिष्ट प्रजातियों की संख्या पर सीमाओं के कारण, हम अप्रत्यक्ष एंटीबॉडी एक समय में केवल तीन या चार फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी धुंधला संयोजन करने के लिए तरीकों दाग द्वारा सीमित हैं । यह एक ऊतक स्लैब पर एकत्र किया जा सकता है कि जानकारी की मात्रा को सीमित करता है । प्रत्यक्ष आइएचसी धुंधला इस सीमा पर काबू पाने और क्षमताओं का विस्तार कर सकते हैं, आठ या अधिक एंटीबॉडी-टैग एंटीजन एक साथ का पता लगाने, हालांकि प्रत्येक एंटीबॉडी अप्रत्यक्ष तरीकों की तुलना में एक बहुत कमजोर फ्लोरोसेंट संकेत उत्पादन के साथ । इस प्रकार, अप्रत्यक्ष आइएचसी counterstaining ist के लिए अप्रत्यक्ष आइएचसी के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है-सना हुआ ऊतकों, की अनुमति के लिए सेलुलर एंटीजन की वृद्धि हुई संख्या का पता लगाने जब के साथ संयुक्त IST प्रतिजन-विशिष्ट सीडी टी कोशिकाओं का पता लगाने.

कुछ उदाहरणों में, पर्याप्त autofluorescence और/या गैर-विशिष्ट tetramer या एंटीबॉडी बाइंडिंग IST/ISH के साथ हो सकती है । इस वजह से, अच्छा सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण पृष्ठभूमि और फ्लोरोसेंट धुंधला से विशिष्ट दाग विचार करने के लिए आवश्यक हैं । MHC के लिए अच्छा नकारात्मक नियंत्रण मैं tetramers नकारात्मक नियंत्रण ऊतक (जैसे, गैर संक्रमित ऊतकों शामिल हैं; MHC के साथ सना हुआ ऊतक मैं अप्रासंगिक पेप्टाइड्स या अप्रासंगिक MHC tetramers के साथ भरी हुई tetramers; या, एक चुटकी में, ऊतकों के साथ दाग नहीं tetramers लेकिन एंटीबॉडी बढ़ाना के साथ) ।

संक्षेप में, MHC I IST आइएचसी के साथ संयुक्त स्थान, बहुतायत, और phenotype के ऊतकों में प्रतिजन-विशिष्ट सीडी टी कोशिकाओं का निर्धारण करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है । इस पद्धति का पता लगाने के लिए अनुमति देता है antigen-विशिष्ट सीडी T कोशिकाओं के स्थानीय वातावरण में, संबंधित स्थानीयकरण के साथ अंय प्रकार के कक्ष और ऊतक संरचनाओं बनाए रखा । यह विधि मोटे तौर पर लागू है क्योंकि इसे स्थानीयकृत, phenotype, और यों तो किसी भी ऊतक में जो MHC tetramers उपलब्ध हैं, के लिए अनिवार्य रूप से कोई प्रतिजन-विशिष्ट सीडी टी सेल इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह कार्य स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617) से सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा अनुदान द्वारा समर्थित था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MHC-I monomer NIH tetramer core facility Materials for MHC-tetramer preparation
ExtrAvidin-FITC Sigma-Aldrich E2716 Materials for MHC-tetramer preparation
Normal goat serum Jackson Immunoresearch 005-000-121
Low melt agarose Promega V3121
Heparin Sigma-Aldrich SLBL6391V
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-6878
Urea J.T.Baker 4204-05
Glycerol gelatin Sigma-Aldrich SLBH2672V
n-propyl gallate Sigma-Aldrich P3130
rat-a-h-CD8 (1:500) Acris 0714 Antibody unstable, use single use frozen aliquot
m-a-h-CD20 (1:500) NOVOCASTRA 6026819
m-a-h-Ki67 (1:500) Vector 6022201
goat-a-m-A488 (1:2,000) Jackson Immunoresearch 124083
goat-a-rb-Cy3 (1:5,000) Jackson Immunoresearch 106232
goat-a-rat-Cy5 (1:5,000) Jackson Immunoresearch 118088
goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000) Jackson Immunoresearch 86579
Compresstome: VF-300 Microtome Precisionary Instruments, LLC 1079
Quick Set Instant Adhesive Loctite 46551
24-well flat bottomed tissue culture plates Falcon 353226
Microscope slide Globe scienfitic Inc. #1321
Razor  blade Ted Pella, Inc 121-6
Feather Disposable Scalpel FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD. No. 21
Round paintbrush #2 PRINCETON ART & BRUSH CO. 4350R Can trim as needed with razor
Confocal Microscope Olympus FV1000
FV10-ASW_Viewer4.0 Olympus

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक १२७ में सीटू tetramer धुंधला (IST) विषाणु-विशिष्ट सीडी + टी कोशिकाओं immunohistochemistry स्थानीयकरण phenotype फोकल माइक्रोस्कोपी मात्रात्मक छवि विश्लेषण
<em>सीटू में</em> MHC-tetramer धुंधला और मात्रात्मक विश्लेषण स्थान, बहुतायत, और Phenotype के ऊतकों में प्रतिजन-विशिष्ट सीडी टी कोशिकाओं का निर्धारण करने के लिए
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Li, S., Mwakalundwa, G., Skinner, P. J. In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues. J. Vis. Exp. (127), e56130, doi:10.3791/56130 (2017).

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