Summary
Her, beskriver vi en metode, der kombinerer i situ MHC-tetramer farvning med Immunhistokemi at bestemme lokalisering, fænotype og mængden af antigen-specifikke T-celler i væv. Denne protokol bruges til at bestemme de rumlige og fænotypiske egenskaber af antigen-specifikke CD8 T celler i forhold til andre celletype og strukturer i væv.
Abstract
T celler er vigtige for mange immunologiske processer, herunder opdage og fjerne virus-inficerede celler, forhindrer autoimmunitet, bistå i B-celle og plasma-celle produktion af antistoffer, og opdage og fjerne kræftceller. Udviklingen af MHC-tetramer farvning af antigen-specifikke T-celler analyseret ved flowcytometri har revolutioneret vores evne til at studere og forstå immunobiology af T-celler. Yderst nyttige til at bestemme mængden og fænotype af antigen-specifikke T-celler, kan ikke flowcytometri bestemme den geografiske lokalisering af antigen-specifikke T-celler til andre celler og strukturer i væv og nuværende opdeling teknikker for at udtrække T behov celler for flowcytometri har begrænset effektiviteten i ikke-lymfoide væv. In situ MHC-tetramer farvning (IST) er en teknik til at visualisere T-celler, der er specifikke for antigener af interesse i væv. I kombination med Immunhistokemi (IHC), kan IST bestemme overflod, placering og fænotype af antigen-specifikke CD8 og CD4 T celler i væv. Her, beskriver vi en protokol for at pletten og optælle antigen-specifikke CD8 T-celler med specifikke fænotyper ligger inden for specifikke væv rum. Disse procedurer er de samme som vi brugte i vores seneste publikation af Li et al., med titlen "Simian immundefektvirus-producerende celler i follikler er delvist undertrykt af CD8 celler,+ In Vivo." De beskrevne metoder er stort set gældende, fordi de kan bruges til at lokalisere, fænotype, og kvantificere det væsentlige alle antigen-specifikke CD8 T celler som MHC tetramers der findes i alle væv.
Introduction
T celler er vigtige for mange immunologiske processer, herunder opdage og fjerne virus-inficerede celler, forhindrer autoimmunitet, bistå i B-celle og plasma-celle produktion af antistoffer, og opdage og fjerne kræftceller. Udviklingen af peptid/MHC klasse I tetramer farvning af antigen-specifikke CD8 T celler1 og den nyere udvikling af MHC klasse II tetramer farvning af CD4 T celler2 ved flowcytometri revolutioneret vores evne til at studere og forstå de Immunobiology af T-celler. Yderst nyttige til at bestemme mængden og fænotype af antigen-specifikke T-celler, tillader flowcytometri ikke til påvisning af den geografiske lokalisering af antigen-specifikke T-celler til andre celler og strukturer i væv, og nuværende opdeling teknikker til at udvinde T celler behov for flowcytometri har begrænset effektiviteten i ikke-lymfoide væv3.
Vi og andre har udviklet metoder bruger peptid-læsset MHC klasse I og klasse II tetramer eller multimer reagenser til pletten antigen-specifikke CD8 og CD4 T celler i væv4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. disse IST metoder give til bestemmelse af placering, overflod og fænotype af antigen-specifikke CD8 og CD4 T celler i væv og give et middel til at opdage disse celler i forhold til andre celler og strukturer i væv. Vores gruppe har flittigt brugt MHC-jeg tetramer farvning for at studere human immundefekt virus (HIV)- og simian immundefektvirus (SIV) - specifikke CD8 T celler i lymfoide, kønsorganer og rektal væv til at opnå en forståelse af HIV og SIV immunpatogenese og at identificere korrelerer vellykkede vaccination strategier14,15,16,17. Derudover udviklet vi også en teknik, der kombinerer IST med i situ hybridisering (ISH) at lokalisere og kvantificere virus-specifikke CD8 T celler og virus-inficerede celler i væv og til at bestemme in vivo effektor-til-målet-niveauer 18 , 19.
Her, vi beskriver en protokol bruger peptid-læsset MHC-jeg tetramers til at plette antigen-specifikke CD8 T celler i frisk væv sektioner, til kontrastfarve væv ved hjælp af IHC og kvantificere celler med specifikke fænotyper i bestemte væv rum. Disse procedurer er de samme som blev brugt i vores seneste publikation af Li et al., hvor vi bestemt placering, overflod og fænotype af SIV-specifikke T-celler i lymfoide væv under kronisk SIV infektion i makakaber20.
For denne procedure, frisk væv i snit og inkuberes natten over med peptid-læsset MHC-jeg tetramers konjugeret til fluorescein kaliumthiocyanat molekyler (FITC). De er så fast i PARAFORMALDEHYD. Efter fastsættelsen af væv, forstærkes signalet fra MHC-tetramers ved hjælp af kanin anti-FITC antistoffer og inkuberes med fluorescently mærket anti-kanin IgG antistoffer, som yderligere forstærker signalet fra de bundne tetramers. IHC bruges i forbindelse med IST til at karakterisere antigen-specifikke T-celler og omkringliggende celler. Antistoffer, der genkender epitoper på overfladen af celler eller i det ekstracellulære rum er inkluderet i den primære inkubering med en tetramers. Antistoffer, der genkender intracellulære epitoper kræver gennemtrængning af cellevæggen før farvning. Afsnittene farves væv er afbildet ved hjælp af en Konfokal mikroskop og analyseret ved hjælp af Konfokal software. Mærket celler er kvantificeret konfokalmikroskopi software eller ImageJ. Den beskrevne protokol kan bruges til at plette hovedsagelig alle antigen-specifikke CD8 T celler i alle væv for hvilke MHC-jeg tetramers er tilgængelige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dag 1: frisk væv skæring og primære inkubation
- Brug en skalpel til at skære frisk væv i små (ca 0,5 cm bred ved 0,5 cm høj) stykker. Separat lim hver væv til et stempel og integrere dem med 3-5 mL 4% lav-Smelt Agarosen i PBS. Label stemplet med væv oplysninger ved hjælp af en mærkat. Sætte det i en kølet indehaveren i en isspand størkne.
- Tænder på mikrotomen og sæt tykkelsen af sektioner til 200 µm. installere et barberblad på mikrotomen og Indsæt stemplet monteret med væv i mikrotomen bad.
- Forbered fosfatbufferet saltopløsning med heparin (PBS-H) ved at tilføje 100 µg/mL eller 18,7 U/mL heparin til PBS at bevare RNA og tillade potentielle ISH programmer nedstrøms. Fylde mikrotomen bad, der dækker den indlejrede væv, med 100-120 mL af kølede, steril PBS-H. Tilføje PBS-H isterninger til bad til at holde temperaturen på 0 - 2 ° C. Start mikrotomen og skære væv i 200 µm sektioner.
Bemærk: Det er vigtigt at holde væv kølet på isen for at minimere cellulær aktivitet i væv og fordi frisk væv er lettere at afsnit, når det er kølet. PBS alene kan bruges, hvis der er ingen planer for downstream ISH. - Alternativt til væv, der ikke skære godt med en mikrotom (fx gut og lunge), bruge en skalpel eller barberblad til at skære væv i tynde strimler som tæt som muligt på 200 µm.
- Etiket låget af 24-godt vævskultur plader med eksperimentel prøve oplysninger og placere væv kamre i de tilsvarende brønde. Brug en pensel til at overføre sektionerne til et væv kammer i godt af en 24-godt vævskultur plade indeholdende 1 mL af kølet PBS-H.
Bemærk: Genanvendelige væv kamre bør gøres før indlede farvning. Væv kamre kan gøres ved hjælp af en 14 mL polypropylen runde-bunden snap-cap tube og wire mesh. Brug et skarpt barberblad til at skære bunden af en 14 mL polypropylen runde-bunden snap-cap tube off. Skær trådnet i en cirkel til at passe i hullet i bunden af røret. Varme wire mesh cirkel ved hjælp af en bunsenbrænder, indtil det er rødglødende. Sæt wire mesh cirkel meget hurtigt og skub røret på trådnet. Kontroller at trådnet er forsvarligt fastgjort til bunden af røret og derefter omhyggeligt skæres ud i toppen af røret på 3 mL mærket ved hjælp af et skarpt barberblad. Sætte op til 3 væv sektioner i kamrene væv, eller op til 1 cm 2 væv pr. brønd. Holde mindst én tom godt mellem brønde med forskellige antistof kombinationer til at undgå krydskontaminering. - Fortsæt til primære tetramer og antistof farvning umiddelbart efter endt overførsel af alle snit sektioner i væv kamre. Holde sektioner neddykket og kølet i 1 mL PBS-H på alle tidspunkter.
- Ruger afsnittene væv natten med 0,5 µg/mL FITC-konjugeret, peptid-læsset MHC-jeg tetramers fortyndes i PBS-H med 2% normal ged serum (NGS). Omfatter mus eller andre ikke-kanin antistoffer rettet mod ekstracellulære epitoper af interesse i denne inkubering (fx rotte anti-CD8 antistoffer fortyndet 1: 500 i PBS-H med 2% NGS). Placer 1 mL fortyndet antistoffer i hver brønd.
Bemærk: Omhu bør tages, når du vælger CD8 antistoffer, som nogle kan øge og nogle kan hæmme MHC tetramers binding til T-celle receptorer 4 , 21. Rotte anti-menneskelige CD8 antistof beskrevet her er ustabil og undertiden resulterer i lidt svag farvning. Det bruges her til tredobbelt mærkning, fordi det er den eneste ikke-kanin og ikke-musen CD8 antistof testet at farves rhesus makak CD8 T celler. - Brug 1 mL af opløsning pr. brønd for primære antistof og alle efterfølgende inkubationer, og udføre dette og alle efterfølgende inkubationer ved 4 ° C, med plader på en vuggende platform.
Bemærk: Væv skal flyde frit i kammeret.
2. Dag 2: Fiksering og sekundære inkubation
- efter den primære inkubation, vaske i afsnit to gange med 1 mL af kølet PBS-H i 20 min. hver vask. Gøre dette ved at overføre væv kamre til en forskellige 24-godt vævskultur plade indeholdende 1 mL af kølet PBS-H i de tilsvarende wells.
Bemærk: Vær forsigtig ikke at dryppe indholdet fra en eksperimentel prøve til en anden, når du flytter mellem væv kamre. For alle efterfølgende inkubationer og vasker, ligeledes overføre væv salen til en ren plade indeholdende den passende løsning. Sørg for at overvåge sektionerne i væv kamre under procedure for at sikre, at sektionerne ikke går i stå til siderne af væv kamre. Hvis de gør, skubbe dem tilbage i løsningen. - Fix afsnittene med 1 mL frisk PBS-buffered 4% PARAFORMALDEHYD i 2 timer ved stuetemperatur (ikke over løser). Vask med koldt PBS-H to gange i 5 min.
Forsigtig: PARAFORMALDEHYD er giftige; bære passende personlige værnemidler.
Bemærk: Hvis antigen hentning og permeabilization er nødvendig for at afsløre intracellulære epitoper, antigener kan hentes ved kogning sektioner i 0,01 mol urinstof efter PARAFORMALDEHYD fiksering. - Overføre sektionerne til 24-og kultur plader der indeholder 0,01 mol urinstof og placere disse plader i en mikrobølgeovn. Kog i afsnit tre gange for omkring 10 s hver, i alt 30 s.
Bemærk: Vær meget forsigtig, som kogende løsningen kan tvinge afsnittene ud af brøndene. Hvis dette sker, bruge en pensel til at skubbe tilbage fra væv kammerets sider eller fra låget af pladen-afsnittene i passende væv kammerets bund. - Forudgående til sekundær antistof inkubation, permeabilize og blokere afsnittene væv ved at inkubere dem i blokerende løsning indeholdende PBS-H, 0,3% vaskemiddel (PBS-H-T) og 2% NGS på en rocker for 1 h på 4 ° C. Udfør efterfølgende antistof inkubationer med PBS-H-T/2% NGS.
- For den sekundære inkubation, overføre sektioner i væv kamre til brønde indeholdende kanin anti-FITC antistof fortyndet 1:10,000 i PBS-H-T/2% NGS. Der inkuberes natten.
- Udføre counterstaining ved hjælp af musen anti-CD20 antistof fortyndet 1:200 i PBS-H-T/2% NGS. Denne indstilling, hente epitoper, hvis nødvendigt, gennemsyre cellerne og blokere før denne inkubation, som beskrevet ovenfor.
3. Dag 3: Tertiære inkubation
- efter den anden inkubation, vaske i afsnit tre gange i PBS-H ved 4 ° C i mindst 20 min.
- Udføre en afsluttende inkubering med den relevante fluorescently mærket antistoffer (fx ged anti-kanin konjugeret grønligt gule, ged anti-rotte konjugeret langt rødt farvestof og ged anti-mus konjugeret grønne farvestof antistoffer fortyndet 1:5, 000, 1:5, 000 og 1:2, 000, henholdsvis i PBS-H-T/2% NGS). Der inkuberes natten.
Bemærk: på dette tidspunkt, inkubation kan forlænges i op til tre dage hvis det er nødvendigt. Holde afsnittene beskyttet mod lys ved indpakning pladerne i sølvpapir under denne incubation trin og derefter, som lys slukker fluorophores.
4. Dag 4: Montering afsnittene
- vask i afsnit tre gange i PBS-H i mindst 20 min.
Bemærk: Hvis planlægning for downstream ISH 19, lave sektioner i 4% PARAFORMALDEHYD for 1 h til at sikre tetramers og antistoffer i sted og derefter vaske afsnittene to gange med PBS-H i 5 min.
Forsigtig: PARAFORMALDEHYD er giftige; bære passende personlige værnemidler. - Bruger en pensel til at overføre sektionerne til et objektglas. Pas på ikke at stikke vævet for meget. Coat hver sektion med glycerol/gelatine indeholdende 4 mg/mL n-propyl gallate eller en anden montering medium indeholdende en fluorophore konserveringsmiddel. Dække med en coverslip.
- Gemme diasene i et lys-beskyttet dias beholder ved -20 ° C. Skyl vævskultur plader og fjerne etiketter på låg bruger alkohol.
Bemærk: Pladerne kan genbruges.
5. Erhvervelse af Konfokal mikroskop billeder
- fange høj opløsning billeder med en Konfokal mikroskop, ved hjælp af passende lasere og filtre for hver fluorophore ( figur 1A og B).
Bemærk: I dette eksempel, en Konfokal mikroskop (Se Tabel af materialer) blev brugt. Billeder blev indsamlet ved hjælp af 561 nm laser på 20% strøm til grønlig gul-mærket antigen-specifikke T celler, 488 nm laser ved 10% effekt for grøn-mærket CD20-udtrykker B celler og 640-nm laser på 15% strøm til langt rød-mærket CD8 T celler. 20 X mål og en numerisk blænde af 0,8 anvendtes. - Indsamle sekventielt z-serie på 3 µm (eller andre) mellemrum i de tre kanaler i flere 800 x 800 pixel felter. Konstruere en montage af de indsamlede felter ( figur 1 c -E). Navngive hver montage billede baseret på oplysningerne i det tilsvarende dias og gemme til analyse.
- Udføre kvantitative billedanalyse ved hjælp af de respektive Konfokal mikroskop analyse og kvantificering software eller ImageJ.
6. Kvantitative billedanalyse
Bemærk: kvantitative billedanalyse kan opnås ved hjælp af Konfokal mikroskop analyse og kvantificering software eller ved hjælp af ImageJ software. Her, ImageJ blev brugt som et eksempel.
- Åben en Konfokal montage ved at trække det til vinduet ImageJ ( figur 2A).
Bemærk: ImageJ kan direkte åbne montager indsamlet af mange forskellige Konfokal mikroskoper. Hvis montagen ikke kan åbnes direkte af ImageJ, eksportere udvalgte z-scanningen som en TIFF-fil til at åbne sig. - Duplikere den valgte z-scan til analyse (" Image "-> " duplikere ") ( figur 2B).
- Delt de forskellige kanaler (" Image "-> " farve "-> " Split kanaler ") ( figur 2 c).
- Tegner ROI for kvantitativ analyse i den pågældende kanal til at være objektiv og føje det til ROI manager ved at trykke på " T " på tastaturet. Måle området.
Bemærk: ROI manager for ImageJ viser området i µm 2 ( figur 2D). - Justere fluorescens lysstyrken og kontrasten af kanal skal analyseres (" Image "-> " Juster "-> " lysstyrke/kontrast ") ( figur 2E).
- Tromle ROI på billedet (" ROI manager "-> " Flatten ") ( figur 2F).
- Kvantificere de positive celler i billedet ved hjælp af den " multi-punkt " værktøj ( fig. 2 g).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser hvordan man skal indsamle Konfokal billeder ved hjælp af en Konfokal mikroskop. Figur 2 viser kvantitative billedanalyse ved hjælp af ImageJ. Figur 3 og 4 viser repræsentant billeder af lymfeknude væv fra en SIV inficerede rhesus makak farves med MHC tetramers, CD8 antistoffer og CD20 antistoffer, og tjene til at demonstrere specificiteten af MHC-tetramer farvning. Figur 3 sammenligner MHC klasse I tetramers fyldt med en peptid fra SIV sammenlignet med sektioner fra det samme væv farves med MHC klasse tetramers fyldt med en irrelevant peptid. Figur 4 viser, at celler farves med SIV/MHC-peptid tetramer Co farves med CD8 antistoffer, men ikke CD20 antistoffer, der plette B-celler. Figur 5 viser et eksempel på en montage oprettet fra flere Konfokal z-serie felter bruges til kvantificering af tetramer farvede celler med specifikke fænotyper i forskellige anatomiske rum på lymfeknude. Udvidelsen viser et område af lymfeknude med en B-celle follikel afgrænset af CD20 farvning, og omkringliggende T-celle zone, hvor MHC-tetramer-farvede celler kan påvises, hvoraf nogle Co express Ki67, som er en markør for T-celle aktivering og spredning. Denne farvning kombination giver mulighed for bestemmelse af Fænotypen af SIV-specifikke CD8 T celler inden for og uden for B-celle follikler, i forhold til SIV-specifikke CD8 T-celler og andre Ki67 udtrykker celler, og B-celler.
Figur 1: Repræsentant Screenshots viser hvordan man skal indsamle Konfokal billeder ved hjælp af en Konfokal mikroskop. (A) erhvervelse mode bruges til at indsamle Konfokal billeder. (B) kanaler bruges til billedsamling. (C) 20 X mål og 800 x 800 pixel felter blev brugt i billedsamling. (D) A sekventielle z-stakken var indsamlet 3 µm mellemrum. (E) fliser blev vedtaget for at afgrænse og indsamle billeder i flere felter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Repræsentant Screenshots viser kvantitative billede analyse ved hjælp af ImageJ. (A) åbne en Konfokal montage ved at trække det til vinduet ImageJ. (B) Dupliker de valgte z-scan til analyse. (C) opdeler de forskellige kanaler. (D) Draw ROI for kvantitativ analyse i den pågældende kanal til at være objektiv og føje det til ROI manager ved at trykke på "T." (E) Juster fluorescens lysstyrke og kontrast på kanalen der skal analyseres. (F) Flatten ROI på billedet. (G) Grev positive celler i billedet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : IST kombineret med IHC i axillær lymfeknude sektioner fra en SIV-inficerede Rhesus makak. Ebbe - A * 02 tetramers fyldt med SIV Nef YY9 peptider blev brugt til at plette antigen-specifikke CD8 T celler, og lignende tetramers fyldt med en irrelevant FLP peptid fra hepatitis B-virus blev brugt som en negativ kontrol (rød). Anti-CD20 museantistoffer blev brugt til at plette CD20-+ B celler (grøn), og rotte anti-CD8 antistoffer blev brugt til at plette CD8+ T-celler (blå). (A) A repræsentativt billede fra en axillær lymfeknude afsnit farves med YY9 tetramers, CD20 og CD8 antistoffer. (B) det samme billede som i panelet en viser YY9 tetramer pletten alene. (C) repræsentativt billede af et afsnit fra samme axillær lymfeknude, farves med FLP tetramers og CD20 og CD8 antistoffer. (D) det samme billede som i panelet C med FLP tetramer pletten alene. Skalere barer = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : IST kombineret med IHC viser specificiteten af MHC-tetramer farvning. Repræsentative axillær lymfeknude afsnit farves med Ebbe - A * 02 tetramers fyldt med Nef YY9 peptider til etiketten SIV-specifikke CD8 T celler (rød), anti-CD20 museantistoffer etiket B celler (grønne) og rotte anti-CD8 antistoffer til mærkningen CD8 T celler (blå) (A ). En SIV-specifikke CD8 T-celle er tetramer + (B), CD20- (C), og CD8+ (D). Skalere barer = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: IST kombineret med IHC at vise placering, overflod og fænotype af Antigen-specifikke CD8 T celler. (A) repræsentative axillær lymfeknude afsnit farves med Ebbe - A * 02 tetramers fyldt med Nef YY9 peptider til at mærke SIV-specifikke CD8 T celler (rød), Ki67 antistoffer til at mærke prolifererende celler (grønne) og IgM antistoffer til mærke B celler (blå). Skalalinjen = 100 µm. (B) udvidelsen af en udvalgt region i panelet A. IgM farvning definerer den follikulære område, der er markeret som "F;" det extrafollicular område er markeret som "EF." Tetramer+ celler er angivet med pile. Skalalinjen = 100 µm. repræsentative tetramer+ Ki67- celle (C, D, E) og tetramer+ Ki67+ celle (F, G, H). Skalalinjen = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IST kombineret med IHC giver et vigtigt redskab for påvisning, kendetegner og kvantificere antigen-specifikke CD8 T celler i native miljøer med konteksten af andre celler og væv strukturer. Her, beskrevet vi nærmere procedurer for IST kombineret med IHC, efterfulgt af kvantitative billedanalyse, til at bestemme placering, overflod og fænotype af antigen-specifikke CD8 T-celler i lymfeknuder fra rhesus makakaber. Lignende farvning kan blive anvendt til menneskelige, mus, eller andre arter væv for hvilke MHC-jeg tetramers er tilgængelige. Derudover kan peptid MHC klasse II tetramer eller dextramer farvning udføres ved hjælp af relativt lignende metoder til at mærke antigen-specifikke CD4 T-celler i væv4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. IST kan også kombineres med ISH til at bestemme, for eksempel, i vivo effektor-til-målet celle niveauer18,19. I fremtiden vil det være interessant at bære IST/IHC yderligere ved at kombinere IST/IHC med avancerede i situ RNA og DNA påvisning metoder. De seneste fremskridt inden i situ hybridisering assays omfatte udvikling af RNAscope og DNAscope24. Disse teknikker giver mulighed for påvisning af target RNA og DNA i væv. Det bliver spændende at kombinere disse metoder med IST og IHC samtidigt afsløre virus-specifikke-CD8 T celler, viral RNA, viral DNA og antistof-mærket antigener af interesse.
Mens vi oprindeligt beskrevet IST metoder med frisk væv, væv, der var fastsat for en kort varighed, og frossen væv4, i de seneste år, har vi udelukkende brugt friske væv sektioner, som de konsekvent producere de højeste kvalitet pletter og giver mulighed for undersøgelse af celler i tykt væv sektioner. Som et alternativ til procedurerne, der præsenteres her, du kan anvende tetramers til væv, inkuberes natten over, fix, integrere og cryopreserve i frysning medium (fx OCT), producere frosne tynde sektioner og udføre IHC senere22. Ligeledes, vi pletten rutinemæssigt et undersæt af væv sektioner med tetramers alene og derefter fryse afsnittene i OLT at give mulighed for yderligere counterstaining kombinationer i fremtiden. Derudover kan Qdot 655-konjugeret peptid-MHC multimerer bruges til direkte visualisere antigen-specifikke T-celler i befrugtede væv afsnit13.
Vi har beskrevet her indirekte tetramer farvning. Direkte farvning ved hjælp af APC - eller PE-konjugeret tetramers har også vist sig at arbejde4,22. I dette tilfælde er koncentrationen af MHC tetramer kræves højere end den, der anvendes i indirekte tetramer farvning. I vores hænder var en koncentration på 20 µg/mL af APC-mærket tetramer effektiv til påvisning af antigen-specifikke celler. Farvning intensiteten var imidlertid meget lavere end der opnås med indirekte mærkning, som omfatter forstærkning med anti-FITC antistoffer.
Vi fandt, at brugen af en komprimering-baserede mikrotom (Se Tabel af materialer) til frisk væv skæring lettet processen med at skære frisk væv sektioner som sammenlignet med ved hjælp af en vibrerende mikrotomen23. Men i tilfælde hvor en komprimering-baserede mikrotom ikke er tilgængelig, en vibrerende mikrotomen eller skalpel kan bruges til frisk væv skæring.
En stor begrænsning af denne teknik er anvendelse af frisk væv. Brug frisk væv er meget vanskeligere end fast eller frossen væv, fordi de kræver øjeblikkelig opmærksomhed og behandling. Vi har med succes leveret frisk væv natten over på køl i vævskultur medium eller PBS-H. Der har dog været lejlighedsvise problemer med forsendelse; for eksempel, har snestorme forsinket leverance af væv i 48 timer eller mere. I disse tilfælde, vi har fundet, frisk væv i snit og de farves 48 timer efter ekstraktion generelt viser specifik farvning med tegn på nogle væv nedbrydning; væv farves 72 h efter ekstraktion er for nedbrudt til farvning. Vi også konstateret, at forsendelsen af frisk væv med isen blokke, der er for koldt eller for tæt på væv kan fryse væv under forsendelse; denne indefrysning generelt ødelægger væv til farvning. Det er således yderst vigtigt, at skibet frisk væv kølet, men ikke er frosset, og at indlede IST farvning inden for 24 h. frisk væv behandling også kræver en hel del af studerende og personale tid som væv fra flere dyr eller undersøgelsens deltagere ikke kan være indsamlet og farves sammen på et senere tidspunkt. Trods disse vanskeligheder finde vi, at frisk væv sektioner er det bedste valg for smukt, specifikke IST/IHC farvning.
En anden begrænsning af IST/IHC-metoden beskrevet her er de indirekte farvning tilgang. På grund af begrænsninger på antallet af forskellige arter af dyr, der er tilgængelige til at generere sekundær antistof kombinationer, er vi begrænset af indirekte antistof farvning metoder til kun tre eller fire fluorescerende antistof farvning kombinationer ad gangen. Dette begrænser mængden af oplysninger, der kan indsamles på en væv slab. Direkte IHC farvning overvinder denne begrænsning og kan udvide funktionaliteten, afsløre otte eller flere antistof-tagged antigener samtidig, om end med enkelte antistof producerer en meget svagere fluorescerende signal i forhold til indirekte metoder. Således kan indirekte IHC anvendes som et alternativ til indirekte IHC til counterstaining IST-farvede væv, giver mulighed for påvisning af øgede antallet af cellulære antigener når kombineret med IST påvisning af antigen-specifikke CD8 T celler.
I nogle tilfælde kan væsentlige autofluorescence og/eller ikke-specifikke tetramer eller antistof bindende forekomme med IST/ISH. På grund af dette er gode positive og negative kontroller nødvendigt at skelne specifikke pletter fra baggrunden og autofluorescent farvning. God negative kontroller til MHC tetramers omfatter negativ kontrol væv (f.eks. ikke-inficerede væv, væv farves med MHC tetramers indlæst med irrelevante peptider eller irrelevante MHC tetramers; eller i en knivspids, væv farves med no tetramers men med forstærke antistoffer).
I Resumé er MHC I IST kombineret med IHC et værdifuldt redskab til at bestemme placering, overflod og fænotype af antigen-specifikke CD8 T celler i væv. Denne metode giver mulighed for påvisning af antigen-specifikke CD8 T celler i native miljøer, med den relative lokalisering til andre celletyper og væv strukturer vedligeholdes. Denne metode er generelt gældende, fordi det kan bruges til at lokalisere, fænotype, og kvantificere hovedsagelig en antigen-specifikke CD8 T celle for hvilke MHC tetramers er tilgængelige i alle væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Public Health Service tilskud fra National Institutes of Health (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MHC-I monomer | NIH tetramer core facility | Materials for MHC-tetramer preparation | |
| ExtrAvidin-FITC | Sigma-Aldrich | E2716 | Materials for MHC-tetramer preparation |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Low melt agarose | Promega | V3121 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | SLBL6391V | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-6878 | |
| Urea | J.T.Baker | 4204-05 | |
| Glycerol gelatin | Sigma-Aldrich | SLBH2672V | |
| n-propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| rat-a-h-CD8 (1:500) | Acris | 0714 | Antibody unstable, use single use frozen aliquot |
| m-a-h-CD20 (1:500) | NOVOCASTRA | 6026819 | |
| m-a-h-Ki67 (1:500) | Vector | 6022201 | |
| goat-a-m-A488 (1:2,000) | Jackson Immunoresearch | 124083 | |
| goat-a-rb-Cy3 (1:5,000) | Jackson Immunoresearch | 106232 | |
| goat-a-rat-Cy5 (1:5,000) | Jackson Immunoresearch | 118088 | |
| goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000) | Jackson Immunoresearch | 86579 | |
| Compresstome: VF-300 Microtome | Precisionary Instruments, LLC | 1079 | |
| Quick Set Instant Adhesive | Loctite | 46551 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon | 353226 | |
| Microscope slide | Globe scienfitic Inc. | #1321 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc | 121-6 | |
| Feather Disposable Scalpel | FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD. | No. 21 | |
| Round paintbrush #2 | PRINCETON ART & BRUSH CO. | 4350R | Can trim as needed with razor |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| FV10-ASW_Viewer4.0 | Olympus |
References
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen. J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Steinert, E. M., et al. Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance. Cell. 161 (4), 737-749 (2015).
- Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
- Haanen, J. B., et al. In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity. Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining using MHC class I tetramers. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).
- Li, Y., et al. Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors. Immunobiology. 216, 947-960 (2011).
- Bischof, F., et al. Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers. J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).
- Massilamany, C., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS ONE. 9, e87519 (2014).
- Massilamany, C., et al. In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers. J Vis Exp. (90), e51679 (2014).
- Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues. PLoS ONE. 10 (6), e0128862 (2015).
- Tjernlund, A., et al. In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques. Retrovirology. 7, 7-12 (2010).
- Connick, E., et al. CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue. J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).
- Hong, J. J., et al. Localized Populations of CD8low/− MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium. PLoS ONE. 4 (1), e4131 (2009).
- Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIVΔnef immunization and SIVmac251 vaginal challenge. PLoS ONE. 8 (12), e81623 (2013).
- Connick, E., et al. Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL. J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).
- Li, Q., et al. Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection. Science. 323, 1726-1729 (2009).
- Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ. J Vis Exp. (30), e1561 (2009).
- Li, S., et al. Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo. J Virol. 90, 11168-11180 (2016).
- Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
- Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response. Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).
- Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biol Proced Online. 17, (2015).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
