Summary
وهنا يصف لنا أسلوب الذي يجمع في الموقع تيترامير MHC تلطيخ مع إيمونوهيستوتشيميستري لتحديد الترجمة، والنمط الظاهري، وكمية محددة مستضد الخلايا في الأنسجة. هذا البروتوكول يستخدم لتحديد الخصائص المكانية والمظهرية لخلايا تي CD8 مستضد على حدة بالنسبة لنوع الخلية الأخرى والهياكل في الأنسجة.
Abstract
خلايا T حاسمة بالنسبة للعديد من العمليات المناعية، بما في ذلك كشف والقضاء على الخلايا المصابة بالفيروس، ومنع المناعة الذاتية، ومساعدة في الإنتاج ب-الخلايا والخلايا البلازما من الأجسام المضادة، وكشف والقضاء على الخلايا السرطانية. تطوير MHC-تيترامير تلطيخ الخلايا T محددة مستضد تحليلها بواسطة التدفق الخلوي ثورة في قدرتنا على دراسة وفهم إيمونوبيولوجي خلايا تي. بينما مفيدة للغاية لتحديد الكمية والنمط الظاهري محددة مستضد خلايا T، التدفق الخلوي لا يمكن تحديد التعريب المكانية محددة مستضد تي الخلايا إلى الخلايا والهياكل في الأنسجة، وتقنيات التصنيف الحالية الأخرى لاستخراج تي الخلايا اللازمة للتدفق الخلوي محدودة الفعالية في الأنسجة غير اللمفاوية. في الموقع تلطيخ تيترامير MHC (IST) هو تقنية لتصور خلايا تي التي محددة لمولدات المضادات للفائدة في الأنسجة. في تركيبة مع إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة)، يمكن تحديد المحكمة العراقية الخاصة وفرة والموقع والنمط الظاهري لخلايا محددة مستضد CD8 و CD4 T في الأنسجة. هنا، نحن تصف وضع بروتوكول لوصمة عار وتعداد الخلايا التائية CD8 مستضد على حدة، مع تعمل محددة تقع داخل مقصورات الأنسجة محددة. هذه الإجراءات هي نفسها التي استخدمت في المنشور الذي صدر مؤخرا من لي et al.، بعنوان "الخلايا المنتجة" فيروس نقص المناعة القردي "في" المسام تقمع جزئيا "من CD8 الخلايا+ " في فيفو "." الأساليب المذكورة قابلة للتطبيق على نطاق واسع لأنها يمكن استخدامها لترجمة، النمط الظاهري، وتحديد مقدار أساسا أي خلية CD8 T مستضد محددة تتوفر فيها MHC tetramers، في أي أنسجة.
Introduction
خلايا T حاسمة بالنسبة للعديد من العمليات المناعية، بما في ذلك كشف والقضاء على الخلايا المصابة بالفيروس، ومنع المناعة الذاتية، ومساعدة في الإنتاج ب-الخلايا والخلايا البلازما من الأجسام المضادة، وكشف والقضاء على الخلايا السرطانية. تطوير ببتيد/MHC الفئة الأولى تيترامير تلطيخ محددة مستضد خلايا CD8 تي1 ووضع عهدا MHC الفئة الثانية تيترامير تلطيخ الخلايا CD4 تي2 بالتدفق الخلوي أحدث ثورة في قدرتنا على دراسة وفهم إيمونوبيولوجي خلايا تي. بينما مفيدة للغاية لتحديد الكمية والنمط الظاهري محددة مستضد خلايا T، التدفق الخلوي لا تسمح للكشف عن توطين المكانية محددة مستضد خلايا تي إلى الخلايا والهياكل في الأنسجة، والحالية الأخرى تقنيات تفصيل لاستخراج الخلايا T اللازمة للتدفق الخلوي محدودة الفعالية في الأنسجة غير اللمفاوية3.
نحن وآخرون تطورت أساليب استخدام الطبقة MHC الببتيد-تحميل الأول والصف الثاني تيترامير أو الكواشف مولتيمير بوصمة عار محددة مستضد خلايا CD8 و CD4 T في الأنسجة4،5،،من67، 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13-أساليب "هذه المحكمة الخاصة العراقية" السماح لتحديد موقع والوفرة، والنمط الظاهري لخلايا محددة مستضد CD8 و CD4 T في الأنسجة وتوفير وسيلة للكشف عن هذه الخلايا بالنسبة لخلايا وهياكل في الأنسجة أخرى. مجموعتنا وقد تستخدم على نطاق واسع MHC--أنا تيترامير تلطيخ لدراسة فيروس نقص المناعة البشرية (فيروس الإيدز)-وفيروس نقص المناعة القردي (سيف)-الخلايا التائية CD8 محددة في الأنسجة اللمفاوية والأعضاء التناسلية والمستقيم اكتساب فهم لفيروس نقص المناعة البشرية وسيف إيمونوباثوجينيسيس وأن تحديد يرتبط التطعيم الناجحة استراتيجيات14،15،،من1617. وباﻹضافة إلى ذلك، وضعنا أيضا أسلوب الذي يجمع بين المحكمة الخاصة العراقية في الموقع التهجين (العش) لتوطين والتحديد الكمي للخلايا التائية CD8 الخاصة بالفيروس والخلايا المصابة بالفيروس في الأنسجة وتحديد مستويات المستجيب للهدف في فيفو 18 , 19.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول باستخدام MHC الببتيد-تحميل-أنا تيتراميرس وصمة عار محددة مستضد خلايا تي CD8 في أقسام الأنسجة الطازجة، إلى أنسجة كونتيرستاين استخدام المدينة، والتحديد الكمي للخلايا مع محددة تعمل في المقصورات الأنسجة محددة. هذه الإجراءات هي نفسها كما كانت تستخدمها لي et al., الذي حددنا الموقع والوفرة، والنمط الظاهري لخلايا تي سيف على حدة في الأنسجة اللمفاوية أثناء الإصابة المزمنة بسيف في ماكاكويس20في المنشور الذي صدر مؤخرا.
لتنفيذ هذا الإجراء، مقطوع الأنسجة الطازجة والمحتضنة بين عشية وضحاها مع MHC الببتيد-تحميل-أنا tetramers مترافق لجزيئات ثيوسيانات fluorescein (فيتك). ثم أنها ثابتة في بارافورمالدهيد. بعد تحديد الأنسجة، يتم تضخيمه الإشارة من MHC tetramers باستخدام الأجسام المضادة-فيتك أرنب والمحتضنة مع المعلمة فلوريسسينتلي أرنب المضادة الأجسام المضادة مفتش، وكذلك تضخيم الإشارة من تيتراميرس منضم. المدينة يستخدم بالاقتران مع المحكمة الخاصة العراقية لصفات محددة مستضد الخلايا T والخلايا المحيطة بها. الأجسام المضادة التي تعترف [ابيتوبس] على سطح الخلايا أو مدرجة في الفضاء خارج الخلية في الحضانة الأولية مع تيتراميرس. الأجسام المضادة التي تعترف بداخل الخلايا [ابيتوبس] تتطلب تخلل لجدار الخلية قبل التلوين. يتم تصويرها باستخدام مجهر [كنفوكل] أقسام النسيج الملون وتحليلها باستخدام البرمجيات [كنفوكل]. الخلايا المسماة كمياً باستخدام برامج الفحص المجهري [كنفوكل] أو إيماجيج. يمكن استخدام بروتوكول وصف وصمة عار أساسا أي خلية محددة مستضد تي CD8 في أي أنسجة للذي MHC--أنا تيتراميرس متوفرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-1 اليوم: تقطيع الأنسجة الطازجة والحضانة الأولية
- استخدام مشرط قطع الأنسجة الطازجة إلى قطع صغيرة (حوالي 0.5 سم من 0.5 سم). بشكل منفصل الصق كل الأنسجة للمكبس وتضمينها مع 3-5 مل من 4% ذوبان منخفضة [اغروس] في برنامج تلفزيوني. قم بتسمية المكبس مع المعلومات الأنسجة باستخدام ملصق. وضعها في حامل مبردة في دلو الجليد يصلب.
- بدوره على مبضع ومجموعة شنت سمك الفروع إلى 200 ميكرومتر. تثبيت شفرة حلاقة على مبضع وإدراج المكبس مع الأنسجة في حمام مبضع. إعداد
- مخزنة الفوسفات المالحة مع الهيبارين (برنامج تلفزيوني-ح) بإضافة 100 ميكروغرام/مل أو 18.7 يو/مليلتر الهيبارين إلى برنامج تلفزيوني للحفاظ على الجيش الملكي النيبالي والسماح التطبيقات المحتملة ايش المصب. ملء حمام مبضع، تغطي الأنسجة المضمنة، مع 100-120 مل من برود، عقيمة برنامج تلفزيوني ه. إضافة مكعبات الثلج ح برنامج تلفزيوني للحمام للحفاظ على درجة حرارة 0-2 ° جيم ابدأ مبضع وقطع الأنسجة إلى 200 ميكرومتر المقاطع.
ملاحظة: من المهم أن تبقى الأنسجة المبردة بالثلج لتقليل النشاط الخلوي داخل الأنسجة وسبب أنسجة جديدة أسهل للقسم عند هي مبردة. يمكن استخدام برنامج تلفزيوني وحدها إذا لم يكن هناك أي خطط للعش المصب. - بدلاً من ذلك، لاستخدام الأنسجة التي لا تقطع مع مبضع (مثل الأمعاء والرئة)، مشرط أو شفرة حلاقة لقطع الأنسجة إلى شرائح رقيقة كأقرب ما يمكن من 200 مليميكرون.
- تسمية غطاء لوحات زراعة الأنسجة 24-جيدا مع معلومات العينة التجريبية والدوائر الأنسجة في الآبار المقابلة. استخدام مجموعة الرسام لنقل المقاطع إلى دائرة أنسجة في بئر صفيحة 24-جيدا زراعة الأنسجة التي تحتوي على 1 مل من برود PBS-حاء
ملاحظة: ينبغي قبل الشروع في تلطيخ الدوائر الأنسجة القابلة لإعادة الاستخدام. يمكن إجراء استخدام أنبوب الحد الأقصى للأداة أسفل جولة البوليبروبيلين 14 مل الدوائر الأنسجة وأسلاك الشبكة. استخدام شفرة حلاقة حادة لقطع الجزء السفلي من أنبوب الحد الأقصى للأداة أسفل الجولة البوليبروبيلين 14 مل. قطع أسلاك شبكة في حلقة مفرغة لتناسب الثقب في الجزء السفلي من الأنبوب. الحرارة دائرة شبكة الأسلاك باستخدام موقد بنسن حتى وملتهب. تعيين دائرة شبكة الأسلاك إلى أسفل بسرعة كبيرة، ودفع الأنبوب على الشبكة. تحقق من أن أسلاك شبكة أمان تعلق على الجزء السفلي من الأنبوب وثم قطع بعناية الجزء العلوي من الأنبوب عند علامة 3 مل باستخدام شفرة حلاقة حادة. وضع يصل إلى 3 أقسام الأنسجة في كل دائرة الأنسجة، أو ما يصل إلى 1 سم 2 من أنسجة كل بئر. تبقى بئر فارغة واحدة على الأقل بين الآبار مع تركيبات مختلفة من الأجسام المضادة لتجنب التلوث عبر.
تيترامير - المضي قدما إلى المرحلة الابتدائية وجسم تلطيخ فورا بعد الانتهاء من نقل جميع قطع المقاطع إلى الدوائر الأنسجة. الحفاظ على الأقسام المغمورة وبرود في 1 مل ح برنامج تلفزيوني في جميع الأوقات.
- احتضان الفروع الأنسجة بين عشية وضحاها مع 0.5 ميكروغرام/مل مترافق FITC، محملة الببتيد MHC--أنا تيتراميرس المخفف في برنامج تلفزيوني-ح بمصل الماعز العادية 2% (خ ع). وتشمل الماوس أو الأجسام المضادة غير الأرانب الأخرى الموجهة إلى خارج الخلية [ابيتوبس] للفائدة في هذه الحضانة (مثل الفئران مكافحة CD8 أضداد المخفف 1: 500 في برنامج تلفزيوني-H مع 2% خ ع). ضع 1 مل من الأجسام المضادة المخفف في كل بئر-
ملاحظة: يجب توخي الحذر عند تحديد الأجسام المضادة CD8، كما يمكن أن يعزز بعض وبعضها يمكن أن تمنع tetramers MHC ملزمة لمستقبلات خلية تي 4 ، 21. جسم CD8 الإنسان مكافحة الفئران الموصوفة هنا غير مستقر، ويؤدي أحياناً إلى تلطيخ ضعيفة إلى حد ما. وهو يستخدم هنا لوسم الثلاثي لأنها الوحيدة غير الأرنب والماوس غير CD8 جسم اختبار تلك الخلايا التائية CD8 المكاك الريسوسي الملون. - استخدام 1 مل من محلول لكل بئر لجسم الأولية واللاحقة كل إينكوبيشنز، والقيام بهذا وجميع إينكوبيشنز اللاحقة في 4 درجات مئوية، مع لوحات على منصة هزاز.
ملاحظة: الأنسجة أن التعويم الحر في الدائرة-
2. يوم 2: التثبيت وحضانة الثانوي
- بعد الاحتضان الابتدائي، يغسل كل غسل أبواب مرتين مع 1 مل ح برنامج تلفزيوني يبرد لمدة 20 دقيقة. القيام بذلك عن طريق نقل الدوائر الأنسجة إلى لوحة زراعة الأنسجة 24-آبار مختلفة التي تحتوي على 1 مل ح برنامج تلفزيوني مبردة في الآبار المقابلة.
ملاحظة: كن حذراً لا بالتنقيط محتويات من عينة تجريبية واحدة إلى أخرى عند الانتقال بين الدوائر الأنسجة. لجميع إينكوبيشنز اللاحقة ويغسل، وبالمثل نقل الدائرة الأنسجة لصفيحة نظيفة تحتوي على الحل المناسب. تأكد من رصد المقاطع في الدوائر الأنسجة أثناء إجراء للتأكد من أن الفروع لا تتعثر على الجانبين من الدوائر الأنسجة. إذا أنها، تدفع لهم العودة إلى الحل. - إصلاح الأجزاء مع 1 مل بارافورمالدهيد 4% مخزنة في برنامج تلفزيوني جديد ح 2 في درجة حرارة الغرفة (عدم الإفراط وإصلاح). أغسل مع ح برنامج تلفزيوني الباردة مرتين للحد الأدنى 5
تنبيه: بارافورمالدهيد السامة؛ ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
ملاحظة: إذا كان من الضروري استرجاع مستضد و permeabilization للكشف عن [ابيتوبس] داخل الخلايا، المستضدات يمكن استردادها بواسطة غلى المقاطع في 0.01 mol اليوريا بعد التثبيت بارافورمالدهيد.
تحويل الأقسام إلى لوحات الثقافة 24-البئر الذي يحتوي على 0.01 mol اليوريا - ووضع هذه اللوحات في فرن ميكروويف. غلى المقاطع ثلاث مرات لحوالي 10 s كل منهما، ليصبح مجموع 30 س.
ملاحظة: كن حذراً جداً، الغليان يمكن فرض الحل أبواب الخروج من الآبار. إذا حدث هذا، استخدم الرسام دفع الفروع من الجانبين من قاعة الأنسجة أو من غطاء اللوحة مرة أخرى إلى الجزء السفلي من الدائرة الأنسجة مناسبة. - مسبق للاحتضان جسم الثانوية، بيرميبيليزي وكتلة أقسام الأنسجة التي تفرخ لهم في عرقلة الحل الذي يحتوي على برنامج تلفزيوني-ح والمنظفات 0.3% (برنامج تلفزيوني-ح تي) 2% خ ع على الروك ح 1 في 4 ° C. إجراء إينكوبيشنز جسم اللاحقة مع خ ع PBS-H-T/2%-
- للاحتضان الثانوية، نقل المقاطع في الدوائر الأنسجة إلى الآبار تحتوي على الأرنب فيتك مكافحة جسم المخفف المضيفين في خ ع PBS-H-T/2%. تبني بين عشية وضحاها.
- استخدام كونتيرستينينج إجراء الماوس المضادة-CD20 جسم المخفف 1: 200 في خ ع PBS-H-T/2%. لاستخدام هذا الخيار، استرداد [ابيتوبس] إذا لزم الأمر، تتخلل الخلايا، وكتلة قبل هذه الحضانة، كما هو موضح أعلاه.
3. يوم 3: التعليم العالي حضانة
- بعد الحضانة الثانية، يغسل المقاطع ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني-ح في 4 درجات مئوية على الأقل 20 دقيقة
- القيام حضانة نهائي مع المناسبة المسمى فلوريسسينتلي الأجسام المضادة (مثل الماعز الأرنب المضادة مترافق أصفر مخضر والماعز لمكافحة الفئران مترافق صبغ أحمر الآن والماعز الصبغة الخضراء مترافق الماوس المضادة الأجسام المضادة المخفف 1:5، 000، 1:5، 000 000، و 1:2، على التوالي، في PBS-H-T/2% خ ع). تبني بين عشية وضحاها.
ملاحظة: عند هذه النقطة، الحضانة يمكن تمديد لمدة تصل إلى ثلاثة أيام إذا لزم الأمر. إبقاء أبواب تحميها من الضوء التفاف اللوحات في إحباط القصدير أثناء هذا إينكوالخطوة بيشن وبعد ذلك، وكما يروي الضوء فلوروفوريس.
4. يوم 4: تركيب الأبواب
- أغسل أقسام ثلاثة مرات في برنامج تلفزيوني-ح لمالا يقل عن 20 دقيقة
ملاحظة: إذا كان التخطيط المصب ايش 19، إصلاح المقاطع في بارافورمالدهيد 4% ح 1 تأمين تيتراميرس والأجسام المضادة في المكان، ويغسل المقاطع مرتين مع برنامج تلفزيوني-H لمدة 5 دقائق في كل.
تنبيه: بارافورمالدهيد السامة؛ ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
استخدام - الرسام لنقل المقاطع إلى شريحة مجهر. احرص على عدم كزة الأنسجة كثيرا. معطف كل قسم مع الجلسرين/الجيلاتين يحتوي على آخر متوسط المتصاعدة التي تحتوي على فلوروفوري حافظة أو يبيغاللوكاتيشين البروبيل-ن 4 مغ/مل. تغطية مع ساترة.
- تخزين الشرائح في حاوية شريحة محمية بالضوء في-20 درجة مئوية. شطف لوحات زراعة الأنسجة وإزالة التسميات على الأغطية استخدام الكحول.
ملاحظة: يمكن إعادة استخدام اللوحات.
5. الحصول على صور المجهر [كنفوكل]
- التقاط صور عالية الدقة مع مجهر [كنفوكل]، باستخدام أشعة الليزر المناسبة ومرشحات لكل فلوروفوري ( الشكل 1 أ وب)-
ملاحظة: في هذا المثال، (انظر الجدول للمواد) استخدم مجهر [كنفوكل]. وجمعت الصور استخدام الليزر نانومتر 561 في السلطة 20% لخلايا تي محددة مستضد المسمى أصفر مخضر و 488 نانومتر الليزر بقوة 10% للأخضر المسمى ب CD20-الإعراب عن الخلايا 640 نانومتر الليزر بقوة 15% للخلايا التائية CD8 الأحمر المسمى الآن. واستخدمت 20 × الهدف وفتحه عددية من 0.8- - تسلسلياً جمع فترات سلسلة z في 3 ميكرومتر (أو غيرها) في القنوات الثلاث في حقول متعددة 800 × 800 بكسل. بناء مونتاج من الحقول التي تم جمعها ( الشكل 1 -E). تسمية كل صورة المونتاج استناداً إلى المعلومات الشريحة المقابلة وحفظه للتحليل-
- القيام بتحليل الصورة الكمية باستخدام مجهر [كنفوكل] كل تحليل وتقدير حجم البرنامج أو استخدام إيماجيج-
6. التحليل الكمي للصورة
ملاحظة: يمكن إنجاز التحليل الكمي الصورة باستخدام برامج التحليل والقياس الكمي مجهر [كنفوكل] أو باستخدام برنامج إيماجيج. واستخدمت هنا، إيماجيج على سبيل مثال-
المونتاج- مفتوحة [كنفوكل] بواسطة سحبه إلى إطار إيماجيج ( الشكل 2A).
ملاحظة: يمكن مباشرة فتح ImageJ المونتاج جمعتها مجاهر [كنفوكل] مختلفة كثيرة. إذا كان لا يمكن فتح المونتاج مباشرة قبل إيماجيج، تصدير z-الفحص المحدد كملف TIFF لفتح ذلك - مكررة z-الفحص المحدد للتحليل (" صورة "-> " المكررة ") ( الشكل 2B).
- تقسيم قنوات مختلفة (" صورة "-> " اللون "-> " تقسيم القنوات ") ( الشكل 2). رسم
- دوروا للتحليل الكمي في القناة المقابلة يكون موضوعيا وإضافته إلى إدارة العائد على الاستثمار عن طريق الضغط على " تي " على لوحة المفاتيح. قياس المنطقة.
ملاحظة: يظهر مدير ImageJ دوروا المنطقة في 2 ميكرومتر ( الشكل 2D). - ضبط fluorescence السطوع والتباين للقناة ليتم تحليلها (" صورة "-> " ضبط "-> " السطوع/") ( الشكل 2E).
- تسطيح دوروا على الصورة (" دوروا مدير "-> " سطح ") ( الشكل 2 واو)-
- تحديد الخلايا إيجابية في الصورة باستخدام " متعددة النقاط " أداة ( الشكل 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 1 يبين كيفية جمع الصور [كنفوكل] باستخدام مجهر [كنفوكل]. الشكل 2 يوضح تحليل الصورة الكمية باستخدام إيماجيج. الشكلان 3 و 4 إظهار الممثل الصور من العقدة الليمفاوية الأنسجة من سيف إصابة المكاك الريسوسي ملطخة MHC tetramers، CD8 الأجسام المضادة، والأجسام المضادة CD20، وتثبت خصوصية تلطيخ تيترامير MHC. الشكل 3 يقارن MHC الفئة الأولى tetramers محملة ببتيد من سيف مقارنة بأقسام من نفس النسيج الملون مع الطبقة MHC أنا tetramers محملة ببتيد غير ذي صلة. ويبين الشكل 4 أن الخلايا الملون مع تيترامير MHC/سيف-الببتيد ملطخة يشترك مع الأجسام المضادة CD8، ولكن لا أضداد CD20، الذي وصمة عار ب الخلايا. يبين الشكل 5 مثال على المونتاج التي تم إنشاؤها من عدة حقول سلسلة z [كنفوكل] تستخدم للتحديد الكمي تيترامير الملون الخلايا مع محددة تعمل في الأقسام التشريحية المختلفة في العقدة الليمفاوية. يظهر التوسيع منطقة العقدة الليمفاوية مع المسام خلية ب رسمتها تلطيخ CD20 والمحيطة بها الخلية تي المنطقة، التي يمكن الكشف عن خلايا تيترامير الملطخة MHC، بعضها شارك إكسبريس Ki67 الذي علامة على تنشيط خلية تي وانتشار. يسمح هذا المزيج المصبوغة تحديد النمط الظاهري الخلايا التائية CD8 سيف على حدة داخل وخارج الخلية بالمسام، في علاقة الخلايا الخاصة بسيف CD8 تي وخلايا أخرى تعرب عن Ki67، وخلايا ب.
رقم 1: الممثل من الصور تبين كيفية جمع الصور [كنفوكل] باستخدام مجهر [كنفوكل]- (أ) اكتساب وضع المستخدمة لجمع الصور [كنفوكل]. (ب) القنوات المستخدمة لجمع الصور. (ج) 20 X الهدف و 800 × 800 بكسل استخدام الحقول في مجموعة الصور. (د) متسلسلة z-مكدس جمعت فترات 3 ميكرومتر. اعتمدت البلاط (ﻫ) تحديد وجمع الصور في حقول متعددة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : صورة الممثل من الصور مما يدل على كمية التحليل باستخدام إيماجيج- (أ) فتح مونتاج [كنفوكل] بواسطة سحبه إلى إطار إيماجيج. مكرر (ب) z-الفحص المحدد للتحليل. (ج) تقسيم قنوات مختلفة. (د) رسم دوروا للتحليل الكمي في القناة المقابلة يكون موضوعيا وإضافته إلى إدارة العائد على الاستثمار عن طريق الضغط على "ت." (ه) ضبط سطوع الأسفار وعلى النقيض من القناة يتم تحليلها. (و) سطح دوروا على الصورة. (ز) عدد الخلايا الإيجابية في الصورة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : المحكمة العراقية الخاصة جنبا إلى جنب مع المدينة في أقسام إبطي العقدة الليمفاوية من المكاك الريسوسي المصابة بسيف- Tetramers Mamu-A * 02 محملة الببتيدات سيف Nef YY9 استخدمت لوصمة عار محددة مستضد الخلايا التائية CD8، واستخدمت tetramers مماثلة محملة ببتيد حزب العمل الفيجي غير ذات صلة من فيروس التهاب الكبد البائي كعنصر سلبي (أحمر). واستخدمت الأجسام المضادة-CD20 الماوس لوصمة عار CD20 الخلايا+ ب (الأخضر)، واستخدمت الأجسام المضادة-CD8 الفئران لوصمة عار CD8+ تي الخلايا (أزرق). (A) A صورة تمثيلية من قسم إبطي عقده الليمفاوية ملطخة تيتراميرس YY9 و CD20 و CD8 الأجسام المضادة. (ب) نفس الصورة كما هو الحال في لوحة عرض تيترامير YY9 وصمة عار وحدها. (ج) صورة الممثل لمقطع من نفس العقدة الليمفاوية الإبطين، ملطخة بحزب العمل الفيجي تيتراميرس والأجسام المضادة CD20 و CD8. (د) نفس الصورة كما هو الحال في لوحة ج مع تيترامير حزب العمل الفيجي وصمة عار وحدها. تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : المحكمة العراقية الخاصة جنبا إلى جنب مع المدينة تظهر خصوصية تلطيخ MHC-تيترامير. قسم الممثل إبطي العقدة الليمفاوية ملطخة tetramers Mamu-A * 02 محملة Nef YY9 الببتيدات إلى تسمية الخلايا التائية CD8 الخاصة بسيف (أحمر) والماوس CD20 مكافحة الأجسام المضادة للتسمية ب الخلايا (الأخضر) وأجسام CD8 مكافحة الفئران إلى الخلايا التائية CD8 تسمية (الأزرق) (A ). هو خلية محددة سيف CD8 تي تيترامير + (ب)، CD20– (ج)، و CD8+ (د). تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
5 الرقم: المحكمة العراقية الخاصة جنبا إلى جنب مع المدينة لإظهار الموقع والوفرة، والنمط الظاهري للخلايا التائية CD8 محددة مستضد. (أ) قسم الممثل إبطي العقدة الليمفاوية ملطخة tetramers Mamu-A * 02 محملة الببتيدات Nef YY9 لتسمية الخلايا التائية CD8 الخاصة بسيف (أحمر) والأجسام المضادة Ki67 لتسمية الخلايا المتكاثرة (الأخضر) والأجسام المضادة IgM للخلايا التسمية ب (أزرق). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ب) توسيع منطقة المحدد في لوحة أ IgM تلطيخ يعرف منطقة جرابي، والتي تم وضع علامة "و"؛ منطقة اكسترافوليكولار تم وضع علامة "EF." يتم الإشارة إلى الخلايا تيترامير+ مع الأسهم. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الممثل تيترامير+ Ki67– الخلية (ج، د، ه) وتيترامير+ Ki67+ الخلية (و، ز، ح). شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المحكمة العراقية الخاصة جنبا إلى جنب مع المدينة يوفر أداة أساسية لكشف وتميز، والتحديد الكمي للخلايا التائية CD8 محددة مستضد في البيئات الأصلية مع السياق هياكل الأنسجة والخلايا الأخرى. هنا، يمكننا وصف إجراءات مفصلة للمحكمة العراقية الخاصة جنبا إلى جنب مع المدينة، متبوعاً بتحليل الصورة الكمية، تحديد الموقع، ووفرة، والنمط الظاهري محددة مستضد تي CD8 الخلايا في الغدد الليمفاوية من macaques الريسوسي. تلطيخ مشابهة يمكن تطبيقها على الإنسان، الماوس، أو الأنسجة الأنواع الأخرى لأي MHC--أنا تيتراميرس متوفرة. وباﻹضافة إلى ذلك، الببتيد تيترامير MHC Class الثاني أو تلطيخ ديكسترامير يمكن إجراء باستخدام منهجيات مماثلة نسبيا لتسمية الخلايا CD4 T محددة مستضد في الأنسجة4،،من56،، من7 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13-يمكن أيضا الجمع بين المحكمة الخاصة العراقية مع العش لتحديد، على سبيل المثال، في فيفو خلية المستجيب للهدف مستويات18،19. وفي المستقبل، سيكون من المثير للاهتمام أن إجراء المحكمة الخاصة العراقية/المدينة كذلك بالجمع بين المحكمة الخاصة العراقية/المدينة المتقدمة في الموقع الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي منهجيات الكشف. وتشمل التطورات الأخيرة في فحوصات التهجين في الموقع وضع رناسكوبي ودناسكوبي24. تسمح هذه التقنيات للكشف عن الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي المستهدفة في الأنسجة. وستكون مثيرة الجمع بين هذه المنهجيات مع المحكمة الخاصة العراقية والمدينة في نفس الوقت الكشف عن خلايا تي فيروس-خاصة-CD8، الرنا الفيروسي والحمض النووي الفيروسي والمسمى أضداد المستضدات الاهتمام.
بينما نحن أصلاً وصف الأساليب الخاصة العراقية مع الأنسجة الطازجة، والأنسجة التي تم إصلاحها لمدة قصيرة، و4من الأنسجة المجمدة، في السنوات الأخيرة، لدينا حصرا تستخدم المقاطع أنسجة جديدة، كما أنها تنتج دائماً البقع أعلى مستوى من الجودة وتسمح لفحص الخلايا في أقسام الأنسجة سميكة. كبديل للإجراءات المعروضة هنا، أحد يمكن تطبيق تيتراميرس على الأنسجة واحتضان بين عشية وضحاها، إصلاح، وتضمين وكريوبريسيرفي في تجميد المتوسطة (مثلاً، أكتوبر) وإنتاج مقاطع رقيقة المجمدة، وأداء المدينة بعد22. وبالمثل، نحن بشكل روتيني وصمة عار مجموعة فرعية أقسام الأنسجة مع تيتراميرس وحدها، وثم تجميد الأجزاء في أكتوبر للسماح لمجموعات كونتيرستينينج إضافية في المستقبل. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام مترافق 655 قدوت الببتيد-MHC مولتيميرس لتصور مباشرة محددة مستضد تي الخلايا في الأنسجة cryopreserved الأقسام13.
التي وصفناها هنا تيترامير غير المباشرة تلطيخ. المباشر تلطيخ استخدام tetramers APC أو PE مترافق أيضا قد ثبت للعمل4،22. وفي هذه الحالة، تركيز تيترامير MHC المطلوب أعلى من تلك المستخدمة في تلوين تيترامير غير المباشرة. في أيدينا، كان تركيز 20 ميكروغرام/مل من الجيش الشعبي الكونغولي المسمى تيترامير فعالة في الكشف عن خلايا محددة مستضد. ومع ذلك، كثافة المصبوغة كان أقل بكثير من التي تم الحصول عليها مع وضع العلامات غير المباشرة، التي تشمل التضخيم مع الأجسام المضادة-فيتك.
ووجدنا أن استخدام مبضع المستندة إلى ضغط (انظر الجدول للمواد) لقطع الأنسجة الطازجة خفت عملية قطع المقاطع الأنسجة الطازجة كمقارنة باستخدام مبضع من الاهتزاز في23. ومع ذلك، في الحالات التي لا تتوافر فيها مبضع المستندة إلى ضغط، مبضع أو مشرط تهتز يمكن استخدامها لتقطيع الأنسجة الطازجة.
قيداً رئيسيا من هذا الأسلوب هو استخدام أنسجة جديدة. استخدام أنسجة جديدة أكثر صعوبة من الأنسجة الثابتة أو المجمدة لأنها تتطلب اهتماما فوريا والتجهيز. ونحن قد شحنها بنجاح الأنسجة الطازجة بين عشية وضحاها على الجليد في زراعة الأنسجة المتوسطة أو برنامج تلفزيوني-حاء ومع ذلك، كانت هناك قضايا عرضية مع الشحن؛ على سبيل المثال، قد تأخر العواصف الثلجية شحن الأنسجة 48 ساعة أو أكثر. وفي هذه الحالات، وجدنا أن تظهر الأنسجة الطازجة مقطوع وأولئك الملون ح 48 بعد استخراج عموما تلوين المحددة، مع إشارات لبعض تدهور النسيج؛ الأنسجة الملون ح 72 بعد استخراج هي متدهورة جداً لتلطيخ. كما وجدنا أن شحنة أنسجة جديدة مع كتل الجليد التي باردة جداً أو جداً قريبة من الأنسجة يمكن تجميد الأنسجة أثناء الشحن؛ عموما هذا التجميد يدمر الأنسجة لتلطيخ. وهكذا، فمن بالغ الأهمية لشحن الأنسجة الطازجة مبردة، ولكن ليست مجمدة، والشروع في المحكمة العراقية الخاصة تلطيخ داخل 24 h. الأنسجة الطازجة تجهيز أيضا يتطلب قدرا كبيرا من الطلاب ووقت الموظفين، الأنسجة من الحيوانات متعددة أو المشاركين في الدراسة لا يمكن أن يكون التي تم جمعها والملون معا في وقت لاحق. وعلى الرغم من هذه الصعوبات، نجد أن المقاطع أنسجة جديدة هي أفضل خيار لجميل، محددة تلطيخ IST/المدينة.
تقييد آخر للمحكمة الخاصة العراقية/المدينة الأسلوب الموصوفة هنا هو النهج المصبوغة غير المباشرة. نظراً للقيود المفروضة على عدد أنواع الحيوانات المتوفرة لإنشاء مجموعات جسم الثانوية متميزة، نحن محدودة بجسم غير المباشرة تلطيخ أساليب لجسم الفلورسنت سوى ثلاث أو أربع تلطيخ تركيبات في وقت واحد. وهذا يحد من كمية المعلومات التي يمكن جمعها في أحد الأنسجة بلاطة. تلوين المدينة مباشرة يتغلب على هذا القيد ويمكن توسيع القدرات، الكشف عن مولدات الأجسام المضادة الموسومة ثمانية أو أكثر في وقت واحد، لكن مع كل جسم إنتاج إشارة فلورسنت أضعف بكثير مقارنة بأساليب غير مباشرة. وهكذا، المدينة غير المباشرة قد تستخدم كبديل للمدينة غير المباشرة كونتيرستينينج الأنسجة الملطخة بالمحكمة العراقية الخاصة، مما يسمح للكشف عن إعداد متزايدة من المستضدات الخلوية عندما جنبا إلى جنب مع المحكمة الخاصة العراقية الكشف عن الخلايا التائية CD8 حدة مستضد.
وفي بعض الحالات، قد تحدث أوتوفلوريسسينسي كبيرة و/أو ربط تيترامير أو جسم غير محدد مع المحكمة الخاصة العراقية/العش. وبسبب هذا، الضوابط الإيجابية والسلبية الجيدة ضرورية لتمييز البقع محددة من الخلفية وتلطيخ أوتوفلوريسسينت. السلبية جيدة ضوابط ل MHC أنا تيتراميرس تشمل الأنسجة المراقبة السلبية (مثل الأنسجة غير المصابة؛ والأنسجة ملطخة MHC أنا تحميل تيتراميرس مع الببتيدات غير ذات صلة أو غير ذات صلة MHC tetramers؛ أو في قرصه، الأنسجة ملطخة لا تيتراميرس ولكن مع تضخيم الأجسام المضادة).
وباختصار، IST MHC I جنبا إلى جنب مع المدينة أداة قيمة تحديد الموقع، ووفرة، والنمط الظاهري للخلايا التائية CD8 محددة مستضد في الأنسجة. تسمح هذه المنهجية للكشف عن الخلايا التائية CD8 محددة مستضد في البيئات الأصلية، مع التعريب النسبي لأنواع الخلايا والأنسجة الهياكل المحافظة الأخرى. هذا الأسلوب الواجب التطبيق على نطاق واسع لأنه يمكن استخدامه لترجمة، النمط الظاهري، وتحديد مقدار أساسا أي خلية CD8 T محددة مستضد التي MHC tetramers تتوفر، في أي أنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
أيد هذا العمل "خدمة الصحة العامة" منح من "معاهد الصحة الوطنية" (T32 DA007097، R01AI096966، andUM1AI26617).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MHC-I monomer | NIH tetramer core facility | Materials for MHC-tetramer preparation | |
| ExtrAvidin-FITC | Sigma-Aldrich | E2716 | Materials for MHC-tetramer preparation |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Low melt agarose | Promega | V3121 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | SLBL6391V | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-6878 | |
| Urea | J.T.Baker | 4204-05 | |
| Glycerol gelatin | Sigma-Aldrich | SLBH2672V | |
| n-propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| rat-a-h-CD8 (1:500) | Acris | 0714 | Antibody unstable, use single use frozen aliquot |
| m-a-h-CD20 (1:500) | NOVOCASTRA | 6026819 | |
| m-a-h-Ki67 (1:500) | Vector | 6022201 | |
| goat-a-m-A488 (1:2,000) | Jackson Immunoresearch | 124083 | |
| goat-a-rb-Cy3 (1:5,000) | Jackson Immunoresearch | 106232 | |
| goat-a-rat-Cy5 (1:5,000) | Jackson Immunoresearch | 118088 | |
| goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000) | Jackson Immunoresearch | 86579 | |
| Compresstome: VF-300 Microtome | Precisionary Instruments, LLC | 1079 | |
| Quick Set Instant Adhesive | Loctite | 46551 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon | 353226 | |
| Microscope slide | Globe scienfitic Inc. | #1321 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc | 121-6 | |
| Feather Disposable Scalpel | FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD. | No. 21 | |
| Round paintbrush #2 | PRINCETON ART & BRUSH CO. | 4350R | Can trim as needed with razor |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| FV10-ASW_Viewer4.0 | Olympus |
References
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen. J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Steinert, E. M., et al. Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance. Cell. 161 (4), 737-749 (2015).
- Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
- Haanen, J. B., et al. In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity. Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining using MHC class I tetramers. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).
- Li, Y., et al. Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors. Immunobiology. 216, 947-960 (2011).
- Bischof, F., et al. Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers. J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).
- Massilamany, C., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS ONE. 9, e87519 (2014).
- Massilamany, C., et al. In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers. J Vis Exp. (90), e51679 (2014).
- Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues. PLoS ONE. 10 (6), e0128862 (2015).
- Tjernlund, A., et al. In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques. Retrovirology. 7, 7-12 (2010).
- Connick, E., et al. CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue. J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).
- Hong, J. J., et al. Localized Populations of CD8low/− MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium. PLoS ONE. 4 (1), e4131 (2009).
- Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIVΔnef immunization and SIVmac251 vaginal challenge. PLoS ONE. 8 (12), e81623 (2013).
- Connick, E., et al. Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL. J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).
- Li, Q., et al. Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection. Science. 323, 1726-1729 (2009).
- Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ. J Vis Exp. (30), e1561 (2009).
- Li, S., et al. Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo. J Virol. 90, 11168-11180 (2016).
- Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
- Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response. Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).
- Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biol Proced Online. 17, (2015).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
