Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In Situ MHC-tetramer flekker og kvantitativ analyse for å fastslå plasseringen, overflod og fenotypen av Antigen-spesifikke CD8 T celler i vev

Published: September 22, 2017 doi: 10.3791/56130
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Veterinary and Biomedical Sciences, University of Minnesota

Summary

Her beskriver vi en metode som kombinerer i situ MHC-tetramer flekker med immunohistochemistry å bestemme lokaliseringen, fenotype, og antallet av antigen-spesifikke T-celler i vev. Denne protokollen brukes til å angi romlige og fenotypiske kjennetegn av antigen-spesifikke CD8 T-celler i forhold til andre celle type og strukturer i vev.

Abstract

T-celler er avgjørende for mange immunologiske prosesser, inkludert oppdage og fjerne virus-infiserte celler, forebygge autoimmunitet, bistå i B-celle og plasma-celle produksjon av antistoffer, og oppdage og eliminere kreftceller. Utviklingen av MHC-tetramer farging av antigen-spesifikke T-celler analysert av flowcytometri har revolusjonert vår evne til å studere og forstå immunobiology av T-celler. Mens det er svært nyttig for å bestemme antall og fenotypen av antigen-spesifikke T-celler, kan ikke flowcytometri bestemme den romlige lokaliseringen av antigen-spesifikke T-celler til andre celler og strukturer i vev, og gjeldende disaggregation teknikker for å ekstra T nødvendig celler for flowcytometri har begrenset effektivitet i ikke-lymfoid vev. In situ MHC-tetramer flekker (IST) er en teknikk for å visualisere T-celler som er spesifikke for antigener rundt i vev. I kombinasjon med immunohistochemistry (IHC), kan IST bestemme overflod, plasseringen og fenotypen av antigen-spesifikke CD8 og CD4 T celler i vev. Her beskriver vi en protokoll for flekken og nummerere antigen-spesifikke CD8 T celler, med bestemte fenotyper innenfor bestemte vev avdelinger. Disse prosedyrene er det samme som vi brukt i våre siste publikasjon av Li et al., med tittelen "Simian immunsviktvirus-produserende celler i hårsekkene er delvis undertrykt CD8+ celler i Vivo." Metodene beskrevet er bredt aktuelt fordi de kan brukes til å lokalisere, fenotype, og kvantifisere i hovedsak en antigen-spesifikke CD8 T celle som MHC tetramers er tilgjengelige, i alle typer vev.

Introduction

T-celler er avgjørende for mange immunologiske prosesser, inkludert oppdage og fjerne virus-infiserte celler, forebygge autoimmunitet, bistå i B-celle og plasma-celle produksjon av antistoffer, og oppdage og eliminere kreftceller. Utviklingen av peptid/MHC klasse I tetramer farging av antigen-spesifikke CD8 T celler1 og nyere utviklingen av MHC klasse II tetramer farging av CD4 T celler2 av flowcytometri revolusjonerte vår evne til å studere og forstå den immunobiology av T-celler. Mens det er svært nyttig for å bestemme antall og fenotypen av antigen-spesifikke T-celler, tillater flowcytometri ikke påvisning av den romlige lokaliseringen av antigen-spesifikke T-celler til andre celler og vev, og gjeldende Disaggregation teknikker for å trekke ut de T-cellene trengs for flowcytometri har begrenset effektivitet i ikke-lymfoid vev3.

Vi og andre har utviklet ved hjelp av peptid-lastet MHC, klasse I og klasse II tetramer eller multimer reagenser stain antigen-spesifikke CD8 og CD4 T celler i vev4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. disse IST metoder tillater fastsetting av plasseringen, overflod og fenotypen av antigen-spesifikke CD8 og CD4 T celler i vev og gir en måte å oppdage disse celler i forhold til andre celler og strukturer i vev. Vår gruppe har mye brukt MHC-jeg tetramer flekker for å studere humant immunsviktvirus (HIV)- og simian immunsviktvirus (SIV) - spesifikke CD8 T celler i lymfoide, genital og endetarms vev å få en forståelse av HIV og SIV immunopathogenesis og for å identifisere korrelerer vellykket vaksinasjon, strategier,14,,15,,16,,17. Dessuten, utviklet vi også en teknikk som kombinerer IST med i situ hybridisering (ISH) å lokalisere og kvantifisere virus-spesifikke CD8 T celler og virus-infiserte celler i vev og bestemme i vivo effektor til mål nivåer 18 , 19.

Her beskriver vi en protokoll som peptid-lastet MHC-jeg tetramers stain antigen-spesifikke CD8 T celler i ferskt vev deler, til counterstain vev bruker IHC og kvantifisere celler med bestemte fenotyper i bestemte vev avdelinger. Disse prosedyrene er det samme som ble brukt i våre siste publikasjon av Li et al., der vi bestemt plasseringen, overflod og fenotypen av SIV-spesifikke T celler i lymfoidvev under kronisk SIV infeksjon i aper20.

Til dette friskt vev er delt og ruges natten med peptid-lastet MHC-jeg tetramers konjugert til fluorescein thiocyanate molekyler (FITC). De er så fast i paraformaldehyde. Etter festing vevet, forsterkes signalet fra MHC-tetramers bruker kanin anti-FITC antistoffer og inkubert med fluorescently merket anti-kanin IgG antistoffer, som ytterligere forsterke signalet fra de bundne tetramers. IHC brukes i forbindelse med IST for å karakterisere antigen-spesifikke T celler og omkringliggende celler. Antistoffer som gjenkjenner epitopes på overflaten av celler eller ekstracellulær inn er inkludert i den primære inkubering med tetramers. Antistoffer som anerkjenner intracellulære epitopes krever gjennomtrengning av cellen vegg før flekker. Delene farget vev er fotografert ved hjelp av en AC confocal mikroskop og analysert ved hjelp av AC confocal programvare. Merket cellene er kvantifisert bruker AC confocal mikroskopi programvare eller ImageJ. Beskrevet protokollen kan brukes til å flekken i hovedsak en antigen-spesifikke CD8 T celle i alle typer vev for hvilke MHC-jeg tetramers er tilgjengelige.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. dag 1: friskt vev snitting og primære inkubasjon

  1. Bruk skalpell å kutte ferskt vev i små (ca 0,5 cm bred med 0,5 cm høy) stykker. Separat lim hver vev en stempelholderen og bygge dem inn med 3-5 mL 4% lav-smelte agarose i PBS. Etiketten stempelet vev informasjonen med et klistremerke. Legg den i en kjølt holder i en isen bøtte å størkne.
  2. Slår på mikrotomen og sett tykkelsen delene til 200 µm. installere et barberblad på mikrotomen og sett inn stempelet montert med vev i mikrotomen badekaret.
  3. Forberede fosfat-bufret saline med heparin (PBS-H) ved å legge til 100 µg/mL eller 18,7 U/mL heparin PBS å bevare RNA og potensielle ISH søknadene nedstrøms. Fylle mikrotomen badekaret, dekker den innebygde vev, med 100-120 mL kjølt, sterile PBS-H. Legge til PBS-H isbiter i badekaret å opprettholde temperaturen på 0 - 2 ° C. Start mikrotomen og kutt vevet i 200 µm seksjoner.
    Merk: Det er viktig å holde vev kjølt på is å minimere cellular aktivitet i vev og ferskt vev er lettere å delen når den er avkjølt. PBS alene kan brukes hvis det er ingen planer for nedstrøms ISH.
  4. Eventuelt vev som ikke klipp med en mikrotom (f.eks gut og lunge), bruke en skalpell eller barberblad til å kutte vevet i tynne strimler som nær som mulig til 200 µm.
  5. Etikett lokket på 24-og vev kultur plater med den eksperimentelle eksempelinformasjon og plasser vev kamrene i tilsvarende brønnene. Bruk en pensel til å overføre delene til en vev kammer satt i av en 24-og vev kultur plate inneholder 1 mL av kjølt PBS-H.
    Merk: Gjenbrukbare vev kamre bør gjøres før starter flekker. Vev kamre kan fremstilt benytter en 14 mL polypropylen runde bunn snapin-cap rør og wire netting. Bruk en skarp razor blad for å kutte bunnen av et 14 mL polypropylen runde bunn snapin-cap rør. Kuttet netting i en sirkel å passe hullet i bunnen av røret. Varme wire netting sirkelen med en Bunsen brenner til det er rødglødende. Sette ledning maske sirkelen svært raskt og skyv røret på nettet. Kontroller at netting er godt festet til bunnen av røret og forsiktig kutte av toppen av røret på 3 mL merket med en skarp barberblad. Sette opp til 3 vev deler inn hver vev kammeret, eller opp til 1 cm 2 av vev per brønn. Beholde minst én tom vel mellom brønner med forskjellige antistoff kombinasjoner for å unngå kryss-kontaminering.
  6. Fortsett til primært tetramer og antistoff flekker umiddelbart etter overføring av alle kutt deler i vev kamre. Holde delene neddykket og kjølt i 1 mL av PBS-H bestandig.
  7. Ruge delene vev over natten med 0,5 µg/mL FITC-konjugerte, peptid-lastet MHC-jeg tetramers fortynnet i PBS-H med 2% normal geit serum (NGS). Mus eller andre ikke-kanin antistoffer rettet mot ekstracellulære epitopes interesse denne inkubering (f.eks rotte anti-CD8 antistoffer fortynnet 1:500 i PBS-H med 2% NGS). Sett 1 mL av utvannet antistoffer i hver brønn.
    Merk: Må utvises forsiktighet når du velger CD8 antistoffer, som noen kan forbedre og noen kan hemme MHC tetramers binding til T-celle reseptorer 4 , 21. Rotte anti-CD8 antistoffer beskrevet her er ustabil og fører noen ganger litt svake flekker. Det er brukt her for trippel merking fordi det er den eneste ikke-kaninen og ikke-mus CD8 antistoff testet at farget rhesus macaque CD8 T celler.
  8. 1 mL løsning per brønn for den primære antistoff og alle etterfølgende incubations og utføre denne og alle etterfølgende incubations ved 4 ° C, med plater på en rocking plattform.
    Merk: Vev bør flyte fritt i kammeret.

2. Dag 2: Fiksering og sekundære inkubasjon

  1. den primære inkubasjon vaskes delene to ganger med 1 mL av kjølt PBS-H for 20 min hver vask. Gjør dette ved å overføre den vev kammer til en annen 24-og vev kultur plate inneholder 1 mL av kjølt PBS-H i tilsvarende brønnene.
    Merk: Vær forsiktig med å dryppe innholdet fra en eksperimentell utvalg til et annet når du flytter mellom vev kamre. Alle etterfølgende incubations og vasker, tilsvarende overføring vev kammeret til en ren plate som inneholder den riktige løsningen. Sørg for å overvåke delene i vev kamre under prosedyren for å sørge for at delene ikke står fast på sidene av vev kamre. Hvis de gjør, presse dem tilbake i løsningen.
  2. Fikse delene med 1 mL av fersk PBS-bufret 4% paraformaldehyde for 2 timer ved romtemperatur (ikke over fikse). Vask med kaldt PBS-H to ganger for 5 min.
    Forsiktig: Paraformaldehyde er giftig; bruke riktig personlig verneutstyr.
    Merk: Hvis antigen henting og permeabilization er nødvendig å oppdage intracellulær epitopes, antigener kan hentes ved å koke avsnittene i 0.01 mol urea etter paraformaldehyde fiksering.
  3. Overføre delene i 24-brønnen platene som inneholder 0,01 mol urea og plasser disse platene i en mikrobølgeovn. Kok delene tre ganger for ca 10 s hver, til sammen 30 s.
    Merk: Vær svært forsiktig, som kokende løsningen kan tvinge delene av brønnene. Hvis dette skjer, bruk en pensel til å presse delene fra sidene av vev kammeret eller lokket på platen tilbake i bunnen av den aktuelle vev chamber.
  4. Før til den sekundære antistoff inkubering, permeabilize og blokkere delene vev av rugende dem i blokkering løsning inneholder PBS-H, 0,3% vaskemiddel (PBS-T-T) og 2% NGS på en rocker 1t på 4 ° C. utføre påfølgende antistoff incubations med PBS-H-T/2% NGS.
  5. For den sekundære inkubering, overføre delene i vev kamre brønner som inneholder kanin anti-FITC antistoff fortynnet 1:10,000 i PBS-H-T/2% NGS. Ruge over natten.
  6. Utføre counterstaining bruker musen anti-CD20 antistoffet utvannet 1:200 i PBS-H-T/2% NGS. For dette alternativet, hente epitopes hvis nødvendig, gjennomsyre cellene og blokkere før denne inkubering, som beskrevet ovenfor.

3. Dag 3: Tertiær inkubasjon

  1. den andre inkubasjon vaskes avsnittene tre ganger i PBS-H ved 4 ° C i minst 20 min.
  2. Utfører en siste inkubasjon med riktig fluorescently merket antistoffer (f.eks geit anti-kanin konjugert grønnlig gul, geit anti-rotte konjugert langt rød farge og geit anti-musen konjugert grønt fargebad antistoffer fortynnes 1:5, 000, 1:5, 000, og 1:2, 000, i PBS-H-T/2% NGS). Ruge over natten.
    Merk: på dette punktet, inkubering kan forlenges i opptil tre dager hvis nødvendig. Holde delene beskyttet fra lys av innpakning platene i tinn folie under denne incubation trinn og deretter, som lyset slukker fluorophores.

4. Dag 4: Montering delene

  1. vask delene tre ganger i PBS-H i minst 20 min.
    Merk: Hvis planlegger nedstrøms ISH 19, fikse delene i 4% paraformaldehyde 1t å sikre tetramers og antistoffer på plass og deretter vaske delene to ganger med PBS-H i 5 min.
    Forsiktig: Paraformaldehyde er giftig; bruke riktig personlig verneutstyr.
  2. Bruker en pensel til å overføre delene til et mikroskop lysbilde. Pass på at du ikke rote vev for mye. Coat hver del med glyserol/gelatin som inneholder 4 mg/mL n-propyl gallate eller et annet montering medium som inneholder en fluorophore konserveringsmiddel. Dekk med en dekkglassvæske.
  3. Lagre lysbilder i en lys-beskyttet lysbildet beholder på -20 ° C. skyll vev kultur platene og fjerne etiketter på lokkene med alkohol.
    Merk: Platene kan gjenbrukes.

5. Oppkjøpet av AC Confocal mikroskop bilder

  1. fange høy oppløsning med en AC confocal mikroskop, bruker de riktige lasere og filtre for hver fluorophore ( figur 1A og B).
    Merk: I dette eksemplet AC confocal mikroskop (se Tabell for materiale) ble brukt. Bildene ble samlet bruker 561 nm laser på 20% effekt for grønnlig gul-merket antigen-spesifikke T celler, 488-nm laser ved 10% strøm for grønn-merket CD20-uttrykker B celler og 640-nm laseren på 15% strøm for langt rødt-merket CD8 T-celler. 20 X mål og en numerisk blenderåpningen på 0,8 ble brukt.
  2. Sekvensielt samle z-serien på 3 µm (eller andre) intervaller i de tre kanalene i flere 800 x 800 piksel-felt. Konstruere en montasje av feltene samlet ( figur 1 c -E). Gi hver montasje bilde basert på informasjon fra tilsvarende lysbildet og lagre for analyse.
  3. Utføre kvantitativ bildeanalyser ved hjelp av de respektive AC confocal mikroskop analyse og kvantifisering programvare eller ImageJ.

6. Kvantitativ Image Analysis

Merk: kvantitative bildeanalyser kan oppnås ved hjelp av AC confocal mikroskop analyse og kvantifisering programvare eller ved å bruke ImageJ programvare. Her ImageJ ble brukt som et eksempel.

  1. Åpne en AC confocal montasje ved å dra det til vinduet ImageJ ( figur 2A).
    Merk: ImageJ kan direkte åpne montasjer samlet av mange forskjellige AC confocal mikroskop. Hvis montasjen ikke kan åpnes direkte av ImageJ, eksporterer du valgte z-søket som en TIFF-fil for å åpne det.
  2. Dupliserer valgte z-skanningen for analyse (" bilde "-> " kopiere ") ( figur 2B).
  3. Deles de ulike kanalene (" bilde "-> " farge "-> " del opp kanaler ") ( figur 2C).
  4. Trekke Avkastningen for kvantitativ analyse i tilsvarende kanalen å være objektive og legge den til Avkastningen manager ved å trykke " T " på tastaturet. Mål området.
    Merk: Avkastningen leder av ImageJ viser området i µm 2 ( figur 2D).
  5. Juster fluorescens lysstyrken og kontrasten for kanalen som skal analyseres (" bilde "-> " Juster "-> " lysstyrke/kontrast ") ( figur 2E).
  6. Flat Avkastningen på bildet (" ROI manager "-> " trykke sammen ") ( figur 2F).
  7. Kvantifisere positiv cellene i bildet med den " multi-Point " verktøyet ( figur 2 g).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser hvordan du samler AC confocal bilder ved hjelp av en AC confocal mikroskop. Figur 2 viser kvantitative bildeanalyser med ImageJ. Tall 3 og 4 viser representant bilder av lymfeknute vev fra et SIV infisert rhesus macaque med MHC tetramers og CD8 antistoffer CD20 antistoffer, og tjene til å demonstrere spesifisiteten av den MHC-tetramer flekker. Figur 3 sammenligner MHC klasse I tetramers lastet med et peptid fra SIV sammenlignet deler fra samme vev beiset med MHC, klasse jeg tetramers lastet med en irrelevante peptid. Figur 4 viser at celler med MHC/SIV-peptid-tetramer co beiset med CD8 antistoffer, men ikke CD20 antistoffer, som stain B-celler. Figur 5 viser et eksempel på en montasje laget fra flere AC confocal z-serien felt brukes for kvantifisering av tetramer farget celler med bestemte fenotyper i ulike anatomiske rom på lymfeknute. Utvidelsen viser et område på lymfeknute med en B-cellen hårsekken preget av CD20 flekker og omkringliggende T celle sone, der MHC-tetramer-farget celler kan oppdages, hvorav co express Ki67 som er en markør for T celle aktivering og spredning. Denne flekker kombinasjonen kan fastsettelse av fenotypen av SIV-spesifikke CD8 T celler innenfor og utenfor B celle follicles, i forhold til SIV-spesifikke CD8 T celler og andre Ki67 uttrykke celler, og B-cellene.

Figure 1
Figur 1: Representant skjermbilder viser hvordan å samle AC Confocal bilder ved hjelp av en AC Confocal mikroskop. (A) oppkjøp modus brukes til å samle AC confocal bilder. (B) kanaler brukes for bildesamlingen. (C) 20 X mål og 800 x 800 piksel felt ble brukt i bildesamlingen. (D) en sekvensiell z-stack ble samlet inn i 3 µm intervaller. (E) fliser ble vedtatt å avgrense og samle inn bilder i flere felt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Representant skjermbilder demonstrere kvantitative bildeanalyse med ImageJ. (A) åpne en AC confocal montasje ved å dra det til vinduet ImageJ. (B) kopi valgte z-skanningen for analyse. (C) delt de ulike kanalene. (D) uavgjort Avkastningen for kvantitativ analyse i tilsvarende kanalen være objektiv og legge den til Avkastningen manager ved å trykke «T.» (E) justerer fluorescens lysstyrken og kontrasten for kanalen som skal analyseres. (F) trykke sammen Avkastningen på bildet. (G) antall positive celler i bildet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : IST kombinert med IHC i axillaris lymfeknute deler fra et SIV-infiserte Rhesus Macaque. Mamu - A * 02 tetramers lastet med SIV Nef YY9 peptider ble brukt stain antigen-spesifikke CD8 T celler og lignende tetramers lastet med en irrelevante FLP peptid fra hepatitt B-viruset ble brukt som en negativ kontroll (rød). Musen anti-CD20 antistoffer ble brukt stain CD20+ B celler (grønn), og rotta anti-CD8 antistoffer ble brukt stain CD8+ T celler (blå). (A) A representativt bilde fra en axillaris lymfeknute delen farget med YY9 tetramers, CD20 og CD8 antistoffer. (B) det samme bildet i panelet viser YY9 tetramer flekken alene. (C) representativt bilde av en inndeling fra samme axillaris lymph node, farget med FLP tetramers og CD20 og CD8 antistoffer. (D) det samme bildet i panelet C med FLP tetramer flekken alene. Skalere barer = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : IST kombinert med IHC viser spesifisitet av MHC-tetramer flekker. Representant axillaris lymfeknute delen med Mamu - A * 02 tetramers lastet med Nef YY9 peptider etiketten SIV-spesifikke CD8 T-celler (rød), mus anti-CD20 antistoffer mot etiketten B-celler (grønn) og rotten anti-CD8 antistoffer mot etiketten CD8 T celler (blå) (A ). Et SIV-spesifikke CD8 T celle er tetramer + (B) CD20- (C), og CD8+ (D). Skalere barer = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: IST kombinert med IHC vise plasseringen, overflod og fenotypen av Antigen-spesifikke CD8 T celler. (A) representant axillaris lymfeknute delen med Mamu - A * 02 tetramers lastet med Nef YY9 peptider å merke SIV-spesifikke CD8 T celler (rød), Ki67 antistoffer til å merke voksende celler (grønn) og IgM antistoffer til etiketten B celler (blå). Skala bar = 100 µm. (B) utvidelse av en valgt region i panelet A. IgM flekker definerer follikulær området, som er merket som "F;" området extrafollicular er merket som "LoF." Tetramer+ cellene angis med piler. Skala bar = 100 µm. Representative tetramer+ Ki67- -cellen (C, D, E) og tetramer+ Ki67+ celle (F, G, H). Skala bar = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

IST kombinert med IHC gir et viktig verktøy for oppdage karakterisere og kvantifisere antigen-spesifikke CD8 T celler i innfødte miljøer med konteksten av andre celler og vev strukturer. Her beskrevet vi detaljerte fremgangsmåter for IST kombinert med IHC, etterfulgt av kvantitative bildeanalyser, for å avgjøre plasseringen, overflod og fenotypen av antigen-spesifikke CD8 T celler i lymfeknutene fra rhesus aper. Lignende flekker kan brukes på menneskelig, mus eller andre arter vev for hvilke MHC-jeg tetramers er tilgjengelige. I tillegg utføres peptid MHC klasse II tetramer eller dextramer flekker med relativt lik metoder for å merke antigen-spesifikke CD4 T celler i vev4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. IST kan også kombineres med ISH å bestemme, for eksempel i vivo effektor til mål celle nivåer18,19. I fremtiden vil det være interessant å bære IST/IHC ytterligere ved å kombinere IST/IHC med Avansert i situ RNA og DNA gjenkjenning metoder. Nylige fremskritt innen i situ hybridisering analyser inkluderer utvikling av RNAscope og DNAscope24. Disse teknikkene tillater for deteksjon av mål RNA og DNA i vev. Det blir spennende å kombinere disse metoder med IST og IHC samtidig oppdage virus-spesifikke-CD8 T-celler, viral RNA, virus-DNA og antistoff-merket antigener rundt.

Mens vi opprinnelig beskrevet IST metoder med friskt vev, vev som var for en kort varighet og frosne vev4, de siste årene har vi utelukkende brukt ferskt vev seksjoner, som de konsekvent produserer høyeste kvalitet flekker og tillater undersøkelse av celler i tykk vev deler. Som et alternativ til prosedyrene presenteres her, en kan bruke tetramers vev, ruge over natten, fikse, bygge og cryopreserve i iskaldt middels (f.eks OCT), lage frosne tynne snitt og utføre IHC senere22. Tilsvarende vi flekken rutinemessig et delsett av vev seksjoner med tetramers alene og deretter fryse delene i oktober-tillater flere counterstaining kombinasjoner i fremtiden. I tillegg kan Qdot 655-konjugerte peptid-MHC multimers brukes til direkte visualisere antigen-spesifikke T celler i cryopreserved vev avsnitt13.

Vi har beskrevet her indirekte tetramer flekker. Direkte flekker bruker APC - eller PE-konjugerte tetramers har også vært vist å arbeide4,22. I dette tilfellet er konsentrasjonen av MHC tetramer kreves høyere enn i indirekte tetramer flekker. I våre hender var en konsentrasjon på 20 µg/mL APC-merket tetramer effektiv på å oppdage antigen-spesifikke celler. Men var flekker intensiteten mye lavere enn med indirekte merking, som inkluderer forsterkning med anti-FITC antistoffer.

Vi fant at bruk av en komprimering-baserte mikrotom (se Tabell for materiale) for ferskt vev kutte lettet prosessen med skjæring ferskt vev seksjonene som forhold til å bruke en vibrerende mikrotomen23. Men i tilfeller der en komprimering-baserte mikrotomen ikke er tilgjengelig kan en vibrerende mikrotomen eller skalpell brukes ferskt vev snitting.

En stor begrensning av denne teknikken er bruk av friskt vev. Bruke friskt vev er mye vanskeligere enn fast eller frosset vev fordi de krever umiddelbar oppmerksomhet og behandling. Vi har vellykket sendt friskt vev overnatter på isen i vev kultur medium eller PBS-H. Men har det vært sporadiske problemer med levering; for eksempel har snøen stormer forsinket leveringen av vev i 48 timer eller mer. I slike tilfeller fant vi at friskt vev delt og de farget 48 timer etter utvinning generelt viser spesifikk farging, tegn til dårligere vev; vev farget 72 h etter utvinning er også degradert til farging. Vi fant også at leveringen av friskt vev med isblokker som er for kaldt eller for nær vev kan fryse vev under transport; Denne frysing ødelegger generelt vevet til farging. Det er derfor svært viktig å sende friskt vev kjølt, men ikke frosset og starte IST flekker i 24 h. ferskt vev behandling også krever mye av student og ansatte tid, som vev fra flere dyr eller deltagerne ikke kan samlet og flekker på et senere tidspunkt. Til tross for vanskelighetene finner vi at ferskt vev delene er det beste valget for vakre, bestemte IST/IHC flekker.

En annen begrensning av de IST/IHC metoden beskrevet her er indirekte flekker tilnærming. På grunn av begrensninger på antall forskjellige arter av dyr tilgjengelig å generere sekundære antistoff kombinasjoner, er vi begrenset av indirekte antistoff flekker metoder til bare tre eller fire fluorescerende antistoff flekker kombinasjoner samtidig. Dette begrenser mengden informasjon som kan hentes på en vev skive. Direkte IHC flekker seirer denne begrensningen og kan utvide mulighetene, oppdage åtte eller mer antistoff-merket antigener samtidig, men med hver antistoff produksjon en mye svakere fluorescerende signal i forhold til indirekte metoder. Dermed kan indirekte IHC brukes som et alternativ til indirekte IHC for counterstaining IST-farget vev, slik at påvisning av økte antall mobilnettet antigener kombinert med de IST deteksjon av antigen-spesifikke CD8 T-celler.

I noen tilfeller oppstå betydelige autofluorescence og/eller ikke-spesifikk tetramer eller antistoff binding med IST/ISH. Derfor er god positive og negative kontroller nødvendig å skille bestemt flekker fra bakgrunn og autofluorescent flekker. God negative kontroller MHC jeg tetramers inkluderer negativ kontroll vev (f.eks uten vev; vev beiset med MHC jeg tetramers lastet med irrelevante peptider eller irrelevante MHC tetramers; eller i et knipetak, vev med nei tetramers men med forsterke antistoffer).

I sammendraget er MHC I IST kombinert med IHC et verdifullt verktøy for å avgjøre plasseringen, overflod og fenotypen av antigen-spesifikke CD8 T celler i vev. Denne metoden tillater påvisning av antigen-spesifikke CD8 T celler i innfødte miljøer, med den relative lokaliseringen til andre celletyper og vev strukturer opprettholdt. Denne metoden er bredt aktuelt fordi det kan brukes til å lokalisere, fenotype, og kvantifisere i hovedsak en antigen-spesifikke CD8 T celle som MHC tetramers er tilgjengelige, i alle typer vev.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av helsevesenet tilskudd fra National Institutes of Health (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MHC-I monomer NIH tetramer core facility Materials for MHC-tetramer preparation
ExtrAvidin-FITC Sigma-Aldrich E2716 Materials for MHC-tetramer preparation
Normal goat serum Jackson Immunoresearch 005-000-121
Low melt agarose Promega V3121
Heparin Sigma-Aldrich SLBL6391V
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-6878
Urea J.T.Baker 4204-05
Glycerol gelatin Sigma-Aldrich SLBH2672V
n-propyl gallate Sigma-Aldrich P3130
rat-a-h-CD8 (1:500) Acris 0714 Antibody unstable, use single use frozen aliquot
m-a-h-CD20 (1:500) NOVOCASTRA 6026819
m-a-h-Ki67 (1:500) Vector 6022201
goat-a-m-A488 (1:2,000) Jackson Immunoresearch 124083
goat-a-rb-Cy3 (1:5,000) Jackson Immunoresearch 106232
goat-a-rat-Cy5 (1:5,000) Jackson Immunoresearch 118088
goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000) Jackson Immunoresearch 86579
Compresstome: VF-300 Microtome Precisionary Instruments, LLC 1079
Quick Set Instant Adhesive Loctite 46551
24-well flat bottomed tissue culture plates Falcon 353226
Microscope slide Globe scienfitic Inc. #1321
Razor  blade Ted Pella, Inc 121-6
Feather Disposable Scalpel FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD. No. 21
Round paintbrush #2 PRINCETON ART & BRUSH CO. 4350R Can trim as needed with razor
Confocal Microscope Olympus FV1000
FV10-ASW_Viewer4.0 Olympus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  2. Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen. J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).
  3. Steinert, E. M., et al. Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance. Cell. 161 (4), 737-749 (2015).
  4. Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
  5. Haanen, J. B., et al. In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity. Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).
  6. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining using MHC class I tetramers. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
  7. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).
  8. Li, Y., et al. Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors. Immunobiology. 216, 947-960 (2011).
  9. Bischof, F., et al. Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers. J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).
  10. Massilamany, C., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS ONE. 9, e87519 (2014).
  11. Massilamany, C., et al. In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers. J Vis Exp. (90), e51679 (2014).
  12. Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues. PLoS ONE. 10 (6), e0128862 (2015).
  13. Tjernlund, A., et al. In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques. Retrovirology. 7, 7-12 (2010).
  14. Connick, E., et al. CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue. J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).
  15. Hong, J. J., et al. Localized Populations of CD8low/− MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium. PLoS ONE. 4 (1), e4131 (2009).
  16. Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIVΔnef immunization and SIVmac251 vaginal challenge. PLoS ONE. 8 (12), e81623 (2013).
  17. Connick, E., et al. Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL. J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).
  18. Li, Q., et al. Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection. Science. 323, 1726-1729 (2009).
  19. Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ. J Vis Exp. (30), e1561 (2009).
  20. Li, S., et al. Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo. J Virol. 90, 11168-11180 (2016).
  21. Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
  22. Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response. Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).
  23. Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biol Proced Online. 17, (2015).
  24. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).

Tags

Immunologi problemet 127 In situ tetramer flekker (IST) virus-spesifikke CD8 + T celler immunohistochemistry lokalisering fenotype AC confocal mikroskopi kvantitativ bildeanalyser
<em>In Situ</em> MHC-tetramer flekker og kvantitativ analyse for å fastslå plasseringen, overflod og fenotypen av Antigen-spesifikke CD8 T celler i vev
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, S., Mwakalundwa, G., Skinner, P. … More

Li, S., Mwakalundwa, G., Skinner, P. J. In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues. J. Vis. Exp. (127), e56130, doi:10.3791/56130 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter