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Cancer Research

CRISPR/Cas9 जीन संपादन का प्रयोग Cytokine निर्भर टेम कोशिकाओं में उत्परिवर्ती Calreticulin की Oncogenic गतिविधि की जांच करने के लिए

Published: January 5, 2018 doi: 10.3791/56726
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Division of Hematology, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Broad Institute, 3Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Medical School

Summary

CRISPR/Cas9 का उपयोग कर लक्षित जीन संपादन बहुत जीन के जैविक कार्यों की समझ में मदद की है । यहां, हम cytokine-निर्भर टेम कोशिकाओं में मॉडल calreticulin उत्परिवर्तनों के लिए CRISPR/Cas9 पद्धति का उपयोग करने के लिए उनके oncogenic गतिविधि का अध्ययन करने के लिए ।

Abstract

संकुल नियमित रूप से एक अंतराल लघु palindromic दोहराता (CRISPR) prokaryotes में एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली है कि वैज्ञानिकों द्वारा आरएनए-निर्देशित nucleases, जैसे CRISPR-संबद्ध (कैस) साइट के लिए विशिष्ट युकेरियोटिक जीनोम के लिए 9 उत्पंन करने के लिए पुनर्जीवित किया गया है संपादन. Cas9 द्वारा जीनोम इंजीनियरिंग कुशलता, आसानी से और मजबूती से कई बायोमेडिकल-प्रासंगिक स्तनधारी सेल लाइनों और जीवों में अंतर्जात जीन को संशोधित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । यहां हम कैसे CRISPR/Cas9 पद्धति का उपयोग करने के लिए विशिष्ट आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के जैविक कार्य को समझने का एक उदाहरण दिखाते हैं । हम मॉडल calreticulin (CALR) murine interleukin में उत्परिवर्तनों-3 (मिल-3) आश्रित प्रो-बी (Ba/एकल गाइड RNAs (sgRNAs) के वितरण द्वारा कोशिकाओं विशिष्ट क्षेत्र में अंतर्जात CALR लोकस लक्ष्यीकरण जहां सम्मिलन और/या विलोपन (indel ) CALR उत्परिवर्तनों myeloproliferative ट्यूमर (सीपीसीबी), रक्त कैंसर का एक प्रकार के साथ रोगियों में होते हैं । sgRNAs डबल किनारा टूट जाता है (DSBs) में लक्षित क्षेत्र है कि गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने (NHEJ) के लिए विभिंन आकारों की indels देने के द्वारा मरंमत कर रहे है बनाएं । हम तो टेम सेलुलर परिवर्तन पर Calr उत्परिवर्तनों के शारीरिक स्तर की अभिव्यक्ति के प्रभाव को समझने के लिए मानक बीए/F3 सेलुलर परिवर्तन परख रोजगार । यह दृष्टिकोण अन्य जीनों के लिए लागू किया जा सकता विभिन्न स्तनधारी सेल लाइनों में उनके जैविक समारोह का अध्ययन करने के लिए.

Introduction

CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी हाल ही में रहने वाले कोशिकाओं और जीवों में लक्षित जीनोम संपादन क्रांति की है । यह जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए एक अत्यंत शक्तिशाली उपकरण बन गया है और वर्तमान में आनुवंशिक रोगों1की चिकित्सा के लिए एक संभावित एवेंयू के रूप में उपयोग किया जा रहा है । सभी जीनोम संपादन उपकरण के लिए आधार जीनोमिक लोकस में एक nuclease प्रेरित डीएनए डबल असहाय तोड़ (DSB) के निर्माण पर निर्भर करता है संशोधित किया जाना है । DSBs नॉन-मुताबिक़ एंड-जॉइनिंग (NHEJ) या समरूपता-निर्देशित मरंमत (HDR)2,3द्वारा सुधारा जा सकता है । ऐसे जस्ता फिंगर nucleases (ZFNs) और प्रतिलेखन उत्प्रेरक जैसे प्रभाव nucleases (TALENs) के रूप में अंय जीनोम इंजीनियरिंग nucleases, पर Cas9 nuclease का लाभ एक वांछित डीएनए अनुक्रम को nuclease लक्ष्यीकरण के लिए आरएनए पर अपनी निर्भरता है, तुलना प्रोटीन के लिए-डीएनए ZFNs और TALENs2,3में पाया बातचीत ।

prokaryotic कोशिकाओं में एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के रूप में CRISPR/Cas9 nuclease मार्ग की खोज के बाद4,5, बहुत प्रयास स्तनधारी सेल लाइनों और मॉडल जीवों2में उपयोग के लिए मार्ग ढालने में चला गया है, 3. जीन संपादन के लिए एक उपकरण के रूप में, CRISPR/Cas9 मार्ग दो मुख्य घटकों का इस्तेमाल करता है: स्ट्रेप्टोकोकस pyogenes (सपा) Cas9 nuclease और ब्याज2,3के जीन लक्ष्यीकरण sgRNAs व्युत्पंन । sgRNA 20 न्यूक्लियोटाइड के होते है कि आरएनए के माध्यम से जीनोम पर एक विशिष्ट साइट के लिए प्रत्यक्ष Cas9-डीएनए बेस जोड़ी complementarity2,3। sgRNA के लक्ष्य साइट 5 ' NGG, जो SpCas9 nuclease द्वारा मांयता प्राप्त है के रूप में एक protospacer आसंन आकृति (पाम) साइट के निकट झूठ चाहिए । इन उपकरणों के साथ, Cas9 sgRNAs डिजाइन द्वारा किसी भी डीएनए अनुक्रम के लिए निर्देशित किया जा सकता है कि ब्याज के क्षेत्र को लक्षित । एसपी व्युत्पन्न Cas9 के अलावा, विशिष्ट अनुप्रयोग के आधार पर विभिन्न सुविधाओं के साथ Cas9 के लिए अतिरिक्त वेरिएंट हैं. उदाहरण के लिए, पर लक्ष्य संपादन या डीएनए के लिए एकल-किनारा क्लीवेज क्षमता6,7के लिए उच्च विशिष्टता के साथ Cas9 वेरिएंट हैं । इसके अलावा, उत्प्रेरक निष्क्रिय Cas9 हाल ही में transcriptional विनियमन8के लिए विकसित किया गया है । वैज्ञानिकों ने अब ऐसे जीन knockin और नॉकआउट के रूप में आवेदनों की एक किस्म के लिए CRISPR/Cas9 प्रणाली का इस्तेमाल किया है जीन9के जैविक कार्यों का अध्ययन, हानि-समारोह और लाभ के समारोह पुस्तकालय स्क्रीन10 और आनुवंशिक मॉडल जीवों की इंजीनियरिंग11.

इस प्रोटोकॉल में, हम CRISPR/Cas9 पद्धति को बीए/F3 सेलुलर परिवर्तन परख के साथ गठबंधन के लिए CALR उत्परिवर्तनों के जैविक समारोह को समझते हैं । Ba/F3 कक्ष एक murine il-3 निर्भर टेम सेल लाइन है कि BCR-ABL12जैसे कुछ oncogenes की अभिव्यक्ति पर स्वतंत्र IL-3 गाया जा सकता है । आदेश में समझने के लिए कि उत्परिवर्ती calreticulin cytokine स्वतंत्र विकास के लिए बीए/F3 कोशिकाओं को बदल सकते हैं, हम अंतर्जात के एक्सॉन 9 लक्षित Calr/लोकस का उपयोग CRISPR उत्परिवर्तनों को लागू करने के लिए Cas9/ recapitulating लाभ के लक्ष्य के साथ सकारात्मक चयन दबाव, समारोह के CALR उत्परिवर्तनों सीपीसीबी रोगियों में पाया. प्रोटोकॉल डिजाइन, क्लोनिंग और sgRNAs के वितरण, स्थिर Cas9 व्यक्त कोशिकाओं के विकास और CRISPR के लिए स्क्रीनिंग पर लक्ष्य जीन संपादन शामिल हैं । इस प्रोटोकॉल अलग जीन और विभिंन cytokine ब्याज की सेल लाइनों पर निर्भर लागू किया जा सकता है और विशेष रूप से मॉडलिंग में मूल्यवान है और कैंसर में शामिल जीन के जैविक समारोह का अध्ययन ।

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Protocol

1. sgRNA डिजाइन ऑनलाइन उपकरण13 का उपयोग

  1. डिजाइन sgRNAs स्वतंत्र रूप से उपलब्ध ऑनलाइन उपकरण का उपयोग कर ब्याज की जीन लक्ष्यीकरण ।
    1. कॉपी और व्यापक संस्थान sgRNA डिजाइनर वेब उपकरण में ब्याज की जीन के NCBI संदर्भ अनुक्रम चिपकाएं: (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) ।
      नोट: यह उपकरण exons भीतर दरार साइटों के साथ sgRNA दृश्यों की पहचान करता है और उन है कि intron/एक्सॉन सीमा अवधि लेकिन अभी भी एक्सॉन भीतर सट ।
    2. डाउनलोड करें और excel में पाठ आउटपुट फ़ाइल खोलें ।
    3. sgRNA अनुक्रम और sgRNA प्रसंग अनुक्रम के साथ पॉपुलेटेड स्तंभों पर फ़ोकस करें । ध्यान दें कि sgRNA अनुक्रम protospacer आसंन आकृति (पाम) शामिल नहीं है, लेकिन संदर्भ दृश्यों करते हैं ।
    4. ध्यान दें कि ऑन-टारगेट प्रभावकारिता स्कोर 0 से 1 के पैमाने पर अनुमानित क्लीवेज दक्षता स्कोर को सूचीबद्ध करता है जहां 1 का स्कोर एक उच्च दरार क्षमता को समझाता है ।
    5. या तो ' लक्ष्य कट% ' कॉलम के माध्यम से लक्ष्य के जीन के भीतर प्रभावकारिता स्कोर या स्थान के आधार पर लक्ष्य के आदेश के लिए एक्सेल के ' सॉर्ट ' समारोह का प्रयोग करें ।
      नोट: जीन के भीतर स्थान से छंटाई sgRNAs है कि एक विशिष्ट डोमेन या ब्याज की एक्सॉन लक्ष्य की पहचान के लिए उपयोगी है ।
    6. 3-6 sgRNAs का चयन करें जो उच्च (> 0.6) पर-लक्ष्य प्रभावकारिता स्कोर के साथ रुचि के क्षेत्र को लक्षित करता है । यह पता है कि उत्परिवर्तनों के प्रकार phenotype कि वांछित है के लिए जिंमेदार हो सकता है उपयोगी हो सकता है (कृपया देखें चित्रा 1 calreticulin के लिए इस्तेमाल किया लक्ष्यीकरण रणनीति समझा) ।
      नोट: sgRNAs नीचे सुझाए गए ०.६ प्रभावकारिता स्कोर दहलीज पर विचार किया जाना चाहिए जब वहाँ अन्य अच्छे उम्मीदवारों की कमी है ।
    7. संभावित बंद-लक्ष्य प्रभाव (http://crispr.mit.edu/) के लिए स्क्रीन करने के लिए एमआईटी gRNA विश्लेषण वेब उपकरण का उपयोग करें । प्रत्येक चयनित sgRNA के लिए, लक्ष्य अनुक्रम (पाम सहित) चलाते हैं ।
      नोट: व्यापक संस्थान sgRNA डिजाइनर वेब उपकरण भी बंद-लक्ष्य प्रभाव (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) के लिए स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
      1. ध्यान दें कि एमआईटी sgRNA विश्लेषण उपकरण 1-100 के पैमाने पर प्रत्येक sgRNA स्कोर जहां १०० का स्कोर उच्च विशिष्टता का अर्थ है । एक स्कोर से अधिक ७० आदर्श है और न्यूनतम बंद-लक्ष्य प्रभाव के साथ एक sgRNA का प्रतिनिधित्व करता है । इस वेबसाइट भी जीनोम के भीतर अपने स्थान के साथ बंद लक्ष्य हिट की एक सूची उत्पंन करता है और कितने बेमेल वे प्रत्येक उंमीदवार गाइड के साथ है ।
        नोट: चार बेमेल या अधिक के साथ ऑफ-टारगेट हिट को14सुरक्षित माना जाता है । यदि वे exons14के भीतर गिर जाते हैं, तो चार से कम बेमेल के साथ ऑफ़-टारगेट हिट समस्याग्रस्त हो सकते हैं ।
    8. चुनें 2-3 sgRNAs जो लक्ष्य जीन के लिए ब्याज के क्षेत्र के भीतर अलग स्थानों को लक्षित है, और जो सबसे अधिक बनती दरार दक्षता और बंद लक्ष्य स्कोर (देखें तालिका 1 sgRNA अनुक्रम के लिए एक्सॉन 9 लक्ष्यीकरण Calr) ।
      नोट: प्रयोगात्मक लक्ष्यों के आधार पर, अधिक से अधिक जोर उल्लेख उपकरण से प्राप्त विभिंन मूल्यों पर रखा जा सकता है ।

2. क्लोनिंग sgRNA ओलिगोस्पर्मिया13

  1. आगे oligo जनरेट करें
    1. पाम साइट के बिना sgRNA अनुक्रम की एक सूची बनाएं ।
    2. sgRNA अनुक्रम के 5 ' अंत में एक जी नहीं है, तो अनुक्रम के 5 ' अंत करने के लिए कोई g जोड़ें ।
      नोट: यह जी U6 संचालित sgRNA प्रतिलेखन स्तर अधिकतम करने के लिए आवश्यक है । एम1 sgRNA (तालिका 1) के लिए एक G के अलावा आवश्यक है ।
    3. अनुक्रम "CACC" G-अनुकूलित गाइड अनुक्रम (कोई पाम) के 5 ' अंत करने के लिए जोड़ें (तालिका 2) BsmBI में annealed ओलिगोस्पर्मिया के बंधाव के लिए आवश्यक फांसी को उत्पन्न करने के लिए पच lentiGuide वेक्टर (चरण 3 देखें).
  2. रिवर्स oligo जनरेट करें
    1. रिवर्स जी अनुकूलित गाइड अनुक्रम (कोई पाम) पूरक ।
    2. अनुक्रम "AAAC" रिवर्स पूरित G-ऑप्टिमाइज़ किया गया मार्गदर्शिका अनुक्रम (तालिका 2) के 5 ' अंत में जोड़ें ।
    3. एक प्राइमरी संश्लेषण कंपनी से डिजाइन ओलिगोस्पर्मिया आदेश ।
  3. एनएन और phosphorylate ओलिगोस्पर्मिया
    1. आगे oligo के 1 µ l को जोड़ें (१०० µ m), 1 µ l के रिवर्स oligo (१०० µ मीटर), 1 µ l की 10x टी-4 बंधाव बफर, ०.५ µ एल के टी-4 polynucleotide कळेनासे (PNK) और ६.५ µ l के H2O करने के लिए एक पीसीआर ट्यूब (Total = 10 µ l).
    2. thermocycler में निंनलिखित कार्यक्रम चलाएं: ३७ ˚ सी के लिए 30 मिनट, ९५ ˚ सी के लिए 5 मिनट, रैंप पर ९५ से 25 में ०.१ डिग्री सेल्सियस/
    3. एच2ओ में 1:250 पर प्रतिक्रिया उत्पाद पतला ।

3. lentiGuide के पाचन-पूरो वेक्टर13

  1. डाइजेस्ट lentiGuide-पूरो वेक्टर
    1. निंनलिखित घटकों के साथ एक ५० µ l पाचन प्रतिक्रिया इकट्ठा: 5 परिपत्र प्लाज्मिड के µ g, 2 µ l (30 इकाइयों) के BsmBI प्रतिबंध एंजाइम, 5 µ एल के प्रतिबंध एंजाइम बफर और अप करने के लिए ५० µ एल के एच2ओ.
    2. ५५ डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए प्रतिक्रिया चलाएँ. पहले घंटे के बाद, जोड़ें 1 µ l अधिक BsmBI प्रतिबंध एंजाइम की.
  2. कट रीढ़ Dephosphorylate
    1. फॉस्फेट प्रतिक्रिया बफर के 7 µ एल और फॉस्फेट एंजाइम के 2 µ एल को पचा वेक्टर जोड़ें ।
    2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
  3. पीसीआर एक वाणिज्यिक किट का उपयोग काट और dephosphorylated रीढ़ शुद्ध ।
    नोट: इन बेहतर बड़े प्लाज्मिड आकार को समायोजित कर सकते है के बाद से miniprep किट नीले रंग के कॉलम के साथ प्रदान की गुलाबी रंग का कॉलम स्थानापन्न । यील्ड से पहले एक ९० ˚ सी हीट ब्लॉक में रेफरेंस बफर को गर्म करके रेफरेंस से बढ़ाई जा सकती है और अंत में दो बार कॉलम से डीएनए को eluting करके (eluted डीएनए को एक दूसरी बार के जरिए पहले रेफरेंस से वापस चलाया जा सकता है).

4. बंधाव ofAnnealed ओलिगोस्पर्मिया में पचता रीढ़13

  1. पच रीढ़ की ५० एनजी जोड़ें, annealed oligo कमजोर पड़ने के 1 µ एल, 10x टी-4 बंधाव बफर के 1 µ एल, टी-4 µ के 1 ligase एल और अप करने के लिए 10 µ एल के H2एक पीसीआर ट्यूब करने के लिए । कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मशीन
  2. बंधाव प्रतिक्रिया के 2 µ l के साथ Stbl3 कोशिकाओं को रूपांतरित करना. एक lysogeny शोरबा पर प्लेट (पौंड) १०० µ जी के साथ प्लेट आगर/एमएल एम्पीसिलीन और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
  3. एक मिनी तैयारी संस्कृति में 3 कालोनियों और लगाना उठाओ ।
  4. मांय सही oligo लन
    1. एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर U6 प्रमोटर में एक प्राइमर से शुरू oligo प्रविष्टि साइट के माध्यम से प्रत्येक संस्कृति और अनुक्रम के लिए एक miniprep प्रदर्शन करते हैं ।
    2. एक midi-प्रस्तुत करने या अनुक्रम-सत्यापित संस्कृति का एक मैक्सी-प्रस्तुत करने का कार्य ।

5. कोशिका lLines छुरा SpCas9 व्यक्त की पीढ़ी

नोट: इस प्रोटोकॉल lentiviral संक्रमण द्वारा pLX_TRC311-Cas9 प्लाज्मिड के वितरण शामिल है । इस प्रोटोकॉल murine interleukin-3 (मिल-3) आश्रित प्रो-B (Ba/F3) कक्षों, एक निलंबन कक्ष पंक्ति के लिए विस्तार से वर्णन किया गया है और प्रत्येक कक्ष प्रकार के लिए पसंदीदा culture शर्तों का उपयोग कर अंय कक्ष प्रकारों के लिए अनुकूलित हो सकता है । Ba/F3 कोशिकाओं के लिए संस्कृति माध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% पेनिसिलिन/streptomycin/L-glutamine और 10 murine interleukin 3 के एनजी/एमएल के साथ पूरक RPMI के होते हैं ।

  1. Transfect HEK-293T कोशिकाओं
    1. 10 सेमी टिशू कल्चर डिश प्रति बीज 3 एक्स 106 HEK-293T कोशिकाओं । अभिकर्मक से पहले बीज वाले कक्षों को रात भर रखें ।
      नोट: HEK-293T कोशिकाओं एक अनुयाई सेल लाइन और नियमित रूप से वायरस के उत्पादन के लिए उपयोग किया जाता है । कोशिकाओं को 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% पेनिसिलिन/streptomycin/L-glutamine के साथ पूरक DMEM में बनाए रखा जाता है । कोशिकाओं अभिकर्मक के समय में ८०% धाराप्रवाह होना चाहिए ।
    2. पूर्व गर्म कम सीरम मीडिया (Opti-मेम) और विकास माध्यम ।
    3. कम सीरम मीडिया के ५०० µ l जोड़ें, pLX_TRC311 के 7 µ g-Cas9 का निर्माण, 4 µ g के pCMV-VSV-g lentiviral पैकेजिंग प्लाज्मिड और 4 µ g के psPAX2 lentiviral पैकेजिंग प्लाज्मिड एक ट्यूब में
      नोट: 293T कोशिकाओं की 10 सेमी डिश प्रति कुल डीएनए 15 µ जी है ।
    4. डीएनए को अच्छी तरह मिलाएं और अभिकर्मक रिएजेंट के ४५ µ l को जोड़ें । धीरे मिश्रण और यह 20 मिनट के लिए खड़े हो जाओ ।
      नोट: सीरम अभिकर्मक रिएजेंट और प्लाज्मिड डीएनए के बीच जटिल गठन को बाधित करेगा क्योंकि यह कम सीरम मीडिया का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
    5. पुराने मीडियम को 293T प्लेट में महाप्राण और उसमें 5 एमएल का नया ग्रोथ मीडियम डालें ।
    6. 293T प्लेट के लिए एक बूंद बुद्धिमान तरीके से डीएनए और अभिकर्मक रिएजेंट मिश्रण जोड़ें । धीरे भंवर और ३७ ° c और 5% CO 24 h के लिए2 पर मशीन ।
    7. हार्वेस्ट वायरल 24 और ४८ एच पोस्ट अभिकर्मक में supernatants । एक ०.२२ µm फिल्टर के माध्यम से दर्रा और एक cryovial ट्यूब में aliquot (१.६ एमएल/ट्यूब और १.५ एमएल संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा) ।
    8. -८० डिग्री सेल्सियस पर वायरल supernatant स्टोर ।
      नोट: 6 महीने के अंदर lentiviral supernatant का इस्तेमाल किया जा सकता है । यदि संभव हो, spinfection transductions ताजा वायरस के साथ किया जाना चाहिए) ।
  2. बा/F3 कोशिकाओं के Lentiviral संक्रमण
    1. बर्फ पर वायरल supernatant गल जाए, अगर जम जाए.
    2. 4 मिनट के लिए ३०० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक ।
    3. महाप्राण supernatant और 3 एक्स 106 कोशिकाओं के एक एकाग्रता पर कोशिकाओं को reसस्पैंड/एमएल ।
    4. reसस्पैंड कोशिकाओं के ५०० µ एल जोड़ें, वायरल supernatant के १.५ मिलीलीटर, polybrene के 4 µ एल (स्टॉक: 2 मिलीग्राम/एमएल) और 10 एम के एनजी/एमएल-IL3 एक 6-well टिशू कल्चर की थाली में । एक नियंत्रण के रूप में वायरल supernatant के बजाय मीडिया के १.५ मिलीलीटर के साथ एक संक्रमित अच्छी तरह से शामिल करने के लिए सुनिश्चित करें ।
      नोट: वायरल supernatant की मात्रा में संक्रमण की बहुलता (मुि) < 1 के अनुरूप होना चाहिए ।
    5. ३७ डिग्री सेल्सियस पर १२० मिनट के लिए ४४० x g पर थाली केंद्रापसारक ।
    6. थाली से बाहर ले लो और ३७ ° c और 5% CO2 मशीन में जगह और रात भर बढ़ने की अनुमति ।
    7. 24 घंटे के बाद कोशिकाओं नीचे स्पिन, और एक 6-अच्छी तरह से थाली में ताजा गर्म मीडिया के 5 मिलीलीटर के साथ reसस्पेंड ।
  3. Cas9 संक्रमित कोशिकाओं का चयन
    1. कोशिकाओं नीचे स्पिन और ताजा गर्म 5 µ g/एमएल blasticidin, ४८ एच पोस्ट spinfection के साथ पूरक मीडिया के साथ reसस्पेंड ।
    2. blasticidin के साथ 9 दिनों के लिए या संक्रमित (ऋणात्मक) नियंत्रण कक्ष मृत होने तक कक्षों का चयन करें ।
    3. एक बार चयन पूरा हो गया है, blasticidin के कम एकाग्रता के साथ मध्यम करने के लिए प्रतिरोधी कोशिकाओं हस्तांतरण ।

6. Cas9 गतिविधि के लिए रिपोर्टर परख15

  1. Transduce पैतृक कोशिकाओं और कोशिकाओं छुरा lentiviral संक्रमण द्वारा pXPR-011 के साथ Cas9 व्यक्त (कदम 5.1-5.2 देखें) ।
    नोट: इस वेक्टर GFP और एक गाइड लक्ष्यीकरण GFP दोनों शामिल हैं । सक्रिय Cas9 वाले कक्ष GFP (आरेख 2) की कमी में परिणाम देंगे ।
  2. 2 µ g/mL ऑफ puromycin, ४८ एच पोस्ट spinfection के साथ 3 दिनों के लिए कक्षों का चयन करें ।
  3. प्रवाह cytometry द्वारा GFP अभिव्यक्ति के लिए नमूनों का विश्लेषण ।
    नोट: ५०% या अधिक की एक GFP कमी इष्टतम Cas9 गतिविधि का प्रतिनिधित्व करता है । blasticidin चयन की एक उच्च एकाग्रता Cas9 गतिविधि को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अगर एक ५०% कटौती से कम मनाया जाता है । सभी कक्ष पंक्तियां blasticidin चयन को बर्दाश्त नहीं कर सकती । इस मामले में, अन्य चयन कैसेट्स के साथ Cas9 वैक्टर का उपयोग आवश्यक हो सकता है. इसके अलावा, नहीं सभी सेल लाइनों Cas9 की स्थिर अभिव्यक्ति बर्दाश्त कर सकते हैं । इस स्थिति में, Cas9 का परिवर्तनीय अभिकर्मक उपयोग किया जा सकता है ।

7. Cas9 व्यक्त कोशिकाओं में sgRNAs के Spinfection

  1. चरणों का पालन करें 5.1-5.2 ब्याज की कोशिकाओं में sgRNAs के lentiviral संक्रमण के लिए ।
    नोट: चरण 5.1.3 में, बदलें pLX_TRC311-Cas9 के साथ निर्माण lentiGuide-पूरो के साथ निर्माण मांय अनुभाग 4 ।
  2. ४८ एच पोस्ट spinfection, 2 µ g/एमएल puromycin के साथ 3 दिनों के लिए कोशिकाओं का चयन करें ।
  3. एंटीबायोटिक दवाओं के कम एकाग्रता के साथ मध्यम करने के लिए प्रतिरोधी कोशिकाओं हस्तांतरण और एक और 4 दिनों के लिए चयन जारी रखने के लिए पर्याप्त संपादन के लिए अनुमति देते हैं ।

8. बा/F3 सेलुलर परिवर्तन और एम-IL3 वापसी का उपयोग कर सकारात्मक चयन

नोट: यह परख मिल के लिए वर्णित है-3 निर्भर बीए/लेकिन किसी भी cytokine निर्भर सेल लाइन के लिए लागू किया जा सकता है ।

  1. नीचे स्पिन तेजी से बढ़ रही बा/ectopically व्यक्त Cas9 और ब्याज की sgRNA ।
  2. महाप्राण supernatant और कोशिकाओं के साथ 5 मिलीलीटर फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) धोने ।
  3. कोशिकाओं नीचे स्पिन और ८.२ चार बार में धो कदम दोहराएं (यह कदम यह सुनिश्चित करता है कि मीडिया IL-3 से मुक्त है) ।
  4. महाप्राण और ताजा मीडिया के 5 मिलीलीटर में आईएल-3 के बिना कोशिकाओं reसस्पेंड ।
  5. किसी hemocytometer या कक्ष व्यवहार्यता विश्लेषक का उपयोग करके कक्षों की गणना करना.
  6. बीज तपसिल में एक 6-well टिशू कल्चर प्लेट में 1 x 10 के एक एकाग्रता में5 कोशिकाओं/एमएल-3 के बिना ताजा मीडिया के 2 मिलीलीटर की कुल मात्रा में ।
  7. मॉनिटर और कोशिकाओं की गिनती 8 दिनों की कुल के लिए हर 2 दिन ।
    नोट: बा/कोशिकाओं की कमी il-3 आमतौर पर 2 दिनों के बाद il-3 भुखमरी मर जाते हैं । यह (आमतौर पर एक गैर लक्ष्यीकरण गाइड एक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है) परख में एक नकारात्मक नियंत्रण शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

9. CRISPR के लिए स्क्रीनिंग पर लक्ष्य संपादन

  1. डिजाइन CRISPR स्क्रीनिंग प्राइमरों नदी के ऊपर और sgRNA दरार साइट के बहाव
    नोट: का प्रयोग करें प्राइमरों की भविष्यवाणी की दरार साइट से कम से १०० बीपी का पता लगाने के लिए एक बड़ी प्रविष्टि द्वारा प्रभावित नहीं किया जाएगा सुनिश्चित करने के लिए और/या विलोपन (indel) sgRNA लक्ष्य साइट पर ।
  2. जीनोमिक डीएनए (gDNA) रूपांतरित कक्षों से अलग करें (वृद्धि वक्र के अंत में) और कक्षों से पूर्व-cytokine आहरण.
    नोट: हमेशा गैर-लक्ष्यीकरण मार्गदर्शिका को जीन संपादन के नियंत्रण के रूप में अभिव्यक्त करने वाले कक्षों को शामिल करें. से पहले और परिवर्तन के बाद कोशिकाओं से अलग gDNA क्लोन है कि सकारात्मक के लिए चुना गया था और एक प्रफलन लाभ है की पहचान करेगा ।
  3. निंनलिखित घटकों के साथ एक ५० µ एल पीसीआर इकट्ठा: 2x पीसीआर मिक्स के 25 µ एल, फॉरवर्ड प्राइमरी के 1 µ एल (10 µ मीटर), रिवर्स प्राइमर के 1 µ एल (10 µ मीटर), gDNA के 50-100 एनजी, और एच2O अप करने के लिए ५० µ एल ।
    नोट: कई उच्च-निष्ठा polymerases चरण ९.३ में उपयोग किया जा सकता है ।
  4. एक thermocycler में नमूने निम्न पैरामीटर का उपयोग करके चलाएँ: 95 ° c 1 मिनट के लिए, (९४ ° c के 1 मिनट के लिए, 30 s के लिए ५२ ° c, 30 s के लिए ७२ ° c), और 10 मिनट के लिए ७२ ° c । यह पीसीआर 3 तालिकामें सूचीबद्ध Calr प्राइमरों के लिए अनुकूलित है । यह gDNA पर परीक्षण के आधार पर चरण ९.१ में डिजाइन प्राइमरी जोड़ी के लिए पीसीआर शर्तों का अनुकूलन ।
  5. 10 V/cm 1x Tris-एसीटेट-EDTA (ताे) बफ़र का उपयोग करके 2% agarose जेल पर नमूनों की 5 µ l को चलाएं । उपस्थिति के लिए नमूनों की जांच/एक प्रवर्धित के आकार में इसी बैंड ब्याज की जीन के अभाव ।
  6. पीसीआर शुद्धिकरण करने के लिए बाकी पीसीआर रिएक्शन (४५ µ l) का प्रयोग करें ।
  7. एक प्लाज्मिड वेक्टर में पीसीआर क्लोनिंग किट के साथ amplicons क्लोन । उदाहरण के लिए, pGEM T-आसान वैक्टर आमतौर पर उपयोग किया जाता है ।
  8. Stbl3 कोशिकाओं या अन्य संगत कोशिकाओं और प्लेट पर पौंड आगर प्रासंगिक एंटीबायोटिक के साथ प्लेट में प्लाज्मिड रूपांतरण । 10-20 कालोनियों, मिनी तैयारी हर एक का चयन करें, और CRISPR/Cas9 संपादन से बनाया indels को चिह्नित करने के लिए सैंज अनुक्रमण करने के लिए प्रत्येक क्लोन विषय ।
    नोट: यदि वांछित, एक सेल प्रतिदीप्ति सक्रिय कक्ष छँटाई (FACS) एक विशिष्ट indel के साथ एक क्लोन को अलग करने के लिए थोक संपादित जनसंख्या पर किया जा सकता है. इसके अलावा, अगली पीढ़ी sequencing (NGS) विधियों sgRNA लक्ष्य क्षेत्र फैले पीसीआर amplicons के गहरे अनुक्रमण का उपयोग कर लक्ष्य संपादन पर अधिक मजबूती से अंदाजा लगाया जा सकता है । उदाहरण के लिए, अपघटन या ज्वार द्वारा Indels की ट्रैकिंग के बजाय उपक्लोनिंग के लिए ठीक स्पेक्ट्रम और लक्षित उत्परिवर्तनों की कोशिकाओं के एक पूल (https://tide.nki.nl/#about)16में उत्पंन की आवृत्ति का निर्धारण किया जा सकता है ।

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Representative Results

यहां उल्लिखित विधि का उपयोग करते हुए, इस प्रयोग के लक्ष्य को टेम कोशिका परिवर्तन पर अंतर्जात Calr लोकस के लिए indel उत्परिवर्तनों शुरू करने के कार्यात्मक प्रभाव का अध्ययन है । CRISPR/Cas9 प्रणाली एक उपकरण के रूप में बीए/F3 कोशिकाओं में अंतर्जात Calr उत्परिवर्तनों बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है । दो sgRNAs को Calr (चित्रा 1) के 9 एक्सॉन लक्ष्य चुना गया था, क्षेत्र में जहां निवेशन और/या विलोपन (indel) उत्परिवर्तनों आमतौर पर Calr-उत्परिवर्ती सीपीसीबी रोगियों17,18में होते हैं । पहले sgRNA (m1) अपनी उच्च क्लीवेज दक्षता और अनुकूल ऑफ-टारगेट स्कोर (तालिका 1) के आधार पर चुना गया था । दूसरी sgRNA (m2) मुख्य रूप से एक्सॉन 9 के भीतर अपने स्थान के लिए चुना गया था और क्षेत्र में अतिरिक्त sgRNAs की कमी के लिए उच्च क्लीवेज दक्षता और अनुकूल ऑफ लक्ष्य स्कोर (तालिका 1) के साथ संपादित करने के लिए. मनाया प्रभाव पर लक्ष्य जीन संपादन के कारण थे कि यह सुनिश्चित करने के लिए दो अलग sgRNAs (m1 या m2) पृथक संक्रमण में इस्तेमाल किया गया । बंद लक्ष्य प्रभाव एकाधिक स्वतंत्र sgRNAs द्वारा साझा किए जाने की संभावना नहीं है । गैर लक्ष्यीकरण नियंत्रण (हाथापाई) भी एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । भर्ती Cas9 endonuclease को Calr एक्सॉन 9 को इस DSBs पर लोकस बनाने की भविष्यवाणी की है. DSBs तो NHEJ, जो चर आकार के indels उत्पंन कर सकते है द्वारा मरंमत की जाएगी (चित्र 1) ।

विकसित करने के लिए इन विट्रो CRISPR/Cas9 सिस्टम में बा/F3 कोशिकाओं, कोशिकाओं छुरा व्यक्त Cas9 प्रोटीन ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार lentiviral मध्यस्थता transduction द्वारा किए गए थे । स्थिर Cas9 अभिव्यक्ति मजबूत Cas9 गतिविधि में परिणाम है । Ba/F3-Cas9 कक्षों में Cas9 गतिविधि pXPR-011 द्वारा मापा गया था, एक रिपोर्टर का निर्माण जिसमें दोनों GFP और एक गाइड लक्ष्यीकरण GFP15। सक्रिय Cas9 वाले कक्षों में GFP15की कमी का परिणाम होगा । GFP प्रवाह cytometry का उपयोग कर कोशिकाओं में मापा गया था । Ba/F3-Cas9 कोशिकाओं GFP में लगभग ७६% की कमी, मजबूत Cas9 गतिविधि (चित्रा 2) के लिए इसी प्रदर्शित किया ।

प्रकार 1 cytokine रिसेप्टर्स, जैसे कि thrombopoietin रिसेप्टर (MPL), erythropoietin रिसेप्टर (EPOR) और granulocyte कॉलोनी उत्तेजक कारक रिसेप्टर (जी-CSFR) प्रत्येक व्यक्तिगत रूप से किया गया, छुरे में व्यक्त की गई बा/F3-Cas9 कोशिकाओं को निर्धारित करने के लिए उनके के साथ cooperativity उत्परिवर्ती calreticulin के परिवर्तन उत्प्रेरण में बीए/ Transduction sgRNA constructs (m1, m2 या एक हाथापाई (गैर लक्ष्यीकरण गाइड)) तो बीए के प्रत्येक में बाहर किया गया था/F3 सेल लाइनों छुरा व्यक्त Cas9 और ब्याज की रिसेप्टर । कोशिकाओं को तो puromycin के साथ 7 दिनों के लिए चयनित करने के लिए CRISPR/Cas9 जीन संपादन के लिए पर्याप्त समय के लिए अनुमति दी गई । एक सकारात्मक चयन दबाव तो cytokine (मिल-3) की कोशिकाओं को भूखा द्वारा लागू किया गया था । इस भुखमरी के दबाव का लक्ष्य की पहचान करने के लिए अगर indels में Calr एक्सॉन 9, सीपीसीबी रोगियों में मनाया उन लोगों के लिए इसी तरह, के लिए चुना जाता है, cytokine में जिसके परिणामस्वरूप-स्वतंत्र विकास और बा/ वृद्धि वक्र 8 दिनों की कुल के लिए किया गया था और कोशिकाओं को हर 2 दिन गिने गए उनके परिवर्तन (चित्रा 3)19को मापने के लिए । जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण के लिए सेल छर्रों वृद्धि वक्र के शुरू होने से पहले एकत्र किए गए थे और विकास वक्र के अंत में लक्ष्य संपादन के लिए जांच करने के लिए और indels कि पोस्ट cytokine भुखमरी (चित्रा 3)19विस्तारित की निगरानी करने के लिए ।

Cytokine स्वतंत्र विकास में मनाया गया था Calr-लक्षित Ba/F3-MPL-Cas9 कोशिकाओं (चित्रा 4B), लेकिन नहीं Calr-लक्षित पैतृक बीए/f3-Cas9 कोशिकाओं (चित्रा 4a), या Ba/f3-Cas9 कोशिकाओं ectopically व्यक्त EPOR (चित्र 4c ) या जी-CSFR (फिगर 4d)19. की पुष्टि करने के लिए कि मिल-3 Calr में स्वतंत्र विकास-लक्षित Ba/F3-MPL-Cas9 कोशिकाओं पर लक्ष्य जीन संपादन का परिणाम था, कोशिकाओं 8 दिनों के बाद मिल-3 वापसी और जीनोमिक डीएनए निकाला गया था काटा गया था19। एक ४२२ बीपी लक्ष्य साइट फैले क्षेत्र तालिका 3में सूचीबद्ध प्राइमरों का उपयोग कर परिलक्षित किया गया था । पीसीआर amplicons के उप क्लोनिंग प्रदर्शन किया गया था और 30 व्यक्तिगत क्लोनों सैंज अनुक्रमण के लिए भेजा गया था । m1 या m2 के लिए Calr-लक्षित Ba/F3-MPL-Cas9 कोशिकाओं, सभी उप क्लोन लक्षित कट साइट (चित्रा 5)19पर अलग आकार के indels निहित । 13 में से 11 m1 उप क्लोन indels कि + 1 बीपी frameshift उत्परिवर्तनों (चित्रा 5), रोगियों में पाया उन लोगों के लिए इसी तरह के नेतृत्व में पाए गए । m2 Calr-लक्षित कोशिकाओं के लिए, 17 उप क्लोनों में से 10 के लिए indels है कि + 1 बीपी frameshifts (चित्रा 5)19के नेतृत्व में पाए गए । इन आंकड़ों की पुष्टि करते है कि CRISPR/Cas9 की मध्यस्थता परिचय + 1bp frameshift उत्परिवर्तनों अंतर्जात Calr एक्सॉन 9 लोकस करने के लिए oncogenic गतिविधि प्रदान करने के लिए पर्याप्त है Calr19. चित्रा 5 में sequencing डेटा भी पता चलता है कि अंतर्जात Calr लोकस करने के लिए heterozygous + 1bp frameshift उत्परिवर्तनों का परिचय बीए/F3-MPL कोशिकाओं को बदलने के लिए पर्याप्त है, अवलोकन के अनुरूप है कि Calr उत्परिवर्तनों आमतौर पर सीपीसीबी रोगियों17,18में heterozygous हैं । indels के बीच उच्च विविधता में NHEJ मरंमत परिणाम के बाद से, एकल कोशिका के लिए ब्याज की एक क्लोन अलग छंटाई किया जा सकता है । इस शोधकर्ता CRISPR/Cas9 द्वारा बनाई गई विशिष्ट उत्परिवर्तनों के प्रभाव का अध्ययन करने की अनुमति होगी ।

Figure 1
चित्रा 1: CRISPR/Cas9 जीन की स्कीमा Calrके एक्सॉन 9 का लक्ष्यीकरण संपादन । दो sgRNAs को माउस Calr एक्सॉन 9 कि मानव frameshift (लाल पट्टी) में 1bp सीपीसीबी उत्परिवर्तनों द्वारा लक्षित करने के लिए इसी क्षेत्र के भीतर एक साइट को लक्षित डिजाइन किए गए थे । पम्म के साथ लक्ष्य अनुक्रम (डार्क ब्लू) दिखाया, और Cas9 द्वारा दरार की उंमीद साइटों लाल त्रिकोण द्वारा संकेत कर रहे हैं । CRISPR/Cas9 द्वारा उत्पंन DSBs तो NHEJ, जो चर लंबाई19के indels उत्पंन होने की उंमीद है द्वारा मरंमत कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: Cas9 गतिविधि परख. पैरेंटल ba/f3 कक्ष और बा/f3 कक्ष Cas9 एक्सप्रेस Cas9 गतिविधि को मापने के लिए pXPR-011 के साथ transduced थे । GFP में कमी Cas9 गतिविधि में वृद्धि के साथ संबद्ध है । माता पिता के बा/f3 कक्ष ~ १००% FITC + बा/F3-Cas9 कोशिकाओं की तुलना में जहां FITC ~ ७६% से कम है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: संक्रमण के लिए समयरेखा और Ba/F3 कक्षों में sgRNAs का चयन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: अंतर्जात Calr लोकस में 1 बीपी frameshift उत्परिवर्तनों का परिचय oncogenic को Calr गतिविधि प्रदान करने के लिए पर्याप्त है । (क-घ) माता-पिता के बा में वृद्धि वक्री/f3-Cas9 कक्षों (a) ba/f3-MPL-Cas9 कक्ष (B), ba/f3-EPOR-Cas9 कक्ष (C), और ba/f3-जी-CSFR-Cas9 कोशिकाओं (D) को दर्शाता है IL-3 स्वतंत्र विकास में Calr-लक्षित Ba/ F3-MPL-Cas9 कक्ष केवल19। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5: सैंज अनुक्रमण सत्यापन । अंतर्जात Calr (एक्सॉन 9) के ऑन-टारगेट संपादन की पुष्टि Ba/F3-MPL कोशिकाओं में । + 1 बीपी frameshift उत्परिवर्तनों काले19में संकेत दिया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

लक्ष्य जीन sgRNA आयडी लक्ष्य अनुक्रम (5 ' से 3 ') किनारा दरार क्षमता ऑफ-टारगेट स्कोर
Calr m1 AGAGGACAAGAAGCGTAAAGAGG + ०.७ ७०
Calr m2 GAGGCTTAAGGAAGAAGAAGAGG + ०.३ 28

Table 1:20-मेर protospacer पाम साइट सहित जुगाड़ (बोल् ड में) दो sgRNAs लक्ष्यीकरण के लिए एक्सॉन 9 of Calr 19.

प्राइमरी आईडी अनुक्रम (5 ' से 3 ')
m1-F CACCGAGAGGACAAGAAGCGTAAAG
m1-R AAACCTTTACGCTTCTTGTCCTCTC
m2-F CACCGAGGCTTAAGGAAGAAGAAG
m2-R AAACCTTCTTCTTCCTTAACCTC

2 तालिका: Protospacer दृश्यों और उनके रिवर्स के साथ पूरक "CACC" और "AAAC" pLenti में क्लोनिंग के लिए जोड़ा-गाइड वेक्टर BsmBI प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग 19.

प्राइमरी आईडी अनुक्रम (5 ' से 3 ')
Calr_Fwd ACCACCTGTCTTTCCGTTCT
Calr_Rev GGCCTCTACAGCTCATCCTT

तालिका 3: CRISPR स्क्रीनिंग पीसीआर प्राइमरों नदी के ऊपर और sgRNA दरार साइट के बहाव ।

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Discussion

यहां हम CRISPR/Cas9 जीन संपादन के उपयोग के लिए टेम कोशिकाओं में CALR उत्परिवर्तनों के जैविक समारोह का अध्ययन प्रदर्शन । इस प्रोटोकॉल की सफलता के कई कारकों पर अत्यधिक निर्भर है । सबसे पहले, यह पता है कि उत्परिवर्तनों के प्रकार phenotype कि वांछित है के लिए जिंमेदार हो सकता है महत्वपूर्ण है । इस प्रोटोकॉल में, readout-3 स्वतंत्रता के लिए बीए/F3 कोशिकाओं के परिवर्तन है और उत्परिवर्तनों के प्रकार के CALRके एक्सॉन 9 में indels हैं । हालांकि, अगर वांछित उत्परिवर्तन एक एकल आधार जोड़ी प्रतिस्थापन है, तो HDR-मध्यस्थता मरंमत पसंदीदा तरीका है क्योंकि यह एक एकल-किनारा या डबल फंसे डीएनए दाता टेंपलेट2से सटीक बिंदु उत्परिवर्तनों या सम्मिलन शुरू कर सकते हैं, 3. यदि यह जीन को पीटकर वांछित है, तो बड़े पैमाने पर जीनोमिक हटाने की जल्दी कोडन exons लक्ष्यीकरण के निर्माण20पसंद है ।

दूसरा, सेल लाइन cytokine-निर्भर होना चाहिए ताकि सकारात्मक चयन दबाव पोस्ट cytokine वापसी के लिए अनुमति देने के लिए । यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि नहीं सभी सेल लाइनों स्थिर अभिव्यक्ति Cas9 सहन कर सकते है (६.३ कदम देखें) । यह blasticidin चयन के कारण हो सकता है, जो सभी सेल लाइनों द्वारा सहन नहीं किया जाता है । इस मामले में, विभिंन चयन कैसेटों के साथ अंय Cas9 निर्माण के विकल्प आवश्यक हो सकता है । ऐसे बा/F3 कोशिकाओं के रूप में cytokine-निर्भर सेल लाइनों, का उपयोग करने की एक चेतावनी है कि वे सहज cytokine स्वतंत्र विकास के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, कई बार ectopically में उत्परिवर्तनों के अधिग्रहण के परिणाम के रूप में ब्याज की जीन व्यक्त निंनलिखित cytokine 21आहरण । तदनुसार, उचित नियंत्रण का उपयोग करने के लिए विश्वास है कि मनाया सेलुलर परिवर्तन पर लक्ष्य CRISPR जीन संपादन के कारण है की आवश्यकता है । इस प्रोटोकॉल में, हमने एक गैर-लक्ष्यीकरण sgRNA नियंत्रण या ba/f3-EPOR और ba/f3-GCSFR कक्षों के साथ transduced में MPL कोशिकाओं में सेलुलर परिवर्तन का निरीक्षण नहीं किया था जो transduced-लक्षित Calr के साथ sgRNAs । यह आगे विश्वास है कि Ba/F3-MPL कोशिकाओं में सेलुलर परिवर्तन अंतर्जात Calr लोकस का लक्ष्य संपादन का परिणाम है प्रदान करता है ।

इस प्रोटोकॉल में, डीएनए मरंमत NHEJ द्वारा चर आकार के indels परिचय के रूप में चित्रा 5में देखा । सैंज अनुक्रमण द्वारा विश्लेषण indels के विस्तार के लिए देखने के क्रम में संपादित कोशिकाओं की थोक आबादी का एक उप-नमूना पर किया गया था कि नेतृत्व करने के लिए + 1 बीपी frameshift उत्परिवर्तनों पोस्ट cytokine वापसी । अगली पीढ़ी sequencing चरण ९.९ में वर्णित एक और अधिक मजबूत तरीका है पर-लक्ष्य संपादन थोक सेल आबादी के लिए है । यदि एक विशिष्ट क्लोन पर विश्लेषण वांछित है, तो एक सेल थोक जनसंख्या की छंटाई आवश्यक है । एकल कोशिका छंटाई उत्परिवर्तन के एक विशिष्ट प्रकार से उत्पंन जैविक प्रभाव को समझने में लाभप्रद है और उपयोगी है जब लक्ष्य के लिए दो उत्परिवर्तनों के विभिंन प्रकार के बीच मतभेदों को समझ है ।

CRISPR/Cas9 प्रणाली के साथ एक चिंता का विषय है, जो लक्षित क्षेत्र के बाहर दरार घटनाओं रहे है लक्ष्य प्रभाव है । CRISPR/Cas9 प्रणाली की विशिष्टता का आकलन करने के लिए और यह सुनिश्चित करें कि रूपांतरित आबादी किसी भी बंद-लक्ष्य मनाया परिवर्तन करने के लिए अग्रणी प्रभाव शामिल नहीं है, हम जांच करना होगा कि जीनोम संपादन के क्षेत्र के बाहर हुई ब्याज. यह Cas9 के सबूत के लिए खोज के द्वारा किया जा सकता है/NHEJ-लक्ष्य जीनोमिक loci महत्वपूर्ण अनुक्रम के साथ संभावित लक्ष्य के लिए इसी तरह से प्रेरित जीनोम संपादन । इस के लिए, अगली पीढ़ी अनुक्रमण भी मात्रात्मक जीनोम के साथ निर्दिष्ट स्थानों पर बंद लक्ष्य प्रभाव की आवृत्ति का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । ऑफ़-टारगेट प्रभावों के लिए संभावित को कम करने के लिए, विभिंन कारकों को प्रोटोकॉल में शामिल किया जा सकता है । के रूप में परिणामों में उल्लेख किया है, एकाधिक sgRNAs रुचि के क्षेत्र को लक्षित करने का अध्ययन यह सुनिश्चित करता है कि phenotype एक पर लक्ष्य घटना का परिणाम है । इसके अलावा, हाल के अध्ययनों से सुझाव दिया है कि 17 न्यूक्लियोटाइड के साथ sgRNAs काट-लक्ष्य दरार घटनाओं22की आवृत्ति को कम कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, स्थिर अभिव्यक्ति से Cas9 के लिए लंबे समय तक निवेश बंद-लक्ष्य प्रभाव की एक उच्च आवृत्ति में परिणाम कर सकते हैं । यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि एक दोहरी वेक्टर प्रणाली दोनों Cas9 और sgRNA युक्त Cas9 के स्थिर अभिव्यक्ति के बजाय प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, इन वैक्टर करने के लिए बहुत बड़े हो जाते है और एक कम lentiviral titer और कम संक्रमण दक्षता में परिणाम । नतीजतन, nucleofection द्वारा कोशिकाओं में निर्माण Cas9 के क्षणिक अभिकर्मक इस्तेमाल किया जा सकता है । हाल की रिपोर्टों में भी लक्ष्य संपादन के लिए उच्च विशिष्टता के साथ Cas9 निर्माण विकसित किया है, जैसे कि eSpCas9 का निर्माण6।

सारांश में, CRISPR/Cas9 एक कुशल, सस्ती और विश्वसनीय जीनोम इंजीनियरिंग उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है, शारीरिक अभिव्यक्ति के स्तर पर आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के अध्ययन के लिए अनुमति देता है । यहां हम एक मजबूत और कुशल विधि के रूप में CRISPR/Cas9 जीन संपादन को रोजगार के लिए टेम कोशिकाओं में CALR उत्परिवर्तनों के कार्यात्मक प्रभाव की समझ अग्रिम ।

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Disclosures

हम इस रिपोर्ट से संबंधित हित का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम NIH (R01HL131835), एक Damon Runyon नैदानिक अंवेषक पुरस्कार और स्टार कैंसर कंसोर्टियम द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BsmBI New England Biolabs R0580L
Blasticidin Sigma Aldrich 15025
Puromycin Life Technologies A1113803
Stbl3 cells Life Technologies C737303
TransIT-LT1 Thermo Fisher Scientific MIR2300
Opti-MEM Life Technologies 51985034
RPMI Thermo Fisher Scientific MT10040CV
DMEM Thermo Fisher Scientific 10-017-CV
Fetal bovine serum (FBS) Omega Scientific FB-11
Penicillin/streptomycin/L-glutamine Life Technologies 10378016
mIL-3 Peprotech 213-13
psPAX2 Addgene N/A
pCMV-VSV-G Addgene N/A
pLX_TRC311-Cas9 Addgene N/A
polybrene Sigma Aldrich H9268
pXPR-011 Addgene N/A
Phosphate Buffered Saline (PBS) Genessee Scientific 25-507
TAE buffer Thermo Fisher Scientific FERB49
LentiGuide-Puro Addgene Plasmid #52963
PNK New England Biolabs M0201S
T4 ligase New England Biolabs M0202S
PCR purification kit Qiagen 28104
Miniprep kit Qiagen 27104

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक १३१ CRISPR Cas9 जीन संपादन sgRNA calreticulin अनुक्रमण रिपोर्टर
CRISPR/Cas9 जीन संपादन का प्रयोग Cytokine निर्भर टेम कोशिकाओं में उत्परिवर्ती Calreticulin की Oncogenic गतिविधि की जांच करने के लिए
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Abdelfattah, N. S., Mullally, A. Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells. J. Vis. Exp. (131), e56726, doi:10.3791/56726 (2018).

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