Summary
Gène ciblé d’édition à l’aide de CRISPR/Cas9 a grandement facilité la compréhension des fonctions biologiques des gènes. Ici, nous utilisons la méthodologie CRISPR/Cas9 à des mutations de la calréticuline modèle de cytokine-dépendante des cellules hématopoïétiques afin d’étudier leur activité oncogénique.
Abstract
Répétitions de courtes palindromiques régulièrement dois‑je cluster (CRISPR) est un système de l’immunité adaptative chez les procaryotes qui a été réutilisée par les scientifiques pour générer des nucléases RNA-guidé, comme associés à CRISPR (AC) 9 pour génome eucaryote in situ d’édition. Génie de génome par Cas9 sert à efficace, robuste et facilement modifier les gènes endogènes dans beaucoup de lignées cellulaires de mammifères biomédical pertinents et d’organismes. Ici, nous montrons un exemple de la façon d’utiliser la méthodologie CRISPR/Cas9 pour comprendre la fonction biologique de mutations génétiques spécifiques. Nous modélisons la calréticuline (CALR) mutations dans des cellules de (Ba/F3) de pro-B charge interleukine-3 (mIL-3) par la remise du seul guide RNAs (sgRNAs) ciblant le locus Calr endogène dans la région spécifique où insertion ou délétion (indel ) CALR mutations se produisent chez des patients atteints de syndromes myéloprolifératifs néoplasmes (NPP), un type de cancer du sang. Les sgRNAs créer des cassures double brin (CDB) dans la région ciblée qui sont réparés par fin non homologue rejoindre (NHEJ) pour donner des indels de différentes tailles. Ensuite, nous utilisons le test de transformation cellulaire standard Ba/F3 pour comprendre l’effet de l’expression de niveau physiologique des mutations Calr sur transformation cellulaire hématopoïétique. Cette approche peut être appliquée à d’autres gènes pour étudier leur fonction biologique dans diverses lignées cellulaires de mammifères.
Introduction
CRISPR/Cas9 technologie a récemment révolutionné génome ciblé d’édition dans les organismes et les cellules vivantes. Il est devenu un outil extrêmement puissant pour la recherche biomédicale et est actuellement utilisé comme une voie potentielle pour le traitement de maladies génétiques1. La base de tous les outils d’édition du génome s’appuie sur la création d’une nucléase induite par l’ADN double brin pause (DSB) au locus génomique à modifier. La CDB peut être réparées par non homologue fin-rejoindre (NHEJ) ou axés sur l’homologie réparation (HDR)2,3. L’avantage de la nucléase Cas9 sur autre génome ingénierie nucléases, tels que les nucléases de doigt de zinc (ZFNs) et nucléases effecteur comme activateur de transcription (TAPS) est sa dépendance sur RNA afin de cibler la nucléase à une séquence d’ADN désirée, par rapport aux interactions protéine-ADN trouvées dans ZFNs et TALENs2,3.
Après la découverte de la voie de la nucléase CRISPR/Cas9 comme un système immunitaire adaptatif dans les cellules procaryotes4,5, beaucoup d’efforts ont été en adaptant la voie pour une utilisation dans les lignées cellulaires de mammifères et modèle organismes2, 3. comme un outil d’édition de gène, la voie CRISPR/Cas9 utilise deux composantes principales : le Streptococcus pyogenes (Sp) dérivés Cas9 nucléase et sgRNAs ciblant le gène d’intérêt2,3. Le sgRNA compose de 20 nucléotides que Cas9 direct à un site spécifique sur le génome à ARN-ADN nucléotide complémentarité2,3. Le site de la cible de la sgRNA doit se situer tout près d’un protospacer motif adjacent (PAM) à la forme de 5' NGG, qui est reconnu par la nucléase de SpCas9. Avec ces outils, Cas9 peuvent être adressées à n’importe quelle séquence d’ADN grâce à la conception sgRNAs qui ciblent la région d’intérêt. En outre Sp dérivé Cas9, il y a des variantes supplémentaires pour Cas9 avec des caractéristiques différentes selon l’application spécifique. Par exemple, il y a des variantes de Cas9 avec la plus grande spécificité pour le montage sur la cible ou capacité de clivage simple-brin ADN entaille6,7. En outre, Cas9 catalytiquement inactif a récemment été développé pour régulation transcriptionnelle8. Maintenant les scientifiques ont utilisé le système CRISPR/Cas9 pour une variété d’applications, telles que le gène knockin et knockout pour étudier les fonctions biologiques des gènes9, de perte de fonction et de gain de fonction bibliothèque écrans10 et génétique génie du modèle organismes11.
Dans ce protocole, nous combinons la méthodologie CRISPR/Cas9 avec le test de transformation cellulaire Ba/F3 pour comprendre la fonction biologique de CALR mutations. BA/F3 cellules sont une ligne de cellules hématopoïétiques dépendant IL-3 murine pouvant être rendus IL-3 indépendants sur l’expression de certains oncogènes tels que BCR-ABL12/12. Afin de comprendre si la calréticuline mutante peut transformer des cellules de Ba/F3 à la cytokine croissance indépendante, nous ciblé exon 9 du locus Calr endogène à l’aide de CRISPR/Cas9 à introduire des mutations indel et puis s’est retiré IL-3 les cellules d’appliquer un pression de sélection positive, dans le but de récapitulant les mutations CALR gain de fonction trouvées chez les patients de NPP. Le protocole inclut la conception, le clonage et la livraison de sgRNAs, le développement de cellules exprimant stables Cas9 et dépistage CRISPR sur-cible gène édition. Ce protocole peut être appliqué à différents gènes et plusieurs lignes de cellules cytokine dépendant d’intérêt et est particulièrement utile dans la modélisation et l’étude de la fonction biologique des gènes impliqués dans le cancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sgRNA Design à l’aide des outils en ligne13
-
Conception sgRNAs ciblant le gène d’intérêt à l’aide des outils disponibles gratuitement en ligne.
- Copiez et collez la séquence de référence NCBI du gène d’intérêt dans l’outil de web designer sgRNA Broad Institute : (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
Remarque : Cet outil identifie les séquences sgRNA avec des sites de clivage dans les exons et ceux qui s’étendent sur la frontière intron/exon mais toujours s’attacher dans l’exon. - Télécharger et ouvrir le fichier de sortie de texte dans excel.
- Mettre l’accent sur les colonnes remplies avec les séquences sgRNA et les séquences de contexte sgRNA. Notez que les séquences sgRNA ne contiennent pas le motif adjacent de protospacer (PAM) mais les séquences de contexte.
- Notez que la partition de l’efficacité sur la cible répertorie le score prédit un clivage d’efficacité sur une échelle de 0 à 1, où une vingtaine de 1 dénote une plus grande efficacité de clivage.
- Utiliser la fonction « classer » d’excel soit commander les cibles par le score d’efficacité ou de position dans le gène de la cible par le biais de la colonne « % cible Cut ».
NOTE : Tri par emplacement dans le gène est utile pour identifier des sgRNAs qui ciblent un domaine spécifique ou l’exon d’intérêt. - Sélectionnez sgRNAs 3-6 qui ciblent la zone d’intérêt avec la haute (> 0,6) scores d’efficacité sur la cible. Il peut être utile de savoir quels types de mutations peuvent être responsables du phénotype qui est désiré (voir Figure 1 exposant la stratégie de ciblage utilisée pour la calréticuline).
Remarque : sgRNAs sous le seuil de score de 0,6 efficacité suggérée devrait considérer lorsqu’il y a un manque d’autres bons candidats. - Utiliser l’outil de web MIT gRNA analyse d’écran pour les effets potentiels de la cible (http://crispr.mit.edu/). Pour chaque sgRNA sélectionné, exécutez l’ordre de cible (y compris la PAM).
Remarque : L’outil de web designer sgRNA Broad Institute pourrait également être utilisé pour dépister les effets hors cible (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).- Notez que l’outil d’analyse de sgRNA MIT obtient chaque sgRNA sur une échelle de 1 à 100 où une note de 100 représente une spécificité plus élevée. Un score supérieur à 70 est idéal et représente un sgRNA avec des effets hors cible minimales. Ce site génère également une liste de visites hors cible avec leur position dans le génome et des incompatibilités combien ils ont chacun avec le guide du candidat.
NOTE : Hits hors cible avec quatre incompatibilités ou plus sont considérés comme sûrs14. Hors cible hits avec moins de quatre incompatibilités peuvent être problématiques si elles relèvent des exons14.
- Notez que l’outil d’analyse de sgRNA MIT obtient chaque sgRNA sur une échelle de 1 à 100 où une note de 100 représente une spécificité plus élevée. Un score supérieur à 70 est idéal et représente un sgRNA avec des effets hors cible minimales. Ce site génère également une liste de visites hors cible avec leur position dans le génome et des incompatibilités combien ils ont chacun avec le guide du candidat.
- Choisissez 2 ou 3 sgRNAs qui ciblent des emplacements distincts au sein de la région d’intérêt pour le gène cible, et qui ont les meilleurs scores sur l’efficacité et hors cible clivage appariés (voir le tableau 1 pour les séquences sgRNA ciblant l’exon 9 du Calr).
Remarque : Selon les objectifs expérimentaux, mettre davantage l’accent peut-être figurer sur les différentes valeurs obtenus à partir des outils mentionnés.
- Copiez et collez la séquence de référence NCBI du gène d’intérêt dans l’outil de web designer sgRNA Broad Institute : (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
2. clonage sgRNA Oligos13
-
Générer les oligo avant
- Créer une liste de séquences sgRNA sans le site de PAM.
- Ajouter un G à l’extrémité 5' de la séquence si l’extrémité 5' de la séquence de sgRNA n’est pas un G.
Remarque : Cette G est nécessaire pour maximiser le niveau de transcription axée sur les U6 sgRNA. Ajout d’un G est nécessaire pour m1 sgRNA (tableau 1). - Ajouter la séquence « CACC » à l’extrémité 5' de la séquence de guide G-optimisé (pas de PAM) (tableau 2) afin de générer les surplombs requis pour la ligature des oligos recuit dans BsmBI digéré lentiGuide vector (voir étape 3).
-
Générer les oligo reverse
- Inverser le complément de la séquence de guide G-optimisé (pas de PAM).
- Ajouter la séquence « AAAC » à l’extrémité 5' de la séquence inverse complétée de guide G-optimisé (tableau 2).
- Commander les oligos conçus auprès d’une compagnie de synthèse de l’apprêt.
-
Recuire et phosphoryler oligos
- Ajouter 1 µL d’oligo avant (100 µM), 1 µL d’oligo inverse (100 µM), de 1 µL de 10 x T4 ligature buffer, 0,5 µL de T4 polynucléotide kinase (PNK) et 6,5 µL d’H2O dans un tube PCR (Total = 10 µL).
- Exécutez le programme suivant dans le thermocycleur : 37 ° c pour 30 min, 95 ° c pendant 5 min, rampe de 95 à 25 à 0,1 ° C/s.
- Diluer le produit de la réaction à 1/250 en H2O.
3. digestion de lentiGuide-Puro Vector13
-
Vecteur lentiGuide-Puro Digest
- Assembler une réaction 50µl de digestion avec les composants suivants : 5 µg de plasmide circulaire, 2 µL (30 unités) de l’enzyme de restriction de BsmBI, 5 µL de tampon de l’enzyme de restriction et jusqu'à 50 µL d’H2O.
- Exécutez la réaction pendant 2 h à 55 ° C. Après la première heure, ajouter 1 µL plus d’enzyme de restriction BsmBI.
-
Déphosphorylent le pivot coupé
- Ajouter 7 µL de tampon de réaction de la phosphatase et 2 µL d’enzyme phosphatase au vecteur digéré.
- Incuber 30 min à 37 ° C.
- PCR purifier la coupe et déphosphorylée épine dorsale à l’aide d’une trousse commerciale.
NOTE : Substitut les colonnes de couleurs roses fournis avec le kit de miniprep bleu colonnes colorées puisque ceux-ci peuvent mieux répondre aux besoins de tailles de gros plasmide. Le rendement peut être augmenté en chauffant le tampon d’élution dans un bloc chauffant de 90 ° c avant d’élution et par élution de l’ADN de la colonne deux fois à la fin (exécuter l’élution de l’ADN de l’élution première à travers une deuxième fois).
4. ligature ofAnnealed Oligos en épine dorsale digéré13
- Ajouter 50 ng d’épine dorsale digérée, 1 µL de recuit oligo dilution, tampon de 1 µL de 10 x T4 ligature, 1 µL de ligase T4 et jusqu'à 10 µL d’H2O dans un tube PCR. Incuber pendant 1 heure à température ambiante
- Transformer des cellules de Stbl3 avec 2 µL de la réaction de ligature. Plaque sur une gélose de bouillon (LB) de lysogénie avec de l’ampicilline 100 µg/mL et incuber une nuit à 37 ° C.
- Prélever 3 colonies et ensemencer dans une culture de mini-préparent.
-
Valider l’insertion correcte oligo
- Effectuer un miniprep pour chaque culture et chaque séquence par le biais du site d’insertion oligo à partir d’une amorce dans le promoteur U6 à l’aide d’une trousse commerciale.
- Effectuer une préparation de midi ou un maxi-prep de la culture de vérifier à la séquence.
5. génération de cellule lLines stablement exprimant SpCas9
Remarque : Ce protocole implique la livraison du plasmide pLX_TRC311-Cas9 par infection des gènes. Ce protocole est décrit en détail pour murine interleukine-3 (mIL-3) pro-B (Ba/F3) cellules dépendantes, une lignée de cellules de suspension et pourrait être adapté à d’autres types de cellules en utilisant les conditions de culture privilégié pour chaque type de cellule. Le milieu de culture pour les cellules de Ba/F3 se compose de RPMI additionné de sérum de veau fœtal 10 %, 1 % pénicilline/streptomycine/L-glutamine et 10 ng/mL de murin interleukine 3.
-
Transfecter cellules HEK-293 t
- Graines de 3 x 106 cellules HEK-293 t cellules / plat de culture de tissu de 10 cm. Garder les cellules ensemencées durant la nuit avant la transfection.
Remarque : Les cellules HEK-293 t sont une lignée de cellules adhérentes et sont couramment utilisés pour la production de virus. Les cellules sont maintenues en DMEM additionné de sérum de veau fœtal 10 %, 1 % pénicilline/streptomycine/L-glutamine. Les cellules doivent être 80 % anastomosé au moment de la transfection. - Chaude avant réduit sérum médias (Opti-MEM) et milieu de croissance.
- Ajouter 500 µL de médias de sérum réduit, 7 µg de construction pLX_TRC311-Cas9, 4 µg de plasmide CMVp-VSV-G packaging des gènes et 4 µg de plasmide d’emballage des gènes psPAX2 dans un tube
NOTE : L’ADN Total par plat de 10 cm des cellules 293 t est de 15 µg. - Bien mélanger l’ADN et ajouter 45 µL de réactif de transfection. Mélanger doucement et laisser reposer pendant 20 min.
Remarque : Il est important d’utiliser les médias de sérum réduit car le sérum inhibent la formation de complexes entre le réactif de transfection et l’ADN plasmidique. - Aspirer le milieu vieux dans la plaque de 293 t et ajouter 5 mL de milieu de croissance nouvelle.
- Ajouter le mélange réactif ADN et transfection d’une manière sage goutte sur la plaque de 293 t. Agiter doucement et incuber à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 24 h.
- Récolter les surnageants virales à 24 et 48 h après transfection. Passez par un 0,22 µm filtre et aliquote dans un tube cryovial (1,6 tube/mL et 1,5 mL volonté être utilisé pour l’infection).
- Magasin de surnageant viral à-80 ° C.
Remarque : le surnageant des gènes peut être utilisé dans les 6 mois. Si possible, spinfection transductions doivent être effectuées par le virus de frais).
- Graines de 3 x 106 cellules HEK-293 t cellules / plat de culture de tissu de 10 cm. Garder les cellules ensemencées durant la nuit avant la transfection.
-
Infection des gènes des cellules Ba/F3
- Décongeler le surnageant viral sur la glace, si gelé.
- Centrifuger de cellules à 300 g pendant 4 min.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules à une concentration de 3 x 106 cellules/mL.
- Ajouter 500 µL de cellules resuspendues, 1,5 mL du surnageant viral, 4 µL de polybrene (stock : 2 mg/mL) et 10 ng/mL de m-IL3 dans une plaque de culture de tissu de 6 puits. Assurez-vous d’inclure un non infecté bien avec 1,5 mL de médias au lieu de surnageant viral comme un contrôle.
Remarque : La quantité de surnageant viral ajouté doit correspondre à une multiplicité d’infection (MOI) < 1. - Centrifuger la plaque à 440 g pendant 120 min à 37 ° C.
- Prendre la plaque de la centrifugeuse et placer en incubateur à CO2 37 ° C et 5 % et permettent d’augmenter du jour au lendemain.
- Tournez en bas les cellules après 24h et remettre en suspension avec 5 mL de frais média chaud dans une assiette de 6 puits.
-
Sélection de cellules infectées de Cas9
- Tournez en bas les cellules et remettre en suspension avec les supports neufs chauds additionnés de 5 µg/mL de blasticidine, 48 h post spinfection.
- Sélectionnez les cellules pendant 9 jours avec blasticidine ou jusqu'à ce que les cellules non infectées (négatif) témoins sont morts.
- Une fois la sélection terminée, transférer les cellules résistantes au milieu avec une concentration plus faible de blasticidine.
6. reporter Assay for Cas9 activité15
- Transduce cellules parentales et les cellules exprimant de manière stable Cas9 avec pXPR-011 par infection des gènes (voir étapes 5.1-5.2).
Remarque : Ce vecteur contient GFP et un guide ciblant la GFP. Cellules contenant Cas9 active seront traduira par une réduction de GFP (Figure 2). - Sélectionnez les cellules pendant 3 jours avec 2 µg/mL de puromycine, 48 h post spinfection.
- Analyse des échantillons pour l’expression de la GFP par cytométrie en flux.
Remarque : Une réduction de 50 % ou plus de GFP représente une activité optimale Cas9. Une concentration plus élevée de blasticidine sélection pourrait servir à augmenter l’activité Cas9 si inférieur à une réduction de 50 % est observée. Pas toutes les lignées cellulaires peuvent tolérer blasticidine sélection. Dans ce cas, l’utilisation des vecteurs de Cas9 avec autres cassettes de sélection peut être nécessaire. En outre, pas toutes les lignées cellulaires peuvent tolérer une expression stable de Cas9. Dans ce cas, transfection transitoire de Cas9 peut être utilisée.
7. Spinfection de sgRNAs dans les cellules exprimant Cas9
- Suivez les étapes 5.1-5.2 pour l’infection des gènes de sgRNAs dans les cellules d’intérêt.
Remarque : À l’étape 5.1.3, remplacez pLX_TRC311-Cas9 construire avec la construction de lentiGuide-Puro validée de la Section 4. - 48 h post spinfection, sélectionnez les cellules pendant 3 jours avec 2 µg/mL de puromycine.
- Transférer les cellules résistantes au milieu avec la plus faible concentration d’antibiotiques et continuer à choisir pour un autre 4 jours pour permettre l’édition suffisant.
8. Ba/F3 Transformation cellulaire et sélection Positive à l’aide de m-IL3 retrait
Remarque : Ce test est décrite pour mIL-3 cellules dépendantes de Ba/F3 mais pourrait être appliqué à n’importe quelle ligne de cellule dépendante de cytokine.
- Tournez en bas Ba/F3 cellules exprimant façon ectopique Cas9 et le sgRNA d’intérêt en croissance exponentielle.
- Aspirer le surnageant et laver les cellules avec 5 mL de Phosphate Buffered Saline (PBS).
- Tournez en bas les cellules et répétez l’étape lavage à 8.2 quatre fois (cette étape garantit que le média est libre de l’IL-3).
- Aspirer le PBS et remettre en suspension les cellules dans 5 mL de supports neufs sans IL-3.
- Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou un analyseur de viabilité cellulaire.
- Semences des cellules en trois exemplaires, une plaque de culture de tissu de 6 puits à une concentration de 1 x 105 cellules/mL dans un volume total de 2 mL de supports neufs sans IL-3.
- Contrôler et compter les cellules tous les 2 jours pour un total de 8 jours.
NOTE : Ba/F3 cellules dépourvues d’IL-3 généralement mourir 2 jours post famine IL-3. Il est important d’inclure un contrôle négatif lors de l’essai (généralement un guide ne pointeraient est utilisé comme contrôle).
9. dépistage CRISPR sur-cible édition
- Conception CRISPR dépistage amorces en amont et en aval du site de clivage sgRNA
Remarque : utiliser des amorces au moins 100 bp depuis le site de clivage prédit afin d’assurer la détection ne serait pas touchée par une grande insertion ou délétion (indel) sur le site de cible sgRNA. - Isoler l’ADN génomique (ADNg) de cellules transformées (à la fin de la courbe de croissance) et de retrait pré-cytokines des cellules.
NOTE : Toujours inclure les cellules surexprimant le guide ne pointeraient comme un contrôle pour la modification des gènes. Génomique des cellules d’isolement avant et après que transformation identifiera les clones qui ont été sélectionnés positivement et ont un avantage prolifératif. - Assembler un 50 µL de PCR avec les composants suivants : 25 µL du mélange de x PCR 2, 1 µL d’apprêt avant (10 µM), 1 µL d’apprêt inverse (10 µM), 50-100 ng d’ADNg et H2O à 50 µL.
NOTE : Nombreux polymérases haute fidélité peuvent être utilisés à l’étape 9.3. - Exécuter les échantillons dans un thermocycleur en utilisant les paramètres suivants : 95° C pendant 1 min 30 cycles de (94 ° C pendant 1 min, 52 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 30 s) et 72 ° C pendant 10 min. Ce PCR est optimisé pour les amorces de Calr énumérés au tableau 3. Optimiser les conditions de la PCR pour la paire d’amorces conçue à l’étape 9.1 issu de tester sur ADNg.
- Exécuter 5 µL des échantillons sur un gel d’agarose de 2 % à 10 V/cm à l’aide de la mémoire tampon Tris-acétate-EDTA (TAE) de x 1. Examiner des échantillons de la présence / absence d’un groupe amplifié correspondant à la taille du gène d’intérêt.
- Utiliser le reste de la réaction PCR (45 µL) pour effectuer une purification de la PCR.
- Cloner les amplicons avec une PCR kit le clonage dans un vecteur plasmidique. Par exemple, vecteur pGEM-T-easy est généralement utilisés.
- Transformer le plasmide dans les cellules Stbl3 ou autres cellules compatibles et plaque sur plaques de gélose LB avec l’antibiotique pertinente. Sélectionner 10-20 colonies, mini-préparent chacun d’eux et de soumettre chaque clone à Sanger séquençage pour caractériser les indels créé à partir d’édition CRISPR/Cas9.
Remarque : Si vous le souhaitez, seul fluorescence activé une cellule que tri (FACS) pourrait être réalisée sur la plus grande partie édition population pour isoler un clone avec un indel spécifique. En outre, prochaine génération (NGS) méthodes de séquençage permet de quantifier plus fermement sur la cible d’édition à l’aide de séquençage en profondeur des amplicons PCR couvrant la région cible de sgRNA. Par exemple, suivi des Indels par décomposition soit de marée peut servir au lieu de subcloning de déterminer précisément le spectre et la fréquence des mutations ciblées générées dans un pool de cellules (https://tide.nki.nl/#about)16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
À l’aide de la méthode décrite ici, l’objectif de cette expérience est d’étudier les effets fonctionnels de l’introduction de mutations indel au locus Calr endogène sur la transformation des cellules hématopoïétiques. Le système CRISPR/Cas9 est utilisé comme un outil pour créer des mutations Calr endogènes dans les cellules de Ba/F3. Deux sgRNAs ont été choisis pour cibler l’exon 9 du Calr (Figure 1), dans la région où les insertions ou les mutations de délétion (indel) généralement contenues en CALR-mutant MPN patients17,18. La première sgRNA (m1) a été choisi à l’issu du clivage haute efficace et favorables hors cible scores (tableau 1). Le deuxième sgRNA (m2) a été choisi principalement pour son emplacement au sein de l’exon 9 et par manque de sgRNAs supplémentaires dans la région d’éditer avec l’efficacité élevée de clivage et hors cible favorable scores (tableau 1). Deux sgRNAs distincts (m1 ou m2) ont été utilisés dans les infections séparées pour s’assurer que les effets observés sont en raison de la modification génétique sur la cible. Hors cible effets ne devraient pas être partagée par plusieurs sgRNAs indépendant. Le contrôle ne pointeraient (scramble) servait aussi comme témoin négatif. Recrutement de l’endonucléase de Cas9 à Calr exon 9 est censé pour créer DSBs à ce locus. La CDB serait alors réparé par NHEJ, qui peut générer des indels de taille variable (Figure 1).
Pour développer l' in vitro CRISPR/Cas9 système Ba/F3 cellules, cellules exprimant de manière stable la protéine Cas9 ont été faites par transduction LENTIVIRAUX médiation selon le protocole décrit ci-dessus. Expression de Cas9 stable entraîne robuste activité Cas9. L’activité dans les cellules de Ba/F3-Cas9 Cas9 a été mesurée par pXPR-011, une construction de journaliste qui contient des GFP et un guide ciblant GFP15. Cellules contenant Cas9 active seront traduira par une réduction de GFP15. GFP a été mesurée dans les cellules à l’aide de cytométrie en flux. BA/F3-Cas9 cellules affichent une réduction d’environ 76 % dans GFP, correspondant à l’activité de Cas9 robuste (Figure 2).
Type de récepteurs de cytokines 1, tel que le récepteur de la thrombopoïétine (MPL), le récepteur de l’érythropoïétine (EPOR) et la colonie de granulocyte-stimulant factor receptor (G-CSFR) ont chacun individuellement, stablement exprimés dans les cellules de Ba/F3-Cas9 pour déterminer leur coopérativité avec mutante calréticuline en induisant la transformation des cellules de Ba/F3. Transduction des constructions sgRNA (m1, m2 ou un scramble (guide ne pointeraient)) a été réalisée ensuite dans chacune des lignées cellulaires Ba/F3 exprimant de manière stable Cas9 et le récepteur d’intérêt. Les cellules ont été ensuite sélectionnées pendant 7 jours avec la puromycine afin de permettre suffisamment de temps pour l’édition de gène CRISPR/Cas9. Une pression de sélection positive a ensuite été appliquée en affamant les cellules de cytokine (mIL-3). L’objectif de la pression de cette famine est d’identifier si indels dans Calr exon 9, semblables à ceux observés chez les patients MPN, sont sélectionnées pour, résultant en croissance indépendante cytokine et la transformation des cellules de Ba/F3. La courbe de croissance a été réalisée pour un total de 8 jours et les cellules étaient comptés tous les 2 jours afin de mesurer leur transformation (Figure 3)19. Granulés de cellule pour l’extraction d’ADN génomique ont été prélevés avant le début de la courbe de croissance et à la fin de la courbe de croissance à vérifier pour le montage sur la cible et à surveiller les indels qui élargi post cytokine famine (Figure 3)19.
Cytokine croissance indépendante a été observée chez Calr-ciblées Ba/F3-MPL-Cas9 cellules (Figure 4 b), mais pas Calr-ciblée les cellules parentales de Ba/F3-Cas9 (Figure 4 a), ou Ba/F3-Cas9 cellules exprimant façon ectopique EPOR (Figure 4 ) ou G-fédérative tchèque et slovaque (Figure 4)19. Pour confirmer que mIL-3 croissance indépendante dans les cellules ciblées Calr Ba/F3-MPL-Cas9 était le résultat de la modification du gène sur la cible, les cellules ont été récoltées 8 jours post mIL-3 retrait et l’ADN génomique a été extrait19. Une région bp 422 s’étendant sur le site de la cible a été amplifié en utilisant les amorces énumérés au tableau 3. Sous clonage des amplicons PCR a été réalisé et 30 clones individuels ont été envoyés pour Sanger séquençage. Pour m1 ou m2 Calr-cellules ciblées Ba/F3-MPL-Cas9, tous les clones des contenus indels, de différentes tailles au lieu prévu de coupe (Figure 5)19. 11 des 13 m1 sous clones trouvées contenant indels qui a conduit à + 1 bp déphasage mutations (Figure 5), semblables à celles trouvées chez les patients. Pour m2 Calr-ciblée des cellules, 10 des 17 sous clones ont été trouvés pour contenir les indels qui a conduit à + 1 bp déphasages (Figure 5)19. Ces données confirment que CRISPR/Cas9-médiée par l’introduction de + 1bp mutations de déphasage à l' endogène Calr , exon 9 locus est suffisante pour conférer l’activité oncogénique Calr19. Les données de séquençage dans la Figure 5 indiquent également que l’introduction des hétérozygotes + 1bp déphasage mutations au locus Calr endogène est suffisante pour transformer des cellules de Ba/F3-MPL, conformes à l’observation que CALR les mutations sont généralement hétérozygotes dans MPN patients17,18. Puisque NHEJ réparer des résultats en forte hétérogénéité entre les indels, seule cellule tri pour isoler un clone d’intérêt pourrait être exécuté. Cela permettrait le chercheur étudier les effets de mutations spécifiques créées par CRISPR/Cas9.
Figure 1 : Schéma de CRISPR/Cas9 édition de gène ciblage de l’exon 9 de Calr. Deux sgRNAs ont été conçus pour cibler un site dans la région d’exon 9 Calr souris correspondant à qui ciblés par le + 1bp déphasage mutations humaine MPN (barre rouge). Les séquences cibles avec PAMs (bleu foncé) sont affichés, et attendue des sites de clivage de Cas9 sont indiqués par triangles rouges. CDB généré par CRISPR/Cas9 est alors réparé par NHEJ, qui devrait générer des indels de longueur variable19. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : analyse d’activité de Cas9. Cellules parentales de Ba/F3 et Ba/F3 cellules surexprimant Cas9 étaient transduites avec pXPR-011 pour mesurer l’activité de Cas9. Une réduction GFP est corrélée avec l’augmentation de l’activité Cas9. Cellules de Ba/F3 parentales sont ~ 100 % FITC + par rapport aux cellules de Ba/F3-Cas9 si la FITC est réduite d’environ 76 %. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : calendrier de l’infection et la sélection de sgRNAs dans les cellules de Ba/F3. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Introduction + 1 bp de mutations de déphasage dans le locus Calr endogène est suffisante pour conférer l’activité oncogénique Calr. Des courbes de croissance (A-D) en parental Ba/F3-Cas9 (A) Ba/F3-MPL-Cas9 cellulesB, cellules Ba/F3-PPOR-Cas9 (C), et cellules Ba/F3-G-CSFR-Cas9 (D) montre la croissance ciblée Calr Ba indépendante IL-3 / F3-MPL-Cas9 cellules seulement19. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5: vérification de séquençage Sanger. Confirmation de sur-cible édition d’endogène Calr (exon 9) dans les cellules de Ba/F3-MPL. + 1 bp déphasage mutations sont indiquées en noir19. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Gène cible | ID sgRNA | Séquence cible (5'-3') | Strand | Efficacité de clivage | Score OFF-cible | ||
| Calr | M1 | AGAGGACAAGAAGCGTAAAGtot. | + | 0,7 | 70 | ||
| Calr | m2 | GAGGCTTAAGGAAGAAGAAGtot. | + | 0,3 | 28 | ||
Tableau 01:20-mer protospacer séquences, y compris la PAM du site (en gras) pour deux sgRNAs ciblant l’exon 9 du Calr 19.
| ID de l’apprêt | Séquence (5'-3') |
| M1-F | CACCGAGAGGACAAGAAGCGTAAAG |
| M1-R | AAACCTTTACGCTTCTTGTCCTCTC |
| m2-F | CACCGAGGCTTAAGGAAGAAGAAG |
| m2-R | AAACCTTCTTCTTCCTTAACCTC |
Tableau 2 : séquences Protospacer et leurs compléments inverses avec « CACC » et « AAAC » ajouté pour le clonage dans le vecteur pLenti-Guide à l’aide d’enzymes de restriction de BsmBI 19.
| ID de l’apprêt | Séquence (5'-3') |
| Calr_Fwd | ACCACCTGTCTTTCCGTTCT |
| Calr_Rev | GGCCTCTACAGCTCATCCTT |
Tableau 3 : CRISPR de dépistage en amont et en aval du site de clivage sgRNA des amorces PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nous démontrons l’utilisationdes CRISPR/Cas9 gène édition pour étudier la fonction biologique de CALR mutations dans les cellules hématopoïétiques. Le succès de ce protocole est fortement tributaire de plusieurs facteurs. Tout d’abord, il est important de savoir quels types de mutations peuvent être responsables du phénotype que l'on souhaite. Dans ce protocole, l’affichage est la transformation des cellules de Ba/F3 à mIL-3 l’indépendance et les types de mutations sont indels dans l’exon 9 de CALR. Toutefois, si la mutation souhaitée est une substitution de la seule paire de bases, puis réparation induite par le HDR est la méthode préférée parce qu’elle peut introduire des mutations ponctuelles précises ou insertions d’un monocaténaire ou bicaténaire ADN donneur modèle2, 3. si on désire knock-out du gène, puis la création des destructions à grande échelle de génomiques ciblant les premiers exons codage est préféré à20.
Deuxièmement, la lignée cellulaire doit dépendre de cytokine afin de permettre le retrait de cytokine de sélection positive pression après. Il est important de noter que pas toutes les lignées cellulaires peuvent tolérer une expression stable de Cas9 (voir étape 6.3). Cela pourrait être dû à la sélection de blasticidine, qui n’est pas tolérée par toutes les lignées cellulaires. Dans ce cas, le choix des autres constructions Cas9 avec des cassettes de sélection différente peut être nécessaire. Une mise en garde de l’utilisation de lignées cellulaires de cytokine-dépendantes, telles que les cellules de Ba/F3 est qu’ils sont sensibles à la croissance indépendante cytokine spontanée, parfois à la suite de l’acquisition des mutations dans le gène exprimé de façon ectopique d’intérêt après cytokine 21de retrait. En conséquence, l’utilisation de contrôles appropriés est nécessaire afin d’être sûr que la transformation cellulaire observée est en raison de la modification du gène sur la cible CRISPR. Dans ce protocole, nous n’avons pas observé la transformation cellulaire en Ba/F3-MPL : cellules transduites avec un contrôle de sgRNA ne pointeraient ou en Ba/F3-PPOR et Ba/F3-GCSFR cellules transduites avec Calr-cible sgRNAs. Cela donne plu confiance que la transformation cellulaire des cellules de Ba/F3-MPL est le résultat de sur-cible édition du locus Calr endogène.
Dans ce protocole, réparation de l’ADN par NHEJ introduit indels de tailles variables, comme on le voit à la Figure 5. Analyse par Sanger séquençage a été effectué sur un sous-échantillon de la population en masse de cellules édités pour chercher l’expansion des indels qui conduisent au retrait de cytokine + 1 bp déphasage mutations après. Prochaine génération séquençage mentionné à l’étape 9,9 est une façon plus robuste afin de quantifier sur la cible d’édition pour les populations de cellules en vrac. Si l’analyse sur un clone spécifique est souhaitée, puis seule cellule tri de la population en vrac est nécessaire. Seule cellule tri est avantageux dans la compréhension de l’effet biologique résultant d’un certain type de mutation et est utile lorsque l’objectif est de comprendre les différences entre les deux différents types de mutations.
Un souci avec le système CRISPR/Cas9 est hors cible effets, qui sont des événements de clivage à l’extérieur de la région ciblée. Afin d’évaluer la spécificité du système CRISPR/Cas9 et pour s’assurer que les populations transformées ne contiennent pas d’effets hors cible conduisant à la transformation observée, nous devrons examiner si génome édition a eu lieu à l’extérieur de la région de intérêt. Cela pourrait se faire par la recherche de preuves de Cas9/NHEJ-driven génome édition à potentiels hors cible locus génomiques avec similarité des séquences significatives à la cible. Pour ce faire, nouvelle génération séquençage pourrait également servir à évaluer de façon quantitative la fréquence des effets hors cible à des endroits précis le long du génome. Pour réduire le risque d’effets hors cible, différents facteurs pourraient être incorporées dans le protocole. Comme mentionné dans les résultats, étudier plusieurs sgRNAs ciblant la zone concernée veille à ce que le phénotype est le résultat d’un événement sur la cible. En outre, des études récentes ont suggéré que sgRNAs tronqué avec 17 nucléotides peut réduire la fréquence du clivage hors cible événements22. En outre, une exposition prolongée à Cas9 d’expression stable peut entraîner une fréquence plus élevée d’effets hors cible. Il est important de noter qu’un système de double vecteur contenant Cas9 et le sgRNA pourrait servir dans le protocole au lieu de l’expression stable de Cas9 ; Toutefois, ces vecteurs ont tendance à être très volumineux et provoquer un faible titre des gènes et le rendement plus faible de l’infection. En conséquence, transfection transitoire de la construction de Cas9 dans les cellules de nucleofection pourrait servir. Des rapports récents ont également développé Cas9 constructions avec la plus grande spécificité pour l’édition de sur la cible, tels que l’eSpCas9 construire6.
En résumé, CRISPR/Cas9 représente un génome efficace, peu coûteux et fiable outil d’ingénierie, permettant l’étude des mutations génétiques au niveau de l’expression physiologique. Ici nous employons CRISPR/Cas9 gène édition comme une méthode robuste et efficace pour faire progresser la compréhension des effets fonctionnels de CALR mutations dans les cellules hématopoïétiques.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nous n’avons aucun conflit d’intérêt concernant ce rapport.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les NIH (R01HL131835), une bourse de chercheur clinique de Damon Runyon et le Consortium de Cancer Starr.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BsmBI | New England Biolabs | R0580L | |
| Blasticidin | Sigma Aldrich | 15025 | |
| Puromycin | Life Technologies | A1113803 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| TransIT-LT1 | Thermo Fisher Scientific | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 51985034 | |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | MT10040CV | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| mIL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| psPAX2 | Addgene | N/A | |
| pCMV-VSV-G | Addgene | N/A | |
| pLX_TRC311-Cas9 | Addgene | N/A | |
| polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
| pXPR-011 | Addgene | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| LentiGuide-Puro | Addgene | Plasmid #52963 | |
| PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 |
References
- DeWitt, M. A., et al. Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells. Sci Trans Med. 8, 360 (2016).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 4, 347-355 (2014).
- Gaj, T., Gerbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31 (7), 397-405 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Wiedenheft, B., Samuel, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
- Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Larson, M. H., et al. CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression. Nat Protoc. 8 (11), 2180-2196 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Kim, H. S., et al. CRISPR/Cas9-mediated Gene-knockout screens and target identification via Whole genome sequencing uncover host genes required for picornavirus infection. J Biol Chem. 10, 1074 (2017).
- Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancies with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Biotechnol. 32 (9), 941-946 (2014).
- Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 9312-9316 (1988).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucl Acid Res. 42, e168 (2014).
- Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med. 369, 2379-2390 (2013).
- Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N Engl J Med. 369, 2391-2405 (2013).
- Elf, S., et al. Mutant Calreticulin requires both its mutant C-terminus and the thrombopoietin receptor for oncogenic transformation. Cancer Discovery. 6 (4), 368-381 (2016).
- Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell lines via CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (95), e52118 (2015).
- Watanabe-Smith, K., et al. Analysis of acquired mutations in transgenes arising in Ba/F3 transformation assays: findings and recommendations. Oncotarget. 8, 12596-12606 (2017).
- Fu, Y., et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. NatBiotechnol. 32, 279-284 (2014).
