Summary
Per strettamente imitare la modalità delle lesioni di ustione richiede l'interazione tra l'osservazione clinica e studi in modelli animali. In questo studio, un modello di suina della ferita di ustione severa è stato istituito per valutare una medicazione sperimentale nelle impostazioni fisiologiche e patofisiologiche.
Abstract
Guarigione delle ferite è un processo di ripristino dinamico ed è il più complesso processo biologico nella vita umana. In risposta alla lesione da ustione, alterazioni nelle vie biologiche alterano la risposta di infiammazione, con conseguente ritardata guarigione delle ferite. Alterata cicatrizzazione si verifica frequentemente nei pazienti con diabete che conduce a risultati sfavorevoli come l'amputazione. Quindi, avendo un effetto benefico nel promuovere la riparazione della ferita di ustione di medicazioni sono necessari. Tuttavia, gli studi sul trattamento della ferita dell'ustione sono limitati a causa della mancanza di modelli animali corretto. Il nostro studio precedente ha dimostrato prestazioni cicatrizzazione in modelli di ratto e suina utilizzando una tecnica chirurgica mini-invasiva. Questo studio ha mirato a dimostrare un modello suina della ferita di ustione severa che elimina la contrazione della ferita e più si avvicina i processi umani di riepitelizzazione e formazione di nuovo tessuto. Questo protocollo fornisce una procedura dettagliata per la creazione di ferite da ustione coerente ed esaminando le prestazioni di guarigione nell'ambito del trattamento di una medicazione sperimentale in un modello di suina. Sei ferite da ustione sono state create simmetricamente sul dorsum, che sono stati coperti con una medicazione clinica composta da quattro strati: uno strato interno di contatto di materiali sperimentali, uno strato intermedio interno di pellicola impermeabile, strato intermedio esterno di garza, e uno strato esterno di cerotto adesivo. Al termine degli esperimenti, la chiusura della ferita, zona della ferita e Punteggio di Vancouver Scar Scale sono stato esaminato. I campioni di pelle resecato da ogni post-sacrificio animale istologicamente sono stati preparati e colorati con ematossilina ed eosina. Inoltre è stato esaminato l'attività antibatterica di ogni medicazione nel contesto della guarigione della ferita. L'applicazione della medicazione clinica per le ferite nel modello suina imita i processi biologici di cicatrizzazione umana rispetto ai processi di epithelialization, proliferazione cellulare e l'angiogenesi. Pertanto, questo modello di suina fornisce un metodo facile da imparare, conveniente e affidabile per valutare l'effetto di medicazioni cliniche in gravi ustioni.
Introduction
Una lesione da ustione avvia il processo infiammatorio e induce effetti patologici complessi, che influenzano numerose funzioni del corpo immediatamente dopo un incidente, con conseguente impatto negativo sulla qualità della vita dei pazienti. Alterata cicatrizzazione causa significativa morbidità e mortalità tra i pazienti con diabete mellito1,2. Maggior parte dei pazienti con le lesioni da ustione provare dolore durante sbrigliamento della ferita di ustione, che è conosciuto come un processo straziante nonostante l'uso di analgesici oppioidi potente3.
A differenza di altri mammiferi, suina condivisione diverse caratteristiche anatomiche e fisiologiche con gli esseri umani per quanto riguarda il processo di epithelialization, proliferazione cellulare e l'angiogenesi. Questo rende suina un modello potenzialmente migliore per alcune procedure e studi, e sono spesso utilizzati negli studi successivi che ha dimostrato risultati promettenti in topi. Queste caratteristiche hanno portato all'uso crescente di porci come una specie maggiore in fase di test preclinici. Recentemente, un rapido aumento nella ricerca biomedica con rispetto a cardiovascolare, urinario, tegumentario e sistemi digestivi è stato osservato4,5,6. Questo studio mira a dimostrare un modello suina della ferita di ustione severa che elimina la contrazione della ferita e fornisce una migliore approssimazione dei processi di guarigione della ferita umana e la formazione di nuovo tessuto. Sei ferite da ustione sono state create simmetricamente sul dorsum, tre su ogni lato della spina dorsale del suino. Successivamente, anexperimental medicazione è stata esaminata in un modello di suina della lesione da ustione grave, che può essere adattato per replicare la guarigione della ferita umana (Figura 1). Le ferite sono stati coperti con una medicazione clinica, che si compone di quattro strati: uno strato interno di contatto di materiali sperimentali, uno strato intermedio interno di pellicola impermeabile, strato intermedio esterno di garza e uno strato esterno di cerotto adesivo. Una pellicola impermeabile mantiene la ferita in ambiente umido impedendo l'infezione batterica e permettendo gas a permeare la medicazione. Lo strato intermedio esterno di garza è stato applicato sui film impermeabile e protetto da uno strato esterno di cerotto adesivo. Al completamento degli esperimenti, sono stato esaminato la chiusura della ferita, zona della ferita e il Punteggio di Vancouver Scar scala (VSS). I campioni di pelle resecato da ogni post-sacrificio animale istologicamente sono stati preparati e colorati con ematossilina ed eosina (lui). Attività antibatterica di ogni medicazione nel contesto della guarigione della ferita inoltre è stato esaminato in questo modello. Il nostro studio precedente ha dimostrato prestazioni cicatrizzazione nel modello di ratto e suina usando una tecnica chirurgica mini-invasiva7. Dato che c'erano che sei ustioni sul dorsum all'interno di ogni suino, ogni medicazione sperimentale è stato testato e valutato in tutte le posizioni di minimizzare bias legate alla ferita il processo di guarigione in diversi punti sul dorsum suina. Pertanto, il modello di suina della lesione da ustione grave stabilita in questo studio fornisce un nuovo approccio per la valutazione di medicazioni cliniche e facilita lo sviluppo di un nuovo trattamento per lesione da ustione. Questo studio fornisce strumenti fondamentali per scoprire la patofisiologia di guarigione della ferita di ustione.
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Protocol
Procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal comitato di cura degli animali al centro medico della difesa nazionale, Taiwan (R.O.C). Questo studio è stato condotto al centro di animali di laboratorio presso il centro medico della difesa nazionale. Suini di peso compreso tra 20 e 25 kg sono stato instrumentato con successo utilizzando questo protocollo.
1. adattamento degli animali a manipolazione umana
- Dopo l'arrivo nella struttura, casa degli animali solitarily ma farli interagire tra loro.
- Fornire agli animali ad libitum accesso a cibo e acqua.
- Acclimatare suina alla manipolazione umana e trasporto dalla struttura animale al laboratorio sperimentale di maneggiamento dell'animale almeno una volta al giorno per una settimana.
- Veloce l'animale per almeno 12 ore prima dell'intervento chirurgico per prevenire la nausea, il vomito e l'aspirazione di fluidi dello stomaco.
2. sedazione
- Prima della creazione della ferita dell'ustione, sedare gli animali tramite un'iniezione endovenosa con Zoletil 50 (25 mg/kg).
3. l'intubazione e la ventilazione
- Metti l'animale su un tavolo e/o il carrello in posizione sternale.
- Aprire la bocca dell'animale con un divaricatore orale.
- In caso di insufficiente rilassamento delle ganasce o presenza di riflessi di deglutizione, che ostacolano l'intubazione, maschera suina con isoflurano per indurre sedazione.
- Monitorare la pressione sanguigna, frequenza cardiaca e temperatura corporea da monitor segnale fisiologico durante la chirurgia per impedire le complicazioni potenziali.
4. anestesia
- Indurre e mantenere l'anestesia; preferibilmente anestetizzare l'animale tramite un'iniezione intramuscolare di tiletamina e zolazepam (25 mg / kg + 25 mg / kg).
- Intubare l'animale con il tubo endotracheale quando reflexed rilassamento muscolare, caratterizzato dalla perdita di tono di mascella e palpebrale, è stata osservata.
- Mantenere tutti i maiali in un stato di anestesia con un'impostazione di vaporizzatore di 0,5-2,5% (v/v) isoflurane fino alla fine della chirurgia.
- Esaminare la profondità dell'anestesia testando i riflessi di dolore con un pizzico di punta del piedino posteriore prima della chirurgia. Quando necessario, aggiungere ulteriore anestesia o attendere per pochi minuti. Controllare i dolori riflessi regolarmente durante la chirurgia.
5. sterilizzazione del sito chirurgico
- Rasatura e pulire la pelle dell'animale su una superficie di circa 25 cm di larghezza della colonna vertebrale fino al axilla su entrambi i lati.
- Strofinare la pelle idratata con scrub povidone-iodio (75 mg/mL) per circa 5 min.
- Rimuovere il sapone di povidone-iodio dalla pelle utilizzando garze sterili bagnate.
- Sterilizzare la pelle con la lozione di povidone-iodio (100 mg/mL).
- Coprire l'animale con teli chirurgici sterili per ridurre il trasferimento batterico e successiva contaminazione del sito chirurgico.
6. masterizzare creazione ferita
- Utilizzare un pennarello chirurgico per segnare il centro di sei ferite da ustione simmetricamente sul dorsum del maiale. Assicurarsi che la distanza tra ogni ferita da ustione sia almeno maggiore del raggio della ferita (Figura 1A).
- Riempire un saldatore modificato con 50 mL di glicerina e inserirvi un termometro elettronico per monitorare la temperatura. Il ferro caldo possiede un'area pianeggiante di circa 9 cm2 (Figura 1B).
- Riscaldare il ferro a 137-139 ° C con una piastra riscaldante (Figura 1).
- Creare sei ferite da ustione uniforme inserendo il ferro sulla zona marcata senza applicare alcuna forza per 30 secondi (Figura 1).
- Lavare le ferite da ustione con soluzione fisiologica 0,9% (Figura 1).
- Misurare le dimensioni della ferita e la ferita per registrare la fotomicrografia (Figura 1E).
7. preparazione di condimenti
- Coprire ogni ferita con lo strato interno di contatto di una preparazione clinica di quattro strati attraverso il contatto diretto. Per questo livello, utilizzare tappi contenenti medicazione o materiali alternativi (Figura 1F).
- Applicare una pellicola impermeabile sulla medicazione clinica per servire come una barriera contro la penetrazione batterica (Figura 1F).
- Coprire ogni ferita con una garza (0,5 cm di spessore) e fissare con nastro adesivo di carta per servire come strato intermedio della medicazione (Figura 1).
- Fissare la garza con uno strato esterno di cerotto adesivo. Estendere questo strato al torso per evitare lo spostamento della medicazione (Figura 1 H-1J).
8. post-masterizzare cura e misurazione
- Iniettare la suina con buprenorfina (0,1 mg/kg, IM) per la gestione del dolore per ogni 8-12 h, a partire prima del recupero dall'anestesia, per una settimana per ridurre il potenziale dolore.
- Consentire l'accesso gratuito di maiale al mangime e acqua.
- Cambiare le medicazioni cliniche ogni 2 giorni per i primi 10 giorni e poi due volte a settimana per 6-settimana di studio.
- Pulire e misurare le ferite prima di riapplicare medicazioni cliniche. Somministrare anestetici durante i cambi di medicazione.
- Registrare la ferita di microfotografia per il confronto di velocità di guarigione della ferita ogni 2 giorni per i primi 10 giorni e poi due volte a settimana per 6-settimana di studio.
- Calcolare la riepitelizzazione della ferita o contrazione come percentuale delle dimensioni della ferita originale secondo un metodo descritto in precedenza. L'analisi della chiusura della ferita è stata condotta in un modo doppio accecato.
- Misurare la cicatrice dell'ustione utilizzando VSS, che consiste di quattro variabili: vascolarizzazione, l'altezza (spessore), duttilità e pigmentazione post-ustione giorni 0, 7, 21 e 42. Ogni variabile ha quattro-sei punteggi possibili. Il totale punteggio varia da 0 a 14, per cui un punteggio pari a 0 riflette pelle normale.
9. esperimenti di crescita batterica dei tessuti post-ustione
- Tamponare la ferita per test antibatterico su post-ustione giorni 0, 7, 21 e 42.
- Inserire il tampone nel 100 mL di soluzione sterile salina allo 0,9% e delicatamente vortice per ottenere una sospensione omogenea.
- In serie diluire (10− 1– 10− 5) l'omogeneizzato e piastra 100 μL di ogni diluizione media selettivi e non selettivi, rispettivamente.
- Incubare tutte le diluizioni in condizioni aerobiche a 37 ° C per 24-72 ore.
- Aliquote triplici di piastra di 10 μL di ogni da tutte le diluizioni sulla piastra di agar sangue completati con sangue di montone al 5% per isolare gli organismi aerobici gram-positivi.
- Incubare il campione da spalmare o versando il campione uniformemente sulla superficie di una piastra di agar durante la notte per determinare il numero di formazione di colonie (CFUs) unità.
- Leggere le piastre dopo incubazione overnight. Capovolgere la piastra di agar sangue di pecora e dividere il fondo del piatto in quattro quadranti uguali utilizzando un marcatore e un piccolo righello.
- Posizionare la piastra sul palco di un microscopio di dissezione e conta delle colonie su ogni piatto. Per definizione, una colonia deve avere un minimo di 300 CFU da enumerare.
- Conta delle colonie batteriche in ciascuno dei tre replicati. Calcolare che il valore medio dei tre replica. Determinare il CFU per piastra moltiplicando il valore medio per il fattore di diluizione finale.
10. eutanasia e fissazione del tessuto
- Iniettare per via endovenosa una dose eccessiva di soluzione di sodio pentobarbital eutanasia (80 – 120 mg/kg).
- Eseguire in blocco l'asportazione del tessuto di ferita di ustione per includere la muscolatura sottostante e i tessuti circostanti.
- Difficoltà tessuti con formalina neutra tamponata 10%.
- Miscelare 10 mL di formaldeide (37%) in 90 mL di soluzione tamponata fosfato (PBS) e conservare a 4 ° C.
- Transfer tessuti a fissativo e agitare il contenitore per assicurare che tutti i tessuti sono completamente immersi nel fissativo. Il volume del fissativo deve essere 30 volte il volume del tessuto.
- Difficoltà tessuti durante la notte a 4 ˚ c.
- Disidratare i tessuti con etanolo e incorporare blocchi di paraffina. Procedere come segue a 4 ˚ c in un agitatore.
- Lavare due volte con PBS per 30 minuti.
- Disidratare i tessuti con etanolo al 70% per 8 ore, durante la notte in 80% di etanolo, etanolo al 95% per 8 ore e poi in etanolo al 100% durante la notte.
- Incubare tessuti in 100% etanolo per altre 8 ore.
- Incubare tessuti in tre cambi di xilene ogni 30 minuti.
- Sostituire lo xilene con cera appena fuso (52 ° C) e incubare a 52 ° C in forno per 1 ora.
- Sostituire la cera con la cera fresca e incubare a 52 ° C in forno per 3 ore e poi ancora una volta sostituire e incubare a 52 ° C durante la notte.
- Tessuti con due ulteriori modifiche di cera ogni di incubare per 1 ora e poi incorporare il tessuto e conservare a 4 ° C.
- Tagliare e macchiare le sezioni paraffina-incastonato con lui e visualizzare tramite un microscopio ottico con 100× ingrandimento.
- Creare sezioni di paraffina tramite un microtomo rotativo.
- Sparaffinatura sezioni con tre cambi di xilene ogni per 3 minuti.
- Reidratare i tessuti con il 100%, 95%, 80% e 70% di etanolo per 3 minuti e poi immergere in acqua distillata.
- Macchiare con ematossilina per 10 minuti e poi sciacquare in acqua corrente.
- Differenziare con etanolo acido cloridrico 0,1% per 5 minuti e risciacquare in acqua di rubinetto.
- Macchia con eosina 0,5% per 1 minuto.
- Disidratare i tessuti con etanolo 70%, 80%, 95% e 100% ogni 2 minuti.
- Deselezionare la colorazione con xilene e asciugare in cappa.
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Representative Results
Ustione di durata di 30 secondi di ferro caldo ha provocato ferite che erano circolari con un margine ben definito e chiaro uniforme con un orlo di eritema (Figura 1). All'interno di ogni animale, c'erano sei ferite da ustione sul dorsum. La disposizione delle ferite dell'ustione è stata raffigurata in Figura 1 K. Ferite da ustione sono stati completamente coperto con medicazione contenenti tappi e utilizzate per valutare la profondità della formazione della cicatrice post-ustione giorni 0, 7, 21 e 42 e riepitelizzazione, come determinato dal lordo ispezione. Ferite da ustione sono stati re-epithelialized base lordo ispezione post-ustione giorno 42. Dimensione della ferita in questi animali è stata valutata per determinare il tasso (Figura 2A) di guarigione della ferita. Le aree della ferita erano 9, 10, 8 e 3 cm2 sul post-ustione giorni 0, 7, 21 e 42, rispettivamente. È stata osservata una riduzione significativa nell'area della ferita post-ustione giorno 42 rispetto al giorno 0. Il tasso di guarigione è stato definito come la distanza più grande del margine medio ferita dal centro della ferita diviso per il tempo necessario per completare la chiusura della ferita. Le ferite trattate con medicazione CAPS-contenenti ha mostrato la chiusura della ferita di un 73.43±6.33% post-ustione giorno 42 (Figura 2B).
Figura 3 Mostra i punteggi VSS per quanto riguarda la cicatrice vascolarità, duttilità, pigmentazione e altezza post-ustione giorni 0, 7, 21 e 42. Il Punteggio di VSS raggiunse il 7.4±0.5 il giorno post-ustione 21 ed è diminuito a 3.33±0.58 il giorno post-ustione 42.
Tutti gli animali sono stati sacrificati il giorno post-ustione 42. Campioni di pelle resecato da ogni post-sacrificio animale istologicamente sono stati preparati e macchiati di H & E. istologici esame dei campioni ha confermato che le ustioni di pieno-spessore sono stati raggiunti, e le ferite è apparso completamente guarito (Figura 4). Necrosi derivanti da ustioni potrebbe essere osservata nell'epidermide, derma e assorbimento cutaneo dei componenti della ferita senza alterare significativamente il muscolo sottostante (Figura 4). Lo spessore del derma sotto la medicazione sperimentale era 5,4 mm (Figura 4A). Inoltre, la desquamazione del derma e infiltrazione linfocitaria sono osservate nella macchiatura H & E, come indicato dalla freccia rossa in Figura 4B.
La proprietà antibatterica della medicazione sperimentale è stata determinata usando un'analisi CFU su post-ustione giorni 0, 7, 21 e 42. Il risultato ha mostrato un lieve aumento nei numeri delle cellule batteriche osservati tra post-ustione giorni 0 e 21 seguita da un significativo aumento post-ustione giorno 42 (Figura 5). Questo risultato suggerisce che il modello di suina della lesione da ustione grave stabilita in questo studio poteva essere utilizzato per monitorare la performance clinica di condimenti sperimentali, tra cui proprietà antibatterica.
Figura 1. Masterizzare ferita creazione e applicazione di una medicazione clinica contenenti CAPS. A seguito di rimozione dei capelli e la preparazione della pelle con iodio e alcool, pennarello chirurgico di (A) è stato utilizzato per delineare sei cerchi sul dorsum, entrambi i lati della linea mediana. (B) il ferro modificato è stato riempito con glicerina e un termometro elettronico inserito in glicerina per mostrare la temperatura. (C) il ferro viene riscaldato a 137-139 ° C con un piatto caldo, e ferite da ustione uniforme sei sono state create i segni della pelle. Per creare ferite da ustione, appoggiate il ferro caldo con nessuna forza esterna sulla pelle schiena di maiale (30 secondi) per creare due ferite a tutto spessore. (D) dopo che sono state create tutte le ferite, le ferite sono state lavate con soluzione fisiologica 0,9%. (E) le scale sono state collocate accanto le ferite per scattare le foto. (F) il primo strato è coperta con una medicazione di prova e il secondo strato con una pellicola impermeabile. (G) il terzo strato è coperto con la garza di circa 0,5 cm di spessore e fissato con nastro di carta. (H-J) Fissare la garza con uno strato esterno di cerotto adesivo. Questo strato si estende al torso per evitare lo spostamento della medicazione. (K) diagramma schematico della distribuzione ferita dell'ustione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Cambiamento delle dimensioni della ferita in un modello di suina. (A) il tasso di chiusura della ferita è stato determinato come percentuale della ferita originale il giorno 0. Le ferite quasi completamente avevano contratto il post-ustione giorno 42, e (B) modifiche della zona della ferita sono state osservate tra 0 a 42 giorni di un modello animale di post-ustione. Essa mostra la più grande diminuzione post-ustione giorno 42, esibendo 90 ± 4% zona chiusura della ferita. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Della media del punteggio totale di Vancouver Scar scala (VSS) utilizzando un disegno sperimentale in doppio-cieco nei giorni post-ustione in un modello di suina. Cicatrice valutazione comprende la pigmentazione, vascolarizzazione, duttilità e altezza della cicatrice. Un punteggio più basso indica la cicatrice alla condizione che approssima la pelle normale (P = 0,0005). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Ematossilina ed eosina su post-ustione giorno 42. (A, B) il triangolo invertito nero indica il tessuto ustione riparato. La morfologia della ferita di pieno-spessore è stato veloce e continuo, e lo strato papillare ha assomigliato a caratteristiche di cicatrici ipertrofiche. Si noti la presenza di neo-epidermide che copre la superficie della ferita. (B) la freccia rossa indica le cellule infiammatorie del tessuto connettivo-infiltrato dermica nell'escara di ferita di ustione sopra il derma praticabile qui sotto. Ingrandimento originale, × 10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Un bar rappresentazione diagramma batterica conteggio delle ferite in diversi momenti. Attività antibatterica di post-ustione ferita modello animale a 0, 7, 21 e 42 giorni. Attività antibatterica è stata valutata dall'analisi di unità (CFU) formanti colonie in tre esperimenti indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Lo studio presente ha stabilito un modello di suina della ferita di ustione severa ed esaminato il modello utilizzando una medicazione CAPS-contenente. I nostri risultati indicano che questo modello di suina può essere utilizzato per monitorare l'andamento clinico dei condimenti sperimentali, tra cui proprietà antibatterica. Cicatrizzazione di tasso, la chiusura della ferita e attività antibatterica inoltre sono stati analizzati mediante test di colorazione ed antibatterico VSS, H & E. L'uso di modelli animali ustione è stato sviluppato come uno strumento prezioso per esaminare la patofisiologia della ferita di ustione. Ci sono alcuni benefici biologici di facendo uso dei ratti come soggetti sperimentali, tra cui l'elevato numero di reagenti specifici del ratto e gli aspetti pratici dell'ottenimento di ratti transgenici, per scoprire le vie di segnalazione molecolare attive nel recupero processo. Tuttavia, lo svantaggio principale dell'utilizzo di ratti in un modello animale di ustione è suo fallimento per approssimare completamente il processo di cicatrizzazione umana. Riepitelizzazione è l'approccio di guarigione principale osservata in esseri umani8, mentre la ferita guarisce nei ratti fortemente dipende dalla contrazione della ferita in un modo veloce9. Inoltre, la non-vulnerabilità dei ratti a ipertrofica o formazione di cicatrice cheloide ha confermato la diversità del loro processo di recupero della ferita da quella degli umani. D'altra parte, suina è di recente diventati oggetto di attenzione di ricercatore perché la loro architettura di pelle è simile a quella della pelle umana. Inoltre, il processo suina e gli esseri umani di cicatrizzazione si verifica attraverso fasi fisiologicamente simili quali infiammazione, proliferazione, riepitelizzazione e rimodellamento. In genere, ustioni in maiali guariscono da 21 giorni, con riepitelizzazione che si verificano tra 7 e 14 giorni post-ferita inflizione10,11, che si inseriscono per le sequenze temporali osservati in esseri umani. Suina Mostra anche una maggiore morbilità confronta ai ratti a causa della loro dimensione corporea che rende più resistenti all'infezione della ferita. I topi sono solitamente il primo modello utilizzato per valutare le condizioni della ferita di ustione sotto diversi trattamenti. Inoltre, a differenza di altri mammiferi, suina condivisione un numero di caratteristiche anatomiche e fisiologiche con gli esseri umani per quanto riguarda il processo di epithelialization, proliferazione cellulare e l'angiogenesi. Questo rende suina potenzialmente un modello migliore, e sono spesso utilizzati negli studi successivi che ha dimostrato risultati promettenti in topi 12,13,14,15. Inoltre, la distribuzione del collagene dermico e rifornimento di anima elastica di contenuto, cutaneo, la sequenza di eventi nella cicatrizzazione e riepitelizzazione hanno reso la suina un modello standard di guarigione della ferita e trattamenti chirurgici ricostruttivi15 ,16,17,18. All'interno di ogni animale, c'erano sei ferite da ustione situate sulla parte superiore, centrale, e inferiore posteriore del suino e distribuito simmetricamente alla colonna vertebrale. Ferite da ustione possono essere create i percorsi simili ma diversi suina. Di conseguenza, ogni medicazione sperimentale possa essere testati e valutati in diverse posizioni per minimizzare bias legate alla ferita il processo di guarigione in diversi punti sul dorsum suina. Inoltre, questo modello di suina della lesione da ustione grave stabilita in questo studio beneficia anche di garantire che ogni suina serve come il suo controllo con una ferita di romanzo che ricevono il trattamento e l'altro come controllo del veicolo, che conduce ad una riduzione significativa del numero di animali.
La gestione delle lesioni di ustione è una delle principali complicanze nella guarigione delle ferite. Il processo di guarigione umano è composto di quattro processi biologici: emostasi, infiammazione, proliferazione e maturazione. Una volta che il processo di guarigione è disturbato o ritardato, promuove una proliferazione fibroblastica che si traduce in una cicatrice ipertrofica, che è visibile e tende ad essere sollevato sopra la pelle circostante16. Per garantire la riproducibilità e la quantificazione accurata, adeguata adesione usando cerotto adesivo è richiesto immediatamente dopo la ferita per minimizzare il ritardo nel tempo. Irritazione cutanea è una reazione comune da cerotto adesivo che si traduce in un'eruzione intorno la medicazione clinica. Pertanto, si raccomanda cautela nell'uso del cerotto adesivo attualmente disponibile per prevenire il prurito. Seguendo tecniche asettiche e disinfettare accuratamente tutte le attrezzature (ad es., pinza) per evitare la contaminazione incrociata tra suini sono di importanza fondamentale.
Guarigione della ferita dell'ustione è un processo complicato. Un certo numero di fattori è stato identificato per avere un'influenza negativa sul processo quali dolore, il prurito e la contaminazione batterica di guarigione arrotolato. Il dolore ha un impatto negativo sulla dieta dell'animale. Senza sufficiente assorbimento dei nutrienti, ritardata guarigione delle ferite è inevitabile. Di conseguenza, ogni suina è stato iniettato con buprenorfina (0,1 mg/kg, IM) al giorno per 7 giorni consecutivi per ridurre il dolore. L'ingestione di cibo è stata monitorata una settimana dopo l'ustione ferita di creazione. Una volta che una diminuzione dell'assunzione di cibo è stata osservata il giorno 7, buprenorfina (0,1 mg/kg, IM) gestione è stata continuata fino al giorno 14. Infezione batterica, che è un potenziale rischio per la guarigione della ferita, può innescare l'infiammazione e smorzare ulteriormente il processo di guarigione. Pertanto, medicazioni cliniche erano coperti con film impermeabile per prevenire e minimizzare la potenziale contaminazione. Prurito è scomoda parte del processo di guarigione arrotolato. Suina può graffiare la propria schiena a terra per ridurre il prurito, che può essere sfavorevole per il processo di cicatrizzazione. Una buona medicazione possiede la proprietà di accelerare bruciare ferita guariscono lasciando una cicatrice accettabile, prevenire l'infezione e l'infiammazione, alleviare il dolore e permettendo la facile e precoce mobilizzazione19,20. La medicazione può essere rimosso quando richiesto per ulteriori applicazioni topiche e/o misurazione della ferita zona21,22. Anche se l'applicazione di una medicazione clinica di quattro strati per un porco è un processo più complicato e richiede molto tempo più clinici, suina modello consente maggiore approssimazione una risposta biologica umana di modello del topo. Molti vantaggi potenziali di utilizzo suina modello rendono una migliore piattaforma per i test preclinici rispetto ad altre specie.
L'efficacia clinica in termini di riduzione della superficie della ferita chiusura l'efficienza e la ferita è stata monitorata utilizzando una medicazione contenenti tappi che ha rivelato una 73.43±6.33% la chiusura della ferita post-ustione giorno 42. Inoltre, il VSS punteggio, un punteggio convalidato scala soggettiva, è stato utilizzato per valutare le ferite nei suini in questo studio17. È importante monitorare la formazione della cicatrice ipertrofica durante il trattamento con medicazioni sperimentale, specialmente in studi clinici18. Applicazione di tappi nel trattamento delle ferite da ustione ha provocato un cambiamento significativo nei punteggi di VSS post-ustione giorno 42 confrontato con i punteggi il giorno 21. Un punteggio più basso indica che la zona danneggiata tenta di ripristinare una condizione che si avvicinano strettamente altezza, vascolarizzazione, duttilità e la pigmentazione di colore della pelle normale. Inoltre, i risultati di macchiatura di H & E hanno indicato uno strato corneo intatto nella zona tappi-trattati. Questo risultato suggerisce che il modello suina di una grave ustione può essere utilizzato in modo affidabile per valutare l'area della ferita, la chiusura della ferita, VSS Punteggio e progressi di guarigione.
Questo protocollo rappresenta i numerosi passaggi dettagliati per dimostrare l'utilizzo di una medicazione sperimentale su un modello di suina della lesione da ustione grave e può essere applicato per la valutazione di tutti i tipi di medicazione clinica. Un saldatore modificato, riempito con 50 mL di glicerina è in grado di mantenere la temperatura entro 137-139° C durante il processo di creazione di ferita. Tuttavia, questo metodo presenta limitazioni quali l'impossibilità di imitare assolutamente la temperatura reale ustione e la ristrettezza della zona di combustione creata a causa dell'ambito di saldatore. Tuttavia, i vantaggi principali del metodo superare tali limitazioni. Questo ferro modificato può essere utilizzato per creare ferite coerente con precisione e facilità rispetto ai metodi tradizionali. Inoltre, questo modello fornisce una misura sensibile della risposta fisiologica e patofisiologica di una lesione da ustione termica sotto il trattamento di varie medicazioni cliniche. Il vantaggio del modello proposto, oltre ai vantaggi economici, è che è facile da movimentare da quelli con esperienza relativamente poco chirurgica. L'applicazione della medicazione clinica per le ferite nel modello suina imita i processi biologici di guarigione della ferita umana. Di conseguenza, il modello di suina della lesione da ustione grave stabilita e testato con condimento clinica in questo studio facilita lo sviluppo di trattamento novello per lesione da ustione. Questo studio fornisce strumenti fondamentali per scoprire la patofisiologia di guarigione della ferita di ustione. In conclusione, questo modello di suina fornisce un metodo facile da imparare, conveniente e affidabile per valutare l'effetto di medicazioni cliniche in gravi ustioni.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione del Tri-Service General Hospital; Centro medico della difesa nazionale, Taiwan (TSGH-C107-042); Ministero della scienza e della tecnologia, Taiwan (maggior parte 106-2314-B-016-014); e il centro medico della difesa nazionale (MAB-106-055; MAB-106-010; MAB-107-064).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sedation: | |||
| Ketamine | Merial | 2528 ESP | 10 mL vial |
| Azaperone | China chemical & pharmaceutical | 47W406 | 100 mL vial |
| Atropine | Oriental chemical works | IN120802 | 1 mL vial |
| Anesthetic: | |||
| Tiletamine+Zolazepam | Virbac | BC91 | 5 mL vial |
| Isoflurane | Baxter | N002A225 | 100 mL vial |
| Surgery: | |||
| Hair clippers | Moser | - | - |
| Povidone iodine scrub solution | Ever star | HA161202 | 4 L barrel |
| Modified iron | - | - | - |
| 0.9% saline solution | CHI SHENG | KC130 | 500 mL vial |
| Gauze | China Surgical Dressings Center | MO15900080 | 10 x10 cm |
| CAPS | CoreLeader Biotech Co., Ltd, Taipei, Taiwan | - | - |
| Paper tape | 3M | NDC-8333-1530-01 | 2.5 cm x 9.1m |
| Waterproof film | 3M | NDC-8333-1600-40 | 10 cm x 10 m |
| Adhesive plaster | Young chemical | BH1426015 | 10 cm x 10 m |
| Dissection: | |||
| Pair of standard sharp/blunt straight scissors (14 cm) | Shinetec instruments | ST-S114 | - |
| Halstead-Mosquito (12.5 cm) | Shinetec instruments | ST-H012 | - |
| Handle(# 4) | Shinetec instruments | ST-H004 | - |
| Surgical Blade(#21) | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
| Post-Fixation & Storage: | |||
| 50 ml Plastic centrifuge tube | Falcon | 352070 | - |
| 10% neutral buffered formalin | Leica | 3800604EG | - |
| Bacterial Growth Experiments | |||
| Blood agar plate (BAP) (TSA with 5% sheep blood) | CMP | - | 90 mm Mono |
References
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