Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist Produktion der gesamten extrazelluläre Matrix Fasern für Wunde Reparatur gezielt die für präklinische Evaluierung im Rahmen eines Implantates, regenerative Gerüst geeignet sind. Diese Fasern hergestellt durch die Kultur der Fibroblasten auf Hohlfaser-Membranen und durch Auflösung der Membranen extrahiert.
Abstract
Veränderter Gerüste aus extrazellulären Matrix (ECM) abgeleitet haben angetriebenes erhebliches Interesse in der Medizin für ihr Potenzial in der Beschleunigung Schließung und heilende Wunde. Gewinnung von extrazellulären Matrix aus Fibrogenic Zelle Kulturen in Vitro hat Potenzial zur Erzeugung von ECM aus Menschen- und potenziell patientenspezifische Zelllinien, minimieren das Vorhandensein von xenogene Epitope, die klinische behindert hat Erfolg von einigen bestehenden ECM-Produkten. Eine große Herausforderung in der in-vitro- Produktion von ECM für eine Implantation geeignet ist, dass ECM-Produktion von Zellkultur in der Regel relativ geringe Ausbeute. In dieser Arbeit werden für die Herstellung von ECM von Zellen innerhalb Opfer Hohlfaser-Membran Gerüste kultivierten Protokolle beschrieben. Hohlfaser-Membranen sind mit Fibroblasten-Zell-Linien in einem konventionellen Zelle Medium kultiviert und aufgelöst nach Zellkultur um kontinuierliche Fäden von ECM zu erzielen. Die daraus resultierende ECM-Fasern produziert durch diese Methode können decellularized und lyophilisiert, wodurch es zur Speicherung und Implantation.
Introduction
Implantierbare chirurgische Gerüste sind fester Bestandteil der Wunde Reparatur, mit mehr als 1 Million synthetische Polymer-Netze implantiert weltweit jedes Jahr für die Bauchdecke Reparatur allein1. Jedoch nach Implantation der synthetischen Materialien Polymere traditionell bei der Herstellung von diese Gerüste verwendet tendenziell eine Fremdkörper-Reaktion, was zu Entzündungen schädlich auf die Funktion des Implantats und Vernarbung des Gewebes2 zu provozieren . Weiter, als die vorherrschende Kunststoffnetz Materialien (z.B. Polypropylen) nicht merklich vom Körper umgebaut werden, sie gelten im Allgemeinen für Gewebe wo Narbenbildung toleriert werden kann, begrenzen ihren klinischen Nutzen in der Behandlung von Gewebe mit Funktion höherer Ordnung wie Muskel. Zwar gibt es viele chirurgische Netz-Produkte, die mit klinischen Erfolg angewendet wurden, erinnert an den letzten Hersteller von synthetischen chirurgische Netze und Komplikationen von Interspezies Gewebe Implantate die Bedeutung der Maximierung der Implantat hervorheben Biokompatibilität, woraufhin die FDA Vorschriften über chirurgische anziehen mesh Hersteller3,4. Implantation von Gerüsten, abgeleitet von Patienten Gewebe reduziert diese Immunantwort, sondern kann dazu führen, dass erhebliche Entnahmestelle Morbidität5. Extrazelluläre Matrix (ECM) Gerüste produziert in Vitro sind eine mögliche Alternative, da decellularized ECM Gerüste ausgezeichnete Biokompatibilität aufweisen insbesondere bei autologen ECM6Implantate.
Wegen der begrenzten Verfügbarkeit von Patienten Gewebe für eine autologe Implantation zu ernten und das Risiko einer Funktion an der Entnahmestelle zu behindern, die Fähigkeit, ECM produzieren Gerüste in-vitro- von der Kultur des humanen Zelllinien oder, wenn möglich, ein Patient eigene Zellen ist eine attraktive Alternative. Die primären Herausforderungen bei der Herstellung von erheblichen Mengen von ECM in Vitro ist die Bindung dieser Moleküle schwierig zu erfassen. In früheren Arbeiten, haben wir bewiesen, dass ECM hergestellt werden kann, durch Kultivierung ECM-sezernierenden Fibroblasten in Opfer polymerer Schäume, die aufgelöst werden, nach der Periode der Kultur zu Ertrag ECM die decellularized kann für Implantation7, 8,9,10. Wie ECM in produziert Schäume sind in der Regel übernehmen die interne Architektur der Schäume, Hohlfaser-Membranen (HFMs) wurden als Opfer Gerüst für die Herstellung von Gewinden von ECM erkundet. Hier beschriebenen Methoden beauftragt für Labor zu skalieren, Herstellung von Zellmembranen Kultur Qualität Hohlfaser und die Gewinnung von Schüttgut extrazelluläre Matrix Fasern aus gleich nach einer Periode des Fibroblasten-Kultur. Dieser statische Kultur Ansatz ist von Labors mit standard Säugerzelle Kultur Ausrüstung leicht annehmbar. ECM, produziert durch diese Vorgehensweise konnte gegenüber einer Vielzahl von klinischen Anwendungen angewendet werden.
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Protocol
1. Produktion von extrazellulärer Matrix mit Opfergaben Hohlfaser-Membranen
Achtung: N-Methyl-2-pyrrolidon ist eine irritierende Lösungsmittel und reproduktive Schlüpfzeit. Exposition gegenüber NMP verursachen Reizungen der Haut, Augen, Nase und Rachen. Lösungsmittelbeständige persönlicher Schutzausrüstung sollte verwendet werden, beim Umgang mit NMP. Verwendung von NMP sollte innerhalb einer Dampfhaube durchgeführt werden.
- Vorbereitung der Polymerlösung Polysulfon Hohlfaser-Membranen
- Wiegen 70 g Polysulfon-Pellets (Molekulargewicht von 35 kD) in einem mit einer Analysenwaage wiegen-Boot.
- Übertragen Sie 314 mL (323,3 g) des N-Methyl-2-pyrrolidon (NMP) auf einem sauberen Borosilikat-Kolben.
- Legen Sie eine Stir Bar in die Küvette mit NMP und Ort Kolben auf Rührer. Legen Sie den Rührer auf eine moderate Geschwindigkeit der Rotation.
- Verwenden Sie einen trockenen Trichter langsam die vorbereitete 70 g Polysulfon in die Küvette mit NMP einfügen.
- Lassen Sie die Polymer "Schmiere" Lösung für drei Tage bei Zimmertemperatur, oder bis homogenisiert rühren.
- Einstellung der Konzentrizität und Reinigung der Hohlfaser-Membran Spinndrüse
Hinweis: Spinnwarzen sind im Handel erhältlich; richtige Spinndüse Dimensionen sind entscheidend für die erfolgreiche Membran Fertigung und sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt. Die Spinndüse sehr schonend zu behandeln, als die Spinndüse Nadel ist besonders empfindlich.- Verwenden Sie einen Schraubendreher oder Bohren mit einer geeigneten Schraubendreher vorsichtig die Spinndüse zu zerlegen.
- Sanft fließen Aceton durch den Einlass und Auslass der Spinndüse, sammeln alle Aceton und Restmüll Polymer in ein Becherglas zur Verfügung.
- Sichern Sie den Oberkörper von der Spinndrüse, mit der Nadel nach oben in einen Schraubstock, Tisch.
- Legen Sie den Auslass (unten) Körper der Spinndüse auf den Oberkörper.
- Halten Sie den Oberkörper auf den Schraubstock fixiert, bis die Spinndüse Nadel direkt in der Mitte des Körpers Outlet bewegen Sie Outlet Körper von der Spinndüse seitlich.
- Vorsichtig und langsam setzen Sie die Schrauben verbinden die beiden Leichen von der Spinndüse gleichzeitig sicherzustellen, dass die Nadel in der Spinndrüse Outlet sichtbar zentriert bleibt.
- Herstellung von Polysulfon Hohlfaser-Membranen
- Bereiten Sie eine "Bohrung-Lösung" mit 45 mL N-Methyl-2-pyrrolidon und 255 mL entionisiertem Wasser, bildet eine 15 % Mischung aus NMP mit entionisiertem Wasser.
- Montieren Sie eine konzentrische Hohlfaser-Membran Spinndüse 8 cm über der Oberfläche der Raumtemperatur Wasser aus dem Wasserhahn Badewanne.
- Zwei separate Stahl Druckbehälter mit einem Innenvolumen von mindestens 350 mL herstellen Sie Polymer Zulauf der die Spinndüse und Bohrung Eintritt des die Spinndüse. Beide Schiffe müssen Rückschlagventile in ihren Verkaufsstellen.
- Schließen Sie jedes der Druckbehälter an die Regulatoren der gesonderten N2 Gasflaschen
- Verwenden Sie einen Trichter bereit Schmiere-Lösung (~ 315 mL) einfügen, in dem Druckbehälter, verbunden mit dem Polymer-Einlass von der Spinndüse. Stellen Sie sicher, dass die Oberseite des Behälters dicht verschlossen ist.
- Verwendung eines Trichters die vorbereiteten einzufügende Bohren Lösung (300 mL) in den Druckbehälter angeschlossen an die Bohrung von der Spinndüse. Stellen Sie sicher, dass die Oberseite des Behälters dicht verschlossen ist.
- Öffnen Sie dem Rückschlagventil für die Bohrung Schiff zuerst, dann das Polymer Schiff zweiter. Wenn die Spinndüse ausreichend sauber ist, startet die Bohrung-Lösung aus der Spinndüse Steckdose zu streamen.
- Beide Schiffe 1 PSI Druck. Bestätigen Sie visuell, dass Polymer und Bohrung Lösungen der Spinndrüse verlassen, mit der eine kontinuierliche weiße Filament Ausfällen wie die kombinierte Streams Wasserbad kontaktieren.
- Lange Pinzette verwenden, um die im Entstehen begriffene Faser unter den Rollen in der Mitte des Bades zu führen, und dann wind der im Entstehen begriffenen Faser um ein rotierendes Rad mit einem Motor verbunden.
- Legen Sie die Inanspruchnahme Rad und Motor, mit einer Rate von etwa zwei Metern pro Minute drehen.
- Anpassungen Sie kleinere an die Regulierungsbehörden oder Inanspruchnahme Raddrehzahl wie nötig, bis eine stationäre Strömung erreicht wird. Die entstehende Fasern sollten einen 90 ° Winkel mit der Oberfläche des Wasserbades bilden.
- Schließen die N2 Zylinder Regler und Druckbehälter Rückschlagventile und die Inanspruchnahme Radmotor zu lösen, nachdem alle Polymer und Bohrung Lösung aus den Gefässen extrudiert wurde hat.
- Entfernen Sie die vorbereiteten Hohlfaser-Membranen und legen Sie sie in ein Bad deionisiertes Wasser für drei Tage, den Austausch von entionisiertem Wasser einmal pro Tag, um restliche Lösungsmittel zu entfernen.
- Sterilisieren der Hohlfaser-Membranen durch Autoklavieren bei 121 ° C für 30 Minuten oder durch Eintauchen für einen Tag in 70 % igem Ethanol.
- Zelle Aussaat der Hohlfaser-Membranen
Hinweis: Alle Zelle Kultur Verfahren sollte innerhalb eines Biosafety Schrank durchgeführt werden.- Behandeln die Hohlfaser-Membranen mit einer 20 µg/mL Lösung des bovinen Plasma Fibronectin mit PBS-Puffer (pH = 7,4), Zellhaftung zu fördern.
- 1 mg pulverisierten bovine Plasma Fibronectin in einem Boot wiegen wiegen und in 1 mL sterile PBS auflösen (pH = 7,4) in einem sterilen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
- 30 Minuten inkubieren Sie die 1 mg/mL bovine Plasma Fibronectin Lösung im Inkubator. 49 mL sterile PBS in einer konischen Zentrifugenröhrchen steril 50 mL der Lösung hinzufügen.
- Inkubieren Sie die Fasern in die vorbereiteten 50 mL bovine Plasma Fibronectin in einem Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2 für 1 Stunde. Erinnern Sie die Fibronektin-Lösung für spätere Verwendung und Shop in einem sterilen 50 mL konische Zentrifugenröhrchen bei 4 ° C.
- Sterile Microscissors verwenden, um die Fasern auf die gewünschte Länge geschnitten (< 6 cm).
- Fibroblasten Samenzellen direkt in die Lumina der Hohlfaser-Membranen bei Aussaatdichte von 100.000 Zellen pro Faser mit einer 21-Gauge-Nadel mit 1 mL Spritze.
Hinweis: Ein praktikables Ziel für die Vorbereitung der Zellsuspension laden in der Spritze ist eine Aussetzung Dichte von 100.000 Zellen für jeden 30 Mikroliter des Mediums. - Legen Sie sechs gesetzte Fasern in einem Durchmesser von 6 cm Petrischale. Lassen Sie die gesäten Fasern für fünf Minuten bei 37 ° C mit 5 % CO2 auszubrüten.
- Inkubation der gesetzten Fasern entfernen und Kultur sie für bis zu 3 Wochen in DMEM/F-12, die endgültige Konzentrationen von 50 µg/mL L-Ascorbinsäure und 150 µg/mL L-Ascorbinsäure Säure 2-Phosphat (frisch zubereitet und steril gefiltert), 5 ng/mL TGF-β1 (von sterilen gefiltert Aliquote bei-20 ° C gelagert), und 1 % Penicillin-Streptomycin in ein 6 cm Petrischale innerhalb einer 5 % CO2 Inkubator bei 37 ° C. Zelle Austauschmedium alle zwei Tage.
- Behandeln die Hohlfaser-Membranen mit einer 20 µg/mL Lösung des bovinen Plasma Fibronectin mit PBS-Puffer (pH = 7,4), Zellhaftung zu fördern.
- Gewinnung von extrazellulären Matrix aus kultivierten Hohlfaser-Membranen
- Ort kultivierten Fasern in einzelnen funkeln Fläschchen mit Pinzette.
- Legen Sie bis zu 5 mL NMP in jedes Fläschchen mit einer Glaspipette.
- Tauchen Sie die hohlen Fasern in NMP, Durchführung von insgesamt drei Austausch von NMP. Aspirieren Sie langsam die alte NMP mit einer 1-mL-Pipette um zu verhindern, Abreißen des extrahierten ECM.
Hinweis: Wenn Sie frische NMP hinzufügen, es ist hilfreich, kippen Sie das Fläschchen und ermöglichen die NMP laufen hinunter die Seiten sonst die restlichen ECM-Gerüst unterliegt um zu scheren, die reißen führen kann. - NMP zu entfernen und den daraus resultierenden ECM Thread 3 Mal in entionisiertem Wasser gespült.
- Ein 1/32-Zoll dicke Platte aus Silikon-Kautschuk auf eine Länge von 3 Zoll, 1 Zoll Breite und schneiden Sie eine 8 mm mit 4 mm rechteckige Form in der Mitte der Länge des Gummis.
- Legen Sie das vorbereitete Stück Gummi auf ein standard 3-Zoll von 1 Zoll Mikroskopie Rutsche und Autoklaven bei 121 ° C für 30 Minuten.
- Legen Sie jede ECM-Faser in 8 mm nebeneinander von 4 mm Silikonform bis gibt es keine sichtbaren offenen Raum.
- Legen Sie die Form in ein 50 mL konische Zentrifugenröhrchen und frieren bei-80 ° C bis vollständig gefroren.
- Lyophilize eingefrorene ECM-Netz über Nacht oder bis es komplett trocken. Speichern Sie das Netz bei 4° C bis zum Decellularization bereit.
2. Decellularization der extrazellulären Matrix
- Bereiten Sie eine Lösung von 1 % (w/w%) Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS) in entionisiertem Wasser.
- 24 Stunden bei Raumtemperatur auf einer Wippe mit sanften Agitation inkubieren Sie extrahierten extrazellulären Matrix in der Form in 1 % SDS.
- Spülen Sie extrahiert extrazellulären Matrix dreimal in sterilen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit sanften Agitation, mit 3 mL PBS pro Spülgang.
Hinweis: Spülungen sollte vorsichtig durchgeführt werden, um zu minimieren, Abreißen des vorbereiteten Gerüste. - Bereiten Sie 1 L DNAse/RNAse Verdauung Puffer.
Hinweis: DNAse/RNAse Verdauung Puffer kann mehrere Monate bei 4 ° c aufbewahrt werden- Wiegen Sie 1,54 g von Tris-HCl, 308 mg MgCl2und 56 mg CaCl2 in separaten wiegen Boote.
- Kombinieren Sie Tris HCl, MgCl2und CaCl2 mit 1 L entionisiertem Wasser in eine große Flasche mit Stir Bar und rühren Sie, bis alle Komponenten aufgelöst werden.
- Sterilfilter die Verdauung-Puffer mit einem 0,22 µm-Filter in einer sterilen 1 L Borosilikat Flasche und speichern bei 4° C.
- 5 mL DNAse/RNAse Aufschlusslösung vorzubereiten.
Hinweis: Aufschlusslösung sollte innerhalb von 24 Stunden der Vorbereitung verwendet werden.- Wiegen 0,125 mg (50 kU) der DNAse I ein wiegen Boot und 5 mL Verdauung Puffer hinzu.
- Die Verdauung Puffer 75 µL RNAse A-Stammlösung hinzufügen.
- Jede Form mit Aufschlusslösung füllen und 6 Stunden bei 4 ° C inkubieren.
- Aspirieren Sie der Aufschlusslösung und spülen Sie dreimal in sterilen PBS.
- Aspirieren der PBS und Gerüste über Nacht in 10 % Penicillin-Streptomycin mit PBS-Puffer bei 4° c inkubieren
- Aspirieren Sie das Penicillin-Streptomycin und spülen Sie Gerüste dreimal in sterilen PBS ab.
- Legen Sie die Form in ein 50 mL konische Zentrifugenröhrchen und frieren bei-80 ° C.
- Lyophilize das decellularized ECM-Netz über Nacht oder bis es komplett trocken.
- Übertragen Sie die lyophilisierten Gerüste innerhalb einer Biosafety-Haube auf einen sterilen Behälter bei 4° C bis zu Verwendung.
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Representative Results
Erfolgreiche Produktion der extrazellulären Matrix aus Opfer Gerüste ist abhängig von entsprechenden Gerüst Herstellung, Zellkultur und Lösemittel spülen Verfahren. Herstellung der Hohlfaser Membranen erfolgt über eine trocken-Jet nass Spinnerei System aus handelsüblichen Bauteilen (Abbildung 1) montiert die Extrusion der Polymerlösung durch den Ringraum eines handelsüblichen Stahl verwendet Spinndüse (Innendurchmesser = 0,8 mm, Außendurchmesser = 1,6 mm), eine im Entstehen begriffene Tube Polymerlösung zu generieren, die in eine Hohlfaser-Membran bei Kontakt mit einem Wasserbad ausfällt.
Ein Beispiel für den Prozess für ECM-Extraktion aus HFMs ist in Abbildung 2dargestellt. Abbildung 3A zeigt ein transversaler Querschnitt der Polysulfon HFMs nach diesem Protokoll hergestellt aus äußeren und inneren Schichten des Finger-wie Poren charakteristisch für eine asymmetrische Membran. In diesem Protokoll sind Zellen ausgesät speziell im Inneren Lumen der Membran und in 6 cm Durchmesser Petrischalen (Abb. 3 b), mit tendenziell auf allen Oberflächen der Membran proliferieren Zellen kultiviert. Kultivierte Membranen können dann Batch NMP und deionisiertes Wasser spülen in standard funkeln Glasfläschchen (Abbildung 3), unterliegen Herstellung lichtdurchlässige Fäden des ECM (Abbildung 3D). ECM-produzierenden Zellen bleiben im Inneren HFMs während der 3-Wochen-Frist der Kultur (Abbildung 4) lebensfähig.
HFMs für drei Wochen mit primären Ratte Skelettmuskeln, die Fibroblasten (Reinigungsintervall) über drei Austausch von N-Methyl-2-pyrrolidon, danach wurden sie dreimal in entionisiertem Wasser gespült aufgelöst wurden kultiviert. Die extrahierte Matrix, normalerweise wird transluzent in Erscheinung, wenn es hydratisiert (Abb. 5A), wird tendenziell auf Hydratation cloud, wenn nicht geeignete Lösemittel spülen wegen des Vorhandenseins des restlichen Polymer ausgesetzt. Anzumerken ist, dass das ECM nach Auflösung der Membran etwas zerbrechlich ist pflegebedürftiger im Umgang mit feinen Pinzette. ECM-Fasern zu Netzen zusammengefügt und dann lyophilisiert weisen eine wollweiße Farbe und faserig aussehen mit einem groben längs Ausrichtung (Abb. 5 b).
Abbildung 1: illustrierte Prozessablauf für casting-Hohlfaser Membranen. Hohlfaser-Membranen werden hergestellt mit der allgegenwärtigen nicht Lösungsmittel induzierte Phase Trennung Methode (NIPS) mit einem System aus handelsüblichen Bauteilen, die in der Tabelle der spezifischen Materialien aufgeführten vorbereitet. Polysulfon in NMP (17,8 w/w%) und NMP Bohrung Lösungen (15 w/w% NMP in Wasser) werden von separaten Edelstahlbehälter von unter Druck stehenden N2 in eine Spinndüse, Erzeugung einer im Entstehen begriffenen Hohlfaser-Membran in der Spinndrüse Auslass, der vollständig ausfällt extrudiert bei Kontakt mit dem Wasser aus dem Wasserhahn-Niederschlag-Bad. Im Entstehen begriffenen Hohlfaser ist manuell geführte unter und über Führungen und durfte auf einem rotierenden Rad der motorisierten Inanspruchnahme in Höhe von 2,3 Meter pro Minute zu sammeln. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Produktion von ECM aus kultivierten Hohlfaser Membranen illustriert. Hohlfaser-Membranen sind mit Fibroblasten gesät und kultiviert für drei Wochen, gefolgt von Austausch von NMP 3 X und Austausch von entionisiertem Wasser 3 X. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Kultur und Gewinnung von ECM. Asymmetrische mesoporösen Hohlfaser-Membranen (A) wurden für drei Wochen mit Reinigungsintervall Zellen in DMEM/F-12 mit ergänzten Ascorbinsäure und TGF-β (B)kultiviert. Kultivierte Hohlfasern (C, D oben) wurden über 3-Austausch in n-Methyl-2-pyrrolidon aufgelöst dann dreimal in entionisiertem Wasser, wodurch kontinuierliche Fäden des ECM (D, unten) gespült. Hohe Vergrößerung scanning Electron Microscopy Schliffbild von ECM Faseroberfläche (E). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Zelle Lebensfähigkeit auf Hohlfaser Membranen. Repräsentative Hohlfaser-Membranen mit Reinigungsintervall Zellen kultiviert, für drei Wochen mit einem feinen Rasiermesser um der luminalen Oberfläche der HFMs längs geschnitten wurden und zu lebenden Toten Färbung mit Calcein AM und EthD-1 unterzogen. Lebensfähigkeit Färbung zeigte eine konfluierende Schicht der lebensfähigen Zellen mit vernachlässigt EthD-1 Fluoreszenz. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Montage des ECM Implantat. Einzelnen extrazelluläre Matrix Gewinde (n = 30) abgeleitet von der Kultur der Reinigungsintervall Zellen wurden längs in eine Silikonform (A) und decellularized von 1 % SDS, gefolgt von der Behandlung mit DNAse ich, RNAse A und Penicillin-Streptomycin. Decellularized ECM wurde dann lyophilisiert, ein Off-White Mesh mit einem faserigen aussehen und längs Architektur (B)nachgeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die beschriebenen Prozesse ermöglichen die Produktion von Bulk ECM Biomaterialien in Vitro mit Hohlfaser-Membranen von einem trocken-Jet nass Spinnerei System für kostengünstige Massenproduktion der Membranen sowie Standardzelle Kultur Ausrüstung geworfen. Während die Membranen, die in diesem Protokoll hergestellt für den Einsatz in der Zellkultur bestimmt sind, kann das beschriebene System auch für die Herstellung von Membranen zur Trennung Zwecke mit Pore Verteilung und hohle Faser Größendimensionen abstimmbaren durch Variation angepasst werden Spinndüse Dimensionen, Polymer verwendet, dopen und trug Durchfluss, Aufnahme-Geschwindigkeit und Umgebungsbedingungen. 13 wenn das ausführliche Protokoll Hohlfaser Membranen beschäftigt, im Prinzip jede wasserlösliche Zellkultur Gerüst mit entsprechenden Transporteigenschaften wie offenzellige Schäume könnte verwendet werden, wie in früheren Arbeiten7, 8,9. Dieser allgemeine Ansatz scheint nützlich für die Herstellung von ECM-Gerüste durch aufopfernde Gerüste, die die interne Architektur von Geweben getreuer nachahmen können. Produziert durch dieses Protokoll insbesondere Implantate weisen eine grobe Ausrichtung (Abb. 5 b), die möglicherweise von besonderem Vorteil gegenüber den Wiederaufbau der stark ausgerichteten Gewebe wie Sehnen, Bänder und Skelettmuskulatur.
Regelmäßiger Austausch von mittleren und vor allem, ist Ergänzung des Mediums mit Ascorbinsäure und TGF-β, Herstellung von ECM, entscheidend, da Ascorbinsäure eine wesentliche Enzym in Kollagen-Biosynthese ist und TGF-β die Synthese von mehreren ECM Proteinen10 induziert . Darüber hinaus gründliches Spülen des ECM mit NMP durchgeführt werden muss, sonst bleibt verbleibende Polymer in der extrahierten ECM, erscheint als eine weiße Folie während Wasser spült. Vorsicht ist geboten, nicht übermäßig aufzuregen ECM während der Membran Auflösung, da es relativ zerbrechlich ist. Gesammelten ECM-Gerüste für die Implantation müssen ein Decellularization Schritt unterzogen werden wie beschrieben um xenogene Epitope zur Minimierung einer möglichen Wirtsantwort Fremdkörper zu entfernen.
Die Bedeutung dieser Technik liegt in der Produktion von leska Biocomplex ganze extrazellulären Matrix, die durch die körpereigene Wundheilung Prozesse renoviert worden zu sein. Mithilfe dieses Ansatzes, um ECM von Zellen spezifisch auf eine Zieltierart zu produzieren, kann es möglich sein, die Fremdkörper-Reaktion zu minimieren, die die klinische Wirksamkeit dieser Klasse von Biomaterialien behindert; Mithilfe von Zellen spezifisch für ein Individuum kann der Fremdkörper-Reaktion weiter verringert werden. Dieser Ansatz ermöglicht auch für die Herstellung von ECM, die gezielt auf bestimmte Gewebe mit aktuellen Berichten, die darauf hindeutet, dass gewebespezifischen ECM in bestimmten Anwendungen12besonders wirksam sein könnte. Da dieses Protokoll ermöglicht die Herstellung von ECM in verschiedenen Zelllinien, Implantate, Kombination von ECM aus mehreren Zelltypen (z. B. Muskel, nervös, Endothelzellen) könnte verwendet werden, um Implantate ungefähren getreuer Struktur und chemischen anpassen Komplexität der Zielgewebe. Während die ECM-Netze hier vorgestellten ursprünglich als Gerüste für Wunde Reparatur gedacht waren, haben sie auch Verwendung als Plattformen für Untersuchungen zu Zelle-ECM-Interaktionen, Durotaxis und Biosensoren. Insbesondere verleiht dieser Ansatz der Ermittler die Fähigkeit, ECM von bestimmten Zelltypen des Interesses zu produzieren, die neue Einblicke in die biologische Bedeutung der gewebespezifischen ECM Struktur, Zusammensetzung und Funktion ermöglicht.
Mögliche Verbesserungen, die hier vorgestellten Techniken der ECM-Produktion könnte Scale-up-über die Verwendung von dynamischen und Pre-Klimaanlage Bioreaktoren sowie die Erforschung von alternativen Opfer Gerüstmaterial und Architekturen enthalten. Übergang zu einem Abbauprozeß lösungsmittelfrei Gerüst Verbesserung insbesondere, die Sicherheit der Extraktion; aufopfernde Gerüste bestehend aus Materialien, die abbaubaren durch Enzyme, wie z. B. regenerierte Zellulose können lösungsmittelfrei ECM Extraktion14vorsehen. Während die Zugfestigkeit dieser Materialien unter denjenigen von synthetischen Materialien ist, gibt es mehrere Wege zur Verbesserung der diese Gerüste, einschließlich der Erforschung der verschiedenen Kulturbedingungen, Medien Formulierungen und aufopfernde Gerüst Geometrien. Die jüngsten Fortschritte der Gentechnik könnte genutzt werden, um Pro-fibrotische Zelllinien zu produzieren, die in Kombination mit Plattformen für ECM-Capture Gerüste klinischen Anforderungen ermöglichen könnte. Darüber hinaus bestehende dynamische Kultur Systeme wie kontinuierlichen Fluss-Schleife Hohlfaser-Membran Bioreaktoren hohe Raten von Nährstoffaustausch förderlich für größere und schnellere ECM-Produktion zu erleichtern, und möglicherweise von besonderem Interesse bei der Nutzung dieses Technik für die Produktion größerer Mengen von ECM für die biologische Forschung und klinischen Nutzen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Forschung berichtet in dieser Publikation wurde unterstützt vom National Institute of Arthritis und Muskel-Skelett und Hauterkrankungen von den National Institutes of Health unter Prämiennummer R15AR064481, der National Science Foundation (CMMI-1404716), sowie die Arkansas Biosciences Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/32 inch thick silicone rubber | Grainger | B01LXJULOM | |
| 20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable - VWR | VWR | 66022-004 | With attached white urea cap and cork foil liner |
| 3 inch by 1 inch microscopy slides | VWR | 75799-268 | |
| 4C refrigerator | Thermo Fisher Scientific | FRGG2304D | Any commercial 4C refrigerator will suffice. |
| 50 mL tubes | VWR | 21008-178 | |
| 6-well cell culture plates | VWR | 10062-892 | Alternative brands may be used |
| Acetone | VWR | E646 | Alternative brands may be used |
| Bore vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Bovine Plasma Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010018 | Comes as 1 mg of lyophilized protein |
| CaCl2 | VWR/Amresco | 97062-590 | |
| Cell Culture Incubator w/ CO2 | Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice. | ||
| Disposable Serological Pipets, Glass - Kimble Chase | VWR | 14673-208 | Alternative brands may be used |
| DMEM/F-12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dope vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Ethanol | VWR | BDH1160 | Dilute to 70% for sterilization |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media) |
| Four 1/4-inch to 1" reducing unions | Swagelok | SS-1610-6-4 | One reducing union for each inlet and outlet of each vessel |
| Freeze-dryer/lyophilizer | Labconco | 117 (A65312906) | Any lyophilizer will suffice. |
| Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes - VWR | VWR | 89106-752 | Any weigh boat will suffice |
| Hollow fiber membrane immersion bath | 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets | ||
| Hollow Fiber Membrane Spinneret | AEI | http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html | Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm |
| Hot plate/stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-glutamine (200 mM) - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media) |
| MgCl2 | VWR/Alfa Aesar | AA12315-A1 | |
| Minus 80 Freezer | Thermo Fisher Scientific | UXF40086A | Any commercial -80C freezer will suffice. |
| N2 gas cylinders (two) | |||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | Alternative fibrogenic cell lines may be used. |
| N-methyl-2-pyrrolidone | VWR | BDH1141 | Alternative brands may be used |
| Penicillin/Streptomycin Solution - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media) |
| Polysulfone | Sigma-Aldrich | 428302 | Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used |
| Portable Pipet-Aid Pipetting Device - Drummond | VWR | 53498-103 | Alternative brands may be used |
| PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) | McMaster-Carr | 52315K24 | Alternative brands may be used. |
| Rat skeletal muscle fibroblasts | Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used. | ||
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Silicone sheet | McMaster-Carr | 1460N28 | |
| Take-up motor | Greartisan | B071GTTSV3 | 200 RPM DC Motor |
| Tris HCl | VWR/Amresco | 97063-756 | |
| Two needle valves | Swagelok | SS-1RS4 |
References
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