Summary
Het doel van dit protocol is productie van hele extracellulaire matrix vezels die voor reparatie van de wond wordt gericht die geschikt voor preklinische evaluatie als onderdeel van een regeneratieve steiger implantaat zijn. Deze vezels worden geproduceerd door de cultuur van fibroblasten op holle vezel membranen en geëxtraheerd door ontbinding van de membranen.
Abstract
Gemanipuleerde steigers afgeleid van extracellulaire matrix (ECM) hebben gedreven significant belang in de geneeskunde voor hun potentieel in de bespoediging van de wond sluiting en genezing. Extractie van extracellulaire matrix van fibrogenic cel culturen in vitro heeft potentieel voor generatie van ECM van menselijke- en potentieel patiënt-specifieke cellijnen, minimaliseren van de aanwezigheid van XENOGENECELLEN epitopes die heeft belemmerd de klinische succes van sommige bestaande ECM-producten. Een belangrijke uitdaging in in vitro -productie van ECM geschikt voor implantatie is dat ECM productie door celkweek meestal voor relatief lage opbrengst. In dit werk, worden protocollen beschreven voor de productie van ECM door cellen gekweekte binnen opofferende holle vezel membraan steigers. Holle vezel membranen zijn gekweekt met fibroblast cellijnen in een conventionele cel medium en ontbonden na celkweek continue draden van ECM opleveren. De resulterende ECM vezels geproduceerd door deze methode kunnen worden decellularized en gelyofiliseerde vorm, waardoor het geschikt is voor opslag en implantatie.
Introduction
Implanteerbare chirurgische steigers zijn een bevestiging van de reparatie van de wond, met meer dan een miljoen synthetisch polymeer mazen geïmplanteerd wereldwijd jaarlijks buikwand reparatie alleen1. Echter, na implantatie de synthetische materialen polymeren van oudsher in de fabricage van deze steigers gebruikt de neiging om te provoceren een vreemd lichaam reactie, resulterend in ontsteking schade wordt berokkend aan de functie van het implantaat en littekens van weefsel2 . Verder, zoals de overheersende synthetische mesh-materiaal (dat wil zeggen, polypropyleen) zijn niet merkbaar verbouwd door het lichaam, ze zijn algemeen van toepassing op weefsels waar littekens kan worden getolereerd, beperken hun klinische nut richting de behandelingvan weefsels met hogere-orde functie zoals spier. Hoewel er vele chirurgische mesh-producten die zijn vereffend met klinische succes, herinnert recente fabrikant van synthetische chirurgische netten en complicaties van interspecies weefsel implantaten wijzen op het belang van het maximaliseren van implantaat biocompatibiliteit, waarschuwing van de FDA te scherpen verordeningen op chirurgische mesh fabrikanten3,4. Implantatie van steigers uit patiënten eigen weefsels verkregen vermindert deze immuunrespons, maar kan leiden tot belangrijke donor-site morbiditeit5. Extracellulaire matrix (ECM) steigers, geproduceerd in vitro zijn een mogelijk alternatief, zoals decellularized ECM steigers exposeren uitstekende biocompatibiliteit, met name in het geval van autologe ECM implantaten6.
Vanwege de beperkte beschikbaarheid van weefsel van de patiënt om te oogsten voor autologe implantatie en het risico van het belemmeren van de functie op de site van de donor, het vermogen te produceren ECM steigers in vitro van de cultuur van menselijke cellijnen of, indien mogelijk, van een patiënt eigen cellen is een aantrekkelijk alternatief. De belangrijkste uitdagingen bij de vervaardiging van aanzienlijke hoeveelheden van ECM in vitro is de vastlegging van deze moleculen moeilijk-aan-vangst. In eerdere werk, hebben wij aangetoond dat ECM kan worden geproduceerd door het kweken van ECM-afscheidende fibroblasten in opofferende polymere schuimen die zijn ontbonden na de periode van de cultuur aan opbrengst ECM die kan worden decellularized voor implantatie7, 8109,,. ECM geproduceerd in schuim de neiging aan te nemen van de interne architectuur van het schuim, holle vezel membranen (HFMs) werden verkend als een offer steiger voor productie van draden voor ECM. Hierin beschreven zijn methoden belast voor lab schaal vervaardiging van cultuur kwaliteit holle vezel celmembranen en de winning van bulk extracellulaire matrix vezels uit hetzelfde na een periode van fibroblast cultuur. Deze statische cultuur aanpak is gemakkelijk adoptable door laboratoria met standaard zoogdieren cel cultuur apparatuur. ECM geproduceerd door deze aanpak kan worden toegepast naar een scala aan klinische toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. productie van extracellulaire Matrix met behulp van opofferende holle vezel membranen
Let op: N-methyl-2-pyrrolidon is een irritante oplosmiddel en reproductieve veroorzaken. Blootstelling aan NMP kan irritatie aan de huid, ogen, neus en keel veroorzaken. Oplosmiddel-resistente persoonlijke beschermingsmiddelen moet worden gebruikt bij de behandeling van NMP. Gebruik van NMP moet worden uitgevoerd in een zuurkast.
- Voorbereiding van Polysulfon polymeeroplossing holle vezel membranen
- Weeg 70 g gekristalliseerd Polysulfon pellets (moleculair gewicht van 35 kD) in een boot van de weeg met behulp van een analytische balans.
- 314 mL (323.3 g) N-methyl-2-pyrrolidon (NMP) overbrengen in een maatkolf van schone borosilicaat.
- Breng een roer-bar in de kolf met het NMP en plaats de kolf op de roerder. Stel de roerder op een gematigd tarief voor rotatie.
- Gebruik een droge trechter de bereid 70 g gekristalliseerd Polysulfon langzaam in de kolf met het NMP invoegen.
- Laat de polymeer "dope"-oplossing te roeren gedurende drie dagen bij kamertemperatuur, of tot gehomogeniseerd.
- Instellen van concentriciteit en schoonmaken van de holle vezel membraan spinneret
Opmerking: Spinnerets zijn commercieel beschikbaar; juiste spinneret afmetingen zijn cruciaal voor een succesvolle membraan fabricage en staan in de Tabel van materialen. Heel voorzichtig omgaan met de spinneret, als de spinneret naald is bijzonder kwetsbaar.- Gebruik een schroevendraaier of boren met een passende schroevendraaier bits te demonteren zorgvuldig de spinneret.
- Zachtjes stromen aceton via de inlaat en uitlaat van de spinneret, verzamelen aceton en resterende polymeer in een bekerglas van glas voor verwijdering.
- Beveilig het bovenlichaam van de spinneret met de naald naar boven gericht in een tabel bankschroef.
- Plaats het lichaam van de uitlaat (onder) van de spinneret op het bovenlichaam.
- Het lichaam van de uitlaat van de spinneret lateraal verplaatsen terwijl het bovenlichaam gefixeerd op de bankschroef totdat de spinneret naald direct in het centrum van het lichaam van de uitlaat is.
- Zorgvuldig en langzaam opnieuw de schroeven aansluiten van de twee organen van de spinneret terwijl ervoor te zorgen dat de naald zichtbaar aan de spinneret uitlaat gecentreerd blijft.
- Fabricage van Polysulfon holle vezel membranen
- Bereid een "boring-oplossing", met 45 mL N-methyl-2-pyrrolidon en 255 mL gedeïoniseerd water, vorming van een mengsel van de 15% van de NMP met gedeïoniseerd water.
- Monteer een concentrische holle vezel membraan spinneret 8 cm boven het oppervlak van een kamertemperatuur tap waterbad.
- De inlaat van de polymeer van de spinneret en de inlaat van de boring van de spinneret verbinding te maken met twee afzonderlijke stalen drukvaten met een innerlijke volume van ten minste 350 mL. Beide schepen moeten hun verkooppunten check kleppen.
- Elk van de drukvaten verbinden met de regulatoren van afzonderlijke N2 gasflessen
- Gebruik een trechter te voegen de bereid dope oplossing (~ 315 mL) in het drukvat aangesloten bij de inlaat van de polymeer van de spinneret. Ervoor zorgen dat de top van het vaartuig is strak verzegeld.
- Gebruik een trechter om in te voegen de klaargemaakte droeg oplossing (300 mL) in het drukvat aangesloten bij de inlaat van de boring van de spinneret. Ervoor zorgen dat de top van het vaartuig is strak verzegeld.
- Open de terugslagklep voor het boring vaartuig eerst, vervolgens het polymeer vaartuig tweede. Als de spinneret voldoende schoon is, zal de boring oplossing beginnen te stromen uit de spinneret outlet.
- Oefenen beide schepen naar 1 PSI. Visueel bevestigen dat zowel polymeer en boring oplossingen de spinneret, met een ononderbroken witte gloeidraad neerslaan als de gecombineerde streams Neem contact op met het waterbad zijn verlaten.
- Gebruik lange pincet te begeleiden de ontluikende vezel onder de rollen in het midden van het bad, en vervolgens de ontluikende vezel rond een draaiende wiel wind verbonden met een motor.
- Stel de invoering wiel en de motor draait met een snelheid van ongeveer twee meter per minuut.
- Kleine aanpassingen aanbrengen in de regelgevers of acceptatie wiel snelheid als nodig totdat de stroom van een stationaire toestand wordt bereikt. De ontluikende vezel moet vormen een hoek van 90° met het oppervlak van het waterbad.
- Sluit de N2 cilinder toezichthouders drukvat controleren kleppen en losraken van de introductie wielmotor nadat alle polymeer en boring oplossing heeft zijn geëxtrudeerde van de schepen.
- Verwijder de vliezen bereide holle vezel en plaats ze in een bad met gedeïoniseerd water voor drie dagen, gedeïoniseerd water eenmaal per dag te verwijderen van de resterende oplosmiddel uit te wisselen.
- De holle vezel membranen steriliseren in autoclaaf bij 121 ° C gedurende 30 minuten of door ze onder te dompelen voor één dag in 70% ethanol hen.
- Cel zaaien van holle vezel membranen
Opmerking: Alle cel cultuur procedures moeten worden uitgevoerd binnen een kabinet bioveiligheid.- Behandelen van de membranen van de holle vezel met een oplossing van 20 µg/mL van boviene plasma fibronectine in PBS (pH = 7.4) ter bevordering van de bijlage van de cel.
- Weeg 1 mg poeder boviene plasma fibronectine in een boot wegen en los het dan op in 1 mL steriele PBS (pH = 7.4) in een steriele 1,5 mL microcentrifuge buis.
- Incubeer de 1 mg/mL boviene plasma fibronectine oplossing in de incubator voor 30 minuten. Meng de oplossing 49 mL steriele PBS in een steriele 50 mL conische centrifugebuis.
- De vezels in de bereid 50 mL boviene plasma fibronectine in een incubator bij 37 ° C met 5% CO2 Incubeer gedurende 1 uur. Herinner me de fibronectine oplossing voor later gebruik en winkel in een steriele 50 mL conische centrifugebuis bij 4 ° C.
- Gebruik van steriele microscissors te snijden van de vezels op gewenste lengte (< 6 cm).
- Zaad fibroblast cellen rechtstreeks in de lumina van de membranen van de holle vezel bij een seeding dichtheid van 100.000 cellen per vezel met behulp van een naald 21-gauge met 1 mL spuit.
Opmerking: Een haalbare doelstelling ter voorbereiding van de celsuspensie van de laden in de spuit is de dichtheid van een schorsing van 100.000 cellen voor elke 30 microliters van medium. - Plaats zes geplaatste vezels in een 6 cm diameter petrischaal. Laat de geplaatste vezels aan Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende vijf minuten.
- Verwijder de geplaatste vezels uit incubatie en cultuur ze voor maximaal 3 weken in DMEM/F-12 met eindconcentraties van 50 µg Mo/mL-L-ascorbinezuur en 150 µg/mL L-ascorbinezuur zuur 2-fosfaat (vers bereid en steriele gefilterd), 5 ng/mL TGF-β1 (van steriele gefilterd aliquots opgeslagen bij-20 ° C), en 1% penicilline-streptomycine in een 6 cm petrischaal binnen een 5% CO2 incubator bij 37 ° C. Exchange cel gemiddeld om de twee dagen.
- Behandelen van de membranen van de holle vezel met een oplossing van 20 µg/mL van boviene plasma fibronectine in PBS (pH = 7.4) ter bevordering van de bijlage van de cel.
- Extractie van extracellulaire matrix van gekweekte holle vezel membranen
- Plaats gekweekt vezels in individuele Scintillatie flacon met pincet.
- Tot 5 mL NMP in elke flacon met behulp van een precisiepipet glas plaatsen.
- Dompel de holle vezels in NMP, uitvoeren van een totaal van drie uitwisseling van NMP. Langzaam gecombineerd de oude NMP met behulp van een pipet 1 mL ter voorkoming van scheuren van uitgepakte ECM.
Opmerking: Wanneer u verse NMP toevoegt, is het nuttig om het kantelen van de flacon en toestaan dat de NMP uitvoeren aan de zijkanten, anders de resterende ECM-steiger is onderworpen als u wilt schuintrekken die kan leiden tot scheuren. - NMP verwijderen en de resulterende ECM draad 3 keer in gedeïoniseerd water gespoeld.
- Knip een 1/32-inch dik blad van silicone rubber tot een lengte van 3 inch, breedte van 1 inch en een 8 mm gesneden door 4 mm rechthoekige schimmel in het midden van de lengte van rubber.
- Plaats het bereid stuk rubber op een standaard 3-inch door 1-inch microscopie dia en autoclaaf bij 121 ° C gedurende 30 minuten.
- Elke ECM vezel naast elkaar in de 8 mm worden vastgesteld per 4 mm siliconen mal totdat er geen zichtbare open ruimte is.
- Plaats de schimmel in een tube van 50 mL conische centrifuge en bevriezen bij-80 ° C tot volledig bevroren.
- Lyophilize bevroren ECM mesh's nachts of totdat volledig droog. Het bewaren van de Maas bij 4° C tot klaar voor decellularization.
2. decellularization van de extracellulaire Matrix
- Bereid een oplossing van 1% (w/w%) natrium dodecyl sulfaat (SDS) in gedeïoniseerd water.
- Incubeer uitgepakte extracellulaire matrix in de schimmel in 1% SDS gedurende 24 uur bij kamertemperatuur op een rocker met zachte agitatie.
- Spoelen geëxtraheerd extracellulaire matrix driemaal in steriele-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met zachte agitatie, met behulp van 3 mL PBS per spoeling.
Opmerking: Gespoeld moeten worden uitgevoerd zachtjes om te minimaliseren van bereid steigers scheuren. - Bereiden 1 L voor DNAse/RNAse spijsvertering buffer.
Opmerking: DNAse/RNAse spijsvertering buffer kan worden opgeslagen voor enkele maanden bij 4° C.- Weeg 1,54 g van Tris-HCl, 308 mg MgCl2en 56 mg CaCl2 in aparte wegen boten.
- Tris-HCl, MgCl2, en CaCl2 combineren met 1 L gedeïoniseerd water in een grote kolf met een roer-bar en roer tot alle onderdelen worden opgelost.
- Steriel filter de spijsvertering buffer met een 0,22 µm filter in een steriele 1 L borosilicaat fles en winkel bij 4° C.
- 5 mL DNAse/RNAse spijsvertering oplossing voor te bereiden.
Opmerking: Spijsvertering oplossing moet binnen 24 uur na de bereiding worden gebruikt.- Weeg 0,125 mg (50 kU) DNAse ik in een weeg boot en Meng 5 mL buffer van de spijsvertering.
- Voeg 75 µL van de stockoplossing RNAse A aan de buffer van de spijsvertering.
- Vul elke schimmel met spijsvertering oplossing en Incubeer bij 4 ° C voor 6 uur.
- De spijsvertering-oplossing gecombineerd en spoel driemaal in steriele PBS.
- De PBS gecombineerd en incubeer steigers overnachting in 10% penicilline-streptomycine in PBS bij 4° C.
- De penicilline-streptomycine gecombineerd en spoel steigers driemaal in steriele PBS.
- Plaats de schimmel in een tube van 50 mL conische centrifuge en bevriezen bij-80 ° C.
- Lyophilize de decellularized ECM Maas 's nachts of totdat volledig droog.
- De gelyofiliseerd steigers binnen een bioveiligheid kap overbrengen in een steriele verpakking bij 4° C in afwachting van gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succesvolle productie van extracellulaire matrix van opofferende steigers is afhankelijk van de juiste steiger fabricage, celkweek en oplosmiddel spoelen procedures. Fabricage van de holle vezel membranen wordt uitgevoerd met behulp van een dry-jet NAT-spinnen systeem samengesteld uit commercieel beschikbare componenten (Figuur 1) die gebruik maakt van de extrusie van polymeeroplossing via de annulus van een commercieel beschikbare staal spinneret (binnendiameter = 0,8 mm, buitendiameter = 1,6 mm) voor het genereren van een ontluikende buis van polymeeroplossing die in een holle vezel membraan bij contact met een waterbad precipitaten.
Een voorbeeld-proces voor ECM extractie van HFMs wordt geïllustreerd in Figuur 2. Figuur 3A geeft dat een dwarse doorsnede van Polysulfon HFMs verzonnen ingevolge dit protocol, buiten- en binnenlagen van vinger-achtige poriën karakteristiek van een asymmetrische membraan tentoonstellen. In dit protocol zijn de cellen ontpit specifiek in de innerlijke lumen van het membraan en gekweekt in 6 cm diameter petrischalen (figuur 3B), met cellen de neiging te vermenigvuldigen op alle oppervlakken van het membraan. Gekweekte membranen kunnen vervolgens worden onderworpen aan batch NMP en gedeïoniseerd water spoelen in standaard glas Scintillatie flesjes (Figuur 3 c), doorschijnend draden van ECM (figuur 3D) produceren. ECM-producerende cellen blijven levensvatbare binnen HFMs gedurende de 3-weekse cultuur (Figuur 4).
HFMs gekweekt voor drie weken met primaire rat skeletspieren fibroblasten (RSMF) werden ontbonden via drie uitwisseling van N-methyl-2-pyrrolidon, waarna werden ze driemaal gespoeld in gedeïoniseerd water. De opgehaalde matrix, normaal doorschijnend uiterlijk als gehydrateerd (figuur 5A), zal de neiging om de cloud op hydratatie zoniet onderworpen aan passende oplosmiddelen spoelen als gevolg van de aanwezigheid van residuele polymeer. Ook opgemerkt moet worden dat de ECM die overblijven na de ontbinding van het membraan enigszins fragiel is, waarbij zorg bij behandeling met een fijne Tang. ECM vezels geassembleerd tot mazen en vervolgens gelyofiliseerde vorm vertonen een gebroken witte kleur en vezelig vormgeving met een bruto longitudinale uitlijning (figuur 5B).
Figuur 1: geïllustreerde processtroom voor het gieten van holle vezel membranen. Holle vezel membranen zijn vervaardigd met behulp van de methode van de alomtegenwoordige niet-solvent geïnduceerde fase inzake scheiding (NIP's) met behulp van een systeem dat is bereid uit verkrijgbare onderdelen die worden vermeld in de tabel van specifieke materialen. Polysulfon in NMP (17.8 w/w%) en NMP boring oplossingen (15 w/w% NMP in water) zijn geëxtrudeerd uit aparte RVS schepen door hydrofoor N2 in een spinneret, het genereren van een ontluikende holle vezel membraan aan de spinneret uitlaat die volledig precipitaten bij contact met het leidingwater neerslag bad. Ontluikende holle vezel is handmatig geleid onder en over gidsen en toegestaan om te verzamelen op een roterende gemotoriseerde introductie wiel met een snelheid van 2,3 meter per minuut. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: productie van ECM van gekweekte holle vezel membranen geïllustreerd. Holle vezel membranen zijn bezaaid met fibroblasten en gekweekte voor drie weken, gevolgd door uitwisseling van NMP 3 x en uitwisseling van gedeïoniseerd water 3 x. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Cultuur en extractie van ECM. Asymmetrische mesoporous holle vezel membranen (A) werden gekweekt voor drie weken met cellen van de RSMF in DMEM/F-12 met aangevuld ascorbinezuur en TGF-β (B). Gekweekte holle vezels (C, D boven) waren opgelost via 3 uitwisseling in n-methyl-2-pyrrolidon en vervolgens driemaal gespoeld in gedeïoniseerd water, wat resulteert in continue draden van ECM (D, bodem). Hoge vergroting scanning elektronen microscopie-opname van het ECM vezel oppervlak (E). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: levensvatbaarheid op holle vezel membranen van cellen. Representatieve holle vezel membranen gekweekt met RSMF cellen voor drie weken werden lengterichting gesegmenteerd met behulp van een fijne scheermes te onthullen het luminal oppervlak van de HFMs en onderworpen aan het leven-dood kleuring met calceïne AM en EthD-1. Levensvatbaarheid kleuring bleek een confluente laag van levensvatbare cellen met te verwaarlozen EthD-1 fluorescentie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: vergadering van ECM implantaat. Individuele extracellulaire matrix draden (n = 30) afgeleid van cultuur van RSMF cellen werden geplaatst in de lengte in een siliconen mal (A) en decellularized door 1% SDS gevolgd door behandeling met DNAse ik, RNAse A, en penicilline-streptomycine. Decellularized ECM werd vervolgens gelyofiliseerde vorm, een gebroken witte gaas met een vezelachtig uiterlijk en longitudinale architectuur (B)opbrengst. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beschreven procédés in staat stellen de productie van de bulk ECM biomaterialen in vitro met holle vezel membranen gegoten door een systeem van de dry-jet natte spinnen waardoor voor goedkope bulk productie van membranen evenals standaard cel cultuur apparatuur. Terwijl de membranen vervaardigd in dit protocol zijn bedoeld voor gebruik in de cultuur van de cel, kan het systeem beschreven ook worden aangepast voor de productie van membranen voor scheiding doeleinden, met porie instelbare distributie en holle vezel afmetingen afstembare door te variëren spinneret afmetingen, polymeer gebruikt, dope en droeg debiet, introductie snelheid en milieuomstandigheden. 13 al het protocol gedetailleerde holle vezel membranen dienst, in principe elke oplosbaar celkweek steigerwerk met passend vervoer eigenschappen zoals open cel schuim kunnen worden gebruikt, zoals aangetoond in het vorige werk7, 8,9. Deze algemene aanpak lijkt nuttig is voor de productie van ECM steigers door opofferende steigers die meer getrouw de interne architectuur van weefsels kunnen nabootsen. Implantaten geproduceerd door dit protocol met name vertonen een bruto afstemming (figuur 5B), die van bepaalde voordeel naar de wederopbouw van zeer uitgelijnde weefsel zoals pezen, ligamenten en skeletspieren worden kan.
Regelmatige uitwisseling van medium en in het bijzonder, suppletie van medium met ascorbinezuur en TGF-β is cruciaal voor de productie van ECM, zoals ascorbinezuur een essentiële enzym in de biosynthese van collageen is en TGF-β de synthese van verschillende eiwitten van de ECM10 induceert . Bovendien grondig spoelen voor ECM met NMP moet worden uitgevoerd, anders residuele polymeer blijft in de uitgepakte ECM, verschijnen als een wit film tijdens water gespoeld. Zorg moet men zich niet overdreven doorroeren ECM tijdens membraan ontbinding, omdat het relatief kwetsbaar. Verzamelde ECM steigers die bestemd zijn voor inplanting moeten worden onderworpen aan een decellularization stap zoals beschreven Schakel XENOGENECELLEN epitopes om te minimaliseren van een potentiële gastheer vreemd lichaam reactie.
Het belang van deze techniek ligt in zijn productie van een steiger van de biocomplex van hele extracellulaire matrix die kan worden vernieuwd door de lichaamseigen wondgenezing processen. Met behulp van deze aanpak voor de productie van ECM van specifieke cellen aan een diersoort, wellicht het mogelijk om te minimaliseren van het buitenlandse lichaam antwoord dat de klinische effectiviteit van deze klasse van biomaterialen belemmert; met behulp van cellen specifiek voor een individu, kan de reactie van het buitenlandse lichaam verder worden verminderd. Deze benadering staat ook voor de productie van ECM gericht op bepaalde weefsels, met recente rapporten suggereren dat weefsel-specifieke ECM effectief met name bij bepaalde toepassingen12 zijn kan. Als dit protocol voorziet in de productie van ECM over verschillende cellijnen, implantaten ECM combineren van verschillende celtypes (bijvoorbeeld spier, nerveus, endotheel) kan worden gebruikt om op maat van implantaten om getrouwer onderlinge aanpassing van de structuur en de chemische complexiteit van onderzoeken weefsels. Hoewel de mazen van de ECM hier gepresenteerd werden oorspronkelijk bedoeld als steigers voor reparatie van de wond, kunnen zij ook gebruik hebben als platforms voor onderzoek naar cel-ECM interacties, durotaxis en biosensing. In het bijzonder, leent deze benadering de onderzoeker het vermogen te produceren ECM van specifieke celtypes van belang die in nieuwe inzichten in de biologische betekenis van weefsel-specifieke ECM structuur, samenstelling en functie voorzien kunnen.
Mogelijke verbeteringen aan de ECM productietechnieken hier gepresenteerd kunnen onder meer schaalvergroting via het gebruik van dynamische en vooraf airconditioning bioreactoren, alsmede de verkenning van alternatieve opofferende steiger materialen en architecturen. In het bijzonder, overgang naar de procedure voor het verwijderen van een solventless steiger zou de verbetering van de veiligheid van het extractieproces; offer steigers samengesteld uit materialen die door afbreekbaar door enzymen, zoals folie van geregenereerde cellulose, kunnen toestaan voor solventless ECM extractie14. Terwijl de treksterkte van deze materialen lager dan die van synthetische materialen is, bestaan er verschillende mogelijkheden voor verbetering van deze steigers, met inbegrip van exploratie van verschillende kweekomstandigheden media formuleringen en opofferende steiger geometrieën. Recente gentechnologie vooruitgang kunnen zijn leveraged om te produceren van pro-fibrotische cellijnen, waarmee in combinatie met platforms voor ECM vangen de productie van steigers voldoen aan klinische eisen. Verder, bestaande dynamische cultuur systemen zoals continue stroom-lus holle vezel membraan bioreactoren vergemakkelijken van hoge tarieven van nutriënten uitwisseling dat bevorderlijk is voor grotere en snellere ECM-productie, en kunnen van bijzonder belang in het leveraging van dit techniek voor productie van grotere hoeveelheden voor ECM voor biologisch onderzoek en klinische gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Onderzoek gemeld in deze publicatie werd gesteund door het nationale Instituut van artritis en Musculoskeletal en ziekten van de huid van de National Institutes of Health award onder nummer R15AR064481, de National Science Foundation (CMMI-1404716), evenals de Arkansas Biosciences Instituut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/32 inch thick silicone rubber | Grainger | B01LXJULOM | |
| 20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable - VWR | VWR | 66022-004 | With attached white urea cap and cork foil liner |
| 3 inch by 1 inch microscopy slides | VWR | 75799-268 | |
| 4C refrigerator | Thermo Fisher Scientific | FRGG2304D | Any commercial 4C refrigerator will suffice. |
| 50 mL tubes | VWR | 21008-178 | |
| 6-well cell culture plates | VWR | 10062-892 | Alternative brands may be used |
| Acetone | VWR | E646 | Alternative brands may be used |
| Bore vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Bovine Plasma Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010018 | Comes as 1 mg of lyophilized protein |
| CaCl2 | VWR/Amresco | 97062-590 | |
| Cell Culture Incubator w/ CO2 | Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice. | ||
| Disposable Serological Pipets, Glass - Kimble Chase | VWR | 14673-208 | Alternative brands may be used |
| DMEM/F-12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dope vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Ethanol | VWR | BDH1160 | Dilute to 70% for sterilization |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media) |
| Four 1/4-inch to 1" reducing unions | Swagelok | SS-1610-6-4 | One reducing union for each inlet and outlet of each vessel |
| Freeze-dryer/lyophilizer | Labconco | 117 (A65312906) | Any lyophilizer will suffice. |
| Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes - VWR | VWR | 89106-752 | Any weigh boat will suffice |
| Hollow fiber membrane immersion bath | 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets | ||
| Hollow Fiber Membrane Spinneret | AEI | http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html | Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm |
| Hot plate/stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-glutamine (200 mM) - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media) |
| MgCl2 | VWR/Alfa Aesar | AA12315-A1 | |
| Minus 80 Freezer | Thermo Fisher Scientific | UXF40086A | Any commercial -80C freezer will suffice. |
| N2 gas cylinders (two) | |||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | Alternative fibrogenic cell lines may be used. |
| N-methyl-2-pyrrolidone | VWR | BDH1141 | Alternative brands may be used |
| Penicillin/Streptomycin Solution - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media) |
| Polysulfone | Sigma-Aldrich | 428302 | Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used |
| Portable Pipet-Aid Pipetting Device - Drummond | VWR | 53498-103 | Alternative brands may be used |
| PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) | McMaster-Carr | 52315K24 | Alternative brands may be used. |
| Rat skeletal muscle fibroblasts | Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used. | ||
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Silicone sheet | McMaster-Carr | 1460N28 | |
| Take-up motor | Greartisan | B071GTTSV3 | 200 RPM DC Motor |
| Tris HCl | VWR/Amresco | 97063-756 | |
| Two needle valves | Swagelok | SS-1RS4 |
References
- Cobb, W. S., Kercher, K. W., Heniford, B. T. The argument for lightweight polypropylene mesh in hernia repair. Surgical Innovation. 12 (1), 63-69 (2005).
- Morais, J. M., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. Biomaterials/Tissue Interactions: Possible Solutions to Overcome Foreign Body Response. The AAPS Journal. 12 (2), 188-196 (2010).
- Simon, P., et al. Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT® in pediatric patients. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 23 (6), 1002-1006 (2003).
- FDA strengthens requirements for surgical mesh for the transvaginal repair of pelvic organ prolapse to address safety risks. , Food and Drug Administration. (2016).
- Kartus, J., Movin, T., Karlsson, J. Donor-site morbidity and anterior knee problems after anterior cruciate ligament reconstruction using autografts. Arthroscopy: The Journal of Arthroscopic & Related Surgery. 17 (9), 971-980 (2001).
- Lu, H., Hoshiba, T., Kawazoe, N., Chen, G. Autologous extracellular matrix scaffolds for tissue engineering. Biomaterials. 32 (10), 2489-2499 (2011).
- Wolchok, J. C., Tresco, P. A. The isolation of cell derived extracellular matrix constructs using sacrificial open-cell foams. Biomaterials. 31 (36), 9595-9603 (2010).
- Roberts, K., Schluns, J., Walker, A., Jones, J. D., Quinn, K. P., Hestekin, J., Wolchok, J. C. Cell derived extracellular matrix fibers synthesized using sacrificial hollow fiber membranes. Biomedical Materials. 13 (1), (2017).
- Hurd, S. A., Bhatti, N. M., Walker, A. M., Kasukonis, B. M., Wolchok, J. C. Development of a biological scaffold engineered using the extracellular matrix secreted by skeletal muscle cells. Biomaterials. 49, 9-17 (2015).
- Kasukonis, B. M., Kim, J. T., Washington, T. A., Wolchok, J. C. Development of an infusion bioreactor for the accelerated preparation of decellularized skeletal muscle scaffolds. Biotechnology Progress. 32 (3), 745-755 (2016).
- Murad, S., et al. Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (5), 2879-2882 (1981).
- Zhang, Y., et al. Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype. Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).
- Feng, C. Y., Khulbe, K. C., Matsuura, T., Ismail, A. F. Recent progresses in polymeric hollow fiber membrane preparation, characterization and applications. Separation and Purification Technology. 111, 43-71 (2013).
- Domb, A. J., Kost, J., Wiseman, D. Handbook of Biodegradable Polymers. , CRC Press. (1998).
