Summary
该方案的目标是生产针对伤口修复的整体细胞外基质纤维, 作为再生支架植入物的一部分, 适合临床前评估。这些纤维是通过在中空纤维膜上培养成纤维细胞而产生的, 并通过膜的溶解提取。
Abstract
来自细胞外基质 (ecm) 的工程支架使人们对医学产生了浓厚的兴趣, 因为它们在加速伤口闭合和愈合方面具有潜力。从体外纤维细胞培养中提取细胞外基质有可能从人类和潜在的患者特异性细胞系中产生 ecm, 从而最大限度地减少阻碍临床的异种表位的存在一些现有的 ecm 产品的成功。在体外生产适合植入的 ecm 中, 一个重大挑战是细胞培养的 ecm 生产通常产量相对较低。本文介绍了在牺牲中空纤维膜支架内培养的细胞生产 ecm 的方案。用成纤维细胞系在常规细胞培养基中培养中空纤维膜, 并在细胞培养后溶解, 产生连续的 ecm 螺纹。该方法制备的 ecm 纤维可脱珠化冻干, 适用于贮存和植入。
Introduction
植入式手术支架是伤口修复的固定装置, 每年有超过100万个合成聚合物网格被植入全球, 仅用于腹壁修复1。然而, 植入后, 传统上用于制造这些支架的合成材料聚合物往往会引起异物反应, 导致炎症对植入物的功能有害, 组织结疤 2.此外, 由于主要的合成网状材料 (即聚丙烯) 并没有被人体明显改造, 它们一般适用于可以耐受疤痕的组织, 从而限制了它们在治疗方面的临床用途。具有高阶功能的组织, 如肌肉。虽然有许多外科网状产品已应用于临床上, 但最近制造商召回的合成手术网格和物种间组织植入物的并发症突出了最大限度地扩大植入物的重要性生物相容性, 促使 fda 收紧对手术网状企业 3,4的规定。从患者自身组织中提取的支架可降低这种免疫反应, 但可导致显著的供体-部位发病率 5。体外产生的细胞外基质 (ecm) 支架是一种可能的替代方法, 因为脱细胞化的 ecm 支架具有良好的生物相容性, 特别是在自体 ecm 植入物6的情况下。
由于患者组织用于自体植入的收获有限, 而且有可能阻碍供体部位的功能, 因此能够从人类细胞系的培养中, 或在可能的情况下, 从患者的细胞培养中生产体外的 ecm 支架。自己的细胞是一个有吸引力的选择。在体外制造大量 ecm 的主要挑战是这些难以捕获的分子的固存。在前面的工作中, 我们已经证明了 ecm 可以通过培养 ecm 分泌成纤维细胞在培养期后溶解的牺牲聚合物泡沫中产生 ecm, 从而产生可在植入7中脱珠化的 ecm, 8,9,10。由于泡沫中产生的 ecm 往往采用泡沫的内部结构, 中空纤维膜 (hfm) 被探索为生产 ecm 螺纹的牺牲支架。本文介绍了在成纤维细胞培养一段时间后, 负责细胞培养质量中空纤维膜实验室大规模制造和从同一细胞外基质纤维中提取的方法。这种静态培养方法很容易被含有标准哺乳动物细胞培养设备的实验室采用。这种方法产生的 ecm 可应用于各种临床应用。
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Protocol
1. 使用牺牲中空纤维膜生产细胞外基质
注意: n-甲基-2-吡咯烷酮是一种刺激性溶剂和生殖毒物。接触 nmp 可能会对皮肤、眼睛、鼻子和喉咙造成刺激。在处理 nmp 时, 应使用耐溶剂的个人防护设备。nmp 的使用应在通风罩内进行。
- 中空纤维膜聚磺酸聚合物溶液的制备
- 使用分析天平在称重船上称量70克聚磺酸颗粒 (分子量为 35kd)。
- 将314毫升 (323.3 克) n-甲基-2 吡咯烷酮 (nmp) 转移到干净的硼硅酸盐瓶中。
- 将搅拌棒与 nmp 放在烧瓶中, 并将烧瓶放在搅拌器上。将搅拌器设置为中等旋转速率。
- 使用干漏斗慢慢地将准备好的70克聚磺酸插入与 nmp 的烧瓶中。
- 允许聚合物 "涂料" 溶液在室温下搅拌三天, 或直到均质。
- 中空纤维膜纺纱机同心度的设置与清洗
注: 纺车机可在市场上买到;正确的纺丝机尺寸是成功的膜制造的关键, 并列在材料表中。非常温和地处理纺丝机, 因为纺丝针特别易碎。- 使用螺丝刀或钻头与适当的螺丝刀位仔细拆卸主轴。
- 轻轻地将丙酮流经纺丝器的入口和出口, 收集玻璃烧杯中的任何丙酮和残留聚合物进行处置。
- 将纺丝器的上半身固定在桌上的虎钳中, 针头朝上。
- 将纺丝器的出口 (底部) 主体放在上身。
- 侧向移动纺纱机的出口体, 同时将上体固定在虎钳上, 直到纺丝针直接位于出口主体的中心。
- 小心地、缓慢地重新插入连接主轴机两个主体的螺钉, 同时确保在纺丝机出口可见的针头保持居中。
- 聚磺酸中空纤维膜的制备
- 制备含有45毫升 n-甲基-2-吡咯烷酮和255毫升去离子水的 "孔溶液", 形成15% 的 nmp 混合物与去离子水。
- 安装同心中空纤维膜纺纱机8厘米以上的室温自来水浴。
- 将纺丝机的聚合物入口和纺丝机的孔入口连接到两个内部体积至少为350毫升的独立钢制压力容器上。两艘船的出口都必须有止回阀。
- 将每个压力容器连接到独立的 n2 气瓶的调节器上
- 使用漏斗将制备的涂料溶液 (~ 315 毫升) 插入连接到纺丝机聚合物入口的压力容器中。确保容器的顶部是密封的。
- 使用漏斗将准备好的孔溶液 (300 毫升) 插入连接到主轴孔入口的压力容器中。确保容器的顶部是密封的。
- 首先打开孔容器的止回阀, 然后再打开聚合物容器。如果纺丝机足够干净, 孔溶液将开始从纺丝机出口流出。
- 将两艘船加压至 1 psi。直观地证实聚合物和孔溶液都退出了纺丝器, 当组合的流与水浴接触时, 会产生连续的白色长丝沉淀。
- 使用长钳引导在浴缸中心的滚子下的新生纤维, 然后将新生的纤维绕在连接到电机的旋转车轮周围。
- 将接带轮和电机以每分钟约2米的速度旋转。
- 根据需要对调节器或接轮速度进行小的调整, 直到实现稳态流量。新生的纤维应与水浴表面形成90°角。
- 关闭 n2缸调节器和压力容器止回阀, 并在所有聚合物和孔溶液从容器中挤出后脱离接行轮电机。
- 取出制备好的中空纤维膜, 放入去离子水浴中三天, 每天交换一次去离子水, 以去除残留的溶剂。
- 将中空纤维膜在121°c 下高压灭菌 30分钟, 或将其浸入70% 乙醇中一天, 对其进行灭菌。
- 中空纤维膜的细胞播种
注: 所有细胞培养程序都应在生物安全柜内进行。- 用 pbs (ph = 7.4) 中的牛血浆纤维连接蛋白20μgml 溶液处理中空纤维膜, 促进细胞附着。
- 在称重船中称量1毫克的牛粉状血浆纤维连接蛋白, 并将其溶解在无菌 pbs (ph 值 = 7.4) 的1毫升中, 在无菌 1.5 ml 微离心管中。
- 将牛血浆纤维连接蛋白溶液孵育30分钟。将溶液加入到无菌 pbs 的49毫升中, 在无菌的50毫升锥形离心管中。
- 在37°c 的孵化器中, 用5% 的 co2 孵育准备的牛血浆纤维连接蛋白中的纤维, 孵育 1小时.重新检测纤维连接蛋白溶液, 供以后使用, 并在4°c 下储存在无菌的50毫升锥形离心管中。
- 使用无菌微剪刀将纤维切割到所需的长度 (& lt;6 厘米)。
- 种子成纤维细胞直接进入中空纤维膜的腔内, 种子密度为每纤维 100, 000 细胞, 使用21规格的针头与1毫升注射器。
注: 准备细胞悬浮液在注射器中加载的一个切实可行的目标是每30微升介质的悬浮液密度为 100, 000个细胞。 - 将6个种子纤维放入直径为6厘米的培养皿中。允许种子纤维在37°c 时与 5% co2 孵育 5分钟.
- 将种子纤维从孵育中取出, 在含有 50μgml l-抗坏血酸和 150μml l-抗坏血酸 2-磷酸 (新鲜制备和过滤) 的最终浓度中, 将其培养长达 3周, 5 ngml tgf-β1 (无菌在-20°c 下储存的过滤的) 和1% 的青霉素链霉素在37°c 的 5% co2 孵化器内的6厘米培养皿中.每两天交换一次细胞培养基。
- 用 pbs (ph = 7.4) 中的牛血浆纤维连接蛋白20μgml 溶液处理中空纤维膜, 促进细胞附着。
- 从培养的中空纤维膜中提取细胞外基质
- 使用钳子将培养的纤维放入单个闪烁小瓶中。
- 使用玻璃移液器将高达5毫升的 nmp 放入每个小瓶中。
- 将中空纤维浸入 nmp 中, 共进行三次 nmp 交换。使用1毫升移液器慢慢吸气旧 nmp, 以防止提取的 ecm 撕裂。
注: 添加新鲜的 nmp 时, 倾斜小瓶并允许 nmp 从两侧运行是有帮助的, 否则剩余的 ecm 支架会受到剪切, 这可能会导致撕裂。 - 取出 nmp, 并在去离子水中冲洗产生的 ecm 螺纹3次。
- 切割半2英寸厚的硅橡胶, 长度为3英寸, 宽度为1英寸, 并在橡胶长度的中心切割8毫米由4毫米矩形模具。
- 将准备好的橡胶片放在标准的3英寸1英寸显微镜滑梯上, 并在121°c 下将高压灭菌器放置30分钟。
- 将每个 ecm 纤维并排放置在 8 mm 的 4 mm 硅胶模具中, 直到没有可见的开放空间。
- 将模具放入50毫升的锥形离心管中, 并在80°C 冻结, 直到完全冻结。
- 冷冻 ecm 网体在一夜之间或直到完全干燥。将网格存放在 4°C, 直到准备去电磁化。
2. 细胞外基质的去细胞化
- 在去离子水中制备 1% (w/w) 的十二烷基硫酸钠 (sds) 溶液。
- 在室温下, 用温和的搅拌在摇杆上, 在 1% sds 中提取细胞外基质24小时。
- 用温和搅拌的3毫升 pbs 冲洗未育磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 中三次提取细胞外基质。
注: 应轻轻冲洗, 以尽量减少准备好的脚手架撕裂。 - 制备1升的 dnasse/rnase 消化缓冲液。
注: dnase/rnse 消化缓冲液可在4°C 储存数月。- 重量1.54 克 tris hcl, 308 毫克的 mgcl2, 56 毫克的 ccl2在不同的称重船。
- 将 tris hcl、mgcl2和 ccl 2 与1升的去离子水结合在一个大烧瓶中, 搅拌棒, 搅拌至所有成分溶解。
- 无菌过滤消化缓冲液与0.22μm 过滤器到一个不育的 1 l 硼硅酸盐瓶, 并存储在4°C。
- 准备5毫升的 dnasse/rnase 消化液。
注: 应在准备后24小时内使用消化液。- 重量0.125 毫克 (50ku) 的 dnasse i 在称重船上, 并添加到5毫升的消化缓冲液。
- 在消化缓冲液中加入75μl 的 rnse a 库存溶液。
- 用消化液填充每个霉菌, 在4°c 下孵育6小时。
- 吸入消化液, 在无菌 pbs 中冲洗三次。
- 在4°C 的 pbs 中, 在10% 的青霉素中, 在 pbs 中夜间吸收 pbs 和孵育支架。
- 在无菌 pbs 中吸头青霉素和冲洗支架三次。
- 将模具放入50毫升的锥形离心管中, 并在80°C 处冻结。
- 在一夜之间或直到完全干燥的去细胞化的 ecm 网格的再干。
- 将生物安全罩内的冻干脚手架转移到无菌容器中, 4°C 使用。
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Representative Results
牺牲支架细胞外基质的成功生产取决于适当的支架制作、细胞培养和溶剂冲洗程序。中空纤维膜的制造是使用由市售部件组装的干射流湿纺系统进行的 (图 1), 该系统通过市售钢的环环挤出聚合物溶液纺丝器 (内径 = 0.8 毫米, 外径 = 1.6 毫米), 生成一个新生的聚合物溶液管, 在与水浴接触时沉淀成中空纤维膜。
从 hfm 中提取 ecm 的示例过程如图2所示。图 3a显示了根据该协议制备的聚磺酸 hfm 的横向横截面, 显示了非对称膜所特有的指状毛孔的外层和内层。在该协议中, 细胞在膜的内腔中特别播种, 并在直径为6厘米的 petri 培养皿中培养, 细胞倾向于在膜的所有表面增殖。然后, 培养的膜可以在标准的玻璃闪烁小瓶中进行批量 nmp 和去离子水冲洗 (图 3c), 产生 ecm 的半透明螺纹 (图 3C)。在为期三周的培养过程中, ecm 生产细胞在 hfm 中保持活力 (图 4)。
通过三次 n-甲基-2-吡咯烷酮的交换, 溶解了与原发大鼠骨骼肌成纤维细胞 (rsmf) 培养三周的 hfm, 然后在去离子水中冲洗三次。提取的基质, 通常是半透明的外观时, 水合 (图 5a), 将倾向于云时水合, 如果不进行适当的溶剂冲洗, 由于残留聚合物的存在。还应注意的是, 膜溶解后剩余的 ecm 有些脆弱, 需要小心处理精细的钳子。ecm 纤维组装成网格, 然后冻干显示出一种非白色和纤维状的外观, 具有总的纵向对齐 (图 5b)。
图 1: 说明了铸造中空纤维膜的工艺流程.中空纤维膜采用无处不在的非溶剂诱导相分离方法 (NIPS), 使用特定材料表中列出的商用组件制备的系统。nmp (17.8 w/w%) 和 nmp 孔溶液 (水中的 nmp 为 15 w/w% nmp) 通过加压 n2 从单独的不锈钢容器中挤出成一个纺丝体, 在纺丝体出口产生一个新生的中空纤维膜, 完全沉淀与自来水降水浴接触时。鼻腔中空纤维在导轨下和导轨下手动引导, 并允许以每分钟2.3 米的速度在旋转机动滚轮上收集。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 从培养的中空纤维膜中生产 ecm 的图解.中空纤维膜采用成纤维细胞播种, 培养三周, 然后交换 nmp 3倍和交换去离子水3倍。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: ecm 的培养和提取。用 dmemsef-12 中的 rsmf 细胞, 用抗坏血酸和 tgf -β (b)的补充, 培养了不对称介孔中空纤维膜(a ) 三周。培养的中空纤维 (c, d top) 通过在 n-甲基-2 吡咯烷酮中的3个交换溶解, 然后在去离子水中冲洗 3次, 形成 ecm (d, 底部) 的连续螺纹。ecm 纤维表面的高放大扫描电子显微镜显微镜 (e)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 中空纤维膜上的细胞活力.用 rsmf 细胞培养三个星期的代表性中空纤维膜, 用精细剃须刀纵向切片, 以揭示 hfm 的管腔表面, 并使用 calcein am 和 eth-1 进行活死染色。可行性染色显示了一层可忽略不计的活细胞的真核素荧光。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: ecm 植入物的组装.从 rsmf 细胞培养中获得的单个细胞外基质螺纹 (n = 30) 纵向放入硅胶模具(a)中, 并用 1% sds 进行去细胞化, 然后用 dnasse i、rnse a 和青霉素链霉素进行处理。然后对脱光 ecm 进行冻干, 产生一个具有纤维状外观和纵向结构的非白色网格(b)。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
所述工艺使使用干式湿纺系统铸造的中空纤维膜能够在体外生产散装 ecm 生物材料, 从而能够以低廉的价格批量生产膜以及标准的细胞培养设备。虽然本协议中制造的膜用于细胞培养, 但所述系统也可用于生产用于分离目的的膜, 孔径分布和中空纤维尺寸可通过变化进行调整纺丝机尺寸、所使用的聚合物、涂料和钻孔流量、取料速度和环境条件。13虽然该协议详细使用中空纤维膜, 原则上任何溶解细胞培养支架具有适当的传输性能, 如开放细胞泡沫可以使用, 如前面的工作7所示, 8,9。这种通用的方法似乎是有用的, 以生产 ecm 支架的牺牲支架, 可以更忠实地模仿组织的内部结构。该协议产生的植入物尤其表现出总对齐 (图 5b), 这可能对重建高度对齐的组织 (如肌腱、韧带和骨骼肌) 特别有益。
定期交换培养基, 特别是补充抗坏血酸和 tgf-β的培养基, 对 ecm 的产生至关重要, 因为抗坏血酸是胶原蛋白生物合成中必不可少的酶, tgf-β诱导几种 ecm 蛋白的合成 10.此外, 必须使用 nmp 对 ecm 进行彻底冲洗, 否则残留聚合物将保留在提取的 ecm 中, 在水冲洗过程中显示为白色膜。在膜溶解过程中, 由于 ecm 相对脆弱, 因此必须注意不要过度搅拌 ecm。用于植入的已收集的 ecm 支架必须经过所述的去电磁化步骤, 以去除异种表位, 从而最大限度地减少潜在的宿主异物反应。
这项技术的意义在于它生产了一个生物复杂的整个细胞外基质支架, 它可以通过人体自身的伤口愈合过程进行重塑。通过使用这种方法从特定于目标物种的细胞中产生 ecm, 可以最大限度地减少阻碍这类生物材料临床疗效的异物反应;通过使用个人特有的细胞, 异物的反应可能会进一步减弱。这种方法还允许针对特定组织的 ecm 的生产, 最近的报告表明, 组织特异性 ecm 在某些应用中可能特别有效 12.由于该协议允许跨不同细胞系生产 ecm, 因此可以使用多种细胞类型 (如肌肉、神经、内皮) 的 ecm 组合的植入物来定制植入物, 以便更忠实地接近结构和化学物质目标组织的复杂性。虽然这里介绍的 ecm 网格最初是作为伤口修复的支架, 但它们也可能被用作研究细胞-ecm 相互作用、双细胞介素和生物传感的平台。特别是, 这种方法使调查员能够从感兴趣的特定细胞类型中产生 ecm, 这可能使他们能够对组织特异性 ecm 结构、组成和功能的生物学意义有新的认识。
这里介绍的 ecm 生产技术的潜在改进可能包括通过使用动态和预处理生物反应器进行扩展, 以及探索替代牺牲脚手架材料和建筑。特别是过渡到无溶剂支架的拆除过程将提高提取过程的安全性;牺牲支架由酶降解的材料组成, 如再生纤维素, 可允许无溶剂 ecm 萃取 14.虽然这些材料的抗拉强度低于合成材料, 但有几种途径可以改进这些支架, 包括探索各种培养条件、培养基配方和牺牲脚手架几何形状。最近基因工程的进展可以用来生产亲纤维化细胞系, 结合 ecm 捕获平台, 可以生产满足临床需求的支架。此外, 现有的动态培养系统, 如连续流动循环中空纤维膜生物反应器, 有助于实现更高的营养交换率, 有利于更大、更快速的 ecm 生产, 并可能对利用这一特性特别感兴趣。用于生物研究和临床应用的大量 ecm 的生产技术。
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Disclosures
提交人声明, 他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
该出版物中报告的研究得到了国家卫生研究院国家关节炎和肌肉骨骼及皮肤病研究所的支持, 该研究所的奖项号为 r15ar064481, 国家科学基金会 (cmmi-1404716), 以及阿肯色州生物科学研究所。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/32 inch thick silicone rubber | Grainger | B01LXJULOM | |
| 20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable - VWR | VWR | 66022-004 | With attached white urea cap and cork foil liner |
| 3 inch by 1 inch microscopy slides | VWR | 75799-268 | |
| 4C refrigerator | Thermo Fisher Scientific | FRGG2304D | Any commercial 4C refrigerator will suffice. |
| 50 mL tubes | VWR | 21008-178 | |
| 6-well cell culture plates | VWR | 10062-892 | Alternative brands may be used |
| Acetone | VWR | E646 | Alternative brands may be used |
| Bore vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Bovine Plasma Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010018 | Comes as 1 mg of lyophilized protein |
| CaCl2 | VWR/Amresco | 97062-590 | |
| Cell Culture Incubator w/ CO2 | Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice. | ||
| Disposable Serological Pipets, Glass - Kimble Chase | VWR | 14673-208 | Alternative brands may be used |
| DMEM/F-12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dope vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Ethanol | VWR | BDH1160 | Dilute to 70% for sterilization |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media) |
| Four 1/4-inch to 1" reducing unions | Swagelok | SS-1610-6-4 | One reducing union for each inlet and outlet of each vessel |
| Freeze-dryer/lyophilizer | Labconco | 117 (A65312906) | Any lyophilizer will suffice. |
| Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes - VWR | VWR | 89106-752 | Any weigh boat will suffice |
| Hollow fiber membrane immersion bath | 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets | ||
| Hollow Fiber Membrane Spinneret | AEI | http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html | Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm |
| Hot plate/stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-glutamine (200 mM) - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media) |
| MgCl2 | VWR/Alfa Aesar | AA12315-A1 | |
| Minus 80 Freezer | Thermo Fisher Scientific | UXF40086A | Any commercial -80C freezer will suffice. |
| N2 gas cylinders (two) | |||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | Alternative fibrogenic cell lines may be used. |
| N-methyl-2-pyrrolidone | VWR | BDH1141 | Alternative brands may be used |
| Penicillin/Streptomycin Solution - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media) |
| Polysulfone | Sigma-Aldrich | 428302 | Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used |
| Portable Pipet-Aid Pipetting Device - Drummond | VWR | 53498-103 | Alternative brands may be used |
| PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) | McMaster-Carr | 52315K24 | Alternative brands may be used. |
| Rat skeletal muscle fibroblasts | Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used. | ||
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Silicone sheet | McMaster-Carr | 1460N28 | |
| Take-up motor | Greartisan | B071GTTSV3 | 200 RPM DC Motor |
| Tris HCl | VWR/Amresco | 97063-756 | |
| Two needle valves | Swagelok | SS-1RS4 |
References
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